KR101309578B1 - 시스테인 프로테아제 선택성을 갖는 다이타이로신 화합물 및 이를 이용한 시스테인 프로테아제의 검출방법 - Google Patents

시스테인 프로테아제 선택성을 갖는 다이타이로신 화합물 및 이를 이용한 시스테인 프로테아제의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시스테인 프로테아제 선택성을 갖는 다이타이로신 화합물 및 이를 이용한 시스테인 프로테아제의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 형광단으로 다이타이로신을, 소광제로 이소니아지드를 사용하여 구조가 간단하고 생산단가가 저렴한 형광 프로브를 제공하며, 상기 형광 프로브는 시스테인 프로테아제를 선택적으로 검출할 수 있어 상기 프로테아제가 고 발현되는 질환을 진단할 수 있다.

Description

시스테인 프로테아제 선택성을 갖는 다이타이로신 화합물 및 이를 이용한 시스테인 프로테아제의 검출방법{Dityrosine compounds having selectivity for cysteine proteases and method for monitoring cysteine proteases using the same}
본 발명은 화학센서로 사용할 수 있는 시스테인 프로테아제 선택성을 갖는 다이타이로신 화합물 및 이를 이용한 시스테인 프로테아제의 검출방법에 관한 것이다.
프로테아제는 단백질과 폴리펩타이드에서 펩타이드 결합을 선택적으로 분해하는 효소이다. 프로테아제는 광범위한 생리과정, 예를 들어, 혈액응고, 호르몬 활성화 및 성숙화, 단백질 소화, 어팝토시스, 수정, 생장 분화 및 세포신호화 등에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, 몇몇 논문들에서 프로테아제는 HIV 등의 바이러스 감염, 심혈관 질환, 암, 알츠하이머 질환 및 염증 질환 같은 많은 질병들과 연관되어 있다고 말하고 있다. 프로테아제와 질병 간의 관련성으로 인해, 지난 수십 년 간 빠르고, 민감하고 특이적인 프로테아제 분석 물질의 합성에 대한 요구는 상당히 증가하였다.
요즘, 고도의 민감한 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 분석 물질을 개발하기 위해 형광 염료를 이용하여 프로테아제의 특이 결합 프로파일을 나타내는 많은 합성 펩타이드들이 제조되었다. 이들 FRET 분석 물질은 도너(형광단) 및 수용체(소광제)를 갖고 있다. 2개의 발색단이 가까이 존재할 경우, 상기 소광제는 형광단의 방출 강도를 감소시킨다. 프로테아제에 의한 합성 펩타이드의 가수분해 시, 형광단과 소광제가 분리되고, 형광단의 형광이 회복된다. 그러나, 합성 펩타이드의 제조 과정은 자동화된 고체-상 펩타이드 합성 장비를 필요로 하고, 이러한 합성 과정은 비싸고 복잡하다.
본 발명자들은 프로테아제 분석 물질을 위한 후보물질로 간단한 구조를 갖는 다이타이로신을 기반으로 한 화합물을 합성하였다. 다이타이로신은 정상적인 포스트트랜스레이션 과정의 결과로서 형성된 특이한 아미노산으로, 40년 전에 최초로 알려졌다. 또한, 다양한 조건 및 생물학적 시스템 하에서 산화/질화 스트레스 시 발견된다. 다이타이로신은 315 nm(알칼리 조건) 또는 284 nm(산성 조건) 흡수 밴드 내에서 여기 시 측정할 수 있는 400 내지 420 nm 범위를 갖는 형광성을 갖고 있다. 다른 산화 산물과는 달리, 다이타이로신은 산소 및/또는 높은 pH에 노출에 의해 변성되지 않으며, 이러한 안정성은 용해 효소에 의한 가수분해에 대한 내성을 제공한다. 다이타이로신의 형광 및 안정성으로 인해 많은 연구자들이 UV 및 감마선 조사, 노화, 및 산소 자유 라디칼, 이산화질소 및 지질 과산화물에 대한 노출 동안 산화적으로 변형된 단백질의 중요한 바이오마커로서 다이타이로신을 이용하였다. 그러나, 프로테아제를 분석하기 위한 목적으로 다이타이로신을 이용하는 시도는 보고된 바 없다.
본 발명의 목적은 기존의 FRET 분석 물질들과 비교하여, 다이타이로신을 형광단으로 하여 합성 펩타이드를 대신하고, 이소니아자이드를 소광제 분자로 사용하여 구조가 간단하면서도 시스테인 프로테아제를 선택적으로 검출할 수 있는 신규 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112011033679194-pat00001

상기 식에서,
R은 아민 보호기를 나타내고,
R1은 하이드록시기, 또는
Figure 112011033679194-pat00002
를 나타낸다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112011033679194-pat00003

[화학식 3]
Figure 112011033679194-pat00004

[화학식 1]
Figure 112011033679194-pat00005

상기 식에서,
R은 아민 보호기를 나타내고,
R1은 하이드록시기, 또는
Figure 112011033679194-pat00006
를 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 센서를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 고 발현 질환 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 억제물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명은 형광단으로 다이타이로신을, 소광제로 이소니아지드를 사용하여 구조가 간단하고 생산단가가 저렴하며 시스테인 프로테아제를 선택적으로 검출할 수 있는 형광 프로브를 제공하는 효과가 있다.
또한, 상기 형광 센서는 시스테인 프로테아제 고 발현 질환을 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 다이타이로신 기반 형광 프로브의 합성 과정(a)과, 상기 화합물의 구조 및 프로테아제의 분해 부위를 나타낸 것이다(b).
도 2는 프로테아제에 의한 본 발명의 다이타이로신 기반 형광 프로브의 가수분해를 나타낸 것이다.
도 3은 25℃에서 인산염 완충용액에서 다이타이로신(-●-) 및 본 발명의 다이타이로신 기반 형광 프로브(-◇-)의 형광 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 25℃에서 인산염 완충용액에서 파페인에 의한 본 발명의 다이타이로신 기반 형광 프로브의 농도별 가수분해 결과와(a), 파페인에 대한 본 발명의 다이타이로신 기반 형광 프로브의 Lineweaver-Burk 곡선(b)을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure 112011033679194-pat00007

상기 식에서,
R은 아민 보호기를 나타내고,
R1은 하이드록시기, 또는
Figure 112011033679194-pat00008
를 나타낸다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"아민 보호기"는, 통상의 유기합성 시 아민기에 결합하여 특정 기능기의 화학적 선택성을 제공할 수 있는 보호기의 일종을 의미한다. 상기 아민 보호기는 공지의 아민 보호기, 예를 들어, 카보벤질록시기, p-메톡시벤질 카보닐기, 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 아세틸기, 벤질기, 카바메이트기 등을 가리킨다. 또한, 상기 아민 보호기는 카르복실기로 개질된 친수성 또는 소수성 화합물, 또는 아미노산이 아민기와 결합하여 보호기 역할을 수행할 수도 있다. 상기 친수성 또는 소수성 화합물로, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리스티렌, 폴리아이소피렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 이들의 유도체, 또는 이들의 공중합체 등일 수 있다.
"아미노산 모이어티"란 아미노산의 탄소에 결합되어 있는 사이드 체인을 의미하는 것으로, 공지의 아미노산 종류, 예를 들어, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산 등의 아미노기와 카르복시기를 제외한 사이드 체인 부분을 포함할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로는,
R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며,
R1은
Figure 112011033679194-pat00009
를 나타내는 화합물 일 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 형광성을 갖는 다이타이로신의 말단 작용기인 하이드록시 또는 카르복실기와 직접 또는 가교성 결합을 통해 상기 형광을 소거하는 소광제 화합물이 결합되어 시스테인 프로테아제를 검출할 수 있는 프로브로 사용할 수 있는 복합형 고분자인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 화합물에 있어서, 상기 다이타이로신은 말단의 카르복시기의 화학적 선택성을 위해 말단 아민기에 아민 보호기가 결합된 형태이거나, 상기 아민기와 아마이드 결합을 통해 친수성 또는 소수성 화합물, 또는 아미노산 등이 결합되어 아민기가 블라킹되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 화합물에 있어서, 화학식 1의 R1에 해당하는 소광제 화합물을 적어도 하나 포함할 수 있다. 상기 소광제 화합물은 말단의 아민기와 다이타이로신의 카르복시기가 반응하여 펩타이드 결합을 형성하며, 상기 결합은 다이타이로신의 일 말단 또는 양 말단에 형성될 수 있다.
상기 다이타이로신과 소광제 화합물의 펩타이드 결합을 통해 다이타이로신의 형광성이 사라진다. 상기 펩타이드 결합 부위는 시스테인 프로테아제가 분해할 수 있는 인식 부위로서, 시스테인 프로테아제에 의한 분해를 통해 다이타이로신으로부터 소광제 화합물이 제거되어 다이타이로신의 형광성이 회복된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 시스테인 프로테아제 존재 여부에 따라 분해에 의한 형광 강도의 증가를 나타내므로 시스테인 프로테아제를 형광 검출할 수 있어 본 발명의 화합물은 시스테인 프로테아제 검출을 위한 형광센서로 사용할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure 112011033679194-pat00010

[화학식 3]
Figure 112011033679194-pat00011

[화학식 1]
Figure 112011033679194-pat00012

상기 식에서,
R은 아민 보호기를 나타내고,
R1은 하이드록시기, 또는
Figure 112011033679194-pat00013
를 나타낸다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 촉매 및 가교제 하에서 양 말단의 아민기가 블라킹되어 있는 상기 화학식 2의 다이타이로신과 상기 화학식 3의 이소니아지드의 반응을 통해 제조할 수 있다.
상기 다이타이로신은 말단 카르복시기의 최적 반응을 위해 양 말단의 아민기가 보호기로 보호되어 있거나, 블라킹되어 있는 다이타이로신을 사용하는 것이 좋다.
상기 다이타이로신의 블라킹은 아민 보호기를 도입하거나, 다이타이로신의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 화합물을 처리하여 수행할 수 있다.
상기 아민 보호기의 종류는 공지의 아민 보호기를 사용할 수 있어 특별히 제한하지 않으며, 도입 방법 역시 공지의 방법을 수행할 수 있다.
상기 다이타이로신의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 화합물은 카르복시기로 개질된 친수성 또는 소수성 화합물, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하거나, 아미노산 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 다이타이로신과 결합하는 화학식 3의 소광제 화합물은 다이타이로신의 말단 작용기와 결합할 수 있는 작용기를 포함하거나, 상기 작용기를 포함하도록 말단이 개질 및 활성화될 수 있는 소광제 화합물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 하기 화학식 3으로 표시되는 이소니아지드일 수 있다.
상기 다이타이로신과 소광제 화합물의 결합 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제는 다이타이로신 또는 화학식 3의 소광제 화합물의 말단 작용기를 아실 할라이드(Cl, F), 아실아지드, 활성화된 에스테르, 아실아이소우레아(카르보다이이미드) 언하이드라이드, 아실록시포스포리움 양이온, 아실우론니움 양이온의 형태로 활성화시키기 위해 사용할 수 있다.
상기 촉매로 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, CMC(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide), 또는 DIC(diisopropyl carbodiimide)) 등의 카르보다이이미드계 화합물 및 NHS 또는 sulfo-NHS, 카르보다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole), 또는 우드워드 리에이젼트 K(woodward's reagent K) 등을 사용할 수 있다.
상기 가교제로, DSP(Dithiobis(succinimidylpropionate)), DTSSP(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), DSS(Disuccinimidyl suberate), BS3(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), EGS(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)), DSC(N,N'-Disuccinimidyl carbonate) 등의 Homobifunctional 가교제, 또는, SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SMPT(Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluene), SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate) 등의 heterobifunctional 가교제를 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 화학식 3의 화합물의 아민기를 카보디이미드계 화합물과 NHS를 이용하여 활성화된 에스테르 형태로 만들고 이를 다이타이로신의 카르복실기와 반응시킴으로써 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, homofunctional 가교제 중 하나인 DSC를 이용하여 화학식 3의 아민기를 활성화된 에스테르 형태로 만든 후 다이타이로신의 아민기와 반응시켜 우레아 결합을 시킬 수 있다. 상대적으로 입체장애(steric hindrance)가 큰 다이타이로신의 하이드록시기는 다이타이로신 간의 결합에는 참여하지 않는다.
또한, 상기 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 또는 다이옥산(1,4-dioxane) 등의 용매에서 상온에서 교반하면서 실시할 수 있다. 보다 바람직하게는, 디메틸포름아마이드를 사용할 수 있는데, NHS로 활성화된 카르복실기는 디메틸포름아마이드에서 아민기와의 반응성이 매우 강하기 때문이다.
상기 반응 결과, 24시간 내에 높은 수율로 다이타이로신의 일 말단(1분지) 또는 양 말단(2분지)에 소광제가 결합된 화합물을 얻을 수 있다.
상기 1 분지 또는 2 분지 화합물은 다이타이로신과 화학식 3의 화합물의 몰비를 조절함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 다이타이신의 말단 작용기(예를 들어, 카르복실기) 기준 1 mole에 대해 1 내지 3 mole의 몰 비로 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 1분지 화합물의 경우 다이타이신의 말단 작용기 기준 1 mole에 대해 약 1 mole, 2 분지 화합물의 경우는 약 2 내지 3 mole의 몰 비로 사용할 수 있다.
상기 반응 결과, 24시간 내에 높은 수율로 1 또는 2분지 화합물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 제조방법은 반응 후 제조된 화합물에 대해 용매를 이용한 침전법과 투석(dialysis), 실리카 컬럼(silica column), GPC(gel permeate chromatography), GFC(gel filtration chromatography), 또는 IEC(ion exchange chromatography)를 이용한 분리정제단계를 추가로 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 센서에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 시스테인 프로테아제에 의해 펩타이드 결합이 분해되면서 다이타이로신의 형광성이 회복되어 형광 세기가 증가하므로 시스테인 프로테아제를 선택적으로 검출하기 위한 형광센서로 사용할 수 있다.
하기 도 1에서와 같이, 형광 신호화는 다이타이로신과 소광제 화합물 간의 펩타이드 결합을 분해하면서 화학식 1의 화합물로부터 소광제가 분리되고 다이타이로신의 형광성이 회복되어 강한 형광성을 나타내는 턴-온 타입의 형광 신호화 특성을 나타낸다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 수용액에서 시스테인 프로테아제를 첨가함에 따라 농도의존적으로 400 내지 420 nm에서 선택적인 형광 증가를 나타내므로 상기 화학식 1의 화합물을 "턴-온(turn-on)" 타입의 형광 프로브(probe)로 사용하여 시스테인 프로테아제를 검출할 수 있다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 검출용 센서는 시스테인 프로테아제를 검출하고자 하는 시료용액과 혼합하여 시스테인 프로테아제의 유무 및 농도를 확인할 수 있는 통상의 키트로 제공될 수 있다.
상기 시스테인 프로테아제는 액티니다인(actinidain), 브로멜라인(bromelain), 칼페인(calpain), 카스파아제(caspase), 카텝신(cathepsin), Mir1-CP, 또는 파페인(papain) 등일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 시스테인 프로테아제를 검출하고자 하는 시료를 반응시키는 단계; 및
상기 시료에서 발생되는 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 시스테인 프로테아제의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 시스테인 프로테아제를 수용액 상태에서 검출할 수 있는 "턴-온(turn-on)" 타입의 센서로서 형광을 나타내지 않는 상태에서 시스테인 프로테아제를 감지하면 형광의 세기가 증폭되는 사실을 센서화시킨 타입이다.
본 발명의 시스테인 프로테아제 검출용 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물 외에 완충용액을 포함할 수 있다. 완충용액의 종류 및 농도는 특별히 제한되지 아니하나, 상기 시스테인 프로테아제 검출용 조성물의 적용 용도에 따라 적절히 변경할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로는, pH 3 내지 10의 완충용액일 수 있다. 가장 구체적으로는, NaCl 및 EDTA가 포함된 pH 3 내지 10의 인산염 완충용액을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물에 의한 시스테인 프로테아제의 검출은 형광 강도의 변화를 측정하는 것으로, 시스테인 프로테아제의 농도 의존적으로 400 내지 420 nm에서의 큰 폭으로 증가된 형광 강도를 나타내므로 이를 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 고 발현 질환 진단 키트에 관한 것이다.
시스테인 프로테아제는 질환, 특히 식도선암종 등의 암, 또는 퇴행성 신경질환에서 고 발현되므로 상기 화학식 1의 화합물은 시스테인 프로테아제의 형광 검출을 통해 상기 효소를 고 발현하는 질환을 진단할 수 있다.
상기 시스테인 프로테아제 고 발현 질환 진단은 정상세포의 시스테인 프로테아제의 형광 강도 대비 질환세포의 시스테인 프로테아제의 형광 강도를 비교함으로써 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 억제물질의 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 시스테인 프로테아제 및 시스테인 프로테아제 후보 억제물질이 포함된 시료와 반응시켜 시스테인 프로테아제 억제물질이 상기 효소의 활성을 억제하고, 상기 화학식 1의 화합물의 펩타이드 결합의 분해가 억제되므로, 형광 강도의 감소를 측정할 수 있어 이를 통해 시스테인 프로테아제 후보 억제물질을 스크리닝할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 대조군 시약(양성 및/또는 음성)과 함께 상기 화학식 1의 화합물을 투여 형태로 제형화한 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라, 당-코팅된 정제, 캡슐제, 엘릭서제 및 마이크로캡슐제로서 경구투여될 수 있으며, 또는 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체를 가지는 멸균 용액 또는 현탁제의 주사제 형태로 비경구 투여될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질(media), 구체적으로는 멸균수, 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향신제, 부형제, 비히클(vehicle), 보존제, 결합제등과 혼합될 수 있다. 상기 제제화에서 활성 성분의 양은 바람직한 범위 내에서 적절한 투여량으로 한다.
정제 및 캡슐제에 혼합될 수 있는 첨가제의 예는 젤라틴, 옥수수 녹말, 트라거캔스 고무 및 아라빅 고무와 같은 결합제; 크리스탈 셀룰로스와 같은 부형제; 옥수수 녹말, 젤라틴, 알긴산(alginic acid)과 같은 팽윤제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 설탕, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 및 페퍼민트, 가울테리아 아데노쓰릭스(Gaultheria adenothrix) 오일 및 체리와 같은 향신제이다.
단위-투여 형태가 캡슐일 경우, 오일과 같은 액상 담체가 또한 추가로 상기의 성분에 포함될 수 있다. 주사제용 멸균 합성물들은 주사제에 사용된 멸균수와 같은 비히클을 사용하는 정상 약물 제조법에 따라 제형화될 수 있다. 생리 식염수, 글루코스, 및 D-솔비톨, D-만니톨, D-만노스, 및 염화 나트륨과 같은 보조제를 포함하는 다른 등장액이 주사제의 수용액으로 사용될 수 있다. 이는 알코올, 구체적으로는 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알코올, 폴리솔베이트 80(TM) 및 HCO-50과 같은 비-이온성 계면 활성제와 같은 적합한 용해제와 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 키트 형태로 제조될 수 있어 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 포함될 수 있다. 상기 조성물의 분석 포맷은 당해 기술분야에 알려진 형광분석장치, 예를 들어, Perkin-Elmer LS55 luminescence spectrometer를 이용한 상대형광값이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> DBDY-(INH)2의 합성
N-Boc-L-타이로신 (98%), 호스래디쉬(HRP) 유래의 페록시다아제, 붕산(99%), 소듐 테트라보렉이트 디카하이드레이트(sodium tetraborate decahydrate)(99.5%), 우태아 췌장 유래의 키모트립신(chymotrypsin), 우태아 췌장 유래의 트립신(trypsin), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 유래의 서브틸리신(subtilisin), 파파야 라텍스(papaya latex) 유래의 파페인(papain), 돼지 위점막 유래의 펩신(pepsin), 바실러스 써모프로테오라이티쿠스 로코(Bacillus thermoproteolyticus rokko) 유래의 써모라이신(thermolysin), 우태아 췌장 유래의 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase A), 이소니아지드(INH), N,N-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(99%), N-하이드록시석신이미드(NHS), L-시스테인, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), Tris-HCl, 소듐 포스페이트 모노베이직, 소듐 포스페이트 다이베이직, 트리플루오로아세트산(TFA)(99%), N,N-디메틸포름아마이드(DMF)(99.8%), 디메틸 설폭사이드-d6 (DMSO-d6)(99.9%), 디메틸 설폭사이드, 2-머캅토에탄올(98%)은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 아세토니트릴 및 물 (HPLC 등급)은 Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실리카겔 60 (70-230 mesh)는 Merck Chemical. Co. (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 암모니아수(25-30%), n-프로판올(99%), H2O2(28%), 염화나트륨, 염화칼슘 및 염화메틸렌(99%)는 Duksan Pure Chemical Co. (Ansan, GyonggiDo, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
기공 크기가 1.2㎛인 Whatman GF/C 글래스 마이크로파이버 필터 멤브레인(Whatman, UK) 및 기공 크기가 0.2㎛인 Advantec PTFE 필터 멤브레인(Advantec, Japan)은 여과용으로 사용하였다.
(N,N'-diBoc-다이타이로신의 제조)
N,N'-diBoc-다이타이로신을 합성하기 위해, 0.1M 붕산염(borate buffer)(pH9.1)에서 5 mM BY(Boc-Tyrosine) 용액 1L를 제조하였다. HRP는 2260 purpurogallin units/L 활성도로 첨가하였다. 농도가 2.5mM이 되도록 과산화수소를 첨가하여 산화를 개시하였다. 반응 온도는 39℃에서 유지하였다. 20분 후, 2-머캅토에탄올을 5mM의 농도로 첨가하여 상기 반응을 종결하였다. DBDY는 45℃에서 진공 하에서 증발하여 100배 농축하였다. 침전된 완충용액 성분은 Whatman GF/C 글래스 마이크로파이버 필터 멤브레인을 통해 여과하여 제거하였다. 농축시킨 용액은 정제 전까지 4℃에서 저장하였다. 또한, 저장 동안 형성된 부가 침전물들은 여과하여 제거하였다.
DBDY의 정제를 위해, 농축시킨 반응 용액을 실리카겔 60 (70-230 mesh, Merck Chemical. Co. Darmstadt, Germany)이 포함된 컬럼(150×5 cm i.d.) 상에 로딩하였다. N-프로판올 및 암모니아수 혼합물(90:10 v/v)을 이동상으로 사용하였다.
분리는 60 mL/min의 유량 및 15℃ 이하의 온도에서 수행하였다. DBDY를 함유하는 분획을 수집하고 45℃에서 진공 증발을 통해 농축하였다. 수율은 35% 이상이었다.
(N,N'-diBoc-다이타이로신-(이소니아지드)2 (DBDY-(INH)2)의 합성)
N,N'-diBoc-다이타이로신(DBDY) 200mg (0.357mmol), 이소니아지드(INH) 294mg (2.142mmol) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS) 164mg (1.428mmol)를 N,N'-디메틸포름아마이드(DMF)에서 녹였다. 이들 물질들을 녹인 후, 같은 용매에 N,N′-디클로로헥실카보디이미드(DCC)를 첨가하였다. 실온에서 혼합 용액을 교반하고, 반응은 오버나이트 동안 교반하여 완성하였다. 반응이 끝난 후, 침전물, N,N'-디사이클로헥실우레아를 여과하고, 상기 여과물을 동결건조하였다. 그 후, 잔유물은 각각 물과 디클로로메탄으로 세척하여 노르스름한(yellowish-white) 고체를 210 mg 수득하였다.
(분석)
파페인에 의한 DBDY-(INH)2의 가수분해 산물은 UV 흡광 검출기(Waters 486, Waters Corp., USA)가 장착된 HPLC 시스템(Waters 510, Waters Corp., USA)을 사용하여 분석하였다.
분리는 용출액으로 10mM 암모늄 바이카보네이트 및 아세토니트릴 혼합 용액을 사용하여 C-18 컬럼 (5㎛의 입자 크기, 250mm×4.6mm, 80Å의 기공 크기, Phenomenex, USA)에서 실시하였다. 용출은 아세토니트릴의 직선 구배를 증가시키면서(0% 내지 60%) 15분 동안 실시하였다. 상기 용출액의 유량은 35℃에서 1mL/분에서 측정하였다.
N,N'-diBoc-다이타이로신-(이소니아지드)2 (DBDY-(INH)2) 및 N,N'-diBoc-다이타이로신(DBDY)의 형광은 여기 파장 284/320 nm 및 방출 파장 410 nm에서 Perkin-Elmer LS55 발광 분광계(luminescence spectrometer)에서 측정하였다.
완충용액의 pH는 pH 4, 7, 및 10의 완충용액으로 조정시킨 pH 미터(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 측정하였다.
DBDY-(INH)2의 구조는 Bruker Advance 500-MHz 핵자기공명 분광계(Bruker BioSpin Corp., Germany) 상에서 기록되는 1H NMR 스펙트럼을 기초로 하여 동정하였다. 분석 전에 DMSO에 DBDY-(INH)2 를 녹였다.
도 1에 나타난 바와 같이, DBDY-(INH)2는 Boc 보호 기술과 DCC 및 NHS 화학을 병합하여 합성하였다. 상기 합성 과정은 프로테아제를 분석하기 위한 물질을 제조하는 어떠한 다른 과정 보다 훨씬 간단하다. 더욱이, 이 신규한 화합물은 1일 이내에 쉽게 제조할 수 있다.
이 물질에서, N,N'-diBoc-다이타이로신(DBDY)은 DBDY-(INH)2가 프로테아제에 의해 가수분해될 때 특정 여기 파장에서 형광 빛을 방출하는 형광단의 역할이고, 이소니아지드(INH)는 DBDY의 형광을 사라지게 하는 소광제이다.
상기 화합물이 합성을 통해 펩타이드 결합을 형성하므로 프로테아제 분석 물질로서의 용도를 평가하였다.
<실시예 2> 프로테아제에 의한 DBDY-(INH)2의 가수분해
프로테아제 분석 물질로서 DBDY-(INH)2의 적합 여부를 평가하기 위해, 다양한 종류의 프로테아제를 이용하여 실험하였다. 이를 위해, 각 프로테아제의 대표 물질을 선정하였고, 특히, 세린 프로테아제의 대표로 키모트립신, 트립신 및 서브틸리신을, 시스테인 프로테아제의 대표로 파페린을, 아스파라진산 프로테아제의 대표로 펩신을 선택하였다. 써모라이신 및 카르복실펩티다아제 A는 메탈로프로테아제의 대표로 선택하였다. 이들 프로테아제 반응은 각각 최적 조건들에서 수행하였다.
구체적으로, DBDY-(INH)2의 스톡 용액은 DMSO(100μM, 250μM, 500μM)에서 제조하였고 4℃에서 저장하였다. 각 프로테아제 반응은 각각 0.1M NaCl이 포함된 50mM 인산염 완충용액(pH7.8, 25℃)(키모트립신), 50mM Tris-HCl buffer (pH7.5, 25℃)(트립신), 10mM CaCl2이 포함된 50mM Tris-HCl buffer (pH7.5, 37℃)(서브틸리신), 5mM L-시스테인, 300mM NaCl 및 2mM EDTA 이 포함된 50mM 인산염 완충용액(pH6.2, 25℃)(파페인), 10mM HCl 용액(pH2, 37℃)(펩신), 10mM CaCl2 및 2M NaCl이 포함된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.5, 37℃)(써모라이신), 500mM NaCl이 포함된 50mM Tris-HCl 완충용액(pH7.5, 25℃)(카르복실펩티다아제 A)의 최적 조건에서 실시하였다.
상기 프로테아제 스톡 용액(25μM) 20㎕를 4980㎕의 반응 완충용액에 첨가하였다. 그 후, 0.1μM의 프로테아제가 포함된 2955-2985㎕의 반응 완충용액을 25℃(키모트립신, 트립신, 파페인, 카르복시펩티다아제 A) 및 37℃(서브틸리신, 펩신, 써모라이신)에서 30분 동안 인규베이션 하였다.
열적 평형 후, 15-45㎕의 DBDY-(INH)2 스톡 용액(DMSO의 최종 농도가 1.5% 미만이 되도록 함)을 첨가하여 가수분해 반응을 시작하였다. N,N'-diBoc-다이타이로신(DBDY)의 형광 증가는 파페인과 펩신 반응에서는 λex=284nm 및 λem=410nm에서, 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 써모라이신 및 카르복시펩티다아제 A 반응에서는 λex=320nm 및 λem=410nm에서의 조건으로 Perkin-Elmer LS55 발광 분광계에서 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 시스테인 프로테아제인 파페인에 의한 상대 형광 증가는 다른 프로테아제 반응들에 의한 형광 증가에 비해 훨씬 컸다. 비록, 써모라이신 및 카르복실펩티다아제 A는 메탈로프로테아제에 속하기는 하나, 각각 두 번째 및 세 번째로 높은 형광 도를 나타냈다. 이들 강도는 파페인의 강도의 약 10%에 해당한다. 다른 프로테아제들은 형광의 유의적인 증가를 나타내지 않았다. 이 결과는 DBDY-(INH)2가 파페인 특이 분석 물질로 이용될 수 있음을 나타내는 것이다.
<실시예 3> 이소니아자이드에 의한 형광 소거
이소니아자이드가 결합된 DBDY의 형광 소거는 5mM L-시스테인, 300mM NaCl 및 2mM EDTA이 포함된 50mM 인산염 완충용액 (pH6.2, 25℃)로 구성된 파페인의 반응 완충용액에서 실시하였다. 이 조건은 DBDY-(INH)2가 파페인에 의해 선택적으로 분해되므로 선택된 것이다. DBDY, INH, DBDY-(INH)2의 형광 표준 곡선은 여기파장 284 nm에서 제조하였다(도 3).
도 3에 나타난 바와 같이, DBDY 및 DBDY-(INH)2 사이의 방출 강도는 엄청난 차이가 있음이 관찰되었다. 이 현상은 INH가 DBDY 형광의 강력한 소광제임을 나타내는 것이다. 또한, INH의 형광은 검출되지 않았다. 이러한 특징은 DBDY-(INH)2의 가수분해를 발광 스펙트로미터에서 측정할 때 INH에 의해 발생되는 백그라운드 신호를 염려할 필요가 없음을 나타내는 것이다.
결론적으로, 1μM의 DBDY-(INH)2의 가수분해는 1326 상대 형광 유닛(relative fluorescence units, rfu)에 의해 형광 강도를 발생한다.
<실시예 4> 파페인의 특이 분석 및 카이네틱 연구
도 2를 통해, DBDY-(INH)2가 파페인 특이 분석에 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, DBDY-(INH)2이 민감하고 빠른 파페인 분석에 이용될 수 있는지의 가능성을 입증하고자 한다. DBDY-(INH)2의 민감도를 평가하기 위해, 다양한 기질 농도에서 DBDY-(INH)2의 가수분해에 의해 생산되는 상대 형광 강도의 증가를 관찰하였다(도 4a). 각 농도별 데이터는 3반복으로 얻었다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 파페인 분석에 대한 DBDY-(INH)2의 검출 한계는 0.5μM보다 낮았다.
또한, Lineweaver-Burk 곡선에 의한 파페인에 대한 DBDY-(INH)2의 Km 값을 측정한 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 상기 신규하고 간단한 프로테아제 분석 물질인 DBDY-(INH)2는 다른 프로테아제 분석 물질들과 비교하여 6.91μM의 낮은 Km 값을 나타내었다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112013032590670-pat00014


    상기 식에서,
    R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며,
    R1은
    Figure 112013032590670-pat00037
    를 나타낸다.
  2. 삭제
  3. 촉매 및 가교제 하에서 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 용매에서 교반하면서 상온에서 반응시키는 단계를 포함하고,
    상기 촉매는 카르보다이이미드계 화합물(carbodiimide) 및 NHS 또는 sulfo-NHS, 카르보다이이미다졸(carbodiimidazole), 또는 우드워드 리에이젼트 K(woodward's reagent K) 중 적어도 하나이며,
    상기 가교제는 DSP(Dithiobis(succinimidylpropionate)), DTSSP(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), DSS(Disuccinimidyl suberate), BS3(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), EGS(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)), DSC(N,N'-Disuccinimidyl carbonate), SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SMPT(Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluene) 및 SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고,
    상기 용매는 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide) 및 다이옥산(1,4-dioxane)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure 112013032590670-pat00017


    [화학식 3]
    Figure 112013032590670-pat00018


    [화학식 1]
    Figure 112013032590670-pat00019


    상기 식에서,
    R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며, R1은
    Figure 112013032590670-pat00038
    를 나타낸다.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제3항에 있어서,
    화학식 3의 화합물은 화학식 2의 화합물의 말단 작용기 1 mole 당 1 내지 3 mole의 몰 비로 첨가하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 센서:
    [화학식 1]
    Figure 112013032590670-pat00021


    상기 식에서,
    R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며,
    R1은
    Figure 112013032590670-pat00039
    를 나타낸다.
  10. 삭제
  11. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112013032590670-pat00024


    상기 식에서,
    R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며,
    R1은
    Figure 112013032590670-pat00040
    를 나타낸다.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    pH 3 내지 10의 수용액을 더 포함하는 시스테인 프로테아제 검출용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    수용액은 NaCl 및 EDTA가 포함된 인산염 완충용액인 시스테인 프로테아제 검출용 조성물.
  15. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 암 또는 퇴행성 신경질환 진단 키트:
    [화학식 1]
    Figure 112013032590670-pat00027


    상기 식에서,
    R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며,
    R1은
    Figure 112013032590670-pat00041
    를 나타낸다.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 시스테인 프로테아제 억제물질의 스크리닝용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112013032590670-pat00030


    상기 식에서,
    R은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내며,
    R1은
    Figure 112013032590670-pat00042
    를 나타낸다.
  19. 삭제
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