KR101299157B1 - 신규한 화합물, 그 제조방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 화합물 및 그 용도와 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물, 구체적으로 약학 조성물, 더 구체적으로 신규한 화합물 및 이의 염을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 치료, 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 신경세포 보호능 및 신경세포사 억제능이 우수하고, 아교세포 활성 억제능이 뛰어나며, 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 뇌 해마조직 CA1 영역의 신경 손상을 효과적으로 예방할 수 있어서, 허혈성 뇌혈관 질환을 효과적으로 치료, 예방 및 개선하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한 이러한 효과가 동물실험을 통하여 확인되었으므로, 인체에 대한 부작용도 없거나 극히 적을 것으로 예상되므로, 뇌신경세포의 보호 및 뇌질환의 치료, 예방 또는 개선을 위해 다양하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 화합물, 그 제조방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물{A NOVEL COMPOUND, METHOD OF THE SAME AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME}

본 발명은 신규한 화합물, 그 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

최근 보고된 바에 의하면, 미국을 비롯한 선진국의 평균 수명이 급증하고 있어서, 2030년에는 65세 이상의 노령 인구의 경우 두 배 가량 늘어날 것으로 전망되고 있다. 상기 급속한 노령 인구의 증가와 함께 선진국과 일부 개발도상국의 사회경제적 환경이 구조적으로 변화함에 따라, 보건 및 의학분야에서도 지난 50여 년간 주요한 사망원인이 되었던 급성 전염성 질병보다는 만성 허혈성 질병에 대한 관심이 증대되고 있다. 특히, 급속한 노령 인구의 증가에 따라, 뇌, 척추 또는 말초신경 등의 손상을 포함한 허혈성 신경질환이 계속해서 증가하고 있는 추세이다.

우리나라의 경우에도 노령 인구의 비율을 살펴보면 지난 2000년 65세 이상 인구가 총인구에서 차지하는 비중이 7.2 %에 이르러 고령화 사회에 들어섰으며, 오는 2019년에는 이 비율이 14 %를 넘어 고령사회에 진입할 것으로 전망되고 있다. 노령화 인구의 증가로 인해서 지난 50여 년간 사망의 주된 원인이 되었던 급성 전염성 질병보다는 만성 허혈성 질병이 더욱더 큰 문제로 대두 되고 있다. 특히 만성 허혈성 질병 중에서 뇌혈관 질환에 의한 사망은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이다.

구체적으로, 2002년 WHO의 조사에 근거한 보고서에 의하면, 2000년 기준 세계 60억 인구 중 알츠하이머성 치매환자는 3,700만 명, 뇌졸중 환자는 4,100만 명으로 보고되고 있으며, 현재 뇌졸중을 비롯하여 알츠하이머성 치매, 파킨슨병 등 허혈성 뇌혈관 질환의 연간 시장규모는 미국이 200조 원, 한국이 약 10조 원에 달하며, 2004년 WHO에 근거한 OECD 보고서에 의하면 세계 뇌졸중 시장은 약 10조 원이며, 국내도 450 원억이 소비되는 것으로 알려져 있으며, 2010년에는 이보다 4 배 이상 증가하여, 해외는 약 41조, 국내는 약 2,500억 원의 시장 규모를 이룰 것으로 예상된다.

2005년에 발표된 2004년 통계청 발표 자료에 의하면, 뇌혈관질환은 우리나라 사망 원인에 2위를 차지하는 질환이고, 미국에서도 심장질환과 암에 이어 3번째 사망 원인에 해당하는 질환이다.

상기 뇌혈관 질환이란 흔히 뇌졸중이라고도 하며, 뇌혈류 이상으로 인해 갑작스레 유발되는 신경학적 결손 증상의 하나로, 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다.

하나는 주로 교통사고 등과 같이 외부의 충격에 의해서 뇌에 있는 혈관이 터져서 발생하는 뇌출혈과 같은 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환으로 뇌혈관 폐쇄 등과 같이 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소공급이 되지 못하여, 뇌세포가 죽게 되어 발생되는 질환으로, 뇌경색과 같은 허혈성 뇌질환이 있다. 우리나라의 뇌혈관질환은 약 27%가 뇌출혈인 반면, 약 69%가 뇌경색으로, 최근 들어서 점차적으로 뇌경색이 증가되고 있는 추세이다.

상기 뇌경색은 허혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소공급을 되지 못하여, 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환을 의미한다. 상기 뇌경색이나 뇌출혈로 인해 뇌의 기능을 잃게 되면 외견상 반신마비, 언어장애 및 의식장애 등의 신체증상이 나타나기도 하며, 심한 경우에는 사망을 할 수도 있다. 일 예로, 뇌졸증 환자의 15% 내지 30%는 반신마비나 정신발달 장애와 같은 영구적인 장애가 남게 되며, 근본적인 병인의 이해 및 치료기술 개발에 대한 수요가 증가되고 있음에도 불구하고, 치료 후에도 상당수가 재발하는 것으로 알려져 있다.

뇌혈관 질환 중 높은 발병률을 갖고 있는 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아, 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 유발되어 발생되는 질환을 의미한다. 또한, 상기 허혈성 뇌질환은 동맥경화나 심장마비와 같은 병리학적 상황에서 뇌에 혈액이 공급되지 않음으로써 유발되는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌혈관벽에 콜레스테롤이 침착되면서 생기거나 심혈관계통 내에서 생성된 혈전이 뇌혈관을 막거나, 기타 노폐물이 뇌혈관을 막아서 발병하게 되며, 뇌의 혈류가 감소되어 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아, 해마부위, 구체적으로 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 유발되어 발생된다.

상기 해마부위는 노화 및 각종 허혈성 질환에 의해 손상을 쉽게 받는 부위로 알려져 있으며, 특히 노화에 따라서 고유의 기능인 단기 및 일과적 기억이 현저하게 감소되는 것으로 알려져 있다. 이러한 노화에 따른 기능저하에 대해서 과거에는 신경세포의 손상에 의한 것으로 알려져 있고, 최근 들어 신경세포 손상 외에 신경세포 재생의 현저한 감소로 인해 해마 기능저하가 나타날 수 있는 것으로 보고되고 있다.

상기 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 유발되어 발생되는 질환을 의미하며, 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다.

또한, 허혈성 뇌신경세포사는 흥분성 세포독성, 산화적 스트레스, 질산화적 스트레스 및 세포예정사와 같은 기전에 의해서 유발된다고 알려져 있다. 특히, 일시적 대뇌허혈(transient cerebral ischemia)은 해마 CA1 영역의 피라밋 신경세포와 같은 취약한 세포에서 선택적 신경세포 사멸을 유발한다. 이러한 취약성은 글루타메이트(glutamate) 신경독성, 세포 예정사 단백질의 활성화, 미토콘드리아의 이상, 2차적 염증반응에 의한 것으로 생각되고 있다. 상기 지연성 신경세포사의 원인은 세포 내로 칼슘의 과다유입, 프리 라디칼(free radical) 관련 신경세포 손상 또는 글루타메이트-수용체 매개 신경세포 손상이라고 알려져 있다.

보다 구체적으로, 뇌허혈이 발생되면, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP(Adenosine Triphosphate)의 감소로 인해 능동수송의 역전이 발생되어, 신경세포의 탈분극이 일어나고, 시냅스의 글루타메이트(glutamate)가 유리되어 세포 외 글루타메이트의 농도가 증가한다. 상기 세포 외 글루타메이트의 축적은 NMDA(N-methyl-D-aspartic Acid), AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid) 및 메타보트로픽 글루타메이트 수용체(metabotropic glutamate receptor)의 연속적인 활성을 유도하여, 칼슘의 세포 내 과다 유입을 초래한다. 칼슘의 세포 내 유입은 특히 칼슘 의존성 프로테아제, 리파제 및 모듈레이터의 활동을 촉발시키고, 결국 프리 라디칼을 포함하는 세포 독성분자가 생성되어 DNA 및 세포막 등의 세포 구조물을 파괴하여 신경세포사가 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 신경세포사는 뇌허혈이 있은 후, 상당한 시간이 경과된 뒤에 나타나므로, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다.

상기 뇌신경계 질환 또는 허혈성 신경질환을 치료하기 위해서 세포 이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만 대부분이 위험요소와 부작용을 나타내고 있으며, 기전적인 연구를 바탕으로 뇌허혈시 유발되는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있으나, 손상 기전의 복잡성 등으로 실질적으로 신경세포의 손상을 보호하는 치료제는 개발되지 못하고 있는 실정이다.

지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직 플라스미겐 활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서, 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량 사용하거나, 자주 사용하는 경우에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발할 수 있어 문제가 된다.

또한, 초기의 세포 내 칼슘 유입을 효과적으로 저해함으로써 글루타메이트 유도 세포독성을 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행이 되었으나, 그 부작용으로 인해 약물을 폐기한 바 있다.

한편, 이외에도 많은 물질이 임상테스트를 실시하고 있으나, 뇌졸중에 대한 치료효과보다는 오히려 약물의 투여로 인해 나타나는 부작용이 매우 심각하여, 실제 약물로 사용기 어려운 것으로 보고되고 있다.

뿐만 아니라, 최근 뇌신경세포의 재생이 가능하다는 것이 보고되기는 하였으나, 이러한 뇌신경세포의 재생은 그 조직학적 특성을 고려하건데 용이하지 아니할 것으로 예상된다.

최근 천연물을 이용하여 뇌허혈에 의한 신경세포 사멸을 효과적으로 보호하기 위한 연구가 국내외적으로 무수히 많이 진행되고 있으며 일부 임상시험단계까지 연구가 되고 있지만, 아직까지 혈전용해제 이외에 임상적으로 사용되는 물질은 없는 실정이다.

따라서, 뇌혈관 질환의 특성을 고려해 볼 때 뇌혈관질환은 치료보다는 그에 대한 예방이 강조되고 있는 경향이며, 뇌신경세포를 효과적으로 보호할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

KR 0879816 B KR 2011-0090155 A KR 2011-0054452 A

Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, pp201-208(1984) Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69(1982) Kang TC, et al., J Neurocytol., 30, pp945-955(2001) Won MH, et al., Brain Res., 836, pp70-78(1999)

상기 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 허혈성 뇌혈관 질환을 효과적으로, 치료, 예방 또는 개선하고, 신경세포 보호능이 우수하며, 뇌허혈에 의한 뇌 손상을 억제할 수 있고, 항아교세포 활성 억제능이 뛰어나, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료, 예방 또는 개선에 효과가 있고, 부작용은 적은 신규 화합물, 상기 화합물의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물, 구체적으로 신규한 화합물 및 이의 염을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 치료, 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규한 화합물, 그 제조방법 및 이의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규한 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈 및 백질 이상증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 신경세포 재생용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 신경세포의 손상에 대한 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 뇌 손상에 대한 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 발명자들은 신경세포 보호능이 우수하고, 아교세포 활성 억제능이 우수한 물질의 경우 신경세포의 손상에 대한 치료 또는 예방 효과가 뛰어나 이와 관련된 질병의 치료 또는 예방 효과가 있을 수 있고, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료 또는 예방 효과도 있을 수 있다는 사실에 착안하여 이러한 효능이 있는 물질에 대해 연구하던 중, 신규한 화합물을 도출하였고, 이들의 제조법을 확립하였으며, 상기 화합물이 신경세포 보호능이 우수하며, 아교세포 활성 억제능이 뛰어나는 것을 동물모델을 이용한 실험을 통하여 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서 허혈성 뇌혈관 질환이란, 뇌의 혈류가 감소되어 산소와 포도당의 공급이 정상적으로 이루어지지 않아, 뇌세포 중 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 해마조직 CA1 영역의 신경세포에 지연성 신경세포사가 유발되어 발생되는 질환을 통칭하며, 일 예로 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈, 백질이상증, 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 헌팅턴병 중풍, 노인성 치매 등 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 조성물이란 명시된 성분들을 포함하는 생성물 또는 명시된 성분들을 명시된 양으로 포함하는 생성물뿐만 아니라 명시된 성분들의 배합물로부터 직접 또는 간접적으로 야기되는 생성물을 포함하는 의미이다.

본 발명에 있어서, 유효량 또는 치료학적 유효량이란 목적하는 치료, 경감, 억제 또는 예방 효과를 발생시키는 데 효과적인 본 발명의 유효성분 또는 조성물의 양을 의미한다.

본 발명의 한 실시예에 의하면, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 신경세포 재생용 약학조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 신경세포의 손상에 대한 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 뇌 손상에 대한 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

상기 허혈성 뇌혈관 질환이란 병적인 노화와 관련되어 뇌세포의 조기 사멸로 인해 임상적으로 인지기능 및 운동기능 등에서 병적인 소견이 발생 진행되는 병의 분류를 통칭한다. 노화에 따라서 고유의 기능인 단기 및 일과적 기억이 현저하게 감소되는 것으로 알려져 있고, 이러한 현상은 신경세포 손상 및 신경세포 재생의 현저한 감소로 인해 해마의 기능저하로 나타난다. 바람직하게는 노화로 인한 과립밑구역 부위에서의 신경세포의 재생 및 분화의 감소에 의한 해마의 기능성 저하일 수 있다.

상기 허혈성 뇌혈관 질환의 예로는 알츠하이머병, 파킨슨병, 기억력 감퇴, 노인성 치매 뇌출혈, 뇌신경 질환, 뇌허혈 및 허혈성 신경질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 더욱 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병 및 노인성 치매로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 동물실험을 통하여 확인한 결과, 신경세포 보호능 및 신경세포사 억제능이 우수하고, 아교세포 활성 억제능이 뛰어나며, 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 뇌 해마조직 CA1 영역의 신경 손상 예방효과가 우수한 것으로 확인되었다.

따라서, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 상기와 같은 효과를 가지고 있으므로, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료, 예방 또는 개선을 위한 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 허혈성 뇌혈관 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물은 허혈성 뇌혈관 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약 조성물일 수 있다.

상기 허혈성 뇌혈관 질환 치료 또는 예방용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 100 중량부 당 0.1 내지 200,000 중량부 범위에서 추가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 및 그 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 화학식 1의 구조를 갖는 화합물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 및 그 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다.

상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 및 그 염을 을 유효성분으로 포함하는 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 100 중량부 당 0.1 내지 200 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

또한, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 및 그 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.

구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 항균 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 전제, 침제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등일 수 있다. 더 나아가 본 발명의 치료용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA. 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 바람직한 투여량은 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 의약 조성물은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 양을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량과 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 신규한 화합물을 제공한다. 상기 신규한 화합물은 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물일 수 있으며, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 상기 신규한 화합물의 용도를 제공한다. 상기 용도는 의약적 용도 또는 약리적 용도일 수 있다. 구체적으로 상기 용도는 질병의 치료, 예방 또는 개선을 위한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 허혈성 뇌혈관 질환의 치료, 예방 또는 개선을 위한 용도일 수 있다.

또한, 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 신규한 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 화합물은 하기 반응식 1, 구체적으로 하기 반응식 2에 도시된 방법에 의해 제조될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다. 하기의 반응식 1은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 나타내는 것으로, 다른 화합물들은 당업자들에 의해 숙지된 시약 및 출발물질의 적당한 변화에 의해 제조될 수 있다. 또한, 하기 반응식 2는 상기 반응식 1의 일 예로, 상기 반응에 있어서, 첨가되는 용매 등을 일 예로 예시한 것이다.

상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 제조하는 방법은 하기 반응식 1에 기재된 바에 의할 수 있다.

[반응식 1]

보다 상세하게는, 상기 반응식 1의 제조방법은, 하기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물, 구체적으로 알파 리포익 산(alpha-lipoic acid, 화학식 2)을 하기 화학식 7의 구조를 갖는 화합물, 구체적으로 데커시놀(decursinal, 화학식 3)과 반응시켜, 하기 반응식 1의 구조를 갖는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 신규한 화합물의 제조방법일 수 있다.

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 반응식 1에서 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 제조하는 방법은 일 예로, 하기 반응식 2에 의해 수행될 수 있다.

[반응식 2]

보다 구체적으로, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물을 디클로로메탄에 녹인 후, 상기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물을 반응시켜 제조하는 방법일 수 있다.

일 예로, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물과 상기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물을 반응시켜 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 제조하는 방법은 상기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물을 디클로로메탄(MC)에 녹인 후, DMAP(4-Dimethylaminoprtidine) 및 에틸렌디클로라이드(EDC, ethylene dichloride)를 첨가하고 반응시킨 후, 상기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물을 첨가하고 반응시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 신규 화합물은 신경세포 보호능 및 신경세포사 억제능이 우수하고, 아교세포 활성 억제능이 뛰어나며, 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 뇌 해마조직 CA1 영역의 신경 손상 예방효과가 우수하여, 상기 효과로 인하여 허혈성 뇌혈관 질환을 효과적으로 치료, 예방 및 개선하는데 유용하게 사용할 수 있고, 또한 이러한 효과가 동물실험을 통하여 확인되었으므로, 인체에 대한 부작용도 없거나 극히 적을 것으로 예상되므로, 의약 조성물 또는 건강기능식품 조성물과 같은 다양한 용도로 널리 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 신규한 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 뇌허혈 유발 후 4일이 경과된 실험동물의 해마조직을 크레질 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하여 촬영한 사진으로, 상기 A는 뇌허혈을 유발시키지 않은 정상군(Sham)의 해마전체를 촬영한 사진이고, B는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 C는 용매만을 투여한 후 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle)의 해마전체를 촬영한 사진이고, D는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 E는 20 mg/kg의 알파 리포익산(LA) 을 투여한 군의 해마전체를 촬영한 사진이고, F는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 G는 20 mg/kg의 데커시놀(DA)을 투여한 군의 해마전체를 촬영한 사진이고, H는 CA1 영역을 촬영한 사진이며, 상기 I는 20 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군의 해마전체를 촬영한 사진이고, J는 CA1 영역을 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 신규한 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위한 것으로, 신경세포 생존률을 뇌허혈 유발 4일 후에 생존해 있는 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 뇌허혈을 유발시킨 대조군을 의미하며, LA는 20 mg/kg의 알파 리포익산을 투여한 군을 의미하고, DA 는 20 mg/kg의 데커시놀을 투여한 군을 의미하며, LA+DA는 20 mg/kg의 상기 화합물을 투여한 군을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 신규한 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위한 것으로, 뇌허혈 유발 후 4일이 경과된 실험동물의 해마조직의 CA1 영역을 사멸 신경세포에 대한 Fluoro-Jade B(F-JB)를 이용하여 형광염색한 사진이다. 상기 사진에서 A는 뇌허혈을 유발시키지 않은 정상군(Sham)을 의미하고, B는 용매만 투여한 후 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle)을 의미하며, C는 10 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미하고, D는 20 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 신규한 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위한 것으로, 뇌허혈 유발 4일 후에 사멸한 세포수를 대조군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 뇌허혈을 유발시킨 대조군을 의미하며, 10 mg은 10 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미하며, 20 mg은 20mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미한다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 신규한 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위하여, 뇌허혈 유발 후 4일이 경과된 실험동물의 해마조직의 CA1 영역을 별아교세포의 표지자인 항-GFAP(GFAP) 항체(A, C, E 및 G), 미세돌기아교세포의 표지자인 항-Iba-1(Iba-1) 항체(B, D, F 및 H)를 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법으로 관찰한 사진이다. 상기 사진에서 A 및 B는 정상군(Sham)을 의미하고, C 및 D는 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle)을 의미하며, E 및 F는 10 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미하며, G 및 H는 20 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 신규한 화학식 1의 구조를 갖는 화합물의 허혈성 뇌혈관 질환 보호 효과를 알아보기 위한 것으로, 도 6a는 뇌허혈 유발 4일 후에 GFAP로 염색된 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이고, 도 6b는 뇌허혈 유발 4일 후에 Iba-1으로 염색된 세포수를 정상군에 대한 상대적 수치로 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 Sham은 정상군을 의미하고, Vehicle은 뇌허혈을 유발시킨 대조군을 의미하며, 10 mg은 10 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미하고, 20 mg은 20 mg/kg의 상기 화합물(LA+DA)을 투여한 군을 의미한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규 화합물의 제조

신규 화합물을 제조하기 위해 알파 리포익산과 데커시놀을 반응식 2의 방법으로 반응시켜 제조하였다.

구체적으로, 하기 화학식 2의 알파 리포익 산(alpha-lipoic acid, 0.86 g 4.47 mmol)을 CH₂Cl₂(20 ml)에 녹인 후, DMAP 0.12 g(1.02 mmol)와 EDC (0.86 g, 4.47 mmol)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 아르곤 조건에서 교반하였다. 이후, 하기 화학식 3의 데커시놀(Decursinol, 0.5 g, 2.03 mmol)을 넣고 아르곤 조건에서 24시간 환류반응 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

[화학식 2]

[화학식 3]

유기층을 H₂O로 씻어준 후에 무수 MgSO₄로 처리 후 유기 용매를 제거하였다. 남은 합성물을 실리카 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc : Hexane = 1 : 2)로 분리하여 화합물을 수득하고, 이를 분석하여 다음과 같은 결과를 수득하여, 생성된 화합물이 하기 화학식 1의 화합물(LA+DA), 구체적으로 (S)-2,2-dimethyl-8-oxo-2,3,4,8-tetrahydropyrano[3,2-g]chromen-3-yl 5-(1,2-dithiolan-3-yl)pentanoate인 것을 확인하였다. 상기 생성된 화합물은 0.45 g으로 총 수율이 51%인 것으로 확인되었다(RF = 0.57 at EtOAc:Hexane=1:1).

¹H NMR (CDCl₃,400MHz) 1.35(s, 3H), 1.38(s, 3H), 1.42(m, 2H), 1.68(m, 4H), 1.90(m, 1H), 2.33(t, J=7.2, 2H), 2.45(m, 1H), 2.83(d, J=4.8, 1H), 2.88(d, J=4.8, 1H), 3.15(m, 2H), 3.48(m, 1H), 5.05(t, J=4.8, 1H), 6.23(d, J=9.6, 1H), 6.80(s,1H), 7.17(s,1H), 7.59(d, J=9.6, 1H)

[화학식 1]

실시예 2: 실험동물을 이용한 신규 화합물의 뇌허혈 시 신경세포 보호효능 측정1

상기 실시예 1에서 제조된 상기 화학식 1의 화합물의 신경세포 보효효능을 체중 65g 내지 75g인 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Harlan, USA)을 마취시켜 온목동맥(common carotid artery)을 노출 후 결찰하여 뇌허혈을 유발시킨 후에, 몽골리안 저빌의 해마조직을 염색하여 관찰하는 방법을 통하여 확인하였다.

실시예 2-1. 실험동물의 사육

체중 65 내지 75g의 수컷 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus, Halan, USA) 40 마리를 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기, 21℃ 내지 25℃의 온도 및 45% 내지 65%의 상대습도의 조건에서 사육하였다. 실험동물의 사료는 일반적인 펠렛건조 사료(대한실험동물, 대한민국)를 사용하였고, 사료와 물은 상시로 섭취할 수 있게 하였다.

실시예 2-2. 뇌허혈시 신경세포 보호효능 측정

상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)의 신경세포 보호효과를 확인하기 위해, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포의 사멸 방지 효과를 추가적으로 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 사육한 실험동물에 알파 리포익산(LA)과 데커시놀(DA) 및 상기 실시예 1에서 제조된 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 실험동물 체중 1 kg 당 20 mg이 되도록 1% DMSO에 용해하여, 뇌허혈 유발 3일 전부터 매일 식도용 바늘을 이용하여 실험동물에 경구투여하였다. 또한, 투여 용량에 대한 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1에서 사육한 실험동물에 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 실험동물 체중 1kg 당 10 mg이 되도록 1% DMSO에 용해하여, 뇌허혈 유발 3일 전부터 매일 식도용 바늘을 이용하여 실험동물에 경구투여하였다.

상기 3일간 상기 알파 리포익산, 데커시놀 또는 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 투여한 후에, 질소와 산소가 7 : 3으로 혼합된 가스에 3% 이소플루란(isoflurane, Baxtor, USA)을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물을 전신마취하였다. 상기의 질소와 산소 혼합가스에 2.5% 이소플루란을 혼합한 가스를 이용하여 실험동물의 마취상태를 유지하면서 실험동물에 대한 수술을 수행하였다.

실험동물에 대한 수술은 목 부위의 털을 깎고 소독한 다음 절개를 하여 양쪽 온목동맥을 노출시키고, 동맥류 클립(aneurysm clip, Staelting, USA)을 이용하여 5분 동안 결찰하여 뇌허혈을 일으킨 후, 클립을 제거하여 재관류시키는 방법으로 수행하였다. 이때, 각 실험군은 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 망막중심동맥(central artery of retina)의 혈액 순환 유무를 관찰하여 완전한 온목동맥의 폐쇄여부를 확인하였다.

뇌허혈을 유발시키는 동안 직장 내 체온계를 삽입하여 체온을 측정하였으며, 실험동물의 온도에 따라 자동으로 조절되는 온열 패드를 사용하여 체온을 정상 체온인 36.7℃ 내지 37.3℃로 일정하게 유지시켰다.

상기 실험동물은 뇌허혈 유발 4일 후에 티오펜탈 소듐(thiopental sodium, 유한양행, 대한민국)을 체중 1 ㎏ 당 각각 30㎎의 용량으로 복강 내 주사하여 마취시킨 다음, 1,000 ㎖ 당 헤파린 1,000 IU를 함유한 4 ℃의 생리식염수를 좌심실로 주입하여 관류 세척하였다. 관류 세척이 완료된 상기 동물에 대해 4℃의 4% 파라포름알데하이드(0.1 M 인산완충액(in 0.1 M phosphate buffer; PB), pH 7.4)를 이용하여 관류고정을 수행하였다.

뼈절단기를 이용하여 관류 고정이 끝난 실험동물의 머리뼈 공간을 열어 뇌를 적출하였다. 적출된 실험동물의 뇌를 4℃의 4% 파라포름알데하이드(in 0.1 M phosphate buffer; PB, pH 7.4)를 이용하여 4시간동안 후고정하였다. 후고정이 끝난 뇌는 30% 수크로스 용액(in 0.1 M 인산 완충액(phosphate buffer))에 넣어 바닥에 가라앉을 때까지 침강시킨 후, 슬라이드 마이크로톰(sliding microtome, Reichert-Jung, 독일)으로 상기 뇌의 조직을 30 ㎛ 두께로 잘라 조직절편을 만들었다. 상기의 조직절편을 보존액(storing solution)이 들어있는 6웰 플레이트에 넣어 염색을 수행할 때까지 4℃에서 보관하였다.

상기 만들어진 조직절편 중에서 해마형성체(hippocampal formation)가 잘 나와 있는 조직을 선택하고, 조직절편에 묻어있는 보존액을 없애기 위해 0.01M PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 상기 세척된 조직절편을 젤라틴 입힌 슬라이드에 도말하여 37℃에서 충분히 건조시켰다. 충분히 건조시킨 상기 조직절편을 증류수에 잠시 담가 둔 후, 2% 크레실 바이올렛 아세테이트(cresyl violet acetate, Sigma, USA) 용액에 1분간 담가 조직절편의 염색을 수행하였다.

상기의 염색한 조직절편을 흐르는 물에 충분히 세척하여 슬라이드에 묻어 있는 과량의 염료를 제거하였다. 상기 과량의 염료를 제거한 조직절편을 증류수에 잠시 담근 후에 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 에탄올 용액으로 순차적으로 처리하여 탈수 및 과량의 크레실 바이올렛 세척을 수행하였다. 상기 조직절편에서 니슬소체(Nissle body)가 보이는 것을 확인한 후, 자일렌(Junsei, 일본)에 담가 투명화한 다음 카나다 발삼(Canada Balsam, Kanto, 일본)으로 봉입하였다.

대조군은 상기 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 녹이는데 이용된 1% DMSO만을 경구투여한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 준비하였으며, 정상군은 알파 리포익산(LA)과 데커시놀(DA) 및 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 포함한 어떠한 물질도 투여하지 않고, 허혈-재관류 수술도 시행하지 아니하였으며, 정상군의 조직절편은 상기와 동일한 방법으로 준비하였다.

디지털 카메라(Axiocam, Cal Zeiss, Germany)가 부착되어 있는 악시오엠1 현미경(AxioM1 microscope, Carl Zeiss, 독일)으로 전체 해마 영역을 25배, CA1 영역을 200배로 각각 확대하여 각 조직절편들을 사진 촬영하였다. 상기 가자 추출물 및 분획물을 투여한 실험군, 대조군 및 정상군의 조직절편을 촬영한 결과를 도 1에 나타내었다. 유의성의 검증을 위하여, 상기 도 1은 각 군 중에서 가장 일반적인 부분을 골라 촬영한 사진이다.

또한, 상기 촬영한 사진에 대해 이미지 분석기(Optimas 6.5, USA) 프로그램을 이용하여 보라색으로 염색된 상기 조직절편의 신경세포를 계수하였다. 각 군에 대한 유의성의 검증을 위하여 일원분산분석(one-way ANOVA test)을 수행하였다. 상기 측정한 조직절편의 신경세포를 계수한 결과를 정상군(Sham)에 대한 상대적인 수 즉, 정상군의 신경세포 계수결과를 100%로 하여 각 실험군의 계수결과를 도 2에 나타냈다.

상기 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 정상군(Sham, 도 1의 A 및 B)은 해마의 영역 전체에서 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되고, 특히 CA1 영역에서는 피라미드층에 신경세포가 밀집하여 있는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, 추출물을 투여하지 아니하고 뇌허혈을 유발시킨 대조군(Vehicle, 도 1의 C 및 D)의 경우, 뇌허혈에 의한 지연성 신경세포사로 인해 해마의 영역 중 CA1 영역에서 신경세포사가 일어남으로써 신경세포의 염색이 거의 관찰되지 않았고, CA1 영역 중 피라미드층에 대부분의 신경세포가 소실되었음이 확인되었다. 한편, 20 ㎎/㎏의 알파 리포익산(LA, 도 1의 E 및 F) 또는 데커시놀(DA, 도 1의 G 및 H)을 투여한 실험군의 경우 대조군과 유사하게 해마의 영역 중 CA1 영역에서 신경세포사가 일어나 신경세포의 염색이 거의 관찰되지 않았고, CA1 영역 중 피라미드층에 대부분의 신경세포가 소실되었음이 확인되었다. 하지만, 20 mg/kg의 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 투여한 실험군(도 1의 I 및 J)의 경우 대조군이나 리포익산 또는 데커시놀을 투여한 군과 비교하였을 때 해마의 영역 전체에서 많은 수의 신경세포가 보라색으로 진하게 염색되고, CA1 영역의 피라미드층에서도 신경세포가 밀집하여 있는 것이 관찰되었다. 상기 결과로부터, 알파 리포익산 또는 데커시놀과 구분되는 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)의 신경세포 보호효과를 확인하였다.

또한, 상기 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군은 정상군에 비하여 해마의 CA1 영역 신경세포의 수가 약 16.7% 정도로 관찰되었고, 알파 리포익산 또는 데커시놀을 투여한 경우도 대조군과 유사하게 관찰된 반면, 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)을 투여한 군(20 mg)의 경우, 약 60.2%의 신경세포가 생존한 것으로 확인되어, 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)은 신경세포보호에 탁월한 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

상기 20 mg의 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)의 경우 정상군 대비 각각 60.2%의 신경세포가 계수되어, 뇌허혈 등이 발생하는 경우에도 정상군과 유사한 정도의 신경세포가 유지되는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 화학식 1의 화합물(LA+DA)의 경우, 뇌의 일정 부분 또는 전체의 신경세포의 사멸을 억제할 수 있어서, 뇌허혈이 일어난 경우에도 운동, 언어, 시각 또는 후각 등의 관련 부위의 신경세포 손상을 최대한으로 억제하여, 뇌허혈에 의한 허혈성 뇌혈관 질환이나 운동손실, 감각의 마비, 언어장애, 시각 및 후각 장애와 같은 뇌기능 저하를 예방 또는 개선할 수 있으므로, 상기 화학식 1의 화합물은 신경세포 보호효과가 매우 탁월한 것으로 평가될 수 있다.

실시예 3. 실험동물을 통한 신규한 화합물의 뇌허혈 시 신경세포 보호효능 측정2

상기 실시예 1에서 제조된 상기 화학식 1의 화합물의 신경세포 보호 효과, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포의 사멸 방지 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에서 우수한 것으로 확인된 상기 화학식 1의 화합물의 신경세포 보호효과를 추가로 확인하기 위하여, 사멸된 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B를 이용하여 조직 형광염색을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2의 방법으로 준비된 실험동물 체중 1 kg 당 10 mg 또는 20 mg이 되도록 1% DMSO에 용해한 것을 투여한 후, 뇌허혈을 유도한 실험동물의 조직절편 중 해마복합체가 잘 나타난 조직절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 퇴행신경세포의 표지자인 Fluoro-Jade B(F-J B)를 이용하여 조직형광염색을 수행하였다. 상기 조직절편을 증류수를 이용하여 5분간 3회 세척한 후, 0.06% potassium permanganet 용액에 15분간 담구었다. 이후, 증류수로 2분간 세척하고 0.1% 아세트산(acetic acid)이 포함된 0.001% F-J B(Histochem, Jefferson, AR, USA) 용액에 30분간 담그어 염색을 수행하였다. 상기 염색된 조직은 1분씩 3회 증류수로 세척하고, 50℃ slide warmer에서 20분간 건조한 후, 자일렌(xylen)에 담근 다음, DPX(Sigma, USA)로 봉입하였다. 상기 봉입된 조직을 형광현미경(Ex : 385 nm, Em : 425 nm)을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 촬영한 사진을 촬영하여 도 3에 나타내었다.

또한, 상기 촬영한 사진에 대해 상기 실시예 2-2와 같이 이미지 분석기 프로그램을 이용하여 염색된 신경세포를 계수하였으며, 상기 계수한 결과를 대조군(Vehicle)에 대한 상대적인 수치로 도 4에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상군(Sham, 도 3의 A)은 해마의 CA1 영역 전체가 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B에 의해 거의 염색되지 아니한 반면, 대조군(Vehicle, 도 3의 B)의 경우에는 해마의 CA1 영역 전체에서 진하게 형광염색되어, 다수의 신경세포가 사멸 또는 사멸중인 것으로 확인되었으며, 10 mg/kg의 상기 화학식 1의 화합물을 투여한 군의 경우, 대조군과 유사하게 해마의 CA1 영역 전체에서 진하게 형광염색되어, 다수의 신경세포가 사멸 또는 사멸중인 것으로 확인되었다. 하지만, 20 mg/kg의 상기 화학식 1의 화합물을 투여한 군의 경우 해마의 CA1 영역 전체에서 상기 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B에 의해 형광염색된 세포들이 소수 관찰되었다. 상기 결과로부터, 20 mg/kg의 상기 화학식 1의 화합물을 처리한 경우 허혈 발생에 의해서도 신경세포 사멸 정도가 현저하게 감소되는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 20 mg/kg의 화학식 1의 화합물을 처리한 실험군의 경우, 사멸된 신경세포 또는 사멸중인 신경세포에 대한 표지자인 Fluoro-Jade B로 염색된 신경세포의 수는 정상군의 약 39.7% 정도에 불구하여, 20 mg/kg의 함량으로 화학식 1의 화합물을 처리하는 경우, 신경세포 보호효과가 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 4. 실험동물을 통한 신규한 화합물의 뇌허혈 시 신경세포 보호효능 측정3 (아교세포 활성변화 측정)

상기 실시예 1에서 제조된 상기 화학식 1의 화합물의 신경세포 보호 효과, 보다 구체적으로 뇌허혈에 의한 신경세포의 사멸 방지 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 상기 화학식 1의 화합물을 투여시킨 투여군에 대하여 추가적으로 별아교세포와 미세돌기아교세포의 활성 변화를 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 3과 같이 상기 실시예 2의 방법으로 준비된 실험동물 체중 1 kg 당 10 mg 또는 20 mg이 되도록 1% DMSO에 용해한 것을 투여한 후, 뇌허혈을 유도한 실험동물의 조직절편 중 해마복합체가 잘 나타난 조직절편 중 해마복합체가 잘 나타난 조직절편을 선택하여 실험에 사용하였으며, 상기 선택된 조직절편은 상기 실시예 2에 기재된 방법을 응용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다.

상기 면역조직화학 염색과정에서, 별아교세포의 변화를 확인하기 위한 1차 항체로는 1:1000으로 희석한 항-GFAP(rabbit anti-GFAP, Chemicon, USA)와 반응시켰고, 미세돌기아교세포의 변화를 확인하기 위한 1차 항체로는 1:1000으로 희석한 항-Iba-1(rabbit anti-Iba-1, Wako, Japan)를 사용하였다. 상기 1차 항체를 사용하여 상기 실시예 2에 기재된 방법을 응용하여 면역조직화학 염색과정을 수행한 후, 봉입한 조직절편을 전자 현미경을 이용하여 관찰하였으며, 그 관찰결과를 촬영한 사진을 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 10 mg/kg이 아닌 20 mg/kg의 화학식 1의 화합물을 투여한 실험군의 경우 용매를 투여한 대조군에 비해 별아교세포의 표지자로 알려진 항-GFAP(GFAP)의 발현 및 미세돌기아교세포의 표지자로 알려진 항-Iba-1(Iba-1)의 발현이 상당히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 촬영한 사진에 대해 상기 실시예 2와 같이 이미지 분석기 프로그램을 이용하여 염색된 신경세포를 계수하였으며, 상기 계수한 결과를 대조군(Vehicle)에 대한 상대적인 수치로 도 6에 나타내었다.

또한, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 상기 별아교세포에 대한 1차 항체인 GFAP에 의해 염색된 세포 즉, GFAP에 대한 면역반응성이 확인된 별아교세포는 대조군의 경우 정상군에 대비하여 약 168.3%로 확인되었으나, 10 mg/kg의 화학식 1의 화합물을 투여한 실험군의 경우 정상군에 대비하여 약 163.5%로 확인되었으며, 20 mg/kg의 화학식 1의 화합물을 투여한 실험군의 경우 정상군에 대비하여 약 127%로 확인되었다.

또한, 상기 도 6b에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 미세돌기아교세포에 대한 1차 항체인 Iba-1에 의해 염색된 세포 즉, Iba-1에 대한 면역반응성이 확인된 미세돌기아교세포는 대조군의 경우 정상군에 대비하여 약 205.7 확인되었으나, 10 mg/kg의 화학식 1의 화합물을 투여한 실험군의 경우 정상군에 대비하여 약 195.7%로 확인되었으며, 20 mg/kg의 화학식 1의 화합물을 투여한 실험군의 경우 정상군에 대비하여 약 134.3%로 확인되었다. 따라서, 20 mg의 화학식 1의 화합물을 투여한 실험군에서는 정상군에 비해서 별아교세포와 미세돌기아교세포가 활성화되기는 하였으나, 대조군과 비교하여 비정상적인 활성화를 최대한 억제하여, 상기 화학식 1의 화합물이 신경세포보호에 탁월한 효과를 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 허혈을 유발시킨 경우에서도 신경세포 특히, 해마 영역을 염색한 신경절편을 관찰한 결과 해마의 전체 영역, 해마의 CA1 영역에서의 신경세포사를 억제하는 것으로 확인되었고, 사멸된 신경세포에 대한 표시자인 F-J B를 통해 확인한 결과 신경세포사의 사멸이 현저하게 억제됨이 확인되었으며, 항-GFAP, 항-Iba-1 항체를 통하여 확인한 결과 아교세포의 활성화를 매우 우수하게 억제할 수 있음이 확인되었으므로, 상기 화학식 1의 화합물은 신경세포보호에 탁월한 효과가 있을 뿐만 아니라, 아교세포의 활성화 억제 효과도 우수한 것으로 평가되었다.

따라서, 상기 화학식 1의 화합물은 허혈에 의해 발생되는 지연성 신경세포사를 현저하게 억제할 수 있으므로, 뇌허혈이 일어난 경우에도 운동, 언어, 시각 또는 후각 등의 관련 부위의 신경세포 손상을 최대한으로 억제하여, 뇌허혈에 의한 허혈성 뇌혈관 질환이나 운동손실, 감각의 마비, 언어장애, 시각 및 후각 장애와 같은 뇌기능 저하를 예방 또는 개선할 수 있을 것이다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환 치료 또는 예방용 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제1항에 있어서,
   상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈 및 백질 이상증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 허혈성 뇌혈관 질환 치료 또는 예방용 조성물.
3. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 신경세포 재생용 약학조성물.
   [화학식 1]
   

   
4. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 신경세포의 손상에 대한 치료 또는 예방용 조성물.
   [화학식 1]
   

   
5. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 뇌 손상에 대한 치료 또는 예방용 조성물.
   [화학식 1]
   

   
6. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
   [화학식 1]
   

   
7. 하기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물을 하기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물과 반응시켜 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 제조하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   [화학식 3]
   

   

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