JP2012517805A - ビスフェノールaに特異的に結合する核酸アプタマー - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号2:5’−GCCGTTGGTG TGGTGGGCCY AGGGCCGGCG GCGCACAGCT GTTATAGACG YCTCCAGC−3’(Y=CまたはT)
配列番号3:5’−TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGKTSGRG−3’(K=GまたはT、S=CまたはG、R=AまたはG)
配列番号4:5’−ATCGARTKCC CSCGGCCG−3’(R=AまたはG;K=GまたはT;S=CまたはG)
配列番号5:5’−GTATTGTCNT NCNNATCCTC GNNCTNGCTG TCNT−3’(N=A、T、CまたはG)
配列番号6:5’−GCGGGTACCG TGCT−3’
配列番号7:5’−CGGTGGGTGG NNAGNTGNGA NA−3’(N=A、T、CまたはG)
#23:5’−TGCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAGGC TCCGACCTTG TCCCTGCCGC CACTCTCCCA−3’(配列番号9)
#47:5’−GCGGACGGGC TCGGCTCACC TAGGATGACC TGAGTACTGT CCCCGTGGCG CTAATTCGGG−3’(配列番号10)
#50:5’−CGGCCCGCCC CTAGGATGAC CTGAGTACTG TCCGCGGGAC GGTATCGCTG AGACAGGTGC−3’(配列番号11)
#41:5’−CGGCAGCCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCGAAAGAC TCCATGGTAC CCGGTGCTTA−3’(配列番号12)
#27:5’−GGGGGCGTCG NCCTAGGATG ACCTGAGTAC TGTCCGCACN CAGGGAGGAT GCATTGAC−3’(配列番号13)
#45:5’−GTGTCCCCAC GTCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCC AATG CCGCTCCTCC CGATGCAGAC−3’(配列番号14)
#11:5’−CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGACCTGA GGTCTGCCCA ACGGTGTTTA GAACCCCTTG−3’(配列番号15)
#12−3:5’−CGCAGCGCGC CCCTGAGTAC TGTCCGCCCA ACGGTGTGAC GGCCCTGCGA TCAACGATTG−3’(配列番号16)
#12−4:5’−GGGCCGTCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCCCAACGG TGTGACGGCC CTGCGATCAA−3’(配列番号17)
#22:5’−CCCTCGCCCT GAGTACTGTC CCCCGTCCGT CCGGTGAGGG CCACTATCGC TAACTGATCA−3’(配列番号18)
#12−5:5’−CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC−3’(配列番号20)
#6:5’−CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC−3’(配列番号21)
#12−7:5’−CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CCAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC−3’(配列番号22)
#12−9:5’−TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGGGG−3’(配列番号24)
#12−6:5’−TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGGTCGGG−3’(配列番号25)
#14:5’−GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTC CAGCG TAATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC−3’(配列番号27)
#46:5’−GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCACATC GAGTGCCCCC GGCCGGTGCT−3’(配列番号28)
#13:5’−CCTG GTATTG TCTTGCCAAT CCTCGCCCTG GCTGTCTTAC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG−3’(配列番号30)
#40:5’−GTCGCCACTG CGGGTACCGT GCTTGGGCNA CCGATGNACC NTGNNACCGT GTTTNGCC−3’(配列番号32)
#32:5’−GGGCGGTGGG TGGCGAGTTG TGAGACGCTG GAGGAGGTTG CTGCCCCCGG CACATTGGGA−3’(配列番号34)
1−1:ビスフェノールAアガロース親和性カラム(Bisphenol A-Agarose Affinity Column)の準備
ビスフェノールAに特異的に結合するアプタマーを分離するためにビスフェノールA−アガロース親和性カラムを次のように準備した。
次の配列を有するランダムssDNAライブラリーを化学的に合成してPAGE(Genotech Inc., Korea)で分離した。
5’−GGGCCGTTCGAACACGAGCATG−N60−GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGG−3’(配列番号35)
フォワードプライマー:5’−GGGCCGTTCGAACACGAGCATG−3'(配列番号36)
#31 5’−CGGCCCTAGG ATGACCTGAG TACTGTCCCT CACCCCTACT TCCGCCACTG GCCCAACAGC−3’(配列番号8)
#23 5’−TGCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAGGC TCCGACCTTG TCCCTGCCGC CACTCTCCCA−3’(配列番号9)
#47 5’−GCGGACGGGC TCGGCTCACC TAGGATGACC TGAGTACTGT CCCCGTGGCG CTAATTCGGG−3’(配列番号10)
#50 5’−CGGCCCGCCC CTAGGATGAC CTGAGTACTG TCCGCGGGAC GGTATCGCTG AGACAGGTGC−3’(配列番号11)
#41 5’−CGGCAGCCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCGAAAGAC TCCATGGTAC CCGGTGCTTA−3’(配列番号12)
#27 5’−GGGGGCGTCG NCCTAGGATG ACCTGAGTAC TGTCCGCACN CAGGGAGGAT GCATTGAC−3’(配列番号13)
#45 5’−GTGTCCCCAC GTCCTAGGAT GACCTGAGTA CTGTCCAATG CCGCTCCTCC CGATGCAGAC−3’(配列番号14)
#11 5’−CTCTTCNCTC CAATTCGTAA GATGACCTGA GGTCTGCCCA ACGGTGTTTA GAACCCCTTG−3’(配列番号15)
#12−3 5’−CGCAGCGCGC CCCTGAGTAC TGTCCGCCCA ACGGTGTGAC GGCCCTGCGA TCAACGATTG−3’(配列番号16)
#12−4 5’−GGGCCGTCCT AGGATGACCT GAGTACTGTC CGCCCAACGG TGTGACGGCC CTGCGATCAA−3’(配列番号17)
#22 5’−CCCTCGCCCT GAGTACTGTC CCCCGTCCGT CCGGTGAGGG CCACTATCGC TAACTGATCA−3’(配列番号18)
#4 5’−AGGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC−3’(配列番号19)
#12−5 5’−CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGTCTCCAGC−3’(配列番号20)
#6 5’−CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CTAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC−3’(配列番号21)
#12−7 5’−CCGCCGTTGG TGTGGTGGGC CCAGGGCCGG CGGCGCACAG CTGTTATAGA CGCCTCCAGC−3(配列番号22)
#12−2 5’−TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGAG−3’(配列番号23)
#12−9 5’−TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGTTGGGGG−3’(配列番号24)
#12−6 5’−TGACGGTGGC GTGGAGGGCG CGTATCAATC GTTGATCGCA GGGCCGTCAT ACCGGTCGGG−3’(配列番号25)
#2 5’−GCCGACAGGG CATGGGACGC TATCAGCGGT GTCAATCGAA TTCCCGCGGC CGCCATGCGG−3’(配列番号26)
#14 5’−GGTCCCCGCA GCTCATACGG CGCTCCAGCG TAATCGAATT CCCGCGGCCG CCATGCGGCC−3’(配列番号27)
#46 5’−GCGAGTGGCC CATCAGCAGA GCGTAATCCC CACGCACATC GAGTGCCCCC GGCCGGTGCT−3’(配列番号28)
#12 5’−GTATTGTCAT TCATATCCTC GTGCTTGCTG TCCTCACCCC ACCCACCAGA ATGGAAA−3’(配列番号29)
#13 5’−CCTGGTATTG TCTTGCCAAT CCTCGCCCTG GCTGTCTTAC CCCTCCCCAC CCGCCTGAAG−3’(配列番号30)
#48 5’−GTCGACTCGC GGGTACCGTG CTCAATGTCC CAATCCGGGG AAGCGTTTAG ACCCGCAGCC CAC−3’(配列番号31)
#40 5’−GTCGCCACTG CGGGTACCGT GCTTGGGCNA CCGATGNACC NTGNNACCGT GTTTNGCC−3’(配列番号32)
#3 5’−CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA−3’(配列番号33)
#32 5’−GGGCGGTGGG TGGCGAGTTG TGAGACGCTG GAGGAGGTTG CTGCCCCCGG CACATTGGGA−3’(配列番号34)
2−1:リアルタイムPCR方法を利用したビスフェノールAに対する結合親和度測定
リアルタイムPCR方法を利用して、SELEX方法を行う前の初期ssDNAプール(pool)、各11回目及び12回目選別ラウンドから分離して取得した湧出物(R11及びR12)、前記11回目選別ラウンド及び12回目選別ラウンドから取得したアプタマー(11回目選別ラウンドで#3(配列番号33)、#6(配列番号21);12回目選別ラウンドで#12−3(配列番号16)、#12−5(配列番号20))に対し結合親和度を測定した。この時、BPA結合されたカラムに対する対照群としてBPAが結合されていない対照群カラム(control-column)を使用した。
フォワードプライマー:5’−GGGCCGTTCGAACACGAGCATG−3’(配列番号36)
リバースプライマー:5’−CCTAGGATGACCTGAGTACTGTCC−3’(配列番号37)
一方、いくつかのアプタマーに対しM.Zukerに従って、Mfoldプログラムを使用し、自由エネルギーを最小化することで2次構造の分析を行ったところ、(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi)、この中アプタマー#3(配列番号33)及びアプタマー#12−5(配列番号20)の2次構造は図2Bに示した通りである。
結合アッセイを平衡ろ過法によって行った。Kd決定のために、フォルドされたssDNAの一連の希釈液は200μL反応溶液に75μMビスフェノールAを含む結合バッファーに溶解し、室温で1時間インキュベートした。混合物はYM3 Microcon filter columns(Amicon)にロードした後、12,000gで60分間遠心分離して、約160μLのろ過液を取得した。
y=(Bmax.ssDNA)/(Kd+ssDNA)
この時、yは飽和度(saturation)の程度で、Bmaxは最大結合地点の数で、Kdは解離(dissociation)常数である。
選別されたビスフェノールAアプタマーの親和度をテストするために、ゾル−ゲルチップを準備した。まず、ゾル−ゲルスポットを陰性対照群、ビスフェノールAと共に、図3に示したように陰性対照群(●)とビスフェノールA(●)をsciFLEXARRAYER(Scienion,Germany)を利用して表面改質されたシリコン表面に固定化した。
選別されたビスフェノールAアプタマーの親和度をテストするため、ゾル−ゲルチップを準備した。先ず、ゾル−ゲルスポットを陰性対照群、選別された複数のアプタマー(アプタマー#3及び#12−5)、陽性対照群と共に、図4に示したような順序で陽性対照群(P)、#12−5アプタマー、#3アプタマー及び陰性対照群(N)順にOmniGrid Accent Microarrayer(DIGI LAB, USA)を利用してPMMAコーティングされた96−ウェル上に固定化した。
ビスフェノールA特異的に結合するかを確認するため、アプタマー#3(配列番号33)を利用して追加的にビスフェノールAと類似する構造を有する他のビスフェノール類、例えば、図5Aに提示されたビスフェノールB(BPB)、4,4’−ビスフェノール(BP)、6FビスフェノールA(6F)等に対する実施例2−2の方法で親和性(Kd)を測定した。
前記#3(配列番号33)のtrimmed formアプタマーのビスフェノールAに対する結合力を確認するため、結合アッセイを平衡ろ過法によって行った。具体的には、下記配列番号38乃至配列番号41の配列と表され、図6と同じ構造を形成させた#3 trimmed formアプタマー(#3−tr1、#3−tr2、#3−tr3及び#3−tr4)を製作した。
#3−tr2:5’−TGCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCA−3’(配列番号39)
#3−tr3:5’−AGCATGCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCA−3’(配列番号40)
#3−tr4:5’−ACACGAGCATGCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGT−3’(配列番号41)
本発明に係るビスフェノールAに特異的に結合できる核酸アプタマーは、nMレベルの親和度を有し、極微量のビスフェノールAも検出することが可能で、ビスフェノールAとは一つのメチル基しか差がないビスフェノールB等の他のビスフェノール類に対しては親和性を示すことなく、ビスフェノールAに対してだけ特異的に検出できるため、従来検出が難しかった環境ホルモンであるビスフェノールAの検出及び除去に効果的である。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
Claims (17)
- 配列番号1〜7で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列を含むことを特徴とするビスフェノールAに特異的に結合できる核酸アプタマー。
- 前記アプタマーを構成する全てのヌクレオチドの数は、14〜63ntsであることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号1で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号8〜18で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号2で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号19〜配列番号22で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号3で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号23〜25で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号4で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号26〜28で表される核酸配列から選択されたいずれか一つの核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号5で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号29または配列番号30で表される核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号6で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号31または配列番号32で表される核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 前記配列番号7で表される核酸配列を含む核酸アプタマーは、配列番号33または配列番号34で表される核酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の核酸アプタマー。
- 配列番号8〜34で表される核酸配列のいずれか一つの核酸配列と90%以上100%未満の相同性を有する核酸配列であることを特徴とするビスフェノールAに特異的に結合できる核酸アプタマー。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸アプタマーを利用したビスフェノールAの検出方法。
- 前記ビスフェノールAは、水、土壌、空気、食品、廃棄物、動植物器官及び動植物組織のいずれか一つ以上から採取された試料から検出されることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸アプタマーを含有するビスフェノールAの検出用組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸アプタマーを含有するビスフェノールAの検出キット。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸アプタマーを含有するビスフェノールAの検出センサー。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸アプタマーを利用したビスフェノールAの除去方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸アプタマーを含有するビスフェノールAの除去用組成物。
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