CN101282988A - Egln2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病和冠心病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在氨基酸序列的58位具有丝氨酸或亮氨酸的人EGLN2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病或冠心病中的用途，其中所述疾病尤其是中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(PRIND)、短暂性局部缺血发作(TIA)、心肌梗塞和/或早发性心肌梗塞。

Description

EGLN2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病和冠心病中的用途
技术领域
本发明涉及在氨基酸序列的58位具有丝氨酸或亮氨酸的人EGLN2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病或冠心病中的用途，其中所述疾病尤其是中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(prolonged reversibleischaemic neurological deficit；PRIND)、短暂性局部缺血发作(transientischemic attack；TIA)、心肌梗塞和/或早发性心肌梗塞(prematuremyocardial infarct)。
背景技术
EGLN2，由于其的HIF脯氨酰羟化酶活性，也称作含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白质1(PHD1)，其属于具有由5个编码外显子组成的保守基因组结构的Egl-Nine基因家族的一组密切相关蛋白质。HIF(hypoxia-inducible factor，缺氧诱导因子)是在氧稳态的许多方面发挥关键作用的转录调节因子，但EGLN同种型EGLN1(PHD1)、EGLN2(PHD2)和EGLN3(PHD3)在HIF的生理调节上所起的作用仍然不明确(Appelhoff，R.J.等人(2004)J.Biol.Chem.，279，38458-38465，No.37)。已报道，所有EGLN同种型都表现出不同的细胞特异性和可诱导性行为，这使得可以灵活地调节HIF对缺氧的反应。这意味着，对特定EGLN同种型的特异药理学抑制作用可能可以选择性地调节HIF反应，这在治疗应用中将是有用的(Appelhoff，R.J.等人(2004)，见上文)。例如，对EGLN2的抑制作用广泛地在一系列处于静息状态的细胞类型中激活HIF反应。相反，对EGLN3的特异抑制作用选择性地在高水平表达该酶的一些组织中增强对缺氧的反应(Appelhoff，R.J.等人(2004)，见上文)。这开启了治疗局部缺血性/缺氧性疾病的可能性。与EGLN2和EGLN3相反地，对EGLN1的生理作用知道得不多。
发明内容
为了更好地理解EGLN2在冠心病发生和发展中的潜在作用，就EGLN2基因在根据本发明以索引号NM_053046.2发表的EGLN2参考序列的470位的变异，对一组详细表征的患者进行了基因型-表型相关性分析，其中所述变异为。已经已知SNP(单核苷酸多态性)形式的EGLN2基因的不同遗传变体，并发表在http://www.nchi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref.cgi？locusId＝112398)。
令人惊讶地发现，编码人EGLN2蛋白质的核酸在470位核苷酸的变异、尤其是从胞嘧啶变为胸腺嘧啶、或者人EGLN2蛋白质在58位氨基酸的变异、尤其是从丝氨酸变为亮氨酸，与血栓栓塞病和/或冠心病的发生相关。
因此，本发明的一个主题涉及含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质和编码该EGLN2蛋白质的核酸，尤其是根据SEQ ID NO：4的核酸序列。优选地，根据本发明的核酸为DNA或RNA，优选DNA，尤其是双链DNA。该核酸的序列可以进一步表征为其具有至少一个内含子和/或一个polyA序列。
在本发明再一实施方案中，核酸可以用来制备载体，优选穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体或具有基因治疗活性的载体形式。此外，基因敲除构建体或表达盒可以用上述核酸制备。表达载体可以为原核或真核表达载体。原核表达载体的实例为例如用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体，例如载体pGEM或pUC衍生物，真核表达载体的实例为用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体，例如载体p426Met25或p426GAL1(Mumberg等人(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，用于在昆虫细胞中表达的载体，例如EP-B1-0 127 839或EP-B1-0 549 721中公开的杆状病毒(Baculovirus)载体，以及用于在哺乳动物中表达的载体，例如载体Rc/CMV和Rc/RSV或SV40载体，其中所述载体都为通常能获得的。一般而言，表达载体也含有适于相应宿主细胞的启动子，例如在大肠杆菌中表达的trp启动子(见，例如EP-B1-0 154 133)，在酵母中表达的Met25、GAL1或ADH2启动子(Russel等人(1983)，J.Biol.Chem.258，2674-2682；Mumberg，见上文)，在昆虫细胞中表达的杆状病毒多角体蛋白启动子(见，例如EP-B1-0 127 839)。对于在哺乳动物细胞中的表达，例如，适宜的启动子为那些允许在真核细胞中组成性、可调节性、组织特异性或代谢特异性表达的启动子。根据本发明的可调节元件为启动子、激活物序列、增强子、沉默子和/或阻抑物序列。使得可以在真核生物中组成性表达的合适可调节元件的实例为RNA聚合酶III识别的启动子或病毒启动子、CMV增强子、CMV启动子(也见实施例13)、SV40启动子或例如来自MMTV(小鼠乳腺瘤病毒；Lee等人(1981)Nature 214，228-232)的LTR启动子，以及衍生自例如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV的其它病毒启动子和激活物序列。使得可以在真核生物中诱导性表达的可调节元件的实例为与相应阻抑物联合的四环素操纵基因(Gossen M.等人(1994)Curr. Opin.Biotechnol.5，516-20)。使得可以在真核生物中代谢特异性表达的可调节元件的实例为优选受缺氧调节的启动子。
为了能够引入根据本发明使用的核酸、并且由此能通过转染、转化或感染而在真核细胞或原核细胞中表达多肽，核酸可以以质粒形式或者作为病毒或非病毒载体的一部分出现。本文适宜的病毒载体尤其为：杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated viruse)和疱疹病毒。本文适宜的非病毒载体尤其为：病毒体、脂质体、阳离子脂质或多聚赖氨酸缀合的DNA。
具基因治疗活性的载体的实例为病毒载体，例如腺病毒载体或逆转录病毒载体(Lindemann等人，1997，Mol.Med.3：466-76；Springer等人，1998，Mol.Cell.2：549-58)。分离形式的真核表达载体对基因治疗用途是合适的，因为裸露的DNA在局部应用时能够渗透进入皮肤细胞(Hengge等人，1996，J.Clin.Invest.97：2911-6；Yu等人，1999，J.Invest.Dermatol.112：370-5)。具基因治疗活性的载体也可以通过将根据本发明所用的核酸和脂质体复合来获得，因为这样能实现非常高的转染效率，尤其是对皮肤细胞(Alexander和Akhurst，1995，Hum.Mol.Genet.4：2279-85)。在脂质转染的情况中，可以通过超声波处理脂质体悬浮液，从阳离子脂质制备单层小脂泡。DNA以离子方式结合至脂质体表面，其中结合比率使得可以保持正净电荷、并且质粒DNA100％地复合至脂质体。除了Felgner等人(1987，见上文)采用的脂质混合物DOTMA(1，2-二油基氧基丙基-3-三甲基-铵溴化物)和DPOE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)，还合成了许多新型脂质制剂，并检测了它们转染多种细胞系的效率(Behr，J.P.等人(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6982-6986；Felgner，J.H.等人(1994)J.Biol.Chem.269，2550-2561；Gao，X.&Huang，L.(1991)，Biochim.Biophys.Acta 1189，195-203)。脂质制剂的实例为DOTAP N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-铵乙基-硫酸盐或DOGS(TRANSFECTAM；二-十八烷基酰胺基甘氨酰亚精胺)。增加核酸转移进入细胞的助剂可以是例如使核酸能转运进入细胞核的合成的肽-DNA分子或者结合DNA的蛋白质或肽(Schwartz等人(1999)GeneTherapy 6，282；Brandén等人(1999)Nature Biotech.17，784)。助剂也包括能使核酸释放进入细胞质的分子(Planck等人(1994)J.Biol.Chem.269，12918；Kichler等人(1997)Bioconj.Chem.8，213)或例如脂质体(Uhlmann和Peymann(1990)见上文)。另一尤其适宜的基因治疗载体形式可以如下获得，即通过将根据本发明所用的核酸施用至金颗粒，并在所谓的基因枪辅助下将这些射入组织、优选皮肤或细胞(实施例13；Wang等人，1999，J.Invest.Dermatol.，112：775-81，Tuting等人，1998，J.Invest.Dermatol.111：183-8)。
对于上述核酸的基因治疗应用，如果编码多肽的核酸部分含有一个或多个非编码序列，包括，优选位于启动子和多肽起始密码子之间的内含子序列、和/或尤其位于基因3’末端的polyA序列、尤其是天然存在的polyA序列或SV40病毒polyA序列，那么由于因此可以实现mRNA的稳定化，所以其也是有利的(Jackson，R.J.(1993)Cell 74，9-14和Palmiter，R.D.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，478-482)。
基因敲除构建体为本领域技术人员已知，例如可以从美国专利5,625,122、US 5,698,765、US 5,583,278和US 5,750,825获知。
本发明进一步涉及用根据本发明的载体或基因敲除构建体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞，原核宿主细胞的实例为大肠杆菌，并且真核细胞的实例为酿酒酵母或昆虫细胞。尤其优选的转化了的宿主细胞为转基因的非人胚胎干细胞，其特征为其包含根据本发明的基因敲除构建体或根据本发明的表达盒。转化宿主细胞和/或干细胞的方法为本领域技术人员熟知，并且包括例如电穿孔法或显微注射法。
本发明的另一主题涉及含有根据本发明的核酸或载体的转基因动物。
制备转基因动物尤其是小鼠的方法同样也为本领域技术人员已知的(可以从DE 196 25 049和US 4,736,866、US 5,625,122、US 5,698,765、US 5,583,278和US 5,750,825获知)，并且包括可以例如通过直接将表达载体(见上文)注射进入胚胎或精母细胞或者通过将表达载体转染进入胚胎干细胞(Polites和Pinkert：DNA Microinjection and Transgenic AnimalProduction，15-68页in Pinkert，1994：转基因动物技术：实验室手册，Academic Press，London，UK；Houdebine，1997，Harwood AcademicPublishers，Amsterdam，The Netherlands；Doetschman：Gene Transfer inEmbryonic Stem Cells，115-146页in Pinkert，1994，见上文；Wood：Retrovirus-Mediated Gene Transfer，147-176页in Pinkert，1994，见上文；Monastersky：Gene Transfer Technology；Alternative Techniques andApplications，177-220页in Pinkert，1994，见上文)而产生的转基因动物。如果将根据本发明所用的核酸整合进入所谓的靶向载体中(Pinkert，1994，见上文)，那么可以例如在转染胚胎干细胞和同源重组后产生敲除小鼠，一般地，所述小鼠为杂合小鼠，其显示出所述核酸降低的表达，而纯合小鼠则不再显示出所述核酸的表达。以这种方式产生的转基因的和敲除的细胞或动物也可以用于筛选和鉴定具有基因治疗活性的药物活性物质载体。
本发明的另一主题涉及特异地结合含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质的抗体。
根据本发明，术语“特异地”表示抗体结合含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质，但基本不结合含有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的EGLN2蛋白质，即，抗体适宜于区分在58位具有丝氨酸的EGLN2蛋白质和在58位具有亮氨酸的EGLN2蛋白质。
抗体为多克隆或单克隆的，优选地其为单克隆抗体。根据本发明，术语抗体应理解为也指通过基因工程技术制备的以及任选修饰的抗体或其抗原结合部分，例如嵌合抗体、人源化的抗体、多功能抗体、双或寡特异性抗体、单链抗体、F(ab)或F(ab)2片段(见，例如EP-B1-0 368 684、US4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213、WO 98/24884)。
生产抗体的方法根据本领域技术人员通常已知的方法进行，例如根据需要在存在例如弗氏佐剂和/或氢氧化铝凝胶下、用上述多肽或其所述部分免疫哺乳动物例如兔(见，例如Diamond，B.A.等人(1981)The NewEngland Journal of Medicine，1344-1349)。然后，可以根据通常已知的方法容易地从血液中分离作为免疫反应结果而在动物中形成的多克隆抗体，并例如通过柱层析进行纯化。单克隆抗体可以例如根据Winter&Milstein的已知方法(Winter，G.&Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)产生。重组抗体可以按照如上文具体指出的专利出版物中所公开的方法产生。
本发明的另一主题涉及产生含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质的方法，其中在适宜的培养基中培养上文详述的细胞，并任选地从细胞或培养基中分离该EGLN2蛋白质。
EGLN2蛋白质可以例如根据本领域技术人员通常已知的方法通过在上文已说明的适宜表达系统中表达上述核酸来制备。适宜的宿主细胞为例如大肠杆菌菌株DHS、HB101或BL21，酵母菌株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，鳞翅目(Lepidoptera)昆虫细胞系、例如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞系或动物细胞COS、Vero、293、HaCaT和HeLa，所有这些宿主细胞都是通常可获得的。EGLN2蛋白质也可以为融合蛋白质的一部分。在此，含有上述多肽的融合蛋白质可以如上文所述制备，融合蛋白质自身已具有上述多肽的功能或者该特定功能只有在切去融合部分后才是功能活性的。本文特别包括具有大约1-300、优选大约1-200、尤其是大约1-100、特别是大约1-50个外源氨基酸的部分的融合蛋白质。此类肽序列的实例为原核肽序列，所述原核肽序列可以衍生自例如大肠杆菌的半乳糖苷酶。此外，也可以使用病毒肽序列例如噬菌体M13的病毒肽序列来产生融合蛋白质用于本领域技术人员已知的噬菌体展示方法。用于融合蛋白质的肽序列的其它优选实例为利于更容易地检测出融合蛋白质的肽，这些肽为例如“绿色荧光蛋白”或其变体。
为了分离和/或纯化上述蛋白质，可以连接(一个或多个)其它多肽(标签)。适宜的蛋白质标签允许例如高亲和力吸收至基质、用适当缓冲液严紧洗涤而不显著洗脱复合体、以及随后定向洗脱所吸附的复合体。本领域技术人员已知的蛋白质标签的实例为(His)6标签、Myc标签、FLAG标签、血细胞凝集素标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、具有几丁质结合亲和标签的内含肽或麦芽糖结合蛋白质(MBP)标签。这些蛋白质标签可以位于N或C末端和/或内部。
本发明的再一主题涉及筛选EGLN2蛋白质的调节剂的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)提供EGLN2蛋白质或编码EGLN2蛋白质的核酸，
(b)提供测试化合物，和
(c)测定或检测测试化合物对EGLN2蛋白质或EGLN2基因的影响。
一般地，例如在测试系统中提供EGLN2蛋白质或编码EGLN2蛋白质的核酸，并使其直接或间接地与测试化合物、尤其是生物化学或化学的测试化合物(例如化学化合物文库的形式)接触。然后测定或检测测试化合物对EGLN2蛋白质或编码EGLN2蛋白质的核酸的影响。此后，可以分析和/或分离适宜的调节剂，例如激活剂或抑制剂。对于筛选化学化合物文库，优选使用本领域技术人员已知的或商业可得的高通量测定法。
根据本发明，术语“化学化合物文库”指的是从多个来源中的任何来源集合在一起的多个化学化合物，包括化学合成的分子和天然产物的化学化合物，或是通过组合化学技术产生的多个化学化合物。
一般地，在多相或均相试验中测定或检测测试化合物对EGLN2或EGLN2基因的影响。如本文所用，多相试验为包括一个或多个洗涤步骤的试验，而在均相试验中不需要该洗涤步骤。仅混合试剂和化合物并进行测定。
适宜的功能测试试验可以基于EGLN2的基因表达，EGLN2的直接激活或抑制来进行。在存在作为EGLN2基因表达调节剂的待测试物的生物化学或化学化合物时，可以通过技术人员通常已知的手段或如Appelhoff，R.J.等人(2004)，见上文和/或Jaakkola，P.等人(2001)Science，292，468-472，No.5516.中所述的方法，测定直接的激活作用或抑制作用或与其它蛋白质例如细胞蛋白质形成的复合体。
例如，脯氨酰羟化酶活性可以通过质谱分析来测定，其中可以检测脯氨酸，例如该脯氨酰羟化酶或HIF-1α底物的Pro564的氧化；或者通过本领域技术人员已知的酶测定法，例如在体外测试试验中和/或在用人细胞、动物细胞、细菌细胞或酵母细胞的体外全细胞测试试验中测定。
固相结合的多肽也可以构成阵列的一部分。例如在US 5,744,305中公开了用固相化学作用和光不稳定的保护基团制备该阵列的方法。也可以使这些阵列与测试化合物或化合物文库接触，并测试相互作用，例如结合或构象改变。
在本发明的另一实施方案中，该方法用全细胞进行。通常，将生长在多孔板底部的细胞进行固定并透化处理、之后封闭并与抗目的底物的一级(P)-特异性抗体孵育。然后，例如用铕标记的或HRP缀合的二级抗体与特定化学发光的或显色的物质(例如上述的)来产生信号。联合使用显微镜，不仅可以在单细胞水平上定量(P)-特异性抗体的数量，也可以确定磷酸化诱导的底物移位或细胞的形态变化。
方便地，本发明的方法可以在机器人系统中进行，所述机器人系统例如包括机器人种板(plating)和机器人液体转移系统，例如使用微流体学(microfluidics)，即，在通道结构中。
在本发明的另一实施方案中，该方法以高通量筛选系统的形式进行。方便地，在该系统中筛选方法是自动化和小型化的，尤其是其使用小型化的孔和受机器人控制的微流体技术。
本发明的另一主题涉及含有根据SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸在生产预防或治疗血栓栓塞病和/或冠心病的药物中的用途。所述血栓栓塞病尤其是中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(PRIND)和/或短暂性局部缺血发作(TIA)。此外，冠心病尤其是心肌梗塞。特别地，含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸用来生产预防或治疗中风、PRIND和/或TIA的药物，并且含有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸用来生产预防或治疗心肌梗塞、尤其是早发性心肌梗塞的药物。
具体而言，如果470位的核苷酸在染色体DNA中为胸腺嘧啶或在mRNA中为尿嘧啶或者58位的氨基酸为亮氨酸，那么存在更高的发生中风、PRIND和/或TIA的风险。然而，如果470位的核苷酸为胞嘧啶或58位的氨基酸为丝氨酸，那么存在更高的发生心肌梗塞、尤其是早发性心肌梗塞的风险。
根据本发明，术语“EGLN2-C470C”指的是一组在编码EGLN2的基因的两个等位基因上在参考序列NM_053046.2的470位具有胞嘧啶(导致相应蛋白质58位的氨基酸为丝氨酸)的人。这些人就该EGLN2变体而言是纯合的。相应地，术语“EGLN2-C470T”指的是一组在编码EGLN2的基因的一个等位基因上具有导致相应蛋白质58位为丝氨酸的胞嘧啶、并在编码EGLN2的基因的另一等位基因上具有导致相应蛋白质58位为亮氨酸的胸腺嘧啶的人。这些人就该EGLN2变体而言是杂合的。
编码人EGLN2蛋白质的参考序列的核酸序列优选具有SEQ ID NO：1的核酸序列，并且人EGLN2蛋白质的氨基酸序列优选具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。然而，本发明也包括人EGLN2的其它变体和其非人同系物，例如其它哺乳动物EGLN2同系物、或来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabdidis elegans)、小鼠或大鼠的EGLN2同系物，条件是在对应于所述参考序列的470位的位置存在自胞嘧啶向胸腺嘧啶的核苷酸交换、和/或在对应于所述参考序列58位的位置存在自丝氨酸到亮氨酸的氨基酸交换、并且进一步地该相应蛋白质具有脯氨酰羟化酶活性、尤其是HIF脯氨酰羟化酶活性。所述酶活性例如可以通过如上文所述的质谱分析测定。
一般地，470位的特定核苷酸可以通过核酸测序法、核酸质谱分析、杂交法和/或扩增法确定。核酸测序法的实例为焦磷酸测序(pyrosequencing)和/或借助放射性和/或荧光标记的核苷酸的测序。杂交方法的实例为Southern印迹分析、Northern印迹分析和/或在DNA-微阵列上的杂交法。扩增法的实例为TaqMan分析、RNA差别展示分析和/或代表性的差异分析(Shi M.M.(2002)Am J Pharmacogenomics.，2(3)，197-205；Kozian&Kirschbaum(1999)Trends Biotechnol.，17(2)，73-8.)
此外，58位的氨基酸序列可以通过测定特定蛋白质的量的方法和/或测定特定蛋白质的活性的方法确定。测定特定蛋白质的量的方法的实例为Western印迹分析和/或ELISA。测定特定蛋白质的活性的实例为体外测试试验和/或用人细胞、动物细胞、细菌细胞或酵母细胞进行的体外全细胞测试试验，所有这些都为本领域技术人员已知。
用于检测相应变体的样品的实例为细胞、组织或体液、尤其是血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞。优选地，样品用本领域技术人员已知的常规方法预处理以便分离和/或纯化样品中的核酸或染色体DNA或蛋白质用于进行进一步的分析。
鉴定根据本发明的变体的一个优选方法包括下列步骤：
(a)从样品、特别是从来自例如待研究的人或患者的细胞、组织、体液、血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞，分离核酸探针，尤其是DNA探针；
(b)借助引物，尤其是实施例中详述的引物，扩增包含EGLN2基因470位的特定区域；
(c)测序扩增的区域；和
(d)分析经测序的区域。
确定根据本发明的变体的一个备选方法包括下列步骤：
(a)从样品、尤其是从例如来自待研究的人或患者的细胞、组织、体液、血液的细胞组分、内皮细胞或平滑肌细胞，分离ENGL2蛋白质；和
(b)测定EGLN2蛋白质58位的氨基酸。
实施例中以逐一单独的方式或以集合的方式详述了更加优选的步骤，所述步骤在此处引入作为每个步骤的参考。
最后，本发明的主题涉及生产治疗血栓栓塞病和/或冠心病的药物的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)实施如上文所述的筛选方法，
(b)分离经测定或检测适宜于治疗血栓栓塞病和/或冠心病的测试化合物，和
(c)将经测定或检测的测试化合物用一种或多种可药用载体或辅助物质进行配制。
根据上述方法的步骤(c)，经检测的测试化合物通常根据施用类型用一种或多种可药用添加剂或辅助物质进行配制，其中所述添加剂或辅助物质为例如生理缓冲溶液、例如氯化钠溶液、软化水、稳定剂、ε-氨基己酸或抑胃酶肽A、或螯合剂、例如EDTA、凝胶形成剂例如白凡士林、低粘性石蜡和/或黄蜡等。
适宜的其它添加剂为例如去污剂，例如Triton X-100或脱氧胆酸钠，以及多元醇类、例如聚乙二醇或丙三醇，糖类、例如蔗糖或葡萄糖，两性离子化合物、例如氨基酸、例如甘氨酸或者尤其是牛磺酸或甜菜碱，和/或蛋白质、例如牛或人血清白蛋白。优选去污剂、多元醇类和/或两性离子化合物。
生理缓冲溶液优选具有大约6.0-8.0的pH、尤其是大约6.8-7.8的pH、特别是大约7.4的pH、和/或大约200-400毫渗透压摩尔/升、优选大约290-310毫渗透压摩尔/升的渗透性。通常，药物的pH用适当的有机或无机缓冲液调节，例如优选使用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟基乙基)哌嗪]-乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常取决于期望的缓冲液重量摩尔浓度。例如，磷酸盐缓冲液适用于注射和输注溶液。
药物可以以常规方式施用，例如通过口服剂量形式例如片剂或胶囊、通过粘膜例如鼻腔或口腔、以植入皮下的栓剂形式、通过注射、输注或含有根据本发明药物的凝胶来施用。，还可以局部(topically and locally)施用药物来治疗上文所述的特定关节疾病，如果适当的话以脂质体复合物的形式。此外，治疗可以通过经皮治疗系统(TTS)来进行，这使得可以实现药物在时间上的控制性释放。TTS例如可以从EP 0 944 398 A1、EP 0 916336 A1、EP 0 889 723 A1或EP 0 852 493 A1中已知。
如果仅向身体施用相对小量例如大约1毫升至大约20毫升的溶液或悬浮液，那么通常使用注射溶液。如果施用较大量溶液或悬浮液例如一升或更多升，那么通常使用输注溶液。因为，不同于输注溶液，在注射溶液的情况中仅施用几毫升，所以在注射剂中与血液或组织液在pH和渗透压上的小差别本身不值得注意、或者仅就疼痛感觉而言值得轻微程度的注意。因此，通常不需要在使用前稀释根据本发明的制剂。然而，在施用相对大量的情况中，应当在临施用前将根据本发明的制剂稀释到可以获得至少大约等渗的溶液的程度。等渗溶液的实例为0.9％浓度的氯化钠溶液。在输注剂的情况中，可以用例如无菌水进行稀释，而施用可以通过例如所谓的通路(bypass)进行。
下列图、表、序列和实施例将解释本发明，但不限制本发明的范围。
附图简述
图1显示具NCBI号NM_053046的人EGLN2基因的核酸序列。下划线为用来扩增在470位(粗体)具遗传变异C→T的遗传部分的引物。
图2显示衍生自具NCBI号NM_053046的核酸序列的人EGLN2的氨基酸序列。该EGLN2蛋白质中58位的氨基酸以粗体显示。
图3显示在58位含有亮氨酸的人EGLN2变体的氨基酸序列。该EGLN2蛋白质中58位的氨基酸以粗体显示。
图4显示在470位含有苏氨酸的人EGLN2变体基因的核酸序列。
图5显示在患者组中EGLN2在参考序列NM_053042.2的470位的基因型对冠心病的发生年龄的影响，其中所述基因型导致EGLN2蛋白质58位氨基酸的改变。低于0.05的P值为统计学上相关的。
序列描述
SEQ ID NO：1显示具NCBI号NM_053046的人EGLN2蛋白质的核酸序列。
SEQ ID NO：2显示衍生自具NCBI号NM_053046的核酸序列的人EGLN2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示在58位含有亮氨酸的人EGLN2变体的氨基酸序列。
SEQ IN NO：4显示在470位含有苏氨酸的人EGLN2变体的核酸序列。
SEQ ID NO 5：显示具有参考序列NM_053046.2.的444-463位核苷酸的第一引物序列。
SEQ ID NO 6：显示具有参考序列NM_053046.2.的504-521位碱基的互补序列的第二引物序列。
实施例
通过测序检测和分析SNP
扩增用的寡核苷酸(引物)：
下列引物用来检测具索引号NM_053046.2的EGLN2序列在470位从C到T的核苷酸交换：
引物1：5′-CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG-3′(参考序列NM_053046.2的核苷酸444-463；SEQ ID NO：5)；
引物2：5′-GGGCTGGCAGTGGTAGAG-3′(参考序列NM_053046.2的504-521碱基的互补序列；SEQ ID NO：6)。
用于扩增的PCR实验程序：
所用试剂购自Applied Biosystems(Foster City，USA)：20ng基因组DNA；1单位TaqGold DNA聚合酶；1×Taq聚合酶缓冲液；500μM dNTP；2.5mM MgCl2；上述扩增引物对每个引物各200nM；H2O加至5μl。
鉴定基因型的PCR扩增程序：
95℃10分钟×1个循环
95℃30秒
70℃30秒×2个循环；
95℃30秒
65℃30秒×2个循环；
95℃30秒
60℃30秒×2个循环；
95℃30秒
56℃30秒
72℃30秒×40个循环；
72℃10分钟
4℃30秒×1个循环；
用于微测序和检测SNP的实验程序
所用试剂购自Applied Biosystems(Foster City，USA)。2μl纯化的PCR产物，1.5μl BigDye-Terminator试剂盒，200nM上述测序引物；H2O加至10μl。
用于测序的扩增程序：
96℃2分钟×1个循环；
96℃10秒
55℃10秒
65℃4分钟×30个循环；
72℃7分钟
4℃30秒×1个循环；
测序产物的分析：
首先用Sequenz分析软件(Applied Biosystems，Foster City，USA)分析序列来获得初步数据，然后用软件Phred，Phrap，Polyphred und Consed处理。Phred，Phrap，Polyphred und Consed由华盛顿大学的Phil Green编写(http://www.genome.washington.edu)。
结果
该组个体的特征
表1显示所研究的该组个体的特征
表1
  n   ％
 总数   2074
 性别   女性   603   29.07
  男性   1471   70.93
 年龄   61.8(+/-10.5)
 BMI(体重指数)   29.1(+/-4.4)
 血压   1214   58.7
 吸烟者   1372   66.41
 II型糖尿病   361   17.46
 心肌梗塞   830   40.59
 中风   145   7.01
EGLN2基因变体的频率和分布
表2显示EGLN2基因在参考序列NM_053046.2的470位的遗传变体在所研究的该组患者中的频率和分布。
表2
  频率   百分数
  EGNL2-C470C(EGNL2Ser58Ser)   1253   96.31
  EGNL2-C470T(EGNL2Ser58Leu)   47   3.61
  EGNL2-T470T(EGNL2Leu58Leu)   1   0.08
  缺失值   773
在下文中，仅考虑具EGLN2-C470C(EGLN2Ser58Ser)和EGLN2-C470T(EGLN2Ser58Leu)的个体。
EGLN2变体对早发性心肌梗塞的发生的影响
表3显示在研究的患者组中EGLN2在参考序列NM_053046.2的470位的基因型对早发性心肌梗塞(男性低于55岁，并且女性低于60岁)和中风/PRIND(长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损)/TIA(短暂性局部缺血发作)的发生的影响。P值小于0.05为统计学上相关的。
表3
结果：
1.相比具EGLN2-C470T的患者，具EGLN2-C470C的患者显示统计学上更高的早发性心肌梗塞发病率。
2.相比具EGLN2-C470C的患者，具EGLN2-C470T的患者显示显著增加的遭受中风、PRIND和/或TIA的风险。
EGLN2变体对冠心病患者年龄的影响
图5显示在患者组中EGLN2在参考序列NM_053042.2的470位的基因型对冠心病的发生年龄的影响。
结果：
发现，相比具EGLN2-C470T(EGLN2 Ser58Leu)的患者年龄，具EGLN2-C470C(EGLN2 Ser58Ser)的患者年龄与冠心病的早发显著相关。
结论：
编码EGLN2的基因的遗传变体和/或上述蛋白质EGLN2之间在统计学上的显著相关性清楚地指明，在血栓栓塞病和/或冠心病的发生中涉及所述遗传变体。因此，所述遗传变体是用于预后血栓栓塞病和/或冠心病、尤其是预后早发性心肌梗塞和/或中风、PRIND和/或TIA的生物标记。
序列表
SEQ ID NO：1
   1 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc cttttttttt ttcctttctc
  61 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggact tggggaccag
 121 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctg ccctgcctca ccctgcccca
 181 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcg gaggaggagg cggaggaggg
 241 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccggggg atgaagacac tgctgccatg
 301 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctcc ctcagttacc agggtcttcg
 361 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgg gagtggagag ttacctgccc
 421 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgccta gtgaggcctc ggcagggagt
 481 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagcc ctcttcggga cggttttggc
 541 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaag gcgctgcagc gctggtcacc
 601 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctg aggcccccaa acggaaatgg
 661 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggc cctgggccag gcaagagaac
 721 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgca gcagtggcag tggtgaggcc
 781 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccg agcgcctggc cctggactat
 841 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaagg acagcttcct gggggcagca
 901 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaac ggggtgggcg cctgcgagac
 961 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagca tccgtgggga ccagattgcc
1021 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtg ccctcatggc ccatgtggac
1081 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatg tcatcaacgg gcgcaccaag
1141 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacg taaggcacgt tgacaatccc
1201 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctga atcagaactg ggacgttaag
1261 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggc ccgtggtagc caacatcgag
1321 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggc ggaaccccca cgaggtgaag
1381 ccagcctatg ccaccaggta cgccatcact gtctggtatt ttgatgccaa ggagcgggca
1441 gcagccaaag acaagtatca gctagcatca ggacagaaag gtgtccaagt acctgtatca
1501 cagccgccta cgcccaccta gtggccagtc ccagagccgc atggcagaca gcttaaatga
1561 cttcaggaga gccctgggcc tgtgctggct gctccttccc tgccaccgct gctgcttctg
1621 actttgcctc tgtcctgcct ggtgtggagg gctctgtctg ttgctgagga ccaaggagga
1681 gaagagacct ttgctgcccc atcatggggg ctggggttgt cacctggaca gggggcagcc
1741 gtggaggcca ccgttaccaa ctgaagctgg gggcctgggt cctaccctgt ctggtcatga
1801 ccccattagg tatggagagc tgggaggagg cattgtcact tcccaccagg atgcaggact
1861 tggggttgag gtgagtcatg gcctcttgct ggcaatgggg tgggaggagt acccccaagt
1921 cctctcactc ctccagcctg gaatgtgaag tgactcccca acccctttgg ccatggcagg
1981 caccttttgg actgggctgc cactgcttgg gcagagtaaa aggtgccagg aggagcatgg
2041 gtgtggaagt cctgtcagcc aagaaataaa agtttacctc agagctgcaa aaaaaaaaaa
2101 aaaaaaaaaa a
SEQ ID NO：2
MDSPCQPQPLSQALPQLPGSSSEPLEPEPGRARMGVESYLPCPLLPSYHCPGVPSEASAGSGTPRA
TATSTTASPLRDGFGGQDGGELRPLQSEGAAALVTKGCQRLAAQGARPEAPKRKWAEDGGDAPSPS
KRPWARQENQEAEREGGMSCSCSSGSGEASAGLMEEALPSAPERLALDYIVPCMRYYGICVKDSFL
GAALGGRVLAEVEALKRGGRLRDGQLVSQRAIPPRSIRGDQIAWVEGHEPGCRSIGALMAHVDAVI
RHCAGRLGSYVINGRTKAMVACYPGNGLGYVRHVDNPHGDGRCITCIYYLNQNWDVKVHGGLLQIF
PEGRPVVANIEPLFDRLLIFWSDRRNPHEVKPAYATRYAITVWYFDAKERAAAKDKYQLASGQKGV
QVPVSQPPTPT
SEQ ID NO：3
MDSPCQPQPLSQALPQLPGSSSEPLEPEPGRARMGVESYLPCPLLPSYHCPGVPSEALAGSGTPRA
TATSTTASPLRDGFGGQDGGELRPLQSEGAAALVTKGCQRLAAQGARPEAPKRKWAEDGGDAPSPS
KRPWARQENQEAEREGGMSCSCSSGSGEASAGLMEEALPSAPERLALDYIVPCMRYYGICVKDSFL
GAALGGRVLAEVEALKRGGRLRDGQLVSQRAIPPRSIRGDQIAWVEGHEPGCRSIGALMAHVDAVI
RHCAGRLGSYVINGRTKAMVACYPGNGLGYVRHVDNPHGDGRCITCIYYLNQNWDVKVHGGLLQIF
PEGRPVVANIEPLFDRLLIFWSDRRNPHEVKPAYATRYAITVWYFDAKERAAAKDKYQLASGQKGV
QVPVSQPPTPT
SEQ ID NO：4
  1 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc cttttttttt ttcctttctc
 61 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggact tggggaccag
121 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctg ccctgcctca ccctgcccca
181 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcg gaggaggagg cggaggaggg
241 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccggggg atgaagacac tgctgccatg
301 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctcc ctcagttacc agggtcttcg
361 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgg gagtggagag ttacctgccc
421 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgccta gtgaggcctt ggcagggagt
481 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagcc ctcttcggga cggttttggc
541 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaag gcgctgcagc gctggtcacc
601 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctg aggcccccaa acggaaatgg
661 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggc cctgggccag gcaagagaac
721 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgca gcagtggcag tggtgaggcc
781 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccg agcgcctggc cctggactat
 841 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaagg acagcttcct gggggcagca
 901 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaac ggggtgggcg cctgcgagac
 961 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagca tccgtgggga ccagattgcc
1021 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtg ccctcatggc ccatgtggac
1081 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatg tcatcaacgg gcgcaccaag
1141 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacg taaggcacgt tgacaatccc
1201 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctga atcagaactg ggacgttaag
1261 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggc ccgtggtagc caacatcgag
1321 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggc ggaaccccca cgaggtgaag
1381 ccagcctatg ccaccaggta cgccatcact gtctggtatt ttgatgccaa ggagcgggca
1441 gcagccaaag acaagtatca gctagcatca ggacagaaag gtgtccaagt acctgtatca
1501 cagccgccta cgcccaccta gtggccagtc ccagagccgc atggcagaca gcttaaatga
1561 cttcaggaga gccctgggcc tgtgctggct gctccttccc tgccaccgct gctgcttctg
1621 actttgcctc tgtcctgcct ggtgtggagg gctctgtctg ttgctgagga ccaaggagga
1681 gaagagacct ttgctgcccc atcatggggg ctggggttgt cacctggaca gggggcagcc
1741 gtggaggcca ccgttaccaa ctgaagctgg gggcctgggt cctaccctgt ctggtcatga
1801 ccccattagg tatggagagc tgggaggagg cattgtcact tcccaccagg atgcaggact
1861 tggggttgag gtgagtcatg gcctcttgct ggcaatgggg tgggaggagt acccccaagt
1921 cctctcactc ctccagcctg gaatgtgaag tgactcccca acccctttgg ccatggcagg
1981 caccttttgg actgggctgc cactgcttgg gcagagtaaa aggtgccagg aggagcatgg
2041 gtgtggaagt cctgtcagcc aagaaataaa agtttacctc agagctgcaa aaaaaaaaaa
2101 aaaaaaaaaa a
SEQ ID NO：5
1CTGTCCAGGA GTGCCTAGTG
SEQ ID NO：6
1GGGCTGGCAG TGGTAGAG

Claims (22)

1. EGLN2蛋白质，其含有根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
2. 编码根据权利要求1的EGLN2蛋白质的核酸。
3. 权利要求2的核酸，其含有根据SEQ ID NO：4的核酸序列。
4. 载体，优选表达载体，其含有根据权利要求2或3的核酸。
5. 宿主细胞，其含有根据权利要求2或3的核酸或者含有根据权利要求4的载体。
6. 转基因动物，其含有根据权利要求2或3的核酸或者含有根据权利要求4的载体。
7. 抗体，其可以特异地结合根据权利要求1的EGLN2蛋白质。
8. 产生根据权利要求1的EGLN2蛋白质的方法，其中在适宜培养基中培养根据权利要求5的细胞、并任选地从细胞或培养基中分离该EGLN2蛋白质。
9. 筛选含有根据SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质的调节剂的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)提供所述EGLN2蛋白质或编码所述EGLN2蛋白质的核酸，
(b)提供测试化合物，和
(c)测定或检测测试化合物对所述EGLN2蛋白质或EGLN2基因的影响。
10. 根据权利要求9中所述的方法，其中测试化合物以化学化合物文库的形式提供。
11. 根据权利要求9或10的方法，其中在多相或均相试验中测定或检测测试化合物对EGLN2蛋白质或EGLN2基因的影响。
12. 根据权利要求9-11中任意一项所述的方法，其中所述方法在阵列上进行。
13. 根据权利要求9-12中任意一项所述的方法，其中所述方法用全细胞进行。
14. 根据权利要求9-13中任意一项所述的方法，其中所述方法在机器人系统中进行。
15. 根据权利要求9-14中任意一项所述的方法，其中所述方法应用微流体学进行。
16. 根据权利要求9-15中任意一项所述的方法，其中所述方法为高通量筛选方法。
17. 含有根据SEQ ID NO：2或3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸在生产预防或治疗血栓栓塞病和/或冠心病的药物中的用途。
18. 根据权利要求17中所述的用途，其中所述的血栓栓塞病选自中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(PRIND)和/或短暂性局部缺血发作(TIA)。
19. 根据权利要求17中所述的用途，其中所述的冠心病为心肌梗塞。
20. 根据权利要求17或18中所述的用途，其中所述的含有根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸用来生产预防或治疗中风、PRIND和/或TIA的药物。
21. 根据权利要求17或19中所述的用途，其中所述的含有根据SEQ IDNO：2的氨基酸序列的EGLN2蛋白质或编码该EGLN2蛋白质的核酸用来生产预防或治疗心肌梗塞，尤其是早发性心肌梗塞的药物。
22. 生产治疗血栓栓塞病和/或冠心病的药物的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)实施根据权利要求9-16中任意一项所述的方法，
(b)分离经测定或检测适宜于治疗血栓栓塞病和/或冠心病的测试化合物，和
(c)将该经测定或检测的测试化合物用一种或多种可药用载体或辅助物质进行配制。
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