CN107753483B

CN107753483B - 具有细胞坏死抑制活性的药物及其应用

Info

Publication number: CN107753483B
Application number: CN201610687884.1A
Authority: CN
Inventors: 何苏丹; 郑计岳; 马海阔; 张小虎
Original assignee: Accro Bioscience Inc
Current assignee: Econo Biopharmaceutical (Suzhou) Co., Ltd.
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2036-08-19
Also published as: CN107753483A

Abstract

本发明提供了一种具有细胞坏死抑制活性的药物。该具有细胞坏死抑制活性的药物包含下列化合物中的一种或两种：

本发明还提供了上述的具有细胞坏死抑制活性的药物在作为制备治疗和预防与细胞坏死相关的炎症类疾病、代谢类疾病和神经退行性疾病的药物中的应用。本发明的具有细胞坏死抑制活性的药物能够有效抑制细胞坏死，从而能够用于治疗与细胞坏死相关的炎症类疾病、代谢类疾病和神经退行性疾病等疾病。

Description

具有细胞坏死抑制活性的药物及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有细胞坏死抑制活性的药物及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

细胞的死亡存在不同类型，根据形态学特征，可以把细胞死亡分成凋亡和坏死两种最基本类型。细胞凋亡的特征是细胞质萎缩，核固缩，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)活性增加，最终细胞裂解。由于凋亡通常是生理性变化，故不引起炎症反应。而细胞坏死，曾经被认为是发生在一个能量供应障碍的情况下，涉及膜的完整性丧失，随后细胞肿胀，最终细胞裂解。由于细胞坏死一般会有细胞内容物流出，故会引起炎症反应。

细胞坏死在早期的研究中被定义为一种被动的、偶然性的细胞死亡，并且是不能调控的，没有规律的死亡过程。但之后的研究表明在TNF-α刺激下，一部分细胞并不选择凋亡途径死亡而是选择了坏死途径，如L929细胞系以及韩实验室发现的NIH3T3N细胞系。而近期几篇关于RIPl及RIP3在TNF-α诱导的细胞坏死通路中所起作用的研究为细胞坏死机制的阐明打下了很好的基础(Cho，Y.S.等人.Cell，2009，137(6)：1112-23.；Zhang，D.W.等人，Science，2009，325(5938)：332-336.；He，S.等人，Cell，2009，137(6)：l100-1111.)。

当细胞内的细胞凋亡途径受损或被抑制时，细胞坏死途径被激活，RIPl与FADD、caspase8结合并募集到RIP3形成一个坏死前体复合体，促使RIP3的磷酸化，而MLKL激酶结构域的第357位苏氨酸和358位丝氨酸被PIP3磷酸化，磷酸化的MLKL由单体状态向寡聚体状态转化，寡聚化的MLKL结合磷酸肌醇和心肌磷脂，使整个necrosome复合体从细胞质转移到细胞膜或细胞器膜上，并在这些膜结构上形成通透性孔道，破坏膜的完整性，引发细胞坏死。另外磷酸化后的RIP3与下游底物糖原磷酸酶(glutamate ammonia ligase)、谷氨酸脱氢酶l(glutamate dehydrogenase 1)和PYGL(glycogenphosphrylase)，三个蛋白均是代谢途径中的酶，相互结合，上调糖原磷酸酶以及谷氨酸脱氢酶1的活性，过量产生相关底物—磷酸化葡萄糖和酮戊二酸，加速线粒体内三羧酸循环，引起活性氧物质(reactive oxygenspecies，ROS)过量聚集，进一步导致细胞出现坏死。因此抑制细胞坏死可能成为治疗代谢类疾病如糖尿病的潜在靶点。

程序性细胞坏死参与了神经系统最基本的组成部分——神经元和神经胶质细胞在损伤中的死亡。大量研究表明，阻断程序性细胞坏死发挥神经保护作用。各项研究希望通过逆转细胞死亡减轻组织损伤从而达到降低功能损伤的目的。故阻止细胞死亡常为神经损伤相关疾病治疗的靶点。例如缺血性脑卒中，脑循环障碍导致局部或全面脑缺血缺氧，大量神经元死亡影响其支配的神经运动功能，由此，减少神经元的死亡或成为治疗缺血性脑卒中的目标。

由上可见，要改善因上述因细胞坏死引起的相关病症，就需要有效的细胞坏死抑制剂。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是一种具有细胞坏死抑制活性的药物及其应用，该具有细胞坏死抑制活性的药物能够有效抑制细胞坏死，从而能够用于治疗与细胞坏死相关的炎症类疾病、代谢类疾病和神经退行性疾病等疾病。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种具有细胞坏死抑制活性的药物，其包含下列化合物中的一种或两种：

本发明还提供上述的具有细胞坏死抑制活性的药物在作为制备治疗和预防与细胞坏死相关的炎症类疾病的药物中的应用。

上述的应用中，优选的，所述与细胞坏死相关的炎症类疾病包括急性胰腺炎或结肠炎。

上述的应用中，优选的，所述与细胞坏死相关的炎症类疾病包括视网膜脱落。

上述的应用中，优选的，所述与细胞坏死相关的炎症类疾病包括缺血性心脑血管疾病。

本发明还提供上述的具有细胞坏死抑制活性的药物在作为制备治疗和预防与细胞坏死相关的代谢类疾病的药物中的应用。

上述的应用中，优选的，所述与细胞坏死相关的代谢类疾病包括糖尿病。

本发明还提供上述的具有细胞坏死抑制活性的药物在作为制备治疗和预防与细胞坏死相关的神经退行性疾病的药物中的应用。

上述的应用中，优选的，所述与细胞坏死相关的神经退行性疾病包括多发硬化症。

上述的化合物Ⅰ、Ⅱ作为抗程序性细胞坏死的药学概念目前国内外未见报道。但是，本发明人的大量细胞试验和整体药效学试验研究结果证实，化合物Ⅰ和Ⅱ具有显著的治疗与坏死相关性疾病的疗效。

化合物Ⅰ和Ⅱ在多种人类细胞株中有明显的抗TNF-α诱导细胞坏死的作用。例如在HT29细胞中的半数抑制率(IC₅₀)分别为0.69μM和0.25μM，而10μM浓度下，对人胃癌细胞MKN45，人大肠癌细胞株174T人组织淋巴瘤细胞株U937的抑制率分别为75％和70％、100％和100％、90％和100％；而对于由Trail受体和Toll样受体信号通路介导的细胞坏死，化合物Ⅰ和Ⅱ也有明显的抑制效果。

临床前动物试验结果显示：小鼠进行TNF-α静脉注射会诱导小鼠体内爆发炎症因子风暴，进而引起系统性炎症反应，导致失控的细胞死亡而引起小鼠在短时间内死亡，其发病症状与临床的坏血症症状很相似，也有人称这种小鼠疾病模型为TNF-α休克，而且程序性坏死已被报道参与TNFα过量所导致的系统性炎症反应。我们进而检测化合物Ⅰ和Ⅱ在TNF-α引发的系统性炎症反应综合征中的治疗效果。我们在C57BL/6小鼠中腹腔注射对照或者Ⅰ(30mg/kg)或者Ⅱ(30mg/kg)，之后尾静脉注射鼠源TNF-α重组蛋白，观察TNF-α引发的系统性炎症反应后的小鼠致死情况。注射对照药物组的小鼠在16-24小时出现死亡，存活率约为30％，注射了化合物Ⅰ或Ⅱ的治疗组小鼠存活率显著升高，达到90％，表明化合物Ⅰ和Ⅱ在TNF-α引发的系统性炎症反应综合征中具有良好的治疗效果。根据药物剂量设计的常用方法，推测出人体使用时的有效剂量为3.5mg/kg。

本发明还提供上述的具有细胞坏死抑制活性的药物的制剂，其包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、口服液或注射剂。

此外，在本发明的具有细胞坏死抑制活性的药物中，对化合物Ⅰ和Ⅱ的混合物作为具有细胞坏死抑制活性的药物进行测试，结果显示为两者效果的叠加。

本发明的突出效果为：

本发明的具有细胞坏死抑制活性的药物能够有效抑制细胞坏死，从而能够用于治疗与细胞坏死相关的炎症类疾病、代谢类疾病和神经退行性疾病等疾病。

附图说明

图1a是实施例3中化合物Ⅰ在HT29细胞中对TNF-α诱导的细胞坏死的抑制活性图；

图1b是实施例3中化合物Ⅱ在HT29细胞中对TNF-α诱导的细胞坏死的抑制活性图；

图2a是实施例3中化合物Ⅰ、Ⅱ及对照品在人胃癌细胞中对TNF-α所诱导的细胞坏死的抑制效果对比图；

图2b是实施例3中化合物Ⅰ、Ⅱ及对照品在人大肠癌细胞中对TNF-α所诱导的细胞坏死的抑制效果对比图；

图2c是实施例3中化合物Ⅰ、Ⅱ及对照品在人组织淋巴瘤细胞中对TNF-α所诱导的细胞坏死的抑制效果对比图；

图3是实施例3中化合物Ⅰ、Ⅱ及对照品对带Flag标签RIP3的HeLa细胞中对Trail受体介导的细胞坏死的抑制效果对比图；

图4是实施例3中化合物Ⅰ、Ⅱ及对照品对Toll样受体信号通路介导的细胞坏死的抑制效果对比图；

图5a是实施例3中化合物Ⅰ及对照品抗TNF-α诱导的系统性炎症反应的测试效果对比图；

图5b是实施例3中化合物Ⅱ及对照品抗TNF-α诱导的系统性炎症反应的测试效果对比图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用溶剂和药品均为分析纯或化学纯；溶剂在使用前均经过重新蒸馏；无水溶剂均按照标准方法或文献方法进行处理。所有萃取溶剂未经说明均用无水Na₂SO₄干燥。

实施例1

本实施例提供一种具有细胞坏死抑制活性的药物，其为化合物Ⅰ，其是由如下方法合成的：

1、中间体Ⅰ-1的合成：

将6-溴-2-氨基苯并噻唑(2.50g，10.7mmol)和DMAP(1.33g，12.8mmol)溶于20mL二氯甲烷中，冰浴下滴加乙酸酐(1.23mL，13.0mmol)，常温搅拌过夜后，倒入100mL 1N HCl中，将所得固体抽滤，固体用水淋洗，烘干至恒重，得一白色固体(2.30g，79％)。其图谱数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ9.90(br s,1H),7.94(s,1H),7.61(d,J＝10.4Hz,1H),7.54(d,J＝10.4Hz, 1H),2.30(s,3H)。

2、中间体Ⅰ-2的合成：

在100mL的圆底烧瓶中，依次加入Ⅰ-1(2.10g，7.75mmol)、联频哪醇硼酸酯(3.00g，11.8mmol)、KOAc(3.00g，30.6mmol)和Pd(dppf)Cl₂(560mg，0.765mmol)溶于50mL DMSO中，在氮气保护下90℃反应8h后，过滤，滤液用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和食盐水洗，有机相干燥旋干，旋去溶剂，溶质用石油醚重结晶，得一淡黄色固体(2.40g，97％)。其图谱数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.30(s,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),2.30(s,3H),1.37(s,12H)。

3、中间体Ⅰ-3的合成：

在25mL圆底烧瓶中，依次加入Ⅰ-2(255mg，0.802mmol)、5-溴-2-氯-3-氨基吡啶(200mg，0.964mmol)、碳酸钾(322mg，2.41mmol)、四三苯基膦钯(90mg，0.078mmol)和1,4-二氧六环/水(4mL/0.4mL)，在氮气保护下80℃反应8h后，反应液用乙酸乙酯稀释，抽滤，固体用乙酸乙酯淋洗，干燥，得一白色固体(246mg，95％)。其图谱数据如下：¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.33(s,1H),8.15(s,1H),7.84(s,1H),7.72(d,J＝8.4Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.33(s,1H),5.58(br s,2H),2.12(s,3H)。

4、产物Ⅰ的合成：

将Ⅰ-3(50mg，0.16mmol)溶于2mL吡啶中，冰浴下加入苯乙酰氯(50mg，0.32mmol)，冰浴反应1h后，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，加入50mL水，将所得固体抽滤，固体用乙酸乙酯淋洗，烘干至恒重得一白色固体(15mg，22％)，即为化合物Ⅰ。其图谱数据如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,2H),10.00(s,1H),8.58(d,J＝2.0Hz,1H),8.49(d,J＝2.0Hz,1H),8.35(s,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.76-7.73(m,1H),7.40-7.36(m,2H),7.37-7.35(m,1H),7.30-7.25(m,2H),3.82(s,2H),2.22(s,3H)。

实施例2

本实施例提供一种具有细胞坏死抑制活性的药物，其为化合物Ⅱ，其是由如下方法合成的：

将Ⅰ-3(50mg，0.16mmol)溶于2mL吡啶中，冰浴下加入3-氟苯甲酰氯(50mg，0.31mmol)，冰浴反应1h后，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，加入50mL水，将所得固体抽滤，固体用乙酸乙酯淋洗，烘干至恒重得一白色固体(20mg，29％)，即为化合物Ⅱ，其图谱数据如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.46(s,1H),10.23(s,1H),8.68(d,J＝2.0Hz,1H),8.59(s,1H),8.43(s,1H),7.93-7.77(m,3H),7.68-7.63(m,1H),7.43-7.37(m,2H),2.22(s,3H)。

实施例3

本实施例对实施例1和2的具有细胞坏死抑制活性的药物分别进行测试。

1、在HT29细胞中，化合物Ⅰ和Ⅱ对TNF-α介导的细胞坏死通路半数抑制浓度的测试：

将HT29细胞加入到96孔板中，然后用不同浓度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5.0、10μM)的待测化合物预处理一小时后，再用TNF-α(40ng/mL)，Smac mimetic(100nM)和z-VAD(20μM)联合处理细胞48小时后，定量分析存活率。DMSO预处理组为阴性对照，通过ATP水平检测细胞存活率，然后根据不同浓度下测得的存活率做工作曲线算出半数抑制浓度。

测定结果如图1a和1b所示：化合物Ⅰ和Ⅱ对TNF-α诱导的细胞坏死的半数抑制率(IC₅₀)分别为0.69μM和0.25μM。

2、在人胃癌细胞MKN45、人大肠癌细胞株174T和人组织淋巴瘤细胞株U937中，化合物Ⅰ和Ⅱ对TNF-α介导的细胞坏死通路抑制活性的测试：

将人胃癌细胞MKN45、人大肠癌细胞株174T和人组织淋巴瘤细胞株U937细胞加入到96孔板中，然后用10μM的待测化合物预处理一小时后，再用TNF-α(40ng/mL)，Smacmimetic(100nM)和z-VAD(20μM)联合处理细胞48小时后，定量分析存活率。DMSO预处理组为阴性对照，通过ATP水平检测细胞存活率。

测定结果如图2a、2b、2c所示：在人胃癌细胞MKN45中，化合物Ⅰ和Ⅱ对TNF-α诱导的细胞坏死的抑制活性分别为75％和70％；在人大肠癌细胞株174T中，化合物Ⅰ和Ⅱ对TNF-α诱导的细胞坏死的抑制活性分别为100％和100％；在组织淋巴瘤细胞株U937细胞中，化合物Ⅰ和Ⅱ对TNF-α诱导的细胞坏死的抑制活性分别为90％和100％。

3、化合物Ⅰ和Ⅱ抑制Trail受体介导的细胞坏死抑制活性的测试：

将预处理过表达带Flag标签RIP3的HeLa细胞加入到96孔板中，然后用10μM的待测化合物预处理一小时后，再用Trail(150ng/mL)，Smac mimetic(100nM)和z-VAD(20μM)联合处理细胞48小时后，定量分析存活率。DMSO预处理组为阴性对照，通过ATP水平检测细胞存活率。

测定结果如图3所示：在过表达带Flag标签RIP3的HeLa细胞中，化合物Ⅰ和Ⅱ对Trail受体介导的细胞坏死的抑制活性分别为80％和80％。

4、化合物Ⅰ和Ⅱ抑制Toll样受体信号通路介导的细胞坏死抑制活性的测试：

取6-10周的小鼠，颈椎脱臼法处死，将小鼠放至75％的酒精中浸泡5分钟后，将小鼠铺于超净台中的无菌纸上。用镊子捏起小鼠腹部的皮肤，用剪刀剪开皮肤，并分离下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断。剥离小鼠腿部的肌肉，用无菌纸将骨头上的肌肉擦拭干净，在髋关节处剪开，尽量保证股骨头的完整性，剪去大腿骨两端的软骨，暴露出红色的骨髓腔，将取好的大腿骨头放置到无菌的细菌培养皿中。用10mL的注射器接上1mL无菌注射器的针头，每支吸取10mL的BMDM培养基(30％L929细胞培养上清+20％FBS+50％1640培养基)，轻轻的插入骨髓腔，冲洗骨髓腔以获得骨髓，冲洗液盛至细胞培养皿中。用200μm的铜筛过滤冲洗液2次以去除残渣，然后将这10mL含有骨髓细胞的培养基分至5个培养皿中，每皿再补充8mL的BMDM培养基，于37℃，5％CO₂细胞培养箱内培养。4天后，每皿再补充10mL的BMDM培养基。培养至第7天时，吸弃上清，用5mL PBS漂洗2遍，再加5mL PBS于细胞培养皿中，静置5分钟后将细胞吹打下来。

将收集到的小鼠原代巨噬细胞加入到96孔板中，然后用10μM的待测化合物预处理一小时后，再用LPS(50ng/mL)，Smac mimetic(100nM)和z-VAD(20μM)联合处理细胞48小时后，定量分析存活率。DMSO预处理组为阴性对照，通过ATP水平检测细胞存活率。

测定结果如图4所示：在过表达带Flag标签RIP3的HeLa细胞中，化合物Ⅰ和Ⅱ对Trail受体介导的细胞坏死的抑制活性分别为95％和90％；

5、化合物Ⅰ和Ⅱ抗TNF-α诱导的系统性炎症反应的测试：

取10周龄C57BL/6雌性小鼠(n＝9)，按30mg/kg腹腔注射化合物Ⅰ和Ⅱ，一小时后，每只小鼠通过尾静脉注射2.5μg mTNF-α，在120小时内持续监控小鼠存活率。

测定结果如图5a和图5b所示：空白组的小鼠在16-24小时出现死亡，存活率约为30％，注射了化合物Ⅰ和Ⅱ的治疗组小鼠存活率显著升高，达到90％，表明化合物Ⅰ和Ⅱ在TNF-α引发的系统性炎症反应综合征中具有良好的治疗效果。

综上所述，本发明实施例的具有细胞坏死抑制活性的药物能够有效抑制细胞坏死，从而能够用于治疗与细胞坏死相关的炎症类疾病、代谢类疾病和神经退行性疾病等疾病。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有细胞坏死抑制活性的药物在作为制备抑制Toll样受体信号通路介导、Trail受体介导或TNF-α诱导的细胞坏死、或抑制TNF-α诱导的炎症反应的药物中的应用；该药物包含下列化合物中的一种或两种：