KR100801983B1

KR100801983B1 - 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체 및 이를 이용한 환경호르몬 제거방법

Info

Publication number: KR100801983B1
Application number: KR1020070038282A
Authority: KR
Inventors: 구만복; 김연석
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-19
Filing date: 2007-04-19
Publication date: 2008-02-12

Abstract

본 발명은 핵산 앱타머를 리포좀 내에 위치시킨 리포좀-앱타머 구조체를 이용하여 용액 내에 존재하는 17베타-에스트라다이올을 특이적으로 제거하는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 환경호르몬의 일종인 17베타-에스트라다이올과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 친수성 표면과 소수성 내부층을 갖는 지질이중막으로 형성된 리포좀내에 위치시킨 서브마이크론 사이즈의 앱타머-리포좀 구조체를 이용하여 17베타-에스트라다이올로 오염되어 있는 물에서 17베타-에스트라다이올을 높은 회수율로 쉽게 제거하는 방법에 대한 것이다.

본 발명에 따르면, 환경호르몬과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 지질이중막으로 구성된 리포좀 내에 도입시키면 리포좀 내의 pH와 이온농도 등이 잘 조절된 버퍼에서 환경호르몬과 핵산 앱타머가 더욱 강하게 결합할 수 있고, 결과적으로 수중환경에서 환경호르몬의 효과적으로 제거할 수 있으므로, 수중의 독성물질을 제거하는 기술에 사용될 수 있다.

환경호르몬, 17베타-에스트라다이올, DNA 앱타머, 리포좀, 앱타머-리포좀 구조체

Description

환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체 및 이를 이용한 환경호르몬 제거방법 {Liposome-aptamer complex for removing endocrine disrupting chemicals and method for removing endocrine disrupting chemicals by using the same}

도 1은 본 발명에 따른 핵산 앱타머가 위치한 서브마이크론 사이즈의 리포좀 구조체를 이용하여 용액에 존재하는 17beta-estradiol의 제거 기술 및 방법 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 앱타머가 내부에 위치한 리포좀구조체를 채운 컬럼 (column)을 이용해서 17-beta estradiol을 제거하는 모식도이다.

도 3a와 3b는 본 발명에 따른 핵산 앱타머가 내부에 위치한 리포좀 구조체에 의해 제거된 17베타-에스트라다이올 HPLC 농도 분석 결과 및 17베타-에스트라다이올의 HPLC 표준 검정선을 나타낸다.

도 4는 본 발명에 따른 DNA 앱타머 (서열번호 1)의 2차 구조를 나타낸다.

본 발명은 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 환경호르몬과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 (aptamer)를 지질이중막으로 구성된 리포좀 (liposome) 내에 도입시킨 것을 특징으로 하는 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 핵산 앱타머와 리포좀을 이용하여 용액에 존재하는 환경호르몬을 특이적으로 제거하는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는, 환경호르몬의 일종인 17베타-에스트라다이올과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 이용하여 이를 친수성외부 표면과 소수성 내부층으로 구성된 지질이중막으로 형성된 리포좀내에 위치시킨 후 이 서브마이크론 사이즈의 앱타머-리포좀 구조체를 이용하여 17베타-에스트라다이올이 오염되어 있는 물과 앱타머를 내부에 가지고 있는 서브마이크론 사이즈의 리포좀 구조체를 섞어서 17베타-에스트라다이올을 물로부터 쉽게 제거하는 방법에 대한 것이다.

환경호르몬이란 생물체에서 정상적으로 생성되거나 분비되는 물질이 아니라, 인간의 산업 활동을 통해서 생성되거나 방출되는 화학물질로, 생물체에 흡수되면 내분비계의 정상적인 기능을 방해하거나 혼란케 하는 화학물질을 말한다. 하수처리장 등에서 환경 중으로 배출되는 환경호르몬 물질들은 사람이나 가축의 배설물에서 유래한 것, 식품에서 유래한 것, 의약품에서 유래한 것 등 모든 종류가 포함되어있다. 환경호르몬 물질은 극미량으로 존재하여도 생물축적으로 인해 생태계 및 인간의 생식기능 저하, 성장장애, 기형 또는 암 등을 유발하는 중대한 영향을 끼치기 때문에 심각한 문제가 되고 있다. 환경호르몬은 일단 체내로 들어갔을 경우 분해가 잘 되지 않거나 배출이 되지 않고 축적되므로 환경호르몬이 체내로 들어오는 것을 막는 것이 무엇보다 중요하다. 특히, 수중 환경호르몬은 일반적인 물리화학적 정화 방법에 의해 거의 제거되지 않기 때문에 이를 제거하기 위한 방법으로 다공성 탄소물질이나 나노복합소재, 나노필터 기술 등을 이용한 제거 방법이 고안되고 있으나 아직까지는 효과적인 제거기술이 개발되어 있지는 않다. 따라서 환경호르몬과 같은 수중 독성물질들을 효과적으로 제거하기 위해서는 나노바이오 기술을 활용한 새로운 기술의 도입이 필요하며 이를 위해서는 특정 독성물질만을 선택적으로 제거할 수 있는 새로운 소재 및 기술을 개발하는 것이 필요하다.

핵산 앱타머는 구조 특이적 친화성을 가지는 단일사슬 DNA 혹은 RNA를 말하는 것으로 이러한 핵산 앱타머는 신약으로서 개발되어 오다가 최근에는 약물전달시스템의 표적지시자로서 그리고 바이오센서의 탐지부분 구조체로서 많이 연구되고 있다. 본 발명에서는 이미 이러한 핵산구조체인 앱타머의 구조 특이적 친화성을 활용하여 바이오센서뿐만 아니라 환경호르몬 등 소량이면서 그 위해성이 큰 화학물질의 선택적 제거에 이러한 앱타머를 활용할 수 있음을 확인하여 특허를 출원한 바 있다.

환경호르몬과 같은 작은 환경독성물질들은 일반적인 수질 정화기술인 물리화학적인 흡착, 필터 기술에 의해 거의 제거되지 않는다. 또한 적은 양이라도 체내로 흡수되면 축적되어 잘 배출되지 않기 때문에 인체에 큰 영향을 미치게 된다. 따라서 적은 양의 독성물질이라도 효과적으로 제거할 수 있는 기술의 개발이 필요하며 이를 위해 이들 환경호르몬에 특이적으로 결합할 수 있도록 개발된 핵산 앱타머 나 노구조체를 이용하는 기술의 도입이 필요하다. 하지만 이러한 핵산 앱타머를 이용하는 기술을 실제 샘플에 적용하는데 있어서 가장 큰 장벽은 핵산 앱타머와 환경호르몬 등의 독성화학물질이 결합하는 환경 조건이 매우 제한되어 있다는 점이다. 즉 이들의 구조 특이적 결합력은 버퍼 등의 pH와 이온농도 등이 잘 조절된 수용액 조건에서 가장 강하고 잘 결합한다는 점이다. 그런데 지금까지는 이러한 핵산 앱타머를 이용해서 신약개발, 약물전달시스템의 표적지시자, 혹은 바이오센서의 반응탐지부분 등의 영역에 활용하는 것들만이 연구되어 왔으며 이들 대부분의 경우에는 그 적용환경이 이들 앱타머가 그 타겟과 결합하는 조건이 비슷한 생체환경내부임으로 이러한 요인들은 큰 문제가 되지 않았다. 하지만 2006년 12월 본 발명자들의 환경호르몬의 제거를 위해 핵산 앱타머를 이용하는 특허는 비록 그 내용상으로 자석비드를 활용해서 농축시키는 기능이 있기는 하지만 핵산 앱타머와 환경호르몬이 비공유결합을 하는 미세환경이 조절되지 않는 문제점이 있었다. 이러한 이유 때문에 그 기술을 이용해서 환경호르몬 등을 버퍼용액이 아닌 물에서부터 선택적으로 제거, 농축하는 데는 한번이 아닌 여러 번의 사이클을 거쳐야 하는 저효율의 문제점을 안고 있었다. 그러므로 핵산 앱타머가 특정 타겟물질과 결합하는 미세환경을 제공, 유지해주는 것은 앱타머를 이용하여 특정 타겟물질을 선택적으로 제거, 회수하는데 있어서 매우 중요한 과제이고 본 발명에서는 이러한 과제를 친수성 내외부 표면과 소수성내층으로 구성되는 지질이중막으로 형성된 리포좀을 이용해서 해결하였다. 이 지질이중막 리포좀은 그 특성상 친수성의 외부에서 리포좀 내부로 들어온 후에 다시 외부로 빠져 나가기 전에 친수성이면서 앱타머가 최적하게 그 특이적 결합을 할 수 있도록 버퍼 환경이 유지되는 리포좀 내에 위치하고 있는 앱타머와 결합하게 되고 이렇게 결합한 앱타머-타겟 혼합체는 리포좀 내에만 머무르게 된다. 이러한 리포좀-앱타머 구조체를 컬럼 및 젤 (gel) 형태의 구조적 지지대와 결합하여 물 속에 존재하는 특정 환경호르몬, 농약, 항생제 등 잔류의약품등을 선택적으로 제거, 회수할 수 있게 된다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 환경호르몬과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 지질이중막으로 구성된 리포좀 내에 도입시킴으로써, 리포좀 내의 pH와 이온농도 등이 잘 조절된 버퍼에서 더욱 강하게 결합할 수 있어, 결과적으로 수중환경에서 환경호르몬의 제거에 탁월한 효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 환경호르몬과 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 실제 수중환경에서 사용할 수 있도록 지질이중막으로 구성된 서브 마이크론 사이즈의 리포좀 내에 위치시킴으로써 핵산 앱타먹와 환경호르몬이 잘 결합하게 되어 환경호르몬을 효과적으로 제거할 수 있는 리포좀-앱타머 복합체을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머를 이용한 수중 환경에서의 환경호르몬 제거방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 환경호르몬과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 (aptamer)를 지질이중막으로 구성된 리포좀 내에 도입시킨 것을 특징으로 하는 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체를 제공한다.

본 발명의 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체에서, 상기 리포좀 내의 환경은 상기 앱타머가 상기 환경호르몬에 최적으로 결합할 수 있는 버퍼 조성인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 버퍼 조성은 80 ~ 120 mM Tris-HCl, 180 ~ 220 mM NaCl, 23 ~ 27 mM KCl, 8 ~ 12 mM MgCl₂, 3 ~ 7% 에탄올, pH 7.5 ~ 8.5 인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 상기 버퍼의 조성은 본 발명의 실시예에서와 같이 17베타-에스트라다이올에 사용할 수 있으나, 이에 특정되는 것은 아니며 다른 환경호르몬 및 표적물질에도 적용될 수 있다.

또한, 다른 환경호르몬에 대한 버퍼 조성에 대한 예로써, Bisphenol A 결합 특이적 앱타머의 버퍼 조성(미국특허 20050282226 A1)은 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 5% dioxane, pH 8; Tetracycline 결합 특이적 RNA 앱타머 (Bioorg. Med. Chem.(2001) 9, 2549-2556)의 버퍼 조성은 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 5 mM MgCl₂, 250 mM NaCl; 및 Chloramphenol 결합 특이적 RNA 앱타머 (Chemistry & Biology (1997) 4, 833-843)의 버퍼 조성은 20 mM MgCI, 400 mM NaCI, 100 mM his-Tris, pH 6.4)의 버퍼 조성을 들 수 있다.

본 발명의 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체에서, 상기 환경호르몬은 17베타-에스트라다이올 (17beta-estradiol), 비스페놀 A (bis-phenol A), 노닐페놀 (nonylphenol), PHB (poly-hydroxybutyrate), 항생제 및 농약으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체에서, 상기 환경호르몬에 대한 핵산 앱타머는 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 서열의 핵산 앱타머도 가능하나, 바람직하게는 상기 환경호르몬은 17베타-에스트라다이올이고, 상기 핵산 앱타머는 서열번호 1 내지 8의 염기서열에서 선택된 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 핵산 앱타머는 상기 환경호르몬의 종류에 따라 특이적 결합 염기서열을 선택할 수 있으며, 그 예들을 다음 표 1과 같다.

[표 1]. 환경호르몬의 종류에 따른 특이 결합 앱타머의 염기서열

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 방법으로 표적 환경 호르몬에 특이적인 앱타 머를 개발하는 단계; 단일 리피드 물질을 클로로포름에 녹인 후 증발시켜 지질이중층막을 형성하고 상기 환경호르몬에 최적으로 결합할 수 있는 버퍼를 넣어준 후 초음파 분쇄기를 이용하여 리포좀을 형성하는 단계; 상기 앱타머와 리포좀을 트리스(Tris) 버퍼에서 혼합하는 단계; 상기 혼합액에 에탄올/염화칼슘 용액을 섞어주고 PBS 용액으로 투석하는 단계; 및 고속원심분리기를 이용하여 리포좀-앱타머 복합체를 정제하는 단계를 포함하는 상기 리포좀-앱타머 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 SELEX 방법은 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법 (Louis C. Bock, Linda C. Griffin, John A. Latham, Eric H. Vermaas, John J. Toole. 1992. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355, 564-566)을 말한다.

본 발명의 단일 리피드 물질이란 리포좀을 구성하기 위한 단위체를 말하는 것으로서, 리포좀의 사용 목적에 따라 사용되는 리피드의 종류가 달라질 수 있으나, 본 발명에서 리포좀은 앱타머와 버퍼용액을 담지하는 역할만 하므로 그 종류가 한정되지는 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 단일 리피드 물질은 인지질 물질인 PC (Phosphatidylcholine), PE (Phosphatidylethanolamine), PG (Phosphatidylglycerol), DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylocholine), DOPE (1,2- Dioleoyl-sn-glycero-3- Phosphatidylethanolamine) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 리포좀-앱타머 복합체를 컬럼 또는 젤의 지지체에 유지시키는 단계 및 상기 지지체에 환경호르몬을 포함하는 시료를 통과시키는 단계를 포함하는 환경호르몬 제거방법을 제공한다. 본 발명의 상기 환경호르몬 제거방법에는 상기 리포좀-앱타머 복합체를 유지시키기 위한 지지체로서 어떠한 컬럼, 젤을 사용할 수 있으며, 상기 지지체는 젤 이외에 mesoporus medium과 같은 다공성 물질도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 17베타-에스트라다이올에 특이적으로 결합 가능한 앱타머를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

1) 17베타-에스트라다이올 결합 특이적 DNA 앱타머 개발

표적물질 특이적인 앱타머를 개발하기 위한 방법으로는 일반적으로 SELEX (Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법이 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 이미 개발되어 독성물질 측정 바이오센서 연구에 사용된 적이 있는 17베타-에스트라다이올 결합 특이적 DNA 앱타머를 이용하였다.

2) 서브마이크론 사이즈의 지질이중막 리포좀내로 DNA 앱타머의 도입

앱타머를 리포좀 내로 위치시키기 위한 방법으로 에탄올/염화칼슘 용액 처리 법을 이용하였다. 구체적인 앱타머 도입 방법은 다음과 같다. 단일 리피드 물질을 클로로포름에 녹인 후 증발시켜 지질이중층막을 형성하고 상기 환경호르몬에 최적으로 결합할 수 있는 버퍼를 넣어준 후 초음파 분쇄기를 이용하여 리포좀을 형성하고, 상기 앱타머와 리포좀을 트리스(Tris) 버퍼에서 혼합한 후 상기 혼합액에 에탄올/염화칼슘 용액을 섞어주고 PBS 용액으로 투석하고 고속원심분리기를 이용하여 리포좀-앱타머 복합체를 정제하였다.

3) 앱타머가 도입된 리포좀에 의한 17베타-에스트라다이올 제거

17베타-에스트라다이올과 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 도입된 리포좀을 이용하여 물에 있는 17베타-에스트라다이올을 제거하는 방법의 자세한 내용은 다음과 같다. 앱타머가 도입된 리포좀을 17베타-에스트라다이올이 녹아있는 물에 넣어준 후 상온에서 일정시간 반응시킨다. 원심분리기를 이용하여 리포좀-앱타머 복합체를 용액으로부터 분리하고 용액에 남아있는 17베타-에스트라다이올의 농도를 HPLC 또는 GC/MS를 이용하여 분석하여 처음의 농도와 비교 분석한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 17beta-estradiol 결합 특이적 DNA 앱타머 개발

대략 7.2× 10¹⁴ DNA 분자들로 구성된 랜덤 ssDNA 라이브러리 (GenoTech Co., Deajeon, Korea로부터 구입)로부터 17β-에스트라다이올에 특이적으로 결합할 수 있는 단일사슬 DNA 앱타머를 SELEX 방법에 의해 선택하였다. 17β-에스트라다이올에의 결합력 (affinity) 분석을 포함한 총 7번의 선별 및 증폭과정을 통하여 최종적으로 8개의 DNA 앱타머를 선별하였으며, 이들은 0.1 ~ 3 μM의 해리상수 값을 가졌다 (Biosensors & Bioelectronics (2007) Electrochemical detection of 17beta-estradiol using DNA aptamer immobilized gold electrode chip. 22, 2525-2531 참조). 이들 DNA 앱타머의 염기서열은 하기 표 2와 같다. 이중 0.13 μM의 결합력을 가진 DNA 앱타머 하나 (서열번호 1)를 이후 실험에 사용하였다.

[표 2]. 17베타-에스트라다이올 결합 특이적 DNA 앱타머 염기 서열

상기 서열번호 1의 DNA 앱타머는 76개의 염기를 가지고 분자량은 23 kDa이다. DNA 앱타머의 2차 구조는 도 4와 같다.

실시예 2. 지질이중막 구조의 리포좀 제조

본 발명에서 사용된 리포좀은 다음과 같은 방법으로 제조되었다. 먼저 단일 리피드 물질인 DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 10 mg을 클로로포름 500 μl에 녹인 후 감압증류기 (evaporator)를 이용해 클로로포름을 천천히 증발시켜 유리관 내부에 얇은 지질이중층막을 형성시켰다. 여기에 17beta-estradiol에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 개발할 때 사용하였던 버퍼용액 (100mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 5% ethanol, pH 8.0) 1 ml을 넣어준 후 초음파 분쇄기 (sonicator)를 이용해 지질이중층막을 다시 현탁시켜 리포좀을 형성시켰다. 리포좀은 원심분리기를 이용하여 리포좀을 형성하지 못한 지질 단편들로부터 정제되었다.

실시예 3. 17beta-estradiol에 특이적으로 결합하는 앱타머의 리포좀 내 도입

앱타머를 리포좀 내로 위치시키기 위해 상기 제조된 리포좀과 앱타머 56 pmol을 400 μl의 10 mM Tris buffer (pH 7.4)에 혼합하고 여기에 에탄올/염화칼슘 용액(8.3 mM CaCl₂ in 16.6 mM Tris, pH 7.4, containing 79 % (v/v) ethanol) 400 μl을 섞어주었다. 4℃에서 24시간 동안 PBS용액으로 투석시킨 후 마지막으로 고속원심분리기 (12,000 rpm, 5분)를 이용해 리포좀-앱타머 복합체를 정제하였다. 원심분리 후 용액에 남아있는 앱타머의 양을 Nanodrop을 이용하여 분석한 결과 12 pmol 가량의 앱타머가 리포좀 내부로 들어가지 못하고 용액에 남아있음을 확인하였다. 따라서 실험에 사용된 앱타머 56 pmol의 80% 가량인 44 pmol의 앱타머가 리포좀 내부로 들어갔다는 것을 알 수 있었다 (도 1, 2 참조).

실시예 4. 수중환경에서 리포좀-앱타머 복합체를 이용한 17beta-estradiol의 제거

앱타머와 17beta-estradiol이 가장 강하게 결합하는 조건의 버퍼 조성(100mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 25mM KCl, 10mM MgCl₂, 5% ethanol, pH 8.0)이 아닌 수돗물에 존재하는 17beta-estradiol이 리포좀-앱타머 복합체에 의해 잘 제거되는지 확인하기 위한 실험을 다음과 같이 진행하였다. 우선 앱타머가 내부에 위치된 리포좀 용액 50 μl를 10 ppm의 17beta-estradiol이 녹아있는 수돗물 1 ml과 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응을 끝내고 용액을 원심분리 (12,000 rpm, 5분)하여 리포좀을 수돗물로부터 분리한 후 수돗물에 남아있는 17beta-estradiol의 농도를 HPLC 분석법을 이용하여 측정하였다. HPLC 분석 조건은 유속 1ml/min, 이동상 조성 아세트나이트릴:물 = 6:4, C18 컬럼, 흡광 파장 280 nm 이다. 분석 결과 용액에 잔존하는 17beta-estradiol의 농도는 4.3 ppm으로 리포좀-앱타머 복합체에 의해 수돗물에 존재하는 17beta-estradiol 5.7 ppm이 제거되었음을 알 수 확인하였고 제거 효율은 57 %였다. 상기 조건에서 수행한 HPLC의 표준 검정선과 리포좀-앱타머 복합체에 의해 제거된 17베타-에스트라다이올 농도를 HPLC로 분석한 결과는 도 3과 같다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 핵산 앱타머와 친수성 외부표면과 소수성 내층구조를 갖는 지질이중막으로 구성된 서브마이크론 사이즈의 리포좀 구조체를 이용한 환경호르몬류와 같은 독성물질의 선택적 제거 기술 및 방법은 기존의 용액으로부터 독성 물질을 제거하기 위해 다공성 흡착제나 나노 필터 등을 이용 하거나 혹은 앱타머자체 만을 이용하는 방법과 달리 특정한 독성 물질만을 선택적으로 제거하되 그 특이적 결합력이 최대로 나타날 수 있도록 앱타머 주위의 미세 환경이 잘 제어된 리포좀 구조체를 이용함으로 그 제거 효율을 극대화 할 수 있다.

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Claims

환경호르몬과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 (aptamer)를 지질이중막으로 구성된 리포좀 (liposome) 내에 도입시킨 것을 특징으로 하는 환경호르몬 제거용 리포좀-앱타머 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 리포좀 내의 환경은 상기 앱타머가 상기 환경호르몬에 최적으로 결합할 수 있는 버퍼 조성인 것을 특징으로 하는 리포좀-앱타머 복합체.
제 2항에 있어서, 상기 버퍼 조성은 80 ~ 120 mM Tris-HCl, 180 ~ 220 mM NaCl, 23 ~ 27 mM KCl, 8 ~ 12 mM MgCl₂, 3 ~ 7% 에탄올, pH 7.5 ~ 8.5 인 것을 특징으로 하는 리포좀-앱타머 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 환경호르몬은 17베타-에스트라다이올 (17beta-estradiol), 비스페놀 A (bis-phenol A), 노닐페놀 (nonylphenol), PHB (poly-hydroxybutyrate), 항생제 및 농약으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 리포좀-앱타머 복합체.
제 1항에 있어서, 상기 환경 호르몬은 17베타-에스트라다이올이고, 상기 핵산 앱타머는 서열번호 1 내지 8의 염기서열에서 선택된 하나의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 리포좀-앱타머 복합체.
SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 방법으로 표적 환경 호르몬에 특이적인 앱타머를 개발하는 단계; 단일 리피드 물질을 클로로포름에 녹인 후 증발시켜 지질이중층막을 형성하고 상기 환경호르몬에 최적으로 결합할 수 있는 버퍼를 넣어준 후 초음파 분쇄기를 이용하여 리포좀을 형성하는 단계; 상기 앱타머와 리포좀을 트리스(Tris) 버퍼에서 혼합하는 단계; 상기 혼합액에 에탄올/염화칼슘 용액을 섞어주고 PBS 용액으로 투석하는 단계; 및 고속원심분리기를 이용하여 리포좀-앱타머 복합체를 정제하는 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한항에 따른 리포좀-앱타머 복합체의 제조방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한항에 따른 리포좀-앱타머 복합체를 컬럼 또는 젤의 지지체에 유지시키는 단계 및 상기 지지체에 환경호르몬을 포함하는 시료를 통과시키는 단계를 포함하는 환경호르몬 제거방법.
서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 17베타-에스트라다이올에 특이적으로 결합 가능한 앱타머.