KR101300233B1

KR101300233B1 - 비스페놀 ａ에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 기반 타겟물질의 검출방법

Info

Publication number: KR101300233B1
Application number: KR1020100013904A
Authority: KR
Inventors: 김소연
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-16
Filing date: 2010-02-16
Publication date: 2013-08-26
Also published as: EP2397550B1; WO2010093106A1; US8410256B2; JP5456796B2; JP2012517805A; WO2010093222A2; WO2010093222A3; US20120015354A1; EP2397550A4; EP2397550A2; KR20100093501A

Abstract

본 발명은 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 이를 이용한 비스페놀 A의 검출 및 제거방법과, 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 기반 타겟물질의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머는 nM 수준의 친화도를 가지고 있어 극미량의 비스페놀 A도 검출하는 것이 가능하며, 비스페놀 A와 하나의 메틸기 외에는 차이가 없는 비스페놀 B 등 다른 비스페놀 족에 대해서는 친화성을 보이지 않으면서 비스페놀 A에 대해서만 특이적으로 검출할 수 있는바, 종래 검출이 어려웠던 환경호르몬인 비스페놀 A의 검출 및 제거에 효과적이다. 아울러, 본 발명에 따른 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트는 직접적이고 간편한 방법으로서 일관성있는 재생산이 가능하며 낮은 비용으로 생산이 가능한 압타머를 이용함으로써 경제성을 높이는 장점이 있으므로 매우 유용하다.

Description

비스페놀 Ａ에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머 및 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 기반 타겟물질의 검출방법{Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to Bisphenol A and Method for Detecting Target Molecules Based on Anodic Aluminum Oxide Sensor Using Aptamers}

본 발명은 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 이를 이용한 비스페놀 A의 검출 및 제거방법과, 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 기반 타겟물질의 검출방법에 관한 것이다.

비스페놀 A는 폴리카보네이트나 에폭시 수지 같은 플라스틱 제조의 원료로서, 젖병, 치과에서 사용하는 레진, 음료수 캔의 코팅 등에 널리 사용되고 있다. 그러나, 이는 합성 에스트로겐으로 작용할 수 있는 내분비계 교란물질(endocrine disrupter)로서 이것이 유리되어 생물체에 흡수되면 내분비계의 정상적인 기능을 방해하거나 혼란케 하며, 극미량 존재하는 경우에도 생물축적으로 생식기능 저하, 성장장애, 기형 또는 암 등을 유발하는 심각한 장애를 일으킬 수 있는 환경호르몬이다. 그러므로, 자연 시스템에서 이러한 화학물질의 검출은 공중의 건강 및 환경 보호에 필수적이다.

그러나, 환경산업 및 식품산업에서의 미량 잔류 유해물질의 검사, 제약 산업에서의 안전성 평가 등에 있어 비스페놀 A 등 환경호르몬의 검출이 요청되어 왔음에도, 미량의 비스페놀 A를 검출하는데 많은 어려움이 있어왔다. 따라서, 이러한 비스페놀 A를 효과적으로 검출 및 제거할 수 있는 새로운 기술의 개발이 요구되고 있다.

한편, 압타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA분자로서, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 압타머는 검출분석 시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 일 요소로 이용될 수 있어 항체의 대체물질로 인식되어 오고 있다. 특히, 압타머는 항체와 달리 독소를 비롯한 다양한 유기물 및 무기물의 표적 분자로 이용될 수 있고, 일단 특정 물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리해내면 자동화된 올리고머 합성 방법으로 낮은 비용과 일관성으로 재생산이 가능한 바 경제적이었다. 이에 1996년 처음으로 형광표지된 앱타머를 이용하여 표적 단백질을 측정한 압타머 기반의 바이오센서가 개발된 이후로 이와 같은 앱타머의 장점과 구조적 특성을 기반으로 하여 다양한 압타머 바이오센서들이 개발되고 있으며 (김연석&구만복, NICE, 26(6): 690, 2008), 이와 함께 다양한 화학물질을 검출해 낼 수 있는 새로운 압타머의 발굴이 요청되고 있다.

한편, 용액 중에 있는 작은 분자를 민감하고 특이적으로 검출하기 위한 신규한 센서 플랫폼을 개발하는 것은 질병과 관련된 대사물질, 환경 오염물 및 식품 독소의 모니터닝에 매우 중요한 일이다. 최근까지 대사물질, 환경 오염물 및 독소와 같은 저분자량을 갖는 분석물의 분석은 일반적으로 GC/MS 또는 HPLC와 같은 복잡한 실험으로 진행되어 왔는데, 이는 숙련된 작업자조차도 오랜 시간이 걸리고 온-사이트 분석(on-site analysis)에 적용할 수 없는 문제점이 있었다 (Stales, C.A. et al, Environ . Toxicol . Chem ., 20:2450, 2001). 이에 현지에서의(on-site) 리얼-타임 검출에 성공하기 위해서는 작은 스케일의 장치 및 특이적으로 결합하는 시약이 요구되었다.

이에 본 발명자는 비스페놀 A를 효과적으로 검출하고 제거할 수 있도록 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리하고자 예의 노력한 결과, SELEX (Syetematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 공정을 통하여 비스페놀A에만 특이적으로 결합하는 압타머를 선별하고, 선별된 압타머가 다른 유사한 구조를 가지는 비스페놀 B를 포함한 비오염성 비스페놀에는 결합하지 않으며 비스페놀 A에만 특이적으로 결합함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 또한, AAO 센서에 압타머를 프로브로서 고정하고, 이에 시료를 첨가한 후 정전용량의 변화를 측정함으로써 무극성 저분자물질도 검출해 낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출용 조성물, 검출키트 및 검출센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 압타머를 이용한 비스페놀 A의 검출 및 제거방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 목적은 용액 상에 존재하는 저분자 물질도 검출해 낼 수 있는 새로운 타겟물질의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 8 내지 서열번호 34로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열과 90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열임을 특징으로 하는 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 압타머를 이용한 비스페놀 A의 검출 또는 제거 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출 또는 제거용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출키트 및 검출센서를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 (AAO, Anodic aluminum oxide) 센서 기반 타겟물질의 검출방법을 제공한다:

(a) 기판; 상기 기판상에 형성되고 나노크기의 구멍을 가지는 양극산화 알루미늄; 및 상기 양극산화 알루미늄의 표면을 코팅하는 금속을 포함하며, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 압타머가 상기 금속 표면에 프로브로서 고정되어 있는 AAO 센서에, 타겟물질을 함유하는 시료를 첨가하는 단계; 및

(b) 상기 타겟물질과 압타머가 결합하는 경우 발생하는 상기 AAO 센서의 정전용량의 변화를 측정하여 타겟물질을 검출하는 단계.

본 발명은 또한, 기판; 상기 기판상에 형성되고 나노크기의 구멍을 가지는 양극산화 알루미늄; 및 상기 양극산화알루미늄의 표면을 코팅하는 금속을 포함하는 양극산화 알루미늄(AAO) 센서와, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 타겟물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 이를 이용한 비스페놀 A의 검출방법 및 제거방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머는 nM 수준의 친화도를 가지고 있어 극미량의 비스페놀 A도 검출하는 것이 가능하며, 비스페놀 A와 하나의 메틸기 외에는 차이가 없는 비스페놀 B 등 다른 비스페놀 족에 대해서는 친화성을 보이지 않으면서 비스페놀 A에 대해서만 특이적으로 검출할 수 있는바, 종래 검출이 어려웠던 환경호르몬인 비스페놀 A의 검출 및 제거에 효과적이다.

아울러, 본 발명에 따른 압타머를 이용한 타겟물질의 검출방법 및 검출용 키트는 종래 검출이 어려웠던 저분자량 물질도 검출해 낼 수 있게 함으로써 용액 상에 존재하는 질병과 관련된 대사물질, 환경 오염물 및 식품 독소 등의 검출이 가능하게 하였으며, 직접적이고 간편한 방법으로서 일관성있는 재생산이 가능하며 낮은 비용으로 생산이 가능한 압타머를 이용함으로써 경제성을 높이는 장점이 있으므로 매우 유용하다.

도 1은 본 발명에 따른 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머의 선별 과정 및 비스페놀 A의 검출과정의 개략도이다.
도 2는 리얼타임 PCR 분석법에 의해 비스페놀 A 결합 컬럼 및 비결합 컬럼에 대한 친화도를 나타내는 그래프 및 선별된 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머 (#3 및 #12-5)의 2차 구조를 나타낸다.
도 3은 비스페놀 A 와 압타머 #3 의 결헙을 3차원 졸-겔 칩을 이용해서 확인한 결과를 나타낸다.
도 4은 2개의 비스페놀 A 압타머 #3 및 #12-5를 이용한 3 차원 졸-겔 칩의 샌드위치 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 비스페놀 A와 다른 비스페놀 족의 구조식(A) 및 각 화합물에 대한 비스페놀 A 압타머 #3의 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 trim된 압타머 (#3-tr1, #3-tr2, #3-tr3 및 #3-tr4)의 구조를 나타낸 그림이다.
도 7은 trim된 압타머 (#3-tr1, #3-tr2, #3-tr3 및 #3-tr4)의 비스페놀 A에 대한 결합력을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 다중채널 AAO 센서의 개략도이다.
도 9는 주파수를 0에서 100 헤르츠로 변화시켜 가면서 압타머를 센서에 결합시켰을 때와 비스페놀 A를 흘려넣었을 때의 정전용량을 비교한 결과이다.
도 10은 AAO 센서를 이용한 비스페놀 A의 검출결과를 나타내는 그래프로, (a)는 압타머를 결합시키지 않은 AAO 센서에서의 실험결과이고, (b)는 압타머를 결합시킨 AAO 센서에서의 정전용량 변화 결과를 나타낸다.
도 11은 압타머가 결합되어 있는 AAO 센서에 비스페놀 A를 1nm, 10nM, 및 100nM의 농도로 흘려보냈을 때 정전용량의 변화를 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 "압타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 이때, 상기 압타머가 RNA인 경우에는, 규정된 핵산서열에서 T는 U임을 특징으로 한다.

본원에서 "시료"란, 관심있는 타겟물질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물로, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.

본원에서 "90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열"이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90%이상 100%미만의 서열에 공통성이 있는 것으로 유사한 비스페놀 A 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.

본원에서 "양극 산화 알루미늄 (AAO, Anodic aluminum oxide)"이란 알루미늄을 전기화학적으로 산화시키는 양극산화(anodization)을 이용하여 표면에 균일한 규칙성을 가지는 나노 크기의 다공성 알루미나를 말한다.

본 발명은 일 관점에서, 다음의 서열번호 1 내지 서열번호 7로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머에 관한 것이다.

서열번호 1: 5'-CCTGAGKWAC TGYCC-3' (K=G 또는 T, W=A 또는 T, Y=T 또는 C)

서열번호 2: 5'-GCCGTTGGTG TGGTGGGCCY AGGGCCGGCG GCGCACAGCT GTTATAGACG YCTCCAGC-3' (Y=C 또는 T)

서열번호 3: 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGKTSGRG-3'(K=G 또는 T, S=C 또는 G, R=A 또는 G)

서열번호 4: 5'-ATCGARTKCC CSCGGCCG-3' (R=A 또는 G; K=G 또는 T; S=C 또는 G)

서열번호 5: 5'-GTATTGTCNT NCNNATCCTC GNNCTNGCTG TCNT-3' (N=A, T, C 또는 G)

서열번호 6: 5'-GCGGGTACCG TGCT-3'

서열번호 7: 5'-CGGTGGGTGG NNAGNTGNGA NA-3' (N=A, T, C 또는 G)

이때, 상기 압타머를 구성하는 총 뉴클레오티드의 수는 14~200nts일 수 있으나, 바람직하게는 14~63nts인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 8 내지 서열번호 18로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#31 5'-CGGCCCTAGG ATGA CCTGAG TACTGTCC CT CACCCCTACT TCCGCCACTG GCCCAACAGC-3' (서열번호 8)

#23 5'-TGCCTAGGAT GA CCTGAGTA CTGTCC AGGC TCCGACCTTG TCCCTGCCGC CACTCTCCCA-3' (서열번호 9)

#47 5'-GCGGACGGGC TCGGCTCACC TAGGATGA CC TGAGTACTGT CC CCGTGGCG CTAATTCGGG-3' (서열번호 10)

#50 5'-CGGCCCGCCC CTAGGATG AC CTGAGTACTG TCC GCGGGAC GGTATCGCTG AGACAGGTGC-3' (서열번호 11)

#41 5'-CGGCAGCCCT AGGATGA CCT GAGTACTGTC C GCGAAAGAC TCCATGGTAC CCGGTGCTTA-3' (서열번호 12)

#27 5'-GGGGGCGTCG NCCTAGGATG ACCTGAGTAC TGTCC GCACN CAGGGAGGAT GCATTGAC-3' (서열번호 13)

#45 5'-GTGTCCCCAC GTCCTAGGAT GA CCTGAGTA CTGTCC AATG CCGCTCCTCC CGATGCAGAC-3' (서열번호 14)

#11 5'-CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGA CCTGA G GT CTG C CC A ACGGTGTTTA GAACCCCTTG-3' (서열번호 15)

#12-3 5'-CGCAGCGCGC C CCTGAGTAC TGTCC GCCCA ACGGTGTGAC GGCCCTGCGA TCAACGATTG-3' (서열번호 16)

#12-4 5'-GGGCCGTCCT AGGATGA CCT GAGTACTGTC C GCCCAACGG TGTGACGGCC CTGCGATCAA-3' (서열번호 17)

#22 5'-CCCTCGC CCT GAGTACTGTC C CCCGTCCGT CCGGTGAGGG CCACTATCGC TAACTGATCA-3' (서열번호 18)

본 발명에서, 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 19 내지 서열번호 22로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#4 5'-AG GCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3' (서열번호 19)

#12-5 5'-CC GCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC-3' (서열번호 20)

#6 5'-CC GCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (서열번호 21)

#12-7 5'-CC GCCGTTGG TGTGGTGGGC C C AGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC-3' (서열번호 22)

본 발명에서, 상기 서열번호 3로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 23 내지 서열번호 25로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#12-2 5'- TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGAG-3' (서열번호 23)

#12-9 5'- TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGGGG-3' (서열번호 24)

#12-6 5'- TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGGTCGGG-3' (서열번호 25)

본 발명에서, 상기 서열번호 4로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 26 내지 서열번호 28로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#2 5'-GCCGACAGGG CATGGGACGC TATCAGCGGT GTCA ATCGAA TTCCCGCGGC CGCCATGCGG-3' (서열번호 26)

#14 5'-GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTCCAGCG TA ATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC-3' (서열번호 27)

#46 5'-GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCAC ATC GA G T G CCC C C GGCCGGTGCT-3' (서열번호 28)

본 발명에서, 상기 서열번호 5로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 29 또는 서열번호 30로 표시되는 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#12 5'- GTATTGTC A T T C AT ATCCTC G TG CT T GCTG TC C T CACCCC ACCCACCAGA ATGGAAA-3' (서열번호 29)

#13 5'-CCTG GTATTG TC T T G C CA AT CCTCG CC CT G GCTGTC T T AC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG-3' (서열번호 30)

본 발명에서, 상기 서열번호 6로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 31 또는 서열번호 32로 표시되는 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#48 5'-GTCGACTC GC GGGTACCGTG CT CAATGTCC CAATCCGGGG AAGCGTTTAG ACCCGCAGCC CAC-3' (서열번호 31)

#40 5'-GTCGCCACT G CGGGTACCGT GCT TGGGCNA CCGATGNACC NTGNNACCGT GTTTNGCC-3' (서열번호 32)

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7로 표시되는 핵산서열을 포함하는 핵산 압타머는, 다음의 서열번호 33 또는 서열번호 34로 표시되는 핵산서열임을 특징으로 할 수 있다.

#3 5'-C CGGTGGGTG G TC AG G TG G G A T A GCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3' (서열번호 33)

#32 5'-GGG CGGTGGG TGG CG AG T TG T GA G A CGCTG GAGGAGGTTG CTGCCCCCGG CACATTGGGA-3' (서열번호 34)

핵산 압타머는 단일가닥 DNA 또는 RNA로서 제공되는 것으로서, 본 발명에서 상기 핵산이 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

본 발명의 일 실시에에서는 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 서열번호 8 내지 34로 표시되는 핵산서열의 압타머를 SELEX 공정을 통하여 선별해 낸 다음, 리얼타임 PCR 방법 및 평형 여과법을 통하여 친화도를 측정하여, 상기 서열번호 8 내지 34로 표시되는 핵산서열이 비스페놀 A에 대하여 특이적으로 결합함을 확인하였다. 상기 서열번호 8 내지 34로 표시되는 핵산 서열인 비스페놀 A 압타머는 서열번호 1 내지 7과 같은 공통적으로 보존되는 영역을 가지며, 이에 이러한 공통적으로 보존되는 영역을 가지는 압타머는 비스페놀 A 에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 이러한 공통적으로 보존되는 영역의 존재는 상기 서열번호 8 내지 서열번호 34로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열과 90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열은 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머임을 의미한다. 그룹 1의 경우 서열번호 1의 공통서열을 가지는 11개의 압타머가 수득되었으며, 이들이 모두 비스페놀 A 에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 볼 때, 이들과 90% 이상의 상동성을 가지는 핵산 서열은 역시 비스페놀 A 에 특이적으로 결합할 수 있음은 자명하다고 할 것이다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 서열번호 8 내지 34로 표시되는 핵산 압타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 33으로 표시되는 핵산서열인 압타머 #3에 대하여 비스페놀 A 이외의 다른 비스페놀 족, 예를 들면 비스페놀 B(Bisphenol B, BPB), 4,4'-비스페놀(4,4'-Bisphsenol, BP), 6F 비스페놀 A(6F Bisphenol A, 6F) 등에 대한 실시예 2-2의 방법으로 친화성(Kd)을 측정한 결과, BPB의 경우, 비스페놀 A와 하나의 메틸 기 차이밖에 없음에도 불구하고, 압타머 #3은 BPB에는 친화성을 보이지 않았고, 비스페놀 A에 대해서만 특이적으로 친화성을 나타남을 확인하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서 압타머를 이용한 비스페놀 A의 검출방법에 관한 것이다. 상기 비스페놀 A는 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 서열번호 8 내지 34로 표시되는 핵산 압타머 중 가장 높은 친화도를 보인 서열번호 33으로 표시되는 핵산서열인 압타머 #3에 대하여 졸-겔 칩을 이용한 샌드위치-분석을 수행한 결과, 비스페놀 A 특이적으로 결합함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출센서에 관한 것이다.

상기 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 함유하는 검출 센서 시스템은, 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 비스페놀 A 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머는 또한, 비스페놀 A만을 특이적으로 검출하는바, 이를 포함하여 비스페놀 A의 검출 또는 제거용 조성물을 제공할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용한 비스페놀 A의 제거방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 바람직하게는 상기 압타머가 고정된 비드를 컬럼에 충진하고 비스페놀 A가 포함된 시료를 통과시켜 비스페놀 A를 제거할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 (AAO, Anodic aluminum oxide) 센서 기반 타겟물질의 검출방법에 관한 것이다:

(a)기판; 상기 기판상에 형성되고 나노크기의 구멍을 가지는 양극산화 알루미늄; 및 상기 양극산화 알루미늄의 표면을 코팅하는 금속을 포함하며, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 압타머가 상기 금속 표면에 프로브로서 고정되어 있는 AAO 센서에, 타겟물질을 함유하는 시료를 첨가하는 단계; 및

(b) 타겟물질과 압타머가 결합한 경우 발생하는 상기 AAO 센서의 정전용량의 변화를 측정하여 타겟물질을 검출하는 단계.

양극산화 알루미늄 (AAO, Anodic aluminum oxide) 이란 전기적 방법을 이용해 산화하는 알루미늄을 말한다. 알루미늄은 수직방향으로 규칙적인 정렬을 이룬 미세 나노기공을 가지는데 이는 전기적 산화과정을 거치면서 크기를 조절할 수 있다. 이러한 양극산화 알루미늄 표면에 금속 입자를 입힌 후 압타머를 결합시켜 여기에 선택적으로 비스페놀 A 와 같은 타겟물질이 반응하면 전압과 전류의 변화가 생기게 되고 이는 결국 정전용량의 변화를 일으켜 미량의 물질도 감지 가능한 나노바이오센서를 구현 할 수 있다. 본 발명을 제공하기 위하여 사용되는 AAO 센서로는 종래 알려진 어떠한 형태의 AAO 센서도 활용될 수 있다.

이때, 상기 양극 산화알루미늄 표면에 코팅되는 금속은 금인 것을 특징으로 하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 AAO 센서에의 압타머의 고정은 압타머의 일 말단에 결합된 기능기를 이용하여 수행될 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 압타머의 3'말단에 결합된 티올기가 양극산화 알루미늄 표면의 금과 공유결합을 이루어 AAO 센서의 표면에 결합되도록 하였다.

이때, 바람직하게는 상기 AAO 센서는 동시에 여러 물질의 검출이 가능하도록 도 8에 나타난 바와 같이, 다중채널로 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 각 채널에 서로 다른 압타머를 고정시켜 동시에 여러 물질을 검출하게 할 수 있다. 또는 각 채널에 서로 다른 시료를 흘러보냄으로써 동시에 여러 시료의 조사가 가능하도록 하는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 AAO 센서에 기반한 본 발명에 따른 검출방법이 용액 중의 저분자량의 무극성 물질도 검출해 낼 수 있는지 확인하기 위하여, 환경호르몬으로 잘 알려져 있으나 검출이 극히 어려운 것으로 알려져 온 비스페놀 A의 검출여부를 실험하였다. 그 결과, 용액 중의 비스페놀 A를 검출함을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 검출방법이 종래 용액 중 대사물질, 독소 등의 검출이 매우 어려웠던 것과 달리 본 발명에 따른 방법을 이용함으로써 용액 중의 대사물질, 독소 등의 검출을 가능하게 함을 의미한다.

상기 실시예의 비스페놀 A를 검출하기 위한 AAO 센서에 사용되는 압타머는 바람직하게는 서열번호 8 내지 34의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택될 수 있다. 이때, 핵산 압타머는 단일가닥 DNA 또는 RNA로서 제공되는 것인 바, 상기 핵산이 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

한편, 본 발명에 따른 방법은 휴대성을 높이기 위하여, 키트의 형태로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명은 다른 관점에서, 기판; 상기 기판상에 형성되고 나노크기의 구멍을 가지는 양극산화 알루미늄; 및 상기 양극산화알루미늄의 표면을 코팅하는 금속을 포함하는 양극산화 알루미늄(AAO) 센서와, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 타겟물질 검출용 키트에 관한 것이다. 이때, 바람직하게는 상기 금속은 금인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이후의 수행단계에서 상기 압타머는 압타머의 말단에 결합된 기능기를 이용하여 AAO 센서에 고정되는 것을 특징으로 할 수 있는데 이때 상기 기능기는 티올기일 수도 있고, 흡착에 의한 결합이나 링커(linker)에 의한 결합도 가능하다는 것을 특징으로 할 수 있다. 아울러 상기 키트는 추가로 플로우시스템을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때 플로우시스템이란 상기 AAO 센서로 시료 또는 압타머를 포함하는 결합버퍼를 흘려 보낼 수 있는 시스템을 의미한다.

상기 타겟물질 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 AAO 센서 기반 검출방법에 대한 실시예에서는 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용하여 비스페놀 A의 검출효과를 확인하였으나, 다른 타겟물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용하여 본 발명에 따른 방법을 다른 타겟물질의 검출에도 적용할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1: 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머의 분리

1-1: 비스페놀 A- 아가로스 친화성 컬럼( Bisphenol A- Agarose Affinicy Column)의 준비

비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리하기 위하여 비스페놀 A-아가로스 친화성 컬럼을 다음과 같이 준비하였다.

먼저, 20mM의 비스페놀 A (4,4'-dihydroxy-2,2-diphenylpropane, Sigma-Aldrich, USA)를 50% DMF에 용해하였다. 에폭시-활성화된 세파로스 6B 레진 (Epoxy-activated Sepharose 6B resin; GE Healthcare Bio-Sciences Corp., USA)의 분액은 비스페놀 A를 에테르 결합을 통하여 하이드록시 기로 고정하는데 사용되었다. 비스페놀 A는 커플링 버퍼(coupling buffer: 50% DMF, pH 13.0)에서 대략 11~24μmole의 활성기를 가지는 600㎕ 에폭시 활성화 레진과 38℃에서 5 rpm으로 회전시키면서 밤새도록 반응시켜 커플링시켰다.

타겟-커플링된 레진은 순차적으로 커플링 버퍼, 1M 아세테이트 버퍼, 증류수로 세척된 다음, 커플링된 레진을 1M 에탄올아민(ethanolamine, pH 8.0)과 6시간 동안 42℃에서 회전시키면서 인큐베이션하여, 고정화 과정 동안 자유/비점유 기(free/unoccupied group)를 블로킹하였다. 블로킹 후에, 비드는 세척버퍼 (0.1M 아세테이트, 0.5M NaCl, pH 4.0)로 세척되고, 20% 에탄올에 재현탁된 다음, 사용할 때까지 4℃에서 보관되었다.

유출물(flow-through) 및 폐기되는 워싱 버퍼 내의 미결합된 비스페놀 A의 양은 분광 광도계(Bio-Rad, USA)로 280nm에서 측정하였고, 결합한 비스페놀 A의 농도는 초기 농도와 미결합된 농도의 차이로 산출하였다. 대조구로서 비스페놀 A를 커플링시키지 않고 에탄올아민으로 차단만 시킨 레진의 분액을 이용하였다.

1-2: ssDNA pool 의 준비 및 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머의 선별

다음의 서열을 가지는 랜덤한 ssDNA 라이브러리를 화학적으로 합성하고 PAGE(Genotech Inc., Korea)로 분리하였다.

5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-N₆₀-GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGG-3' (서열번호 35)

Asymmetric PCR 방법이 ssDNA의 준비를 위하여 수행되었으며, ssDNA의 농도는 Quant-iT Oligreen ssDNA 시약 및 키트 (Invitrogen, USA)를 이용하여 측정되었다. ssDNA는 Nuclease S1 (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 확인하였다. 초기 풀은 10¹⁵ molecules를 포함하였다. 상기 asymmetric PCR에는 정방향 프라이머만 사용되었으며 다음과 같다.

Forward primer: 5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-3' (서열번호 36)

SELEX의 선별과 증폭과정을 12회 수행하였다. 비스페놀 A-결합된 레진은 SELEX 과정의 각 라운드 전에 결합 버퍼(binding buffer: 25mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 25mM KCl, 10mM MgCl₂, 5% DMSO, pH 8)로 세척하였다. 랜덤 ssDNA 라이브러리 풀은 95℃에서 5분간 가열된 다음 실온으로 1~2시간 동안 냉각되었다. 매 선별 라운드에서 600㎕의 레진에 커플링된 19μmole의 비스페놀 A는 결합 버퍼에서 랜덤 DNA 풀과 혼합되었다. 이러한 혼합물은 yellow 컬럼(Bio-Rad, USA)에서 실온에서 1시간동안 인큐베이트되었다. 비결합된 ssDNA는 결합버퍼로 세척함으로써 제거되었다.

비스페놀 A-커플링된 레진으로부터 결합된 ssDNA를 용리시키기 위하여, 용리 버퍼(50mM Bisphenol A, 100mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 25mM KCl, 10mM MgCl2, 50% DMSO, pH 8.0)를 컬럼에 첨가한 다음, 유출물을 수득하였다. 용리된 ssDNA를 침전시키기 위하여, 20㎍의 이스트 tRNA를 캐리어로 첨가하였다. 레진에 대한 음성 선별 단계 (즉, 레진으로부터 비결합된 후보자를 제거)는 3번째 사이클 후의 사이클에서 포함되었다. 9번째 및 11번째 선별 라운드 후의 용리된 압타머 풀은 pGEMT easy vector system (Promega, USA)을 사용하여 클론되었고, 개개의 클론은 시컨싱하였다 (Solgent Inc., Korea). 11번째 선별라운드 및 12번째 마지막 선별라운드로부터 54개의 압타머를 선별하였으나, 이중 몇몇은 중복된 것으로 나타났으며 결국 아래에 나타난 바와 같이, 총 27개의 압타머를 선별하였다.

그룹 1

#47　 5'-GCGGACGGGC TCGGCTCACC TAGGATGA CC TGAGTACTGT CC C C GTGGCG CTAATTCGGG-3' (서열번호 10)

#50　 5'-CGGCCCGCCC CTAGGATGA C CTGAGTACTG TCCGC GGGAC GGTATCGCTG AGACAGGTGC-3'　 (서열번호 11)

#41 5'-CGGCAGC C CT AGGATGA CCT GAGTACTGTC CGC GAAAGAC TCCATGGTAC CCGGTGCTTA-3' (서열번호 12)

#27 5'-GGGGGCGTCG N C CTAGGATG A CCTGAGTAC TGTCCGC ACN CAGGGAGGAT GCATTGAC-3'　 (서열번호 13)

#11 5'-CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGA CCTGA G GT CTG C CC A ACGGTGTTTA GAACCCCTTG-3' (서열번호 15)

그룹 2

#4 5'-AG GCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC -3' (서열번호 19)

#12-5 5'-CC GCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC -3' (서열번호 20)

#6 5'-CC GCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CG C CTCCAGC -3' (서열번호 21)

#12-7 5'-CC GCCGTTGG TGTGGTGGGC C C AGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CG C CTCCAGC -3 (서열번호 22)

그룹 3

#12-2 5'- TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGG A G -3' (서열번호 23)

#12-9 5'- TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGG G G G-3' (서열번호 24)

#12-6 5'- TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCG G T C G G G -3' (서열번호 25)

그룹 4

#2　 5'-GCCGACAGGG CATGGGACGC TATCAGCGGT GTCA ATCGAA TTCCCGCGGC CG CCATGCGG-3' (서열번호 26)

#14　 5'-GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTCCAGCG TA ATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC-3' (서열번호 27)

#46　 5'-GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCAC ATC GA G T G CCC C C GGCCG GTGCT-3' (서열번호 28)

그룹 5

#12 5'- GTATTGTC A T T C AT ATCCTC G TG CTTGCTG TC C T CACCCC ACCCACCAGA ATGGAAA-3'　 (서열번호 29)

#13 5'-CCTG GTATTG TC T T G C C AAT CCTCG CC CT G GCTGTC T T AC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG-3' (서열번호 30)

그룹 6

그룹 7

상기에서 밑줄 친 부분은 보존되는 공통서열을 나타낸다. 즉, 그룹 1에서 5'-CCTGAGKWACT GYCC-3' (K=G 또는 T, W=A 또는 T, Y=T 또는 C; 서열번호 1), 그룹 2에서 5'-GCCGTTGG TGTGGTGGGC CYAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGYCTCCAGC (Y=C 또는 T, 서열번호 2), 그룹 3에서 5'-TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGKTSGRG-3'(K=G 또는 T, S=C 또는 G, R=A 또는 G; 서열번호 3), 그룹 4에서 5'-ATCGARTKCC CSCGGCCG-3' (R=A 또는 G; K=G 또는 T; S=C 또는 G; 서열번호 4), 그룹 5에서 5'-GTATTGTCNT NCNNATCCTC GNNCTNGCTG TCNT-3' (N=A, T, C 또는 G; 서열번호 5), 그룹 6에서 서열번호 6: 5'-GCGGGTACCG TGCT-3' (서열번호 6), 그룹 7에서 서열번호 7: 5'-CGGTGGGTGG NNAGNTGNGA NA-3' (N=A, T, C 또는 G; 서열번호 7)이 각 그룹의 압타머가 포함하는 공통서열이다.

실시예 2: 비스페놀 A의 검출활성 측정

2-1: 리얼 타임 PCR 방법을 이용한 비스페놀 A에 대한 결합 친화도 측정

리얼 타임 PCR 방법을 이용하여, SELEX 방법을 수행하기 전의 초기 ssDNA 풀 (pool), 각 11번째 및 12번째 선별 라운드로부터 분리하여 수득한 용출물 (R11 및 R12), 상기 11번째 선별 라운드 및 12번째 선별라운드에서 수득한 압타머 (11번째 선별 라운드에서 #3 (서열번호 33), #6 (서열번호 21); 12번째 선별 라운드에서 #12-3 (서열번호 16), #12-5 (서열번호 20))에 대하여 결합 친화도를 측정하였다. 이때, BPA 결합된 컬럼에 대한 대조군으로 BPA가 결합되지 않은 대조군-컬럼(control-column)을 사용하였다.

즉, 먼저 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)를 5 pmol/㎕의 농도로 혼합한 다음, 리얼타임 PCR을 다음의 조건으로 수행하였다. 즉, 50℃에서 2분간 1회 사이클, 95℃에서 10분간 1회 사이클을 진행하고, 그 다음 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초로 40회 사이클을 진행하고, 다시 72℃에서 10분간 1회 사이클을 진행하였다. 이때, 리얼타임 PCR 반응 혼합물로는 25 ml SYBR Green Mix (2x)(Takara, Japan), 2 ml primer pair mix (5 pmol/ml each primer)(Bioneer, Korea) 및 22.5 ml H₂O를 이용하였고, 상기 리얼타임 PCR 결과는 ABI Prism SDS 7000 (Eurogentec, Belgium)로 확인하였다.

Forward primer: 5'-GGGCCGTTCGAACACGAGCATG-3' (서열번호 36)

Reverse primer: 5'-CCTAGGATGACCTGAGTACTGTCC-3' (서열번호 37)

그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 압타머 #3 (서열번호 33), #6 (서열번호 21), #12-3 (서열번호 16) 및 #12-5 (서열번호 20) 모두 비스페놀 A에 대하여 친화도를 가지는 것으로 나타났으며, 이중 #3 (서열번호 33) 및 #12-5 (서열번호 20)는 비스페놀 A에 대하여 특히 높은 친화도롤 보이는 것으로 나타났다.

특히 압타머 #12-5 (서열번호 20)는 대조군-컬럼에 대하여는 매우 낮은 친화도를 나타내면서 비스페놀 A에 대해서는 매우 높은 친화도를 보이는 것으로 확인되어 비스페놀 A의 검출 및 제거를 위해 유효한 압타머로 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.

한편, 몇몇 압타머에 대하여 M. Zuker에 따라 Mfold 프로그램을 사용하여 자유에너지를 최소화함으로서 2차 구조의 분석을 수행하였는데, (http://frontend. bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi), 이 중 압타머 #3(서열번호 33) 및 압타머 #12-5(서열번호 20)의 2차 구조는 도 2B에 나타난 바와 같다.

2-2: 평형 여과법에 의한 비스페놀 A에 대한 해리 상수( Kd )의 측정

결합 어세이를 평형 여과법에 의하여 수행하였다. Kd 결정을 위하여, 폴드된 ssDNA의 일련의 희석액은 200㎕ 반응용액에 75μM 비스페놀 A를 포함하는 결합버퍼에 용해하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 혼합물은 YM3 Microcon filter columns (Amicon)에 로딩한 후, 12,000g로 60분간 원심분리하여 약 160㎕의 여과액을 수득하였다.

상기 분자량 컷오프 막에 남아있는 용액은 비스페놀 A에 결합하는 ssDNA와 결합하지 않는 ssDNA를 모두 포함하고 있지만, 여과액은 ssDNA에 비결합된 비스페놀 A만을 포함하고 있다. 여과액 샘플들을 분광분석기(Spectrophotometer, Bio-rad)로 278nm에서 측정하여 비스페놀 A의 농도를 결정하였다.

해리 상수를 산출하기 위하여, Sigmaplot 10.0 소프트웨어를 이용하여, 다음의 평형식으로 결합된 비스페놀 A 대 ssDNA 농도의 퍼센트를 플롯화하고, 데이터 포인트를 비선형 회귀 분석에 의해 고정하였다.

y=(B _max ·ssDNA)/(K _d +ssDNA)

이때, y는 포화도(saturation)의 정도이고, B _max 는 최대결합지점의 수이고, K _d 는 해리(dissociation) 상수이다.

그 결과, 상기 실시예 2-1의 리얼타임 PCR 분석법에서 가장 우수한 친화도를 보이는 압타머로 선별된 #3 (서열번호 33) 및 #12-5 (서열번호 20)의 해리상수를 조사한 결과, 압타머 #3 (서열번호 33)의 해리상수는 8.3nM, 압타머 #12-5 (서열번호 20)의 해리상수는 230nM로 나타났다.

즉, 도 2A의 리얼타임 PCR 분석에서는 압타머 #12-5 (서열번호 20)의 압타머가 강한 결합력을 보이는 것으로 나타났으나, 평형 여과 방법에서 해리상수를 조사한 결과, 압타머 #3 (서열번호 33)이 가장 강한 친화도를 가지는 것으로 나타났다.

일반적으로 거대분자에 대한 항체의 친화도와 비교할 때, 작은 분자에 대한 항체의 친화도는 매우 낮다는 것을 고려할 때, 본 발명에 따른 압타머가 nM 수준의 친화도를 보이는 것은 매우 이례적인 것이다. 즉, 본 발명에 따른 압타머는 비스페놀 A에 대한 매우 강한 친화도를 보임을 확인하였다.

실시예 3: 졸-겔 칩을 이용한 비스페놀 A의 압타머 결합 확인

선별된 비스페놀 A 압타머의 친화도를 테스트하기 위하여, 졸-겔 칩을 준비하였다. 먼저 졸-겔 스팟을 음성 대조군, 비스페놀 A 와 함께, 도 3에 나타난 바와 같이 음성 대조군 (○, 회색) 과 비스페놀 A (●, 검정색)를 sciFLEXARRAYER (Scienion, Germany)를 이용하여 표면 개질된 실리콘 표면에 고정화하였다.

상기에서 사용된 졸-겔 스팟을 위한 졸 조성물은 다음과 같이 제조하였다. 먼저 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS) 와 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS) 를 혼합하여 졸 조성물을 제조하였다. 그리고, 용액 I으로는 100mM HCl을 준비하였다.

한편, 100mM SP 완충용액(pH 5.8) 및 2차 증류수(double distilled water, DDW) 20㎕를 섞은 다음, 상기 혼합물에 실험군의 경우 비스페놀 A를 10㎕씩 첨가하여 5초 동안 볼텍싱하고 스핀-다운하여 용액 II를 제조하였다. 음성대조군의 경우 PBS 완충용액(buffer)만을 사용하였다.

그리고 나서, 압타머 #3을 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; Fermentas, Canada)와 Cy3-dUTP (GeneChem, Korea)를 이용하여 라벨링하여 준비하였다.

졸-겔 스팟을 13~15 시간동안 겔화 시킨 후, 각 웰에 2μM의 cy3-라벨된 압타머로 어세이하였다. 그 다음, 세척과정을 거쳐 FLA5100 형광 스캐너 (FUJIFILM, Japan)으로 관찰하고 Multi-image 분석기 및 Multi-gauge 프로그램으로 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A가 고정화 된 칩에서만 시그널이 나타나, 본 발명에 따른 압타머가 비스페놀 A를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 졸-겔 칩에서 비스페놀 A 압타머를 이용한 비스페놀 A 검출

선별된 비스페놀 A 압타머의 친화도를 테스트하기 위하여, 졸-겔 칩을 준비하였다. 먼저 졸-겔 스팟을 음성 대조군, 선별된 압타머들(압타머 #3 및 #12-5), 양성 대조군과 함께, 도 4에 나타난 바와 같은 순서로 양성대조군 (P), #12-5 압타머, #3 압타머 및 음성대조군(N) 순으로 OmniGrid Accent Microarrayer (DIGI LAB, USA)를 이용하여 PMMA 코팅된 96-웰 상에 고정화하였다.

상기에서 사용된 졸-겔 스팟을 위한 졸 조성물은 다음과 같이 제조하였다. 먼저 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS) 과 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS) 를 혼합하여 졸 조성물을 제조하였다. 그리고, 용액I으로는 10mM HCl을 준비하였다.

한편, 10mM SP 완충용액(pH 5.8) 10㎕ 및 2차 증류수(double distilled water, DDW) 20㎕를 섞은 다음, 상기 혼합물에 양성대조군의 경우 10㎕의 Cy3 항체(Santa Cruz, USA)를, 실험군의 경우 선별한 압타머(압타머 #3 및 #12-5)을 10㎕씩 첨가하여 5초 동안 볼텍싱하고 스핀-다운하여 용액 II를 제조하였다. 음성대조군의 경우 완충용액(buffer)만을 사용하였다.

그리고 나서, 압타머 #3 및 #12-5를 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; Fermentas, Canada)와 Cy3-dUTP (GeneChem, Korea)를 이용하여 라벨링하여 준비하였다.

졸-겔 스팟을 13~15 시간동안 겔화 시킨 후, 각 웰에 50μM의 비스페놀 A와 2μM의 cy3-라벨된 압타머로 샌드위치-어세이하였다. 즉, 각 웰에 도 3에 나타난 바와 같이, 상단 우측 웰에는 비스페놀 A(BPA)와 압타머 #12-5를, 하단 좌측 웰에는 완충용액과 압타머 #3만을, 하단 우측 웰에는 BPA와 압타머 #3를 처리하고 배양하였다. 그 다음, 세척과정을 거쳐 FLA5100 형광 스캐너 (FUJIFILM, Japan)으로 관찰하고 Multi-image 분석기 및 Multi-gauge 프로그램으로 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A가 존재하는 경우에만 #12-5 압타머 및 #3 압타머를 고정한 위치에 시그널이 나타나 (적색 원으로 표시), 본 발명에 따른 압타머가 비스페놀 A를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 비스페놀 A 이외 비스페놀 족에 대한 친화성 측정

비스페놀 A 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여, 압타머 #3 (서열번호 33)을 이용하여 추가적으로 비스페놀 A와 유사한 구조를 갖는 다른 비스페놀 족, 예를 들어 도 5A에 제시된 비스페놀 B(Bisphenol B, BPB), 4,4'-비스페놀(4,4'-Bisphsenol, BP), 6F 비스페놀 A(6F Bisphenol A, 6F) 등에 대한 실시예 2-2의 방법으로 친화성(Kd)을 측정하였다.

그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, 압타머 #3의 경우, 비스페놀 A에 대한 해리상수는 0.8nM, 6F는 208nM, BPB는 139mM, BP는 139mM로 나타나, 압타머 #3은 비스페놀 A에만 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.

도 5A의 BPB의 경우, 비스페놀 A와 하나의 메틸 기 차이밖에 없음에도 불구하고, 압타머 #3은 BPB에는 친화성을 보이지 않았고, 비스페놀 A에 대해서만 특이적으로 친화성을 나타내었다.

실시예 6: 평형 여과법에 의한 #3 trimmed form 압타머의 비스페놀 A에 대한 결합력의 확인

상기 #3(서열번호 33)의 trimmed form 압타머의 비스페놀 A에 대한 결합력을 확인하기 위하여, 결합 어세이를 평형 여과법에 의하여 수행하였다. 구체적으로, 하기의 서열번호 38 내지 서열번호 41의 서열로 표시되고, 도 6과 같은 구조를 형성시킨 #3 trimmed form 압타머 (#3-tr1, #3-tr2, #3-tr3 및 #3-tr4)를 제작하였다:

#3-tr1 : 5'-CGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCG-3' (서열번호 38)

#3-tr2 : 5'-TGCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCA-3' (서열번호 39)

#3-tr3 : 5'-AGCATGCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCA-3' (서열번호 40)

#3-tr4 :

5'-ACACGAGCATGCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGT-3'(서열번호 41)

상기 #3 trimmed form 압타머 (#3-tr1, #3-tr2, #3-tr3 및 #3-tr4)의 희석액은 200㎕ 반응용액에 75μM 비스페놀 A를 포함하는 결합버퍼에 용해하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로 비스페놀 A 만을 결합버퍼에 용해시킨 용액을 사용하였다. 혼합물은 YM3 Microcon filter columns (Amicon)에 로딩한 후, 12,000g로 60분간 원심분리하여 약 150㎕의 여과액을 수득하였다. 상기 분자량 컷오프 막에 남아있는 용액은 비스페놀 A에 결합하는 ssDNA와 결합하지 않는 ssDNA를 모두 포함하고 있지만, 여과액은 ssDNA에 비결합된 비스페놀 A만을 포함하고 있다. 여과액 샘플들을 분광분석기(Spectrophotometer, Bio-rad)로 276nm에서 측정하여 비스페놀 A의 농도를 결정하였다. 대조군과 비교하여 비스페놀 A가 각 trimmed form 압타머에 결합하는 비율을 계산하여 그래프로 나타내었다.

그 결과, 표 1 및 도 7에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A가 각 trimmed form 압타머에 결합하는 비율은 #3-tr1 이 5.8%, #3-tr2 가 11.1%, #3-tr3 가 17.9%, #3-tr4 가 22.3% 로 나타났다. 즉, #3-tr4 가 비스페놀 A 에 가장 강한 친화도를 가지는 것으로 나타났다.

	대조군	#3-tr1	#3-tr2	#3-tr3	#3-tr4
Filtrate 양 (㎕)	150	142	155	140	143
Filtrate OD 276nm	0.200	0.199	0.172	0.176	0.163
Binding %	0	5.806667	11.13333	17.86667	22.30333

실시예 7: 압타머를 이용한 다중채널 AAO ( anodic aluminum oxide ) 센서 기반 타겟물질의 검출

7-1: AAO 센서의 제조

본 실시예에서 사용한 AAO (양극산화 알루미늄) 센서는 다음과 같은 방법으로 제작되었다.

(1) 전자 빔 증발기를 이용하여 증착된 1.3 ㎛ 두께의 알루미늄, 5 두께의 금과 10 ㎚ 두께의 티타늄으로 이루어져 있는 금속 패턴은 200 ㎚ 두께의 이산화규소 층을 가지는 실리콘 기판 위에 일반적인 포토리소그래피 (photolithography) 와 lift-off 방법을 이용하여 만들어졌다.

(2) 양극산화 알루미늄의 나노 크기 다공은 직경이 약 75 ㎚ 이며 2단계 양극 산화 과정에 의해 만들어 졌다. (Masuda, H., Fukuda, K., 1995. Science 268 (5216), 1466~1468) 양극 산화의 1단계에서 증착된 알루미늄 필름은 상온에서 0.3 M 의 옥살산에 5분동안 40V 의 일정한 전압 항에서 처리함으로써 양극 처리되었다. 이 양극산화 알루미늄 막은 70 ℃의 1.8 % (wt) 의 크롬산과 에담그어용해된후다시 5분간 양극 처리하였다. 양극산화 알루미늄의 경계층은 상온에서 6 % (wt) 의 인산 용액에 담그어 제거하였고, 양극 산화 알루미늄 구역 바깥쪽에 450 ㎚ 두께의 이산화규소를 증착하였다.

(3) 바닥 부분의 전극이 될 금나노선은 황산을 사용하여 pH 4 로 맞춘 1mM 의 사염화금산 (HAuCl4) 의 전해질 용액에서 1.1V 의 일정한 전압으로 나노선 내부에 전착하였다. 금전극의 윗부분 (0.3 X 5.5 ㎜) 은 포토리소그래피와 lift-off 방법을 이용하여 양극산화 알루미늄 구역 위에 만들어졌다.

(4) 그 다음, PDMA 미세유동 채널은 센서 어레이 위에 위치하도록 붙였다.

7-2: AAO 센서를 이용한 타겟물질의 검출

실시예 7-1에서 제조된 AAO 센서를 플로우 시스템에 연결한 후 3’ 말단에 티올기가 달려 있는 압타머(서열번호 33의 #3 압타머) 10nM 를 결합버퍼 (25mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 25mM KCl, 10mM MgCl₂, pH 8.0) 에 녹인 후 0.1ml/hr 의 속도로 흘려넣으면서 밤새 인큐베이션 하였다. AAO 센서의 표면에는 금 입자가 코팅되어 있기 때문에 금 입자와 압타머의 3’ 말단의 티올기가 공유결합을 이루어 압타머가 AAO 센서의 표면에 결합되게 된다. 대조군으로는 압타머 없이 결합 버퍼 만을 흘려넣어 인큐베이션한 센서를 사용하였다. 비스페놀 A 결합 버퍼를 0.5ml/hr 의 속도로 흘려넣으면서 1시간 동안 세척하고, 기준 완충 용액 레벨로 준비하였다. 1nM, 10nM, 100nM 농도의 비스페놀 A 를 흘려넣은 후 결합 버퍼로 세척한 후 센서의 정전용량 (capacitance, nF) 를 측정하였다. 정전용량을 측정할 주파수를 결정하기 위하여 주파수 스위프 실험을 실시하였다.

주파수를 0에서 1000 헤르츠로 변화시켜 가면서 압타머를 센서에 결합시켰을 때와 비스페놀 A를 흘려넣었을 때의 정전용량을 비교하였을 때, 도 9에 나타난 바와 같이, 100 헤르츠에서 가장 이상적인 결과가 나왔기 때문에 이후 실험에서는 100 헤르츠에서 정전용량을 측정하였다

한편, 대조군으로 압타머가 결합되어 있지 않은 AAO 센서를 이용하고 실험군으로 압타머가 결합된 AAO 센서를 이용하여 비스페놀 A의 검출 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, 압타머가 결합되어 있지 않은 AAO 센서에서는 비스페놀 A 를 흘려넣었을 때 정전용량의 변화가 없었던 반면, 도 10b에 나타난 바와 같이, 압타머를 결합시킨 AAO 센서에서는 10nM 의 비스페놀 A를 흘려넣었을 때 정전용량이 25% 감소하였고, 100nM 의 비스페놀 A를 흘려넣었을 때는 36.1% 감소하였다.

아울러 비스페놀 A를 1nM, 10nM, 100nM 의 농도로 흘려넣었을 때 정전용량의 변화를 그래프로 나타내었다. 그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 1nM 의 농도까지는 약간의 오차는 있었으나 대체적으로 직선 모양의 그래프가 그려지는 것을 알 수 있었다.

상기 실험결과는 본 발명에 따른 AAO 센서에 기반한 검출방법은, 너무 낮은 전하 전달 때문에 검출될 수 없었던, 용액 중에 포함된 저분자량의 무극성 분자도 특이적으로 검출해 낼 수 있음을 의미한다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

부호 없음

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 8 내지 서열번호 34로 표시되는 핵산서열 중 어느 하나의 핵산서열로 구성되는, 비스페놀 A에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머.
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제1항의 핵산 압타머를 이용한 비스페놀 A의 검출방법.
제11항에 있어서, 상기 비스페놀 A는 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 핵산 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출용 조성물.
제1항의 핵산 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출센서.
제1항의 핵산 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 검출키트.
제1항의 핵산 압타머를 이용한 비스페놀 A의 제거방법.
제1항의 핵산 압타머를 함유하는 비스페놀 A의 제거용 조성물.
다음 단계를 포함하는, 압타머를 이용한 양극산화 알루미늄 (AAO, Anodic aluminum oxide) 센서 기반 비스페놀 A의 검출방법:
(a) 기판; 상기 기판상에 형성되고 나노크기의 구멍을 가지는 양극산화 알루미늄; 및 상기 양극산화 알루미늄의 표면을 코팅하는 금속을 포함하며, 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머가 상기 금속 표면에 프로브로서 고정되어 있는 AAO 센서에, 비스페놀 A를 함유하는 시료를 첨가하는 단계; 및
(b) 상기 비스페놀 A와 압타머가 결합한 경우 발생하는 상기 AAO 센서의 정전용량의 변화를 측정하여 비스페놀 A를 검출하는 단계,
이때 상기 압타머는 서열번호 8 내지 34의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택되는 것을 특징으로 함.
제18항에 있어서, 상기 금속은 금인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 압타머의 AAO 센서로의 고정은 압타머의 일 말단에 결합된 기능기를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 기능기는 티올기인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 AAO 센서는 플로우시스템에 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 시료는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프액, 뇌척수액, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 것임을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 AAO 센서는 다중채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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기판; 상기 기판상에 형성되고 나노크기의 구멍을 가지는 양극산화 알루미늄; 및 상기 양극산화알루미늄의 표면을 코팅하는 금속을 포함하는 양극산화 알루미늄(AAO) 센서와, 비스페놀 A에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 타겟물질 검출용 키트,
이때 상기 압타머는 서열번호 8 내지 34의 핵산서열로 표시되는 압타머들 중 선택되는 것을 특징으로 함.
제26항에 있어서, 상기 금속은 금인 것을 특징으로 하는 키트.
제26항에 있어서, 상기 압타머는 압타머의 말단에 결합된 기능기를 이용하여 AAO 센서에 고정되는 것을 특징으로 하는 키트.
제28항에 있어서, 상기 기능기는 티올기인 것을 특징으로 하는 키트.
제26항에 있어서, 추가로 플로우시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제26항에 있어서, 상기 AAO 센서는 다중채널을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.