KR101289895B1 - 비만 및 지방간 개선제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 꼬물꼬시래기 추출물 또는 그 분획물을 이용한 비만 및 지방간 개선제 조성물을 개시한다. 상기 꼬물꼬시래기 추출물 또는 그 분획물은 3T3-L1 전구지방세포의 지방세포로의 분화를 억제하고, 3T3-L1 전구지방세포 및 사람 간암 세포주인 HepG2에서 AMPK(AMP-activated protein kinase) 신호 전달을 활성화시키는 활성을 가지고 있다.

Description

비만 및 지방간 개선제 조성물{Composition for Improving Obesity and Fatty Liver}

본 발명은 비만 및 지방간 개선제 조성물에 관한 것이다.

최근 경제 발전에 따른 생활 수준의 향상, 바쁜 생활 환경에 따른 운동 부족, 영양의 과잉 섭취 등으로 비만 인구가 급속히 늘고 있다. 우리나라의 비만(BMI> 25) 인구 비율은 1995년 11.7%이던 것이 2008년 30.7%, 고도 비만(BMI> 30) 인구 비율은 1998년 2.3%에서 2008년 4.1%로 빠른 증가세를 보이고 있다(보건복지부, 2009).

비만은 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 인하여 체내에 에너지가 과잉으로 축적되어 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 말한다(Clinical Endocrinology 28:675-689, 1998; Clinical Obesity (eds. Kopelman PG, Stock MJ) 248-89 (Blackwell Science, Oxford 1998).

세계보건기구(WHO)는 동양인 기준 BMI(Body Mass Index: 체질량지수)가 23∼25를 과체중, 25∼30을 비만, 30 이상을 고도비만으로 보고 있다.

비만의 원인으로는 고지방·고열량의 식생활, 바쁜 사회적 환경에 따른 운동 부족, 내분비 이상 등 환경적 요인과 유전적 요인을 들 수 있는데, 이 중 비만의 50 내지 70% 정도가 환경적 요인에 의한 것으로 알려져 있고, 나머지가 유전적 요인에 의한 것으로 알려져 있다.

지방간이란 정상적인 지방대사가 이루어지지 못함으로써 간에 지질, 특히 중성지방(트리클리세라이드)이 과도하게 축적되어 간세포 절반 이상에서 지방 공포(空胞)가 관찰되는 상태의 질환을 말한다.

임상적으로는 간세포의 5% 이상에서 지방이 관찰되거나 간 100mg 당 지방이 5mg 이상일 때를 지방간으로 분류한다. 최근 들어서는 생활 수준의 향상에 따른 고지방, 고열량의 식생활, 문명의 발달로 인한 운동부족 등으로 인하여 지방간 환자가 급증하고 있으며, 연령층도 10대부터 50, 60대 이후까지 전반적으로 발병되고 있다. 지방간은 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행될 수 있다.

지방간의 원인으로서는 알코올, 당뇨, 비만, 영양불량증(장기간의 저단백식, 고지방식, 기아, 비타민 부족, 과잉의 당질 섭취), 약물의 남용(김성훈 외, "복부초음파로 진단된 지방간의 원인" 가정의학회지 175(1995.12) pp.785-794) 등이 보고 되어 있다.

현재 대표적인 비만 치료제로는 오리스타트(Orlistat)가 주원료로 하는 제니칼™(로슈), 시브트라민을 원료로 하는 리덕틸™(애보트) 등이 시판되고 있으나 오심, 설사, 복통, 불면증, 혈압상승, 지방변 등의 부작용을 보이고 있으며, 지방간의 치료제로서는 클로피브레이트(clofibrate)로 대표되는 피브레이트계 약제 등이 임상에서 사용되고 있으나, 간기능 장애 등의 부작용이 보고되고 있다(Atherosclerosis. 92:31-40 (1992)).

이처럼 합성 의약품의 부작용과 서양 의학이 한계를 보임에 따라 천연물 의약품에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다.

본 발명은 꼬물꼬시래기(Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenfuss) 추출물과 분획물이 비만 개선 활성과 지방간 개선 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 비만 개선제 조성물과 지방간 개선제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 일 측면에 있어서 비만 개선제 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 꼬물꼬시래기 80% 에탄올 추출물, 그것의 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 3T3-L1 전구지방세포에 분화유도 물질(IBMX, DEXA., insulin)과 함께 처리하였을 때, 지방소적의 형성을 농도-의존적으로 감소시킴과 함께, PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α)과 aP2의 발현을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다. 특히 에틸아세테이트 분획물의 활성이 가장 우수하였다.

상기 PPARγ, C/EBPα 등은 지방세포의 분화를 유도하는 전사인자로 알려져 있으며, aP2는 지방세포 분화 지표 단백질로 알려져 있다(Genes De 2000, 14(11) 1293~1307; Physiol Rev 1998, 78(3):783~809; Annu Rev Biochem 2008, 77:289~312; Genes Dev 1996, 10:1096~1107).

상기 추출물 및 분획물 중 활성이 가장 우수한 에틸아세테이트 분획물의 AMPK(AMP-activated protein kinase) 신호 전달에 미치는 영향을 살펴본 결과, 상기 분획물은 LBK1(AMPK-Kinase)를 활성화시키고, ROS(reactive oxygen species)의 생성을 증가시켰으며, AMPK를 활성화시켜 ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 활성을 억제시키고 UCP2(uncoupling protein 2), CPT-1α(carnitine palmitoyl transferase-1α)를 활성화시켰다.

AMPK는 세포 내의 에너지 항상성 유지에 센서 역할을 담당하는 효소로서 포도당 결핍, ROS 등의 산화적 스트레스에 의해 AMP:ATP 비율이 증가하게 되면 활성화된다고 알려져 있다(J. Biol. Chem. 277:32571-32577, 2002; J. Appl. Physiol. 92:2475-2482, 2002). AMPK의 활성화에는 상위 조절 인산화 효소인 LKB1(AMPK-Kinase)이 관여하는 것으로 알려져 있으며(Curr Biol. 13(22):2004-2008, 2003), AMPK가 활성화되면 ACC이 인산화되어 불성화되는데, ACC는 지방산 합성의 초기 단계에 관여하는 효소로서 아세틸코에이(acetyl-CoA)를 말로닐코에이(malonyl-CoA)로 합성하는 효소이다(Trends Biochem. Sci. 24:22-25, 1999; Biochem. Soc. Trans. 31:162-168, 2003). ACC가 불활성화되면 말로닐코에이(malonyl-CoA)의 세포 내 농도가 낮아져 UCP2, CPT-1α 등이 활성화되어 지방 산화가 촉진되는 것으로 알려져 있다(J. Biol. Chem. 277:32571-32577, 2002, J. Appl. Physiol. 92:2475-2482, 2002).

따라서 AMPK가 활성화되면 체내 지방의 축적을 억제할 수 있으며, 결과적으로 체중의 증가를 억제할 수 있고, 또한 혈중 중성 지방과 콜레스테롤 농도를 저하시키는 결과를 얻을 수 있다.

본 발명의 비만 개선제 조성물은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 비만 개선제 조성물은 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "꼬물꼬시래기 추출물"은 추출 대상으로 꼬물꼬시래기를 사용하고, 추출 용매로 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다. 추출 방법은 유효성분의 추출 정도, 보존 정도 등을 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식을 적용될 수 있다. 상기 추출물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된, 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물일 수 있다. 상기 "꼬물꼬시래기 추출물"은 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 추출 용매로 사용하여 얻어진 것을 의미한다.

또 본 명세서에서, "꼬물꼬시래기 추출물의 헥산 분획물"은 상기 꼬물꼬시래기 추출물, 바람직하게는 꼬물꼬시래기의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매의 추출물, 더 바람직하게는 추출용매가 제거된 고형상의 추출물을 물과 헥산으로 분획하여 얻어진 헥산층의 분획물, 또는 상기 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 첨가하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물을 의미한다. 여기서 "순차적으로 분획한다"는 것의 의미는 물층의 분획물을 분획 후에도 계속 사용하여 상기 열거된 순서의 용매로 분획한다는 의미이다.

또 본 명세서에서, "꼬물꼬시래기 추출물의 에틸아세테이트 분획물"은 분획 용매가 에틸아세테이트인 점을 제외하고 상기 "꼬물꼬시래기 추출물의 헥산 분획물"과 동일하게 정의될 수 있다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "비만"이란, 그것이 유전적 요인에 의한 비만이든 또는 환경적 요인에 의한 비만이든 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 의미하며, 체질량지수의 구분에 따른 비만(BMI이 25 이상인 경우)과 과체중(BMI이 23~25인 경우)을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "비만 개선"이란 비만의 예방, 비만의 치료를 포함하여, 체지방의 감소 및/또는 체중의 감소를 포함하는 의미이다.

본 발명의 비만 개선제 조성물은 그 유효성분을 비만 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 비만 개선 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 다이어트용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선제 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 "다이어트"란 체중 상태가 비만이나 과체중은 아니지만 미용이나 건강 목적으로 체중/체지방의 감소가 바람직하거나 필요한 상태로서 정의된다. 통상 본 발명의 다이어트용 조성물은 정상인의 미용이나 건강 목적으로 제조·사용될 것이다.

또 본 명세서에서, "고지혈증"이란 중성 지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지방량이 많아 유발되는 질환을 말한다. 보다 구체적으로는 혈액 내에 중성지방, LDL 콜레스테롤, 인지질, 유리 지방산 등의 지질 성분이 증가된 상태의 질환을 말한다.

본 발명의 다이어트용 조성물과 고지혈증 개선제 조성물에 있어서, 꼬물꼬시래기 추출물의 의미, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선제 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 3T3-L1 전구지방세포 이외에, 간세포로서의 대사 기능을 가지고 있는 사람 간암세포주 HepG2에 대해서도 지방 축적을 유도한 후 시료를 처리하여 AMPK 신호 전달에 미치는 영향을 살펴봤는데, 상기 3T3-L1 전구지방세포에 시료를 처리하였을 때와 마찬가지로 LBK1(AMPK-Kinase)를 활성화시켜 AMPK를 활성화시키고, ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 활성을 억제시키며, CPT-1α(carnitine palmitoyl transferase-1α)를 활성화시킴을 확인할 수 있었으며, 또한 SREBP-1c(sterol regulatory element binding protein-lc)의 발현을 억제시킴과 함께 그것의 하위 경로에 있는 단백질인 FASN(fatty acid synthetase)의 발현을 억제시킴을 확인할 수 있었다. SREBP-1c의 활성화는 FASN, ACC 등의 발현을 촉진시켜 간에서의 중성 지방의 합성을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:12737-12742, 1999; J. Biol. Chem. 274:30028-30032, 1999).

상기 실험 결과는 꼬물꼬시래기 추출물 등이 지방간 개선 용도로도 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

본 명세서에서, "지방간"은 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화 등의 원인이 되는 질병으로서, 간의 지방대사 장애로 인하여 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태의 질환을 말한다.

본 발명의 지방간 개선제 조성물에 있어서도, 꼬물꼬시래기 추출물의 의미, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성 개선제 조성물에 관한 것이다.

비만은 인슐린 저항성의 여러 원인 중 하나에 해당한다. 고도 비만에서 인슐린 저항성이 발병하지 않는 경우도 있지만, 인슐린 저항성과 비만은 밀접한 상관관계가 있어, 일반적으로 비만이 심할수록 특히 내장 비만(visceral obesity)이 심할수록 인슐린 저항성도 심해진다고 알려져 있다.

지방세포는 생리활성물질인 아디포사이토카인을 분비하는데, 이 아디포사이토카인은 대사의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하지만, 비만 즉 지방의 과도한 축적 상태가 되면 아디포사이토카인의 생성·분비가 과잉 또는 과소가 되어 균형이 파괴됨으로써 인슐린 저항성이 야기되는 것으로 이해되고 있다.

아디포사이토카인 중에는 인슐린 감수성을 항진시키는 것과 인슐린 저항성을 야기시키는 것이 있으며, 전자의 대표적인 경우가 AMPK(AMP-의존성 단백질 키나아제)이며, 후자의 대표적인 경우가 TNF-α, lL-6, 레지스틴(resistin) 등을 들 수 있다.

AMPK 활성 저하는 인슐린 저항성과 고혈당을 수반하므로 AMPK를 활성화시킬 수 있는 물질은 인슐린 저항성을 개선할 수 있는 후보 물질일 수 있다는 연구 결과들이 발표된 바 있다(J. Biol. Chem., 277(28):25226-32, 2002; Diabetes. 51(7):2074-81, 2002; J. Clin. Invest. 108(8):1167-74, 2001).

또 지방세포에서 발현되는 FASN(fatty acid synthase)이나 aP2(adipocyte fatty-acid-binding protein 2)도 인슐린 저항성을 야기시키는 것으로 알려져 있다.

FASN은 지방세포의 분화에 있어 초기에 발현되며(J. Biol. Chem., 255:4745~ 4750 (1980)) 아세틸코에이(acetyl-CoA)와 말로닐코에이 (malonyl-CoA)로부터 팔미테이트(palmitate)를 생산하는 효소인데, FASN은 과도한 에너지를 중성지방의 형태로 저장하여 비만을 일으키는 한편, 그것에 의해 생산된 중성지방인 팔미테이트는 췌장의 β세포를 파괴하여 인슐린 저항성을 야기시킨다고 보고되어 있으며(Proc. Natl. Acad. Sci. 95:2498∼2502 (1998)), aP2는 그 유전자의 결손 쥐에서 인슐린 저항성 발병률이 낮고 aP2 저해제가 인슐린 저항성을 감소시킨다는 결과로부터 인슐린 저항성 치료제 개발에 강력한 표적 단백질로 제안되어 있다(Nature 447:959-965 (2007)).

아래의 실시예 및 실험예는 본 발명의 비만 개선제 조성물의 유효성분인 상기 꼬물꼬시래기 추출물 등이 AMPK를 활성화시키고 FASN과 aP2의 발현을 억제함을 보여준다. 이러한 실험 결과는 꼬물꼬시래기 추출물 등이 비만 개선제로서 뿐만 아니라 인슐린 저항성 개선제로서도 유용하게 활용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 "인슐린 저항성"이란 세포, 장기, 인체 등이 정상적인 대사 활동을 위하여 통상적인 양 이상의 인슐린을 필요로 하는 상태, 즉 인슐린의 작용력이 저하된 인슐린의 작용 부전 상태를 의미하며, 인슐린 비의존형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병과 동일한 의미로 받아들여진다. 당뇨병은 췌장의 β-세포가 파괴된 결과 그 치료를 위하여 인슐린이 필수적으로 요구되는 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린의 작용력이 저하되어 그 치료에 인슐린이 요구되지 않은 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 구분되기 때문에, 당업계에서 인슐린 저항성, 인슐린 비의존형 당뇨병 그리고 제2형 당뇨병은 동일한 의미로 받아들여지고 있다.

본 발명의 인슐린 저항성 개선제 조성물에 있어서도, 꼬물꼬시래기 추출물의 의미, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 의미, 그것의 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 비만 개선제 조성물과 관련하여 전술한 바가 그대로 유효하다.

본 발명의 비만 개선제 조성물, 다이어트용 조성물, 고지혈증 개선제 조성물, 지방간 개선제 조성물 및 인슐린 저항성 개선제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 그 기능성을 상승 보강하거나 다른 기능성(예컨대 숙취 해소 활성 등)을 부가하기 위하여 이미 비만 개선 활성, 숙취 해소 활성 등이 있다고 알려진 임의의 천연물 유래의 분말 또는 추출물을 포함할 수 있는데, 선지 분말 또는 추출물, 콩나물 분말 또는 추출물, 조개 분말 또는 추출물, 굴 분말 또는 추출물, 산미나리 분말 또는 추출물, 무 즙 또는 추출물, 오이 즙 또는 추출물, 부추 즙 또는 추출물, 시금치 즙 또는 추출물, 연근 즙 또는 추출물, 칡 즙 또는 추출물, 솔잎 즙 또는 추출물, 인삼 즙 또는 추출물, 백화사설초 분말 또는 추출물, 감초 분말 또는 추출물, 갈화 분말 또는 추출물, 갈근 분말 또는 추출물, 사인 분말 또는 추출물, 박 분말 또는 추출물, 생강 분말 또는 추출물, 대추 분말 또는 추출물, 인진 분말 또는 추출물, 지구자 분말 또는 추출물, 수비계 분말 또는 추출물, 백출 분말 또는 추출물, 저령 분말 또는 추출물, 진피(진귤의 껍질) 분말 또는 추출물, 구기자 분말 또는 추출물, 녹차 분말 또는 추출물, 오미자 분말 또는 추출물, 헛개나무 분말 또는 추출물, 지치 분말 또는 추출물, 노근 분말 또는 추출물, 계피 분말 또는 추출물, 데커시놀 등이 예시될 수 있다. 상기에서 추출물의 의미는 꼬물꼬시래기 추출물과 관련하여 앞서 설명한 바와 같다. 이러한 추출물은 추출 대상을 혼합하여 얻어질 수도 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 사용할 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비만 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 지방간 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 고지혈증 개선제 조성물, 인슐린 저항성 개선제 조성물 등을 제공할 수 있다. 본 발명의 비만 개선제 조성물 등은 기능성 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 지방소적과 중성 지방의 함량을 관찰할 결과이다.
도 2는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 분화 관련 단백질의 발현 정도를 관찰할 결과이다.
도 3은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 헥산 분획물(GHFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 지방소적과 중성 지방의 함량을 관찰할 결과이다.
도 4는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 지방소적과 중성 지방의 함량을 관찰할 결과이다.
도 5는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 헥산 분획물(GHFr)과 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 분화 관련 단백질의 발현 정도를 관찰할 결과이다.
도 6은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 AMPK 및 그 기질 단백질인 ACC의 인산화 정도(활성 또는 불활성화 정도)를 관찰한 결과이다.
도 7은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 AMPK의 상위 조절 단백질인 LKB1의 발현 정도와 ROS의 생성 정도를 관찰한 결과이다.
도 8은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 지방산 산화에 관여하는 UCP2 및 CPT-1α의 발현 정도를 관찰한 결과이다.
도 9는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 지방전구세포의 3T3-L1에 처리하고 당 흡수와 지방 분해 정도를 관찰한 결과이다.
도 10은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE), 그것의 헥산 분획물(GHFr) 및 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 사람 간세포주인 HepG2에 처리하고 처리 시간별로 AMPK 및 그 기질 단백질인 ACC의 인산화 정도(활성 또는 불활성화 정도)를 관찰한 결과이다.
도 11은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE), 그것의 헥산 분획물(GHFr) 및 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 사람 간세포주인 HepG2에 처리하고 처리 농도별로 AMPK 및 그 기질 단백질인 ACC의 인산화 정도(활성 또는 불활성화 정도)를 관찰한 결과이다.
도 12는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE), 그것의 헥산 분획물(GHFr) 및 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 사람 간세포주인 HepG2에 처리하고 CPT-1α의 발현 정도를 관찰한 결과이다.
도 13은 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE), 그것의 헥산 분획물(GHFr) 및 에틸아세테이트 분획물(GEFr)을 사람 간세포주인 HepG2에 처리하고 AMPK와 그것의 상위 조절 단백질인 LKB1의 인산화 정도(활성화 정도)를 관찰한 결과이다.
도 14는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE)을 사람 간세포주인 HepG2에 처리하고 AMPK의 인산화 정도(활성화 정도)와 SREBP-1c의 발현 정도를 관찰한 결과이다.
도 15는 꼬물꼬시래기의 에탄올 추출물(GE)을 HepG2에 처리하고 FASN의 발현 정도를 관찰한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 꼬물꼬시래기 추출물 및 분획물의 제조

꼬물꼬시래기는 2010년 3월 제주도 동부 지역의 조간대에서 채집하였다. 채집한 시료는 수돗물로 수세하여 염분을 제거하고 음지에서 건조한 후, 분쇄하여 분말을 획득하였다. 시료의 에탄올 추출물을 얻기 위하여 시료 200g의 분말을 2ℓ의 80 % 에탄올에 48시간 추출하고 감압여과 하였다. 여과에서 남은 잔사는 같은 양의 80% 에탄올을 첨가하여 2차 추출한 후 1차 추출물과 함께 감압회전농축기 (Buchi, R-200, Switzerland)로 농축하였다. 농축액에서 에탄올을 제거한 후 얻은 에탄올 추출물은 동결건조 하여 분획 또는 세포 실험에 사용하였다. 에탄올 추출물의 용매 분획은 추출물에 물을 첨가하여 현탁시킨 후 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순으로 각각 3회씩 반복 수행하여 수득한 분획층을 감압농축 및 동결건조하여 획득하였다. 80% 에탄올 추출물(GE), 헥산 분획층(GHFr), 에틸아세테이트 분획층(GEFr)은 DMSO에, 부탄올과 물 분획층은 PBS(phosphate buffered saline)에 녹여 세포실험에 사용하였다.

< 실험예 > 꼬물꼬시래기 추출물 및 분획물의 비만 개선 활성, 지방간 개선 활성, 고지혈증 개선 활성 및 인슐린 저항성 개선 활성 실험

1. 실험 방법

<1-1> 세포 배양

Mouse 유래 3T3-L1 전구지방세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 세포 배양은 10% bovine calf serum (BCS; Gibco, USA)과 1% penicillin/streptomysin (P/S; Gibco, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA)를 사용하여 37, 5% CO₂ 조건하에서 수행하였다. 세포는 T-75 cell culture flask 바닥에 세포가 70% 정도 찼을 때 계대 배양하였다.

HepG2 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)에 1% penicillin/streptomysin (P/S; Gibco, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA) 배지를 사용하여 37, 5% CO₂ 조건하의 배양기 (Sanyo, Japan)에서 수행하였다. 세포는 100 mm cell culture dish 바닥에 세포가 80% 정도 찼을 때 계대 배양하여 유지하였다.

<1-2> 3 T3 - L1 전구지방세포 분화 유도 및 시료처리

지방세포로 분화 유도는 Harmon and Harp (2001)의 방법을 변형하여 수행하였다. 3T3-L1 전구세포를 10% BCS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6 well cell culture plate (1.6 또는 2.0 x 10⁵ cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여 pre-confluent 상태가 되도록 하였다. Pre-confluent 상태에서 배지를 한 번 더 교환하여 48시간 더 배양하였다. Confluent 상태 (분화유도 0일째)에서 배양액을 분화유도 배지 [10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA), 1% P/S, 1μM dexamethasone (DEXA.; Sigma, USA), 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; Sigma, USA) 및 5 ㎍/㎖ 인슐린 (Sigma, USA)이 함유된 DMEM 배지]로 교환하여 2일간 (분화 유도 2일째) 분화 유도하였다. 지방세포 분화에 미치는 꼬물꼬시래기 에탄올 추출물 및 분획층의 영향을 분석하기 위하여 분화유도시 (day 0)에 각 시료를 농도별 (에탄올 추출물: 2, 10, 50 및 100 ㎍/㎖; 헥산 및 에틸아세테이트 분획층: 1, 5, 25 및 50 ㎍/㎖)로 분화 유도 배지에 첨가하였다. 분화 유도 2일 후에 세포 배양액을 10% FBS, 1% P/S 및 5 ㎍/㎖ 인슐린이 포함된 DMEM 배지로 교환하였고, 분화 유도 4일째부터는 세포 배양액을 인슐린만 제거한 DMEM 배지로 2일 마다 교환하였다.

그리고 꼬물꼬시래기 에틸아세테이트층의 AMP-activated protein kinase (AMPK) 및 그 substrate인 acetyl Co-A carboxylase (ACC)의 인산화와 그 하위 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 지방세포의 분화를 다음과 같이 수행하였다. Confluent 상태 (분화유도 0일째)의 세포를 10% FBS, 1% P/S, 1 μM DEXA., 0.5 mM IBMX 및 5 ㎍/㎖ 인슐린이 포함된 DMEM 배지에서 2일간 분화 유도 하였다. 분화 유도 2일 후 배지를 10% FBS, 1% P/S 및 5 ㎍/㎖ 인슐린이 포함된 DMEM 배지로 교환해주고, 다시 2일 후 (분화유도 4일째)부터는 실험에 사용할 때까지 2일 마다 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 분화유도 8-10일째에 배양용기에서 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척한 후 DMEM 배지로 교환하여 무혈청 상태(serum-free stavation)로 6시간 배양한 후 50 ㎍/㎖의 에틸아세테이트 분획층을 시간별 (0, 1, 3, 6, 12 및 24시간) 또는 농도별 (1, 5, 25 및 50 ㎍/㎖)로 12시간 동안 처리하여 AMPK 및 ACC의 인산화를 확인하였다.

<1-3> HepG2 세포의 지방 축적 유도

HepG2 세포의 지방 축적 유도는 Gomez-Lechon 등 (2007)의 방법을 변형하여 수행하였다. HepG2 세포를 10% FBS와 1% P/S가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6 well cell culture plate (1.0 ×10⁶ cells/well)에 접종하고 48시간 동안 배양하여 6 well cell culture plate 바닥에 80% 정도 찬 상태가 되도록 하였다. 세포가 80% 정도 세포가 찬 상태에서 자유 지방산인 oleic acid와 plamitic acid를 각각 200 μM 씩 첨가한 배지로 교환한 뒤 24시간 동안 배양하여 HepG2 세포에 지방 축적을 유도하였다.

<1-4> Oil - Red O 염색

Oil Red O 염색 및 정량 분석은 Cho 등 (2003)의 방법으로 수행하였다. 분화유도 7-9일째 된 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS에 희석된 3.7% formalin [37% formaldehyde solution (Sigma, USA) 1/10으로 희석]으로 1시간 동안 고정한 후, 증류수로 2회 세척하였다. 그리고 Oil Red O 염색액은 isopropanol (Merck, Germany)로 희석한 0.6% Oil Red O (Sigma, USA)와 증류수를 6:4로 희석한 후 여과하여 제조하였다. 세척된 세포는 Oil Red O 염색액으로 1시간 동안 염색 후 증류수로 3회 세척하여 현미경하에서 관찰하였다. 염색된 지방소적의 중성지방의 함량을 정량하기 위해서 4% NP-40 (Amresco, USA)이 포함된 isopropanol를 첨가하여 Oil Red O를 다시 용해시킨 후 microreader로 520㎚에서 흡광도를 측정하였다.

<1-5> Free Glycerol release 측정

Free glycerol 함량은 free glycerol reagent kit (Sigma, USA)를 사용하여 측정하였다. 3T3-L1 전구 지방세포를 분화 유도 방법에 따라 8일간 배양하여 분화 시킨 후, 에틸아세테이트 분획층을 48시간 동안 농도별 (0, 2, 10 및 50 ㎍/㎖)로 처리하였다. Free glycerol 측정 시약 0.4 ㎖에 배양액 5 ㎕를 넣고 10분간 37℃에서 반응시켰고 micro reader로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Free glycerol 정량을 위해서는 standard glycerol solution (Sigma, USA)을 0, 4.0625, 8.125, 16.25, 32.5, 65, 130 및 260 ㎍ glycerol/㎖의 농도로 만들어 위와 동일하게 반응시켜 정량하였고, 3회 반복 실험하였다.

<1-6> RNA 분리 및 real - time PCR

지방세포에서 Real-time PCR을 위한 total RNA는 분화 유도 8일째 세포에 48시간 동안 농도별 (2, 10 및 50 ㎍/㎖)로 처리한 후 세포를 수거하여 분리하였다. Trizol Reagent (Invitrogen, USA)를 500 ㎕ 첨가하여 상온에서 5-10 분간 세포를 균질화한 후, 튜브로 옮기고 chloroform 100 ㎕를 첨가하여 원심분리 (12,000×g, 15분) 하였다. 상층액을 회수하여 새로운 튜브로 옮기고 동량의 isopropanol을 첨가하여 원심분리(12,000×g, 15분)하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 75% 에탄올로 3회 세척하고 건조시킨 후 DEPC 처리된 증류수에 용해시킨 후 nanodrop 2000 spectrometer (Nanodrop, USA)를 이용하여 260 nm의 흡광도를 측정하여 정량하였다. A260 / A280 nm의 비율이 1.8-2.0 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 DNase (Wako, Japan)를 처리하여 순수한 RNA만을 분리하여 실험에 사용하였다.

cDNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1 ㎍ total RNA와 nuclease-free water를 총 20 ㎕가 되게 tube에 넣고 45℃ 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성한 후 여기에 30 ㎕의 nuclease-free water를 첨가하여 희석한 후 PCR에 사용하였다.

Real-time PCR은 5 ㎕의 cDNA, 각 primer는 0.4 ㎕ (10 pmol/L/)씩, 2 ㎕ nuclease-free water와 6 ㎕ iQ^TM SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 혼합한 후 Peltier thermal cycler (Bio-rad, USA) real time PCR 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃/20초, 65℃/20초, 72℃/30초로 하여 49회 증폭하였고 1회 증폭할 때마다 형광량을 측정하여 그 결과를 얻었으며, 모든 cycle이 완료된 후 65℃에서 95℃까지 반응시켜 primer의 melting curve를 분석하였다. 결과 분석은 Chromo4 Real-Time PCR Detection System v1.10 (Bio-rad, USA)을 이용하여 β-actin 대비 상대적 값으로 정량하였다. Real-time PCR에서 사용된 primer의 염기서열을 [표 1]에 나타내었다.

<프라이머>

간세포에서 Real time-PCR 분석을 위한 total RNA는 HepG2 세포를 6 well cell culture plate (1.0 ×10⁶ cells/well)에 접종하고 지방 축적 유도 후 시료를 농도 별로 (GE 시료 : 25, 50, 100 ㎍/mL; GHFr, GEFr 시료 : 12.5, 25, 50 ㎍/mL) 처리하고 72시간동안 배양 후 분리하였다. Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc, USA)를 첨가하여 세포를 균질화한 후, 여기에 chloroform을 첨가하여 원심분리 (12,000×g, 4℃, 15분)하였다. 상층액을 회수하여 동량의 isopropanol을 첨가하여 원심분리 (12,000×g, 4℃, 8분)하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 75% 에탄올로 세척한 후, 건조시켜 nuclease-free distilled water (NFDW; Amresco, USA) 50 ㎕에 용해시킨 후 nanodrop ND 2000 spectrophotometer (Nanodrop, USA)를 이용하여 260 nm의 흡광도를 측정하여 정량하고 DNase (Wako, Japan)를 처리하였다. A260 / A280 nm의 비율이 1.6 ~ 2.0 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 실험에 사용하였다.

cDNA는 Maxime RT PreMix Kit (Oligo dT primer, iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1 ㎍의 total RNA와 NFDW를 총 20 ㎕로 kit에 넣고 45℃ 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성한 후 260 nm의 흡광도를 측정하여 정량 한 뒤 NFDW를 첨가하여 cDNA의 최종 농도를 0.25 ㎍/mL로 맞추었다.

Real-time polymerase chain reaction (PCR)은 2 ㎕의 cDNA, 각 primer는 1 ㎕ (10 pM/㎕ )씩 넣고, 3.5 ㎕의 NFDW와 7.5 ㎕의 iQ^TM SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 혼합한 후 Chromo4 real time PCR (Bio-rad, USA) 기기를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃/20초, 63.5℃/20초, 72℃/30초로 하여 50회 증폭하였고 그 결과는 1회 증폭할 때마다 흡광도로 측정하였다. 결과 분석은 gene expression analysis for chromo4 real-time PCR detection system v1.10 (Bio-rad, USA)을 이용하여 β-actin 대비 상대적 값으로 정량하였다. Real-time PCR에서 사용된 primer의 염기서열과 예상되는 생성물의 크기를 [표 2]에 나타내었다.

<프라이머>

<1-7> Western blot

시료가 처리된 지방세포를 PBS로 2회 세척 후 1 mM PMSF, 1 mM Na₃VO4, 1 mM NaF, 1 ㎍/㎖ aprotinin, 1 ㎍/㎖ pepstatin, 1 ㎍/㎖ leupeptin 및 10% RIPA lysis buffer (Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 1시간 동안 vortexing 하여 분해시킨 후 원심분리 (15000×rpm, 4℃, 20분)하여 상층액을 획득하였다. 단백질 농도는 Bio-rad protein assay kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 micro reader로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 35 ㎍의 단백질을 10% (PPAR, C/EBPα, phospho-AMPK, AMPKα, LKB1, phospho-LKB1 및 β-actin), 6% (phospho-ACC) 혹은 15% (aP2) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동으로 분리한 후 poly vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 전이 (100 V, 120분)시켰다. 단백질이 전이된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 5% skim milk 또는 5% BSA를 함유한 0.1% Tween 20이 포함된 Tris buffered saline (TTBS) 용액으로 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 단백질 분석을 위해 사용된 1차 항체는 PPAR antibody (1:500, Santa Cruz, USA), C/EBPα antibody (1:1,000, Santa Cruz, USA), p-AMPK antibody (1:2,000, Cell Signaling, USA), AMPKα antibody (1:5,000, Cell Signaling, USA), p-ACC antibody (1:1,000, Cell Signaling, USA), LKB1 and p-LKB1 antibody (1:1,000, Santa Cruz, USA), A-FABP antibody (aP2; 1:5,000, Santa Cruz, USA), β-actin antibody clone AC-74 (1:10,000, Sigma, USA) 등이며 4℃에서 하루 밤 동안 수행하였다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.1% TTBS용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:2,000, 1:5,000 혹은 1:10,000으로 희석하여 1시간 동안 반응한 후 TBS-T로 세척하였다. 각 단백질의 발현은 WEST-ZOL western blot detection system (iNtRON Biotechology, Korea)로 반응시켜서 X-ray 필름 (Ortho CP-G plus; Agfa Gevaert N.V., Belgium)으로 검출하였다.

간세포에서 wester blot 분석을 위하여 HepG2 세포를 6 well cell culture plate (1.0×10⁶ cells/well)에 접종하고 지방 축적 유도를 시킨 후 시료를 시간별 (30분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간; GE 시료 : 100 ㎍/mL; GHFr, GEFr 시료 : 50 ㎍/mL)과 농도별 (GE 시료 : 25, 50, 100 ㎍/mL; GHFr, GEFr 시료 : 12.5, 25, 50 ㎍/mL, 12시간 배양)로 처리하였다. 이후 세포를 차가운 phosphate buffered saline (PBS)를 이용해 2회 세척 후 10% RIPA lysis buffer (Upstate Biotechnology, USA) 및 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 1 ㎍/mL aprotinin, 1 ㎍/mL pepstatin, 1 ㎍/mL leupeptin 을 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 1시간 동안 분해시킨 후 원심분리 (15,000 rpm, 4, 20분)하여 상층액을 획득하였다. 단백질은 Bio-rad protein assay kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 micro reader로 595nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 단백질(40 ㎍/㎕)은 8% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동으로 분리 (100 V, 120분)한 후 poly vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 전이 (100 V, 90분)시켰다. 단백질이 전이된 PVDF membrane은 상온에서 1시간 동안 5% skim milk (BD, USA)로 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 AMP-activated protein kinase a (AMPKα) (23A3) antibody (1 : 1,000; Cell Signaling, USA), phospho-AMPKα (Thr 172) (40H9) antibody (1 : 1,000; Cell Signaling, USA), phospho-acetyl-CoA carboxylase (ACC) (Ser 79) antibody (1 : 1,000; Cell Signaling, USA), LKB1 (T-22) antibody (1 : 1,000; Santa Cruz, USA), phospho-LKB1 (Ser 431)-R antibody (1 : 1,000; Santa Cruz, USA), sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBP-1c) antibody (1 : 1,000; BD, USA)는 4℃에서 하루 밤 동안, β-actin clone AC-74 antibody (1 : 10,000; Sigma, USA)는 상온에서 1시간 동안 수행하였다. 1차 항체 반응이 끝난 PVDF membrane은 0.1% Tween 20이 포함된 Tris buffered saline (TTBS) 용액으로 5회 세척하였다. 2차 항체로는 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1 : 5,000 혹은 1 : 10,000으로 희석하여 1시간 동안 반응한 후 TTBS로 5회 세척하였다. 각 단백질의 발현양은 WEST-ZOL western blot detection system (iNtRON Biotechology, Korea)로 반응시켜서 X-ray 필름 (Agfa Gevaert N.V., Belgium)으로 검출하였다.

<1-8> Glucose uptake 분석

시료가 지방세포의 세포 내로 당 흡수 (glucose uptake)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 ³H로 표지된 2-Deoxy-D glucose (2-DOG)를 사용하여 glucose uptake 분석을 시행하였다. 3T3-L1 지방세포를 위에서 설명한 방법과 같이 12 well culture plate에 분화유도를 시킨 후 8 - 10일째에 실험에 사용하였다. 분화된 지방세포는 혈청이 미첨가된 serum-free 배지로 2회 세척한 후 동일한 배지를 1 mL 첨가하여 37℃에서 2-6 시간 절식 배양하였다. 이렇게 배양된 세포를 Krebs-Ringer-Hepes (KRH) buffer [20 mM Hepes, 136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.25 mM MgSO₄, 1.25 mM CaCl₂, (pH 7.4)]로 2회 세척하여 배지를 제거하고 동일한 buffer에 녹인 시료 (2, 10 및 50 ㎍/㎖)를 첨가하여 1시간 배양한 후, 100 ㎕의 KRH buffer에 희석한 인슐린 100 nM을 처리하여 20분간 배양하고, 37 MBq 2-deoxy-D-[³H]-glucose (Amersham Biosciences, Sweden)와 1 mM 2- Deoxy-D-glucose (Sigma, USA)의 혼합물을 100 ㎕에 최종 농도가 각각 3.7 MBq와 0.1 mM이 되게 첨가하여 20분간 배양하였다. 배양액을 제거하고 차가운 PBS로 3회 세척한 후, 세포 내로 흡수된 2-DOG의 양을 측정하기 위해 1% Triton X-100 lysis buffer를 1 ㎖ 첨가하여 약 10분간 37℃에서 배양한 후, 세포 내의 방사능을 Liquid Scintillation Counter (Tri-Carb 2700TR Packard, Meriden, CT, USA)를 이용하여 측정하였다.

<1-9> 세포 내 ROS 측정

세포 내 활성산소종은 Hwang 등 (2005, 2007)의 방법에 따라 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorecein diacetate acetyl ester (CM-H2DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 ROS를 염색하여 확인하였다. 분화 유도된 3T3-L1 지방세포를 0.1% BSA가 함유된 DMEM 배지에 6시간 동안 절식배양시키고 DMEM에 희석시킨 시료 (GEFr, N-acetylcystein)를 각 농도별 (GEFr; 0, 10 및 50 ㎍/㎖, N-acetylcystein; 5 mM)로 12시간 동안 처리하였다. 시간 경과 후 세포는 PBS로 2회 세척하고 3.7% formaldhehyde로 15분간 고정한 후, well 마다 최종 10 μM의 농도가 되도록 CM-H2DCFDA를 넣고 빛을 차단한 상태에서 30분간 상온에서 염색한 후, 형광현미경을 이용하여 확인하였다.

<1-10> 통계처리

실험결과는 평균±표준편차로 나타냈으며 student's t-test로 유의성을 검정하였다.

2. 실험 결과

<2-1> 꼬물꼬시래기 에탄올 추출물과 그 분획물의 전구지방세포 분화 유도 억제 효과

우선 꼬물꼬시래기 에탄올 추출물 (GE)의 3T3-L1 전구지방세포에 대한 세포독성 여부를 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하여 세포독성에 영향을 미치지 않는 100 ㎍/㎖를 최고 농도로 하여 세포 실험을 수행하였다.

3T3-L1 전구지방세포의 분화에 미치는 GE의 영향을 알아보기 위하여 분화 유도 시에 분화유도물질과 GE (2, 10, 50 및 100 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 분화 유도 후 Oil Red O 염색으로 지방소적을 관찰하였다. 도 1A에서 보는 바와 같이 GE가 처리된 실험군에서는 지방소적이 농도 의존적으로 감소됨을 확인할 수 있었다. Oil Red O 염색 강도를 정량화한 결과, 2, 10, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도로 GE를 처리한 실험군은 시료를 처리하지 않은 음성대조군 (100±18.0%)에 비해 106.9±19.4, 91.3±18.5, 15.6±2.8 및 13.7±0.6%의 값을 나타내었다 (도 1B). GE는 50 ㎍/㎖ 농도에서부터 3T3-L1 전구지방세포의 분화를 유의적으로 저해하였다 (도 1B). GE에 의한 형태적인 지방소적 형성 억제 효과를 분자적 수준에서 확인하기 위하여 지방세포 분화 관련 단백질들의 발현을 Western blot으로 분석하였다. GE를 처리한 실험 군에서 지방세포 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ), CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα), 그리고 지방세포 분화 마커인 fatty acid binding protein (aP2)의 발현이 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 2).

GE의 전구지방세포 분화 억제 활성 성분들을 함유하는 분획물을 동정하기 위하여 GE를 용매 분획한 후 각 분획물의 세포독성을 MTT 분석으로 확인하여 세포독성이 없는 50 ㎍/㎖의 농도를 최고 처리 농도로 세포 실험을 진행하였다.

3T3-L1 전구지방세포 분화유도와 함께 헥산 분획(GHFr)과 에틸아세테이트 분획(GEFr)을 각각 1, 5, 25 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 두 분획층의 분화 억제 효과를 비교하였다. GHFr을 처리한 실험군에서는 가장 낮은 1 ㎍/㎖의 농도에서부터 지방소적의 감소를 확인할 수 있었고, 5 ㎍/㎖부터 그 이상의 농도에서는 매우 효과적으로 지방소적의 축적을 억제함을 확인하였다 (도 3A). 또한 지방소적을 정량적으로 분석한 도 3B의 결과에서와 같이 GHFr을 1 ㎍/㎖ 처리한 군에서부터 대조군에 비해 유의적인 지방소적 감소 효과를 나타냄을 확인하였다.

그리고 GEFr을 처리한 실험군에서는 1 ㎍/㎖의 농도에서부터 대조군에 비해 지방소적의 형성을 현저하게 억제하였다 (도 4A). 정량적인 분석에서도 대조군에 비해 모든 처리군에서 유의적으로 지방소적 생성을 억제함을 확인하였다 (도 4B). GHFr과 GEFr의 지방축적 억제 활성을 PPAR, C/EBPα, aP2 단백질 발현 수준에서 확인해본 결과, GHFr의 경우 5 ㎍/㎖의 농도로 처리한 군에서 (도 5A), GEFr의 경우에서는 시료를 처리한 모든 군에서 이들 단백질 발현이 유의적으로 감소되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 5B).

<2-2> 3 T3 - L1 지방세포에서 꼬물꼬시래기 에틸아세테이트 분획층 ( GEFr )이

분화된 지방세포에서 AMPK 신호전달에 미치는 영향

<2-2-1> AMPK 인산화 유도 활성

앞선 실험에서 꼬물꼬시래기 용매분획 중에 에틸아세테이트 분획층 (GEFr)이 지방세포 분화 억제활성이 가장 우수함을 확인하였다. 그래서 GEFr가 AMP-activated protein kinase (AMPK) 신호전달에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 우선 충분히 분화된 지방세포에 GEFr (50 ㎍/㎖)를 처리하여 시간별 (1, 3, 6, 12 및 24 시간)로 AMPK 인산화 정도를 분석하였다. 지방세포에 GEFr을 처리한 후 12분부터 AMPK와 그 기질인 acetyl-CoA carboxylase (ACC)가 인산화되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 6A). 또한, 지방세포에 GEFr을 12시간 동안 농도별 (0, 1, 5, 25 및 50 ㎍/㎖)로 처리했을 경우도 AMPK의 인산화가 농도 의존적으로 증가하였음을 확인하였다 (도 6B). 그러나 AMPK의 인산화와 더불어 ACC의 인산화 역시 5 ㎍/㎖ 처리군부터 농도가 증가함에 따라 증가하였으나 그 이상의 농도 (25 및 50 ㎍/㎖)에서는 더 이상 증가하지 않았다 (도 6B).

<2-2-2> LKB1 인산화 및 ROS 생성

AMPK의 활성화는 upstream AMPK-Kinase로도 알려진 LKB1에 의해 AMPK의 a-subunit의 Thr172 위치의 잔기가 인산화됨으로써 이루어진다고 알려져 있기 때문에 LKB1의 인산화를 Western blot을 통해 확인하였다. 분화 유도된 지방세포에 GEFr을 각각 0, 1, 5, 25 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 1 ㎍/㎖의 농도에서부터 LKB1의 인산화가 유의하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 7A).

또한 reactive oxygen species (ROS)는 세포 내 산화적 스트레스로 작용하여 AMPK를 활성화시키는 인자로 알려져 있기 때문에 GEFr이 ROS 생성에 미치는 영향을 확인하였다. 분화된 지방세포에 10, 50 ㎍/㎖의 GEFr을 처리하였을 때 생성되는 ROS를 DCFH-DA 형광염색을 통해 알아본 결과, 농도 의존적으로 ROS가 증가하였다 (도 7B). ROS의 생성이 GEFr의 처리에 의한 효과인지를 확인하기 위해 항산화제로 알려진 N-acetylcysteine (NAC)을 함께 처리한 결과 ROS의 생성이 감소하는 결과를 나타내었다(도 7B).

<2-2-3> 지방산 β-산화 관련 유전자 발현

AMPK 활성화는 지방산 β-산화를 촉진한다고 알려져 있기 때문에, GEFr 처리에 따른 지방산 β-산화 관련 유전자 (CPT-1α, UCP2)의 발현을 real-time PCR 기법으로 분석하였다. Carnitine palmitoyltransferase 1α(CPT-1α)과 uncoupling protein 2 (UCP2)의 경우 50 ㎍/㎖의 농도로 GEFr을 처리한 군에서 대조군으로 DMSO를 처리한 군에 비해 mRNA의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다 (도 8 A 및 B).

<2-2-4> 당 흡수 ( glucose uptake )와 지방분해 ( lipolysis ) 효과

지방세포에서 ³H로 표지된 2-deoxy-D-glucose를 이용한 glucose uptake 실험을 통해 GEFr이 당 흡수 (glucose uptake)에 미치는 영향을 확인하였다. 분화된 지방세포에 GEFr을 각각 2, 10 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 인슐린 없이 시료를 처리한 군, 인슐린과 함께 시료를 처리한 군 모두에서 영향을 나타내지 않아 GEFr은 지방세포의 당 흡수에는 아무런 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다 (도 9A). 그러나 GEFr은 지방세포에서 배지로 glycerol 방출을 농도 의존적으로 증가시키는 지방분해 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 9B).

<2-3> 지방축적을 유도한 HepG2 세포에서 꼬물꼬시래기 추출물 및 분획물이 AMPK 신호전달에 미치는 영향

HepG2 세포에서 MTT 분석 LDH 분석을 통해 세포독성이 없는 농도로 꼬물꼬시래기 에탄올 추출물(GE)은 100 ㎍/㎖, 그 핵산 분획물(GHFr)과 에틸아세테이트 분획물(GEFr)은 50 ㎍/㎖를 최고 농도로 처리하여 세포 실험을 진행하였다. GE, GHFr, GEFr이 지방산화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 지방축적을 유도한 HepG2 세포를 사용하였다. Oleic acid와 palmitic acid를 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하여 지방 축적을 유도한 후, 시료를 처리하여 배양하고 AMPK 및 그 기질인 ACC의 인산화를 Western blot으로 확인하였다. 지방이 유도된 HepG2 세포에 일정 농도 시료 (GE, 100 ㎍/㎖; GHFr, 50 ㎍/㎖; GEFr, 50 ㎍/㎖)를 처리하여 시간별로 AMPK와 ACC의 인산화 정도를 분석하였다(도 10). AMPK의 활성화는 시료처리 후 2 시간 후부터 시작되어 12 시간까지 증가됨을 확인할 수 있었다. AMPK의 기질인 ACC의 인산화는 AMPK가 활성화되는 시료 처리 후 2시간대에서 가장 높게 이루어졌고 시간이 지날수록 감소되었다.

이후 각 시료를 농도별로 처리하여 시료의 농도에 따른 효과를 알아보았다. 각 시료를 농도별로 처리하고 p-AMPKα는 12시간, p-ACC는 2시간 배양 후 단백질을 분리하여 단백질량을 확인하였다. 그 결과 p-ACC와 p-AMPKα 모두 각 시료별로 농도 의존적으로 단백질량이 증가를 하였다 (도 11). 이 결과를 바탕으로 AMPK의 하위 경로인 CPT1의 활성화를 확인하기 위해 간에서 발현되는 CPT-1α의 mRNA 발현양을 real-time PCR로 확인하였다. 그 결과 CPT-1α mRNA의 발현량이 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 12).

또한 AMPK가 어떠한 경로에 의해서 활성화 되는지 알아보기 위하여 AMPK의 상위 경로를 탐색한 결과 상위 kinase인 LKB1의 인산화를 확인 할 수 있었다. LKB1의 경우 발현양의 차이가 나지 않았지만 p-LKB1의 경우 발현량이 농도 의존적으로 증가를 하였다(도 13).

GE 시료를 이용하여 지방산 합성저해 효과를 알아보기 위해 sterol regulatory element binding protein 1c(SREBP-1c)의 단백질량을 확인한 결과 SREBP-1c 발현량이 감소함을 확인하였고 (도 14). 또한 하위 경로인 fatty acid synthease (FASN)의 mRAN의 발현량을 real-time PCR 확인한 결과 그 발현량이 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다 (도 15).

서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

1. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 약제학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 식품 조성물.
   
4. 삭제
5. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선용 약제학적 조성물.
   
6. 삭제
7. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 개선용 식품 조성물.
   
8. 삭제
9. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선용 약제학적 조성물.
   
10. 삭제
11. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선용 식품 조성물.
    
12. 삭제
13. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성 개선용 약제학적 조성물.
    
14. 삭제
15. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성 개선용 식품 조성물.
    
16. 삭제
17. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 꼬물꼬시래기 추출물, 그것의 헥산 분획물, 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 다이어트용 식품 조성물.
    
    
18. 삭제

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