KR101277406B1

KR101277406B1 - Ｖｃａｍ-1에 특이적으로 결합하고 백혈구와 내피세포의 접착 및 투과를 저해하는 재조합 인간 단일클론항체

Info

Publication number: KR101277406B1
Application number: KR1020100103523A
Authority: KR
Inventors: 이정태; 문경덕; 윤지용; 성병제; 이동헌; 이동은; 류수연; 심현보; 강경재
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2009-10-23
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2013-06-21
Also published as: JP2013508356A; BR112012009638A2; US8623368B2; WO2011049412A3; EP2491057A4; EP2491057A2; US20120276091A1; WO2011049412A2; KR20110044714A; CN102574916A

Abstract

본 발명은 인간 혈관세포접합 분자-1(VCAM-1)에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 단일클론항체 및 이를 포함하는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 암의 진단, 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체는 인간 내피세포에서 발현된 VCAM-1에 대해서 강한 친화력을 나타내며 VCAM-1으로 매개되는 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 효과적으로 저해하므로 천식, 관절염과 같은 염증성 질환, 장기이식거부 억제, 심혈관 질환 및 암과 같은 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＶＣＡＭ-1에 특이적으로 결합하고 백혈구와 내피세포의 접착 및 투과를 저해하는 재조합 인간 단일클론항체{Human recombinant monoclonal antibody that specifically binds to VCAM-1 and inhibits adhesion and transmigration between leukocytes and endothelial cells}

본 발명은 인간 혈관세포접합 분자-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1, VCAM-1)에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 단일클론항체 및 이를 포함하는 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 암의 진단, 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

백혈구 등의 면역세포는 혈관에서 조직으로 이동할 때 활성화된 내피세포를 통과하여 면역반응을 일으키게 되며, 이러한 백혈구의 내피세포로의 접착과 조직으로의 이동에는 인테그린(integrin), 셀렉틴(selectin), ICAM, VCAM 등의 많은 세포접착분자(Cell-adhesion molecules, CAM)가 관여한다. 세포접착분자의 기능적 분류로는 백혈구와 내피세포와의 상호작용에 관여하는 셀렉틴류와, 접착 고정에 관여하는 인테그린류와 ICAM, VCAM 등의 면역글로불린(immunoglobulin) 등으로 나뉘어 지기도 하는데, 이러한 세포접착분자들은 면역작용, 염증 발생뿐만 아니라 혈액의 응고(thrombosis) 등 많은 생리반응에 주요한 역할을 하고 있다.

VCAM-1은 중성구(neutrophil)를 제외한 모든 백혈구 표면에 발현되는 인테그린(VLA-4) 등과 상호작용하는 혈관 내피세포접착분자(vascular endothelial cell adhesion molecule)의 일종이며, 염증 신호 등에 의해 백혈구의 혈관 내피세포로의 부착을 고정시켜 이후 백혈구의 상처 부위로의 이동에 관여한다.

VCAM-1-VLA-4 상호작용에 대한 최근의 관심에도 불구하고, VCAM-1을 중화시키는 항체의 개발은 활발하게 연구되고 있지 않다. 최근 마우스 VCAM-1에 대한 단일클론항체인 M/K-2.7이 개발되어 콜라겐 유도된 관절염 마우스 모델에서 관절염을 감소시키는 효과를 나타내었으나, 이는 마우스에만 특이적으로 결합하므로 임상 적용에 어려움이 있다.

또한, VCAM-1은 IgG-유사 도메인 7개로 구성되고, 그의 상대 리간드인 인테그린 (α4β1 또는 α4β7)과 결합을 할 때는 실질적으로 도메인 1과 도메인 4가 주로 관여한다고 알려져 있다 (1995, PNAS, 92:p5714; 1995, The journal of immunology, 155: p3135 등).

이러한 관점에서, VCAM-1 항원-인테그린의 상호작용을 저해하여 백혈구의 내피세포로의 접착 및 투과를 효과적으로 저해하면서, 면역원성 위험성을 최소화할 수 있는 인간 단일클론항체 (fully human monoclonal antibody)의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자는 인간 내피세포의 표면에 발현된 VCAM-1을 특이적으로 인식할 뿐만 아니라 VCAM-1 항원의 도메인 1 또는 2에 결합하면서 U937 단핵구(promonocytic leukocyte) 및 활성화된 내피세포 사이의 상호작용을 차단하는 강한 활성을 가지는, 중쇄(heavy chain, VH) 및 경쇄(light chain, VL) 도메인 모두가 인간 유래인 인간 VCAM-1에 특이적인 재조합 인간 단일클론항체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 혈관세포접합 분자-1(VCAM-1)에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 인간 단일클론항체를 이용하여 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 암이 의심되는 개체의 생물학적 시료 내 VCAM-1을 항원-항체 반응을 통해 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 인간 단일클론항체를 이용하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 인간 단일클론항체를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 인간 단일클론항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 혈관세포접합 분자-1(VCAM-1)에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 단일클론항체에 관한 것이다.

하기 용어의 정의는 본 발명의 양상을 보다 명확하게 확인하도록 하기 위해 제공되는 것으로, 본원에서 사용된 용어는 오직 특정 실시 양태를 기술하기 위한 것이고, 한정적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형의 용어는 문맥적으로 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 임의로 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 및 단일클론항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

또한, 용어 "항체"는 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 rIgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 형태를 포함한다. 또한, 상기 용어는 재조합 단일 사슬 Fv 단편(scFv)을 나타내고, 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 이가 및 양특이성 분자는 예를 들면, Kostelny 등 (1992, J. Immunol., 148:1547), Pack 및 Pluckthun (1992, Biochemistry, 31:1579), Hollinger 등 (1993, Supra), Gruber 등 (1994, J. Immunol., 5368), Zhu 등 (1997, Protein Sci., 6:781 등), Hu 등 (1996, Cancer Res., 56:3055), Adams 등 (1993, Cancer Res., 53:4026) 및 McCartney 등 (1995, Protein Eng., 8:301)에 기술되어 있다.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프(epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역 (상기 부위는 "도메인"으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, "상보성 결정 영역" (complementaritydetermining resion, 이하, "CDR"이라 함)이라고 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 "구조 영역" (framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 용어, "재조합 인간 단일클론항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미한다.

인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴할 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계는 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인간 단일클론항체들은 인간 내피세포에 발현된 VCAM-1에 대해서 강한 친화력을 나타내며, VCAM-1을 발현하는 활성화된 내피세포에 백혈구가 접합하는 것을 효과적으로 저해할 뿐 아니라, 중쇄 및 경쇄 도메인 모두가 인간 유래이기 때문에 낮은 면역원성을 나타내므로 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 염증성 질환은 종양괴사 인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환, 대장질환, 동맥경화, 및 심근 경색으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 상기 종양괴사 인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환에는 천식, 당뇨병, 포도막염, 강직성 척추염, 패혈증, 내독소 쇼크, 혈류역학 쇼크, 패혈증 증후군, 허혈성 재관류 손상, 말라리아 감염, 마이코박테리아 감염, 수막염, 건선, 울혈성 심장마비, 섬유증 질병, 카헥시, 이식 거부, 암, 자가면역 질병, 에이즈 기회감염성 감염, 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍, 강직성 통풍염, 크론 질병, 궤양성 방광삼각염, 다발성 경화증, 전신계 홍반성 낭창 나증(leprosy) 동반 제2형 나반응(erythema nodosum leprosum; ENL), 방사선에 의한 손상 및 산소 과다성 폐포 손상이 포함된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역(FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 1로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체일 수 있다(도 1 참고).

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역(FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 5로 정의되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체일 수 있다(도 1 참고).

더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변부위를 모두 포함하는 인간 단일클론항체일 수도 있다. 즉, 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역(FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열번호 1로 기재된 중쇄 아미노산 서열과 서열번호 5로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체일 수 있다(도 1 참고).

추가적으로, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역(FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 9로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체일 수 있다(도 10 참고).

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역(FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 13으로 정의되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체일 수 있다(도 11 참고).

더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변부위를 모두 포함하는 인간 단일클론항체일 수도 있다. 즉, 서열번호 10로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 11으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 상기의 상보성 결정 영역(CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역(FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 가장 바람직하게는, 서열번호 9로 기재된 중쇄 아미노산 서열과 서열번호 13으로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체일 수 있다(도 11 참고).

이때, 상기 재조합 인간 단일클론항체는 인간 VCAM-1에 대한 친화도를 제공하는데, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 재조합 인간 단일클론항체의 인간 VCAM-1 항원에 대한 결합/해리 상수(KD value)는 0.1x10^-9M-7.0x10^-9M일 수 있다. 이는 비아코아를 이용한 분석을 통하여 각 항체들과 인간 VCAM-1에 대한 결합/해리상수(KD value)를 구함으로써 확인할 수 있다. 즉 비아코아 기기를 이용하여 인간 VCAM-1 항원을 리간드(ligand)로서 센서칩(Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1003-99)에 고정화시킨 후, 항체를 농도별로 희석하여 고정화된 리간드에 흘려주어 항원-항체간의 결합 및 해리반응을 유도함으로써 해당 항원-항체 간 결합력 상수인 결합(K_a)/해리(K_d) 상수 KD 값을 확인하였으며 분석의 신뢰도와 관련한 통계학적 수치인 chi square(×2) 값을 확인하였다.

본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization) 에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다.

일반적으로 파지 디스플레이 기술은 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ (또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.

바람직한 일 양태로서, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체의 제조방법은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등 (METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2: 119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등 (Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994) 의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파지는, 예를 들어 필라멘트성 파지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 인간 VCAM-1에 대한 인간 항체를 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 scFv 형태로 수득하였으며, 단일 파지 클론(mono phage clone) 형태로 스크리닝(screening)함으로써 인간 VCAM-1에 특이적인 20 종의 단일 클론 파지 (monoclone phage)를 수득하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 재조합 기술로 수득한 VCAM-1의 분자량 및 순도를 확인한 후 단일클론항체의 제조에 이용하였다.　 상기 VCAM-1을 다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포(human naive scFv library cell)로부터 제조한 라이브러리 파지와 반응하여 패닝(panning)시킨 후, VCAM-1 항원에 강하게 결합하는 단일클론항체를 스크리닝(screening)하였다 (표 1 참조).　 상기 선별된 단일클론항체들을 핑거프린팅 (fingerprinting)으로 확인한 후 각각의 서열을 분석하여 항체의 VH와 VL의 CDR 부위(region)를 확인하였다.　 상기 항체와 생식 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 확인한 결과 VCAM-1에 특이적인 20종의 파지 항체를 얻었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 선별된 20종의 인간 항체 파지의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작하였다. 상기 발현벡터의 제작 시에는, 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.　적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 태양에 따르면, 또한, 본 발명은 상기 재조합 인간 단일클론항체의 인간 VCAM-1 항원에 대한 결합 도메인의 위치를 확인하는 방법을 제공할 수 있다. VCAM-1은 IgG-유사 도메인 7개로 구성되어 있고, 실질적으로 그의 상대 리간드인 인테그린 (integrin α4β1 또는 α4β7)과 결합을 할 때는 도메인 1과 도메인 4가 주로 관여한다고 알려져 있다. 이에, 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체에 대한 VCAM-1 항원의 에피토프를 확인하기 위한 구체적인 실시예는 하기와 같다.

본 발명자들은 인간 VCAM-1 항원을 도메인 별 (VD2, VD4, VD7)로 발현 정제한 다음 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 20종에 대한 항체들의 항원 결합부위를 확인한 결과, 항체마다 항원 결합 부위가 다양하였고 이들 중 도메인 1 또는 2에 결합하는 항체 H6 및 7H를 확보할 수 있었다(도 2 참조).

또한, 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체는 인간 VCAM-1 항원에 대한 친화도를 제공한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자는 비아코아를 이용한 분석을 통하여 항체의 인간 VCAM-1 항원에 대한 결합/해리상수 (KD)를 구함으로써 친화도를 확인할 수 있었는데, H6항체 및 7H 항체는 인간 VCAM-1에 강한 친화도를 가지고 있는 것으로 확인되었다(도 3 참조). 확인 결과, 인간 VCAM-1항원에 대해 H6 항체가 약 0.6nM 수준의 우수한 결합력을 가지고 있었고, 7H 항체는 약 6.3nM 수준의 우수한 결합력을 갖는 것으로 확인되었다.

그러므로 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체는 생물학적 시료 내 VCAM-1을 항원-항체 반응을 통해 검출하는 단계를 포함하는 VCAM-1 검출방법 및 검출용 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 백혈구와 활성화된 내피세포간의 상호작용이 VCAM-1에 의해 매개되기 때문에, 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체(H6)가 인간 백혈구(U937 세포)와 재조합 인간 VCAM-1 또는 인간 TNF-α로 자극시킨 인간 내피세포 (HUVEC) 사이의 접착을 저해시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서, 고체 지지체인 플레이트에 인간 VCAM-1을 고정화하거나, HUVEC이 단층 (monolayer)으로 깔린 플레이트에 상기의 항체들을 농도별로 항원에 처리하여 형광 라벨링 (labeling)된 U937 세포가 항원에 결합하는 것을 저해할 수 있는지를 형광강도를 측정하여 저해유무를 확인한 결과, 상기 항체가 접착 저해능을 보였고 특히 낮은 항체 농도에서도 강한 저해능을 보였다(도 4 및 도 5 참조).

뿐만 아니라, 본 발명에서는 백혈구와 활성화된 내피세포간의 상호작용이 VCAM-1에 의해 매개되기 때문에, 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체가 인간 백혈구 (U937 세포)와 인간 TNF-α로 자극시킨 인간 내피세포 (HUVEC)사이의 상호작용 중 인간 백혈구 세포의 인간 내피세포 단층(monolayer) 투과를 저해시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서, 인간 내피세포가 단층 (monolayer)으로 깔린 트랜스웰(transwell) 플레이트에 상기의 항체를 처리한 뒤 U937 세포의 HUVEC 단층 투과 정도를 트래스웰(transwell) 하단에 모아진 U937 세포의 숫자를 세어서 투과 저해유무를 확인하였다. 분석결과 상기 항체가 강한 투과 저해능을 보였다(도 6 참조).

또한, 세포실험을 통해 VCAM-1 항체(7H)를 VCAM-1을 발현하는 마우스 대동맥 내피세포에 처리했을 때 염증세포의 부착 및 투과가 효과적으로 억제되는 것을 확인한 후, 고지질 식이를 실시한 마우스 복강에 VCAM-1 항체(7H) 투여 시 대동맥 내피세포에 특이적으로 부착되는 것을 확인하였고(도 11), VCAM-1 항체(7H)가 심혈관 질환에서의 치료 효과 여부를 판별하기 위해 ApoE-/- 마우스를 4개 그룹으로 나누고 1그룹에서는 일반 식이와 함께 PBS를 주 2회 투여하였고, 2그룹은 고지질 식이와 함께 대조군 항체로서 4BT(10 mg/kg)를 주 2회 투여하였고, 3그룹은 고지질 식이와 함께 VCAM-1 항체로서 7H를 저농도인 1 mg/kg로 주 2회 투여하였고, 4그룹은 고지질 식이와 7H를 고농도인 10 mg/kg로 주 2회씩 12주간 실시한 후 동맥경화증 분석을 위해 대동맥을 펼쳐 병변을 분석하는 en face 기법을 통해 2그룹에 비해 4그룹에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 17 및 18). 또한, 대동맥궁에 형성된 동맥경화증 분석을 위해 심장 동결절편을 순차적으로 절편하여 분석한 결과 3, 4그룹에서 감소하는 경향성을 확인하였고(도 19 내지 도 21), 이는 마우스 혈액 분석을 통해 콜레스테롤 대사 및 배출에 의한 영향이 아니라는 것을 확인하였다(도 15). 또한, 실험기간 동안 측정한 몸무게 및 식이 사료량의 유의적 차이가 없고(도 14), 실험 후 실시한 독성 테스트에서도 항체에 의해 간독성이 보이는지 확인(도 15)함으로서 VCAM-1 항체(7H)가 VCAM-1 역할을 억제함으로서 동맥경화증을 완화시킨 것으로 확인하였다.

그러므로 이러한 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 인간 내피세포에 발현되는 VCAM-1과 강한 친화성을 가지기 때문에, VCAM-1에 대한 항원인식을 유용하게 사용할 수 있는 임의의 적용에서 사용될 수 있으며, 특히 활성화된 내피세포에 대한 백혈구의 접착과 투과를 효과적으로 저해시키므로 염증성 질환, 심혈관 질환 및 암 등과 같은 VCAM-1 매개성 질환에 대한 효과적인 진단 및 치료 방법을 제공할 수 있다.

이에, 다른 태양에 따라, 본 발명은 상기 재조합 인간 단일클론항체를 이용하여 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암이 의심되는 개체의 생물학적 시료 내 VCAM-1을 항원-항체 반응을 통해 검출하는 단계를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 진단에 필요한 정보의 제공 방법 및 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 진단용 조성물을 제공한다.

즉, 인간 VCAM-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 VCAM-1의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 VCAM-1 매개되는 질환, 예컨대, 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암을 진단할 수 있다.

상기 염증성 질환은 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환, 및 대장질환으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환은 천식, 당뇨병, 포도막염, 강직성 척추염, 패혈증, 내독소 쇼크, 혈류역학 쇼크, 패혈증 증후군, 허혈성 재관류 손상, 말라리아 감염, 마이코박테리아 감염, 수막염, 건선, 울혈성 심장마비, 섬유증 질병, 카헥시, 이식 거부, 자가면역 질병, 에이즈 기회감염성 감염, 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍, 강직성 통풍염, 크론 질병, 궤양성 방광삼각염, 다발성 경화증, 전신계 홍반성 낭창 나증(leprosy) 동반 제2형 나반응(erythema nodosum leprosum; ENL), 방사선에 의한 손상 및 산소 과다성 폐포 손상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 심혈관 질환은 심근경색, 협심증, 뇌졸증, 부정맥, 고혈압, 고지혈증 및 동맥경화로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 암은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 진단용 조성물에는 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 VCAM-1 단백질의 존재, VCAM-1 매개성 질환의 유무를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 시료 중의 VCAM-1 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³ ⁺킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 효소면역흡착법, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 효소면역흡착법, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 효소면역흡착법 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

인간의 VCAM-1과 특이적으로 결합하는 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 단독으로 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암에 대한 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 형태로 사용가능하다.

그러므로, 다른 태양으로 본 발명은 재조합 인간 단일클론항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 암의 치료 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "개체"란 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 포함하여 임의의 동물(예컨대, 인간)을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본원에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 다양한 목적을 위해 다른 항체, 생물학적 활성을 가지는 제제 또는 물질과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 내피세포에서 발현하는 VCAM-1에 의해 특징 지워지는 질환들의 치료에서 다른 항-VCAM-1 항체와 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체는 염증 반응에서 나타나는 내피 세포 수용체 (예를 들어, ELAM1, ICAM1 등)를 인식하는 항체들과 병용하여 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 공지의 염증성 질환 억제 약물과도 병용하여 사용될 수 있다.

상기 염증성 질환은 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환, 및 대장질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 이에 제한 되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환은 천식, 당뇨병, 포도막염, 강직성 척추염, 패혈증, 내독소 쇼크, 혈류역학 쇼크, 패혈증 증후군, 허혈성 재관류 손상, 말라리아 감염, 마이코박테리아 감염, 수막염, 건선, 울혈성 심장마비, 섬유증 질병, 카헥시, 이식 거부, 자가면역 질병, 에이즈 기회감염성 감염, 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍, 강직성 통풍염, 크론 질병, 궤양성 방광삼각염, 다발성 경화증, 전신계 홍반성 낭창 나증(leprosy) 동반 제2형 나반응(erythema nodosum leprosum; ENL), 방사선에 의한 손상 및 산소 과다성 폐포 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 질환일 수 있다.

또한, 상기 심혈관 질환은 심근경색, 협심증, 뇌졸증, 부정맥, 고혈압, 고지혈증 및 동맥경화로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 질환일 수 있다.

또한, 상기 암은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 질환일 수 있다.

본 발명의 재조합 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.

또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 재조합 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여경로 및 배출 비율 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 본 발명의 약제학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 투여하는 경우, VCAM-1과 강한 친화성을 가진 본 발명의 재조합 인간 단일클론항체가 내피 세포에 발현된 VCAM-1에 특이적으로 결합함으로써 VCAM-1을 중화시키고, 결국 상기 내피 세포에 백혈구가 접합되는 것을 저해하고 내피세포 내로 백혈구가 투과되는 것을 저해함으로써 염증성 질환, 심혈관 질환 및 암을 치료할 수 있다. 상기 염증성 질환은 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환, 및 대장질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 이에 제한 되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환은 천식, 당뇨병, 포도막염, 강직성 척추염, 패혈증, 내독소 쇼크, 혈류역학 쇼크, 패혈증 증후군, 허혈성 재관류 손상, 말라리아 감염, 마이코박테리아 감염, 수막염, 건선, 울혈성 심장마비, 섬유증 질병, 카헥시, 이식 거부, 자가면역 질병, 에이즈 기회감염성 감염, 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍, 강직성 통풍염, 크론 질병, 궤양성 방광삼각염, 다발성 경화증, 전신계 홍반성 낭창 나증(leprosy) 동반 제2형 나반응(erythema nodosum leprosum; ENL), 방사선에 의한 손상 및 산소 과다성 폐포 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 질환일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론 항체를 이용하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피 세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 방법을 제공한다. 즉, VCAM-1은 염증 및 면역거부에 있어서 활성화된 백혈구 상에서 발현되는 VLA-4(very late antigen-4) 및 α4β1 인테그린과 결합하며 내피세포와 단핵구 및 T세포를 포함하는 백혈구 사이의 상호작용을 일으키는 중요한 역할을 하는데, 본 발명에 따른 단일클론항체는 이러한 VCAM-1에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해시킬 수 있다.

본 명세서에서 인용된 문헌들은 그 전부가 참고문헌으로서 포함된다. 또한, 당해 기술 분야의 숙련가들은 단지 통상적인 실험에 의해서, 여기에서 특히 기술한 본 발명의 특정 양태의 수많은 동등한 것이 있음을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이 같은 동등한 것은 본 청구항의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 재조합 인간 단일클론항체는 인간 내피세포에서 발현된 VCAM-1에 대해서 강한 친화력을 나타내며 VCAM-1으로 매개되는 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 효과적으로 저해하므로 천식, 관절염과 같은 염증성 질환, 장기이식거부 억제, 심혈관 질환 및 암과 같은 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 인간 단일클론항체의 가변영역 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay) 방법에 의해 인간 VCAM-1 도메인 (domain) 별 항원에 특이적인 항 VCAM-1 인간 단클론 항체들의 항원에 대한 친화도 (affinity)를 나타내는 것으로, VD2는 재조합 인간 VCAM-1 도메인 D1-D2/Fc키메라, VD4는 재조합 인간 VCAM-1 도메인 D11-D44/Fc 키메라, VD7은 재조합 인간 VCAM-1 도메인 D1-D7/Fc 키메라를 나타낸 것이다.
도 3은 인간(human) VCAM-1 항원에 특이적인 항 VCAM-1 인간 단클론 항체들의 항원에 대한 결합능 또는 친화도(affinity)를 나타내는 것으로서, 단백질 친화도 분석 기기인 비아코아(BIACORE, BIACORE AB, 스웨덴)를 이용하여 항원-항체 친화도를 1:1 결합 모드 방법으로 해당 항원-항체 단백질 간 친화도 상수인 KD 값을 계산하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항 VCAM-1 인간 단클론 항체에 의해 정제된 인간 재조합 VCAM-1 항원과 인간 백혈구 세포간 접착 저해능 정도를 분석한 것으로 항체를 처리하지 않은 군에 대비해서 형광 강도가 얼마나 떨어졌는지를 계산하여 저해능 정도를 분석하였다.
도 5는 항 VCAM-1 인간 단클론 항체가 TNF-a(Tumor necrosis factor-a)에 의해 활성화된 인간 내피세포와 인간 백혈구 세포간 접착을 저해할 수 있는지 분석한 것으로 항체를 처리하지 않은 군에 대비해서 형광 강도가 얼마나 떨어졌는지를 계산하여 저해능 정도를 분석하였다.
도 6 은 항 VCAM-1 인간 단클론 항체가 TNF-a(Tumor necrosis factor-a)에 의해 활성화된 인간 내피세포 사이를 인간 백혈구 세포가 투과하는 것을 저해하는 정도를 분석한 것으로 항체를 처리하지 않은 군에 대비해서 투과되어진 백혈구 세포가 얼마나 감소 되었는가를 측정하여 저해능 정도를 분석하였다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 RhoA (Ras homolog gene family, member A) 활성 저해능 확인 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 ROS (Reactive oxygen species) 활성 저해능 확인 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 Internalization 확인 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 인간 단일클론항체의 중쇄서열 및 CDR 서열을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 인간 단일클론항체의 경쇄서열 및 CDR 서열을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 동물실험의 개요를 나타낸 모식도이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 in vitro adhesion assay를 통한 VCAM-1 Ab의 염증세포 부착 억제효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A) 부착된 단핵구 세포수의 그래프 (B) 대표사진.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 in vitro transmigration assay를 통한 VCAM-1 Ab의 염증세포 투과 억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A) 4시간 후 transmigrated cell 수 그래프 (B) 18시간 transmigrated cell 수 그래프.
도 15는은 본 발명의 일 구현예에 따른 VCAM-1 Ab (7H)의 in vivo 결합력 테스트를 위한 en face confocal microscopy 분석을 나타낸 것이다. (A) PBS, (B) high dose control Ab, (C) low dose VCAM-1 Ab, (D) high dose VCAM-1 Ab.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 마우스의 몸무게 변화 및 식이 사료량의 변화를 측정한 결과는 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따른 마우스 혈액분석 결과를 나타낸 것이다. (A) total cholesterol level (T-CHO), HDL-cholesterol level (HDL-C) 및 LDL-cholesterol level (LDL-C). (B) Triglyceride level (TG) 및 glucose level (GLU). (C) glutamic oxaloacetic transaminase level (GOT) 및 glutamic pyruvic transminase level (GPT). (D) albumin level (ALB).
도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 대동맥 궁에 형성된 죽상경화반의 확인 및 면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 구현예에 따른 대동맥에 형성된 죽상경화반의 En face 기법을 통해 병변을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 구현예에 따른 대동맥에 형성된 죽상경화반의 En face 기법을 통해 병변을 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 구현예에 따른 VCAM-1 항체 투여에 의한 독성여부를 확인하기 위한 간조직 절편의 H&E 염색을 통한 병리학적 분석결과를 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명의 일 구현예에 따른 VCAM-1 항체 투여에 의한 독성여부를 확인하기 위한 신장 조직 절편의 H&E 염색을 통한 병리학적 분석결과를 나타낸 도이다.
도 23은 본 발명의 일 구현예에 따른 VCAM-1 항체 투여에 의한 독성여부를 확인하기 위한 비장 조직 절편의 H&E 염색을 통한 병리학적 분석결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 인간 및 마우스 VCAM -1 항원의 확보

1.1. 인간 VCAM -1의 클로닝

한국생명공학연구원 인간유전체기능연구사업단의 KUGI(Korean UniGene Information)에서 인간 VCAM-1 유전자를 함유하고 있는 플라스미드(hMU012650)(Kugi # IRAU-75-G02)를 분양받았다.　상기 플라스미드를 주형 DNA로 하고, 상기 VCAM-1의 D1-D2 도메인과 D1-D4 도메인만을 발현시키기 위해서 VCAM-1의 D1-D2 도메인의 경우 정방향 프라이머 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCCC-3'(서열번호 17) 및 역방향 프라이머 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTGCAATTCTTTTACAGCCTG-3'(서열번호 18)를 사용하고 VCAM-1의 D1-D4의 경우 정방향 프라이머 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCCC-3'(서열번호 19)과 역방향 프라이머 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGAGCTCCACCTGGATTCCCT-3'(서열번호 20)를 사용하여 각 유전자를 증폭한 후, sfiI으로 처리한 후, 라이게이즈를 이용하여 pYK602-Fc vector와 pYK602-His only vector (KRIBB에서 제조한 벡터)에 각각 클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고,　94℃ 2 분 반응 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30 초(D1-D4), 45초(D1-D2)로 30 사이클, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.　아울러, 상기 클로닝된 pYK602-FC-VCAM-1-D1-D2, pYK602-His-VCAM-1-D1-D2, pYK602-FC-VCAM-1-D1-D4와 pYK602-His-VCAM-1-D1-D4 벡터들의 염기서열을 확인하였다.

1.2. VCAM -1 단백질의 발현 및 정제

여러 단백질 중, 분자 전체를 포함하는 hVCAM-Fc-chimera (R&D system, cat#:862-VC) 과 mVCAM-1-Fc chimera (R&D systems, Cat#: 643-VM)는 상업적으로 구매하였고, VCAM-1 도메인 별 단편의 발현 및 정제는 다음과 같이 진행하였다.

먼저 150 ㎜ 디쉬 10장에 5 × 10⁶293E 세포를 깔아준 후, 다음날 상기 클로닝된 pYK602-VCAM-1-D1-D2 벡터와 pYK602-VCAM-1-D1-D4 벡터를 각각　20 μg씩 PEI(23966: Polysciences, Inc, USA)를 처리하여 형질전환 하였다.　다음날 성장배지(무혈청 DMEM)로 바꿔준 후 이틀마다 상등액를 얻어 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 웨스턴 블랏으로 발현량을 확인하였다.

hVCAM-1-D1-D2-Fc와 hVCAM-1-D1-D4-Fc의 발현이 확인된 상등액을 모은 다음, 0.22μm Top-filter (Millipore, Cat#: SCGP T05 RE)을 사용하여 필터한 다음, 먼저 충분한 단백질 양을 확보하여 정제 후 사용하였고, 정제 과정은 다음과 같다. 먼저 Econo-column(Bio-Rad Cat. No 737-1006, 1 x 5 cm)을 PBS로 세정(washing)한 후, Protein A(Amersham Cat. No. 17-1279-30) 500 ㎕를 패킹(packing)한다. 패킹(packing) 하는 동안 PBS (pH7.4) 10 ml 정도 흘려주어 비드(Bead)를 세정(washing) 해 주고, 바인딩 버퍼(binding buffer)인 20 mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer) (pH7.0)를 30 ml 정도 흘려주었다. 그런 다음 얻어진 상등액을 Peri-staltic pump(Bio-Rad Cat. No. 731-8142)를 이용하여 0.5 ml/min정도로 흘려주었다. 결합시킨 후 PBS로 2ml/min으로 1시간 정도 세정(washing) 한 후 일루션(elution) 하였다. 0.1M glycine-HCl(pH2.5) 500 ㎕로 일루션(elution) 해주고 1/10 volume의 1M Tris-HCl, pH 9.0)을 넣어 중화시켰다. 6개 일루션(elution) 프랙션(fraction) 중 #1~#2 프랙션(fraction)에 대부분의 단백질이 일루션(elution) 되었고, 이 두 프랙션(fraction)은 10K 투석막(dialysis membrane)에 넣어 4L PBS에서 o/n 투석하였다. 위 모든 과정은 4℃ 냉방에서 실시하고, 정량 후 앨리어컷(aliquot)하여 -70℃에 보관하였다. 정제한 다음, 10% SDS-PAGE gel로 확인하였고, 그 결과 hVCAM-1-D1-D2-Fc와 hVCAM-1-D1-D4-Fc에 대해 각각 2.8mg 과 800ug의 단백질을 얻었다. hVCAM-1-D1-D-Fc와 hVCAM-1-D1-D4-his의 경우, 발현이 확인된 상등액을 모은 다음, 0.22μm Top-filter (Millipore, Cat#: SCGP T05 RE)을 사용하여 필터한 후, LabScale TFF System (Millipore, Cat#: XX42LSS11)의 pellicon XL membrane (Millipore, 8K, cat #: PXB0 08A 50)을 이용하여 1/10 부피로 농축하였다. 그 다음 농축된 10배 부피의 IMAC 완충용액(300mM KCl, 50mM KH2PO4, 5mM imidazole, pH8.0)을 넣어 농축하면서 IMAC 완충용액으로 교환한 후, Bio-Rad의 Profinia TM 단백질 정제 시스템의 Bio-Scle Mini profinity IMAC cartridge (cat#:732-4610)을 사용하여　1ml/min 속도로 제조사의 매뉴얼에 명시된대로 정제한 후, 상기 용리액을 멤브레인(10K, 132574:SPECTRAPOR, USA)에 넣은 후, 4℃에서 4L의 PBS용액에 4시간 이상 완충용액을 바꿔준 후, 다시 미리 차게 해둔 4L의 PBS 용액에 넣어 밤새 투석하여 완충용액을 바꿔주었다.　밤새 투석한 다음, e-tube로 옮기고, Bradford 방법으로 단백질농도를 측정한 후, 400 ㎍의 hVCAM-1-D1-D4-his, hVCAM-1-D1-D2-Fc 단백질을 얻었고, 10% SDS-PAGE 젤에서 확인하였다.

2. 라이브러리 파지 의 제조

다양성을 가진 인간 합성 scFv 라이브러리 유전자를 가진 대장균 세포 2 ×10¹⁰를 SB [bactotrypton 30g, 이스트 추출물(Yeast extract) 20 g, MOPS 10g, pH 7.0], 암피실린(ampicillin) 50 ㎍/㎖, 2% 글루코스(glucose)를 포함하는 배지에서 37℃에서 2~3시간 동안 배양하여 OD₆₀₀=0.5 되도록 한 후, VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)를 감염시켜 37℃에서 배양하였다. 이후 카나마이신(Kanamycin)을 70 ㎍/㎖로 추가한 배지에서 1 mM IPTG를 첨가하여 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.　배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응하였다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.

3. 파지 디스플레이를 통한 바이오패닝

7개의 IgG-유사 도메인으로 구성되어 있는 VCAM-1은 그의 리간드인 알파4베타1 인테그린 (α4β1 integrin)과 결합할 때 도메인 1과 도메인 4가 결합부위(binding motif)로 중요한 역할을 한다고 알려져 있기 때문에, VCAM-1 전체 분자를 이용한 1차 패닝 이외에 인간 VCAM-1-D1-D4 (hVCAM-1-D1-D4)을 항원으로 2차 패닝도 진행하였다. 본 실시예에서는 hVCAM-1-D1-D4에 대한 패닝 방법과 결과를 기재하였다.

3.1. hVCAM -1- D1 - D2 항원과 hVCAM -1- D1 - D4 항원에 대한 바이오 패닝

인간 재조합 VACM-1(R&D system, 809-VR) 항원이 10㎍/㎖로 코팅된 이뮨솝(Immunosorb) 튜브(Nunc 470319)를 실온에서 1시간 동안 3% 탈지우유/PBS로 먼저 차단시킨 다음, 실온에서 1~2시간 동안 위에서 제조한 라이브러리 파지 1 × 10¹²cfu 첨가하여 배양하였다. 상기 튜브를 TBST(0.05%)로 3회 세척하였다. 결합형 파지를 실온에서 10분 동안 1 ml의 새로 제조한 100mM 트리에틸아민의 용액을 사용하여 용출시켰다. 용출된 파지들을 1M Tris (pH 7.4) 용액으로 중화한 후 대장균(ER2537)에 감염시켜 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 감염된 대장균은 2% 글루코오스와 암피실린이 포함된 LB-아가로스 배지 플레이트(직경 15cm)에 도포하여 37℃에서 16시간 배양하고, 배양된 대장균을 5mL SB에 분산하였다. 이 중 50ml를 20ml SB-암피실린-글루코스에 접종하고 <1. 라이브러리 파지의 제조>의 방법에 따라 결합형 파지를 포함하는 용액을 얻어 다음 차수의 패닝에 사용하였다. 1차 패닝 이후 2차~4차 패닝은 이뮨솝(Immunosorb) 튜브에 hVCAM-1-D1-D2 항원과 hVCAM-1-D1-D4 항원을 각각 코팅하여 각각의 패닝을 진행하였다 (표 1 참조).

hVCAM-1-D1-D2 항원과 hVCAM-1-D1-D4 항원으로 패닝한 결과 패닝횟수

패닝횟수	D1-D2 인풋	D1-D2 아웃풋	D1-D4 인풋	D1-D4 아웃풋
1^st(*)	2.2 x 10¹¹	2.5 x 10⁸	2.2 x 10¹¹	2.5 x 10⁸
2^nd	1.5 x 10¹²	2.5 x 10⁸	1.5 x 10¹²	2.5 x 10⁸
3^rd	1.2 x10¹²	5 x 10⁷	5 x 10¹¹	n/d
4^th	1.5 x 10¹²	5 x 10⁷	2.0 x 10¹²	5 x 10⁷

(*)1차 패닝의 항원은 재조합 VCAM-1 (R&D systems 809-VR)이 공통적으로 사용됨

3.2. hVCAM -1- D1 - D4 항원에 대한 단일 클론 항체 선별 확인

4차까지 패닝한 아웃풋 티터(output titer) 플레이트에서 단일 콜로니를 무균의 투스픽(toothpick)을 사용하여 각각 집어내 SB-앰피실린 배지가 200㎕/well로 들어있는 96웰 플레이트에 각각 접종한 뒤 37℃로 2~3시간 (OD600=0.5~0.7) 배양하였다.이 후 각 웰에 20㎕의 10mM IPTG를 넣어 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 96웰 면역 플레이트(Costar 3690)에 hVCAM-1-D1-D4 항원을 웰 당 250 ng 씩 37℃에서 1시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 녹인 스킴 밀크(skim milk)(3 %)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 먼저 배양된 4차 패닝 scFv 파이지를 원심 분리한 후(3000 rpm, 15 분) 상등액을 제거하고 TES 버퍼 60㎕씩 각 웰에 가한 뒤 얼음 위에서 30분간 배양한 후 다시 원심 분리 후(3000 rpm, 15 분) 각각의 상등액을 3% 스킴 밀크(skim milk)/PBS가 제거된 VCAM-1-D1-D4 항원이 코딩된 96웰 면역 플레이트에 웰당 25 ㎕ 씩 넣고 37℃에서 1시간 정도 반응시켰다.

각 웰 마다 PBS-tween 20(0.05%) 0.2 ㎖으로 4회 세척한 후 3% 스킴 밀크(skim milk)/PBS 로 1: 3000으로 희석된 이차 항체 항-HA-HRP (Santa Cruz , SC-7392)를 각 웰마다 25㎕씩 가한 후 1시간 동안 반응하였다.　PBS-tween 20(0.05%) 0.2 ㎖으로 4회 세척한 후에 TMB 용액을 각 웰 당 25㎕씩 가한 후 5분 정도 반응시켰다. 반응 후 바로 1M H2SO4 용액을 25㎕씩 각 웰에 넣어 반응을 정지시킨 뒤 450 ㎚에서 흡광도를 Spectrophotometer(MolecularDevice, 미국)로 측정하였다.

그 결과, hVCAM-1-D1-D4 항원에 대해 78개의 단일 파지 클론들의 결합능을 비교 확인하였고, 이들의 종류를 확인하기 위해 핑거 프린팅(finger printing)과 서열분석으로 선별하여 최종 20종의 서로 다른 파지 항체를 선별할 수 있었다.

4. Full IgG 형태로의 클로닝

hVCAM-1에 대한 단일 클론 파지 항체들을 파지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄는 단일 클론 DNA 1 ㎕와 10 pmole/㎕ 의 중쇄 정방향 프라이머와 중쇄 역방향 프라이머, 10X 버퍼(buffer) 5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1 ㎕, pfu DNA 중합효소(솔젠트, 2.5 U/㎕) 0.5 ㎕,증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다.　또한, 경쇄도 경쇄 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 수행하였다.

PCR 결과 수득한 중쇄 유전자를 DNA-겔 추출 키트(Qiagen)로 정제한 후, pNATAB H 벡터 1 ㎕(10 ng), 중쇄(100~200 ng) 15 ㎕, 10 X Buffer 2 ㎕, 라이게이지(Ligase) (1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다.　상기 벡터를 형질전환용 세포(XL1-blue)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다.　다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다.　LB Amp 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Amp 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-prep. 키트(Nuclogen)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 또한, 경쇄는 pNATAB L벡터를 사용하여 상기와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다. 상기 수득한 DNA의 CMVproF 프라이머(AAA TGG GCG GTA GGC GTG)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트). 그 결과, 전체 IgG로 전환한 다양한 VCAM-1에 대한 9개의 클론의 중쇄와 경쇄의 서열이 파지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.

5. 항체의 임시 유전자 발현 ( transient gene expression )

상기 클로닝된 전체 IgG 중쇄 DNA와 경쇄 DNA로부터 임시 발현을 하였다. 임시발현 숙주로 CHO (Chinese Hamster Ovary)-S 세포에 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000, Cat no. 11668-019, Invitrogen) : DNA의 1 : 1 비율로 Opti-MEMI(GIBCO 31985, Invitrogrn) 혼합 용액에 형질전환 (transfection) 반응을 유도하였다. 임시 배양에서 발현량을 최대화시키기 위한 항체의 중쇄와 경쇄의 DNA 양 비율은 1:1로 구성하였다. 형질전환용 배지로는 RPMI 1640 (GIBCO 22400, Invitrogen)배지를 사용하였고, 세포 농도는 2 X10⁶세포/㎖로 사용하였다. 20분간 반응한 혼합 용액을 형질전환용 배지에 1 : 9 비율의 부피로 섞어주고 이것을 CO₂ 5%, 37℃로 설정된 배양기에 110rpm으로 흔들어주면서 4시간 동안 부화시켰다. 이후 8mM Glutamine(GIBCO 25030, L-Glutamine 200mM, 100X, Invitrogen)과 HTS(GIBCO, HT Supplement, Cat no. 11067-030, Invitrogen)가 포함된 CD-CHO 배지(GIBCO 10743, Invitrogen)로 형질전환된 부피와 동일한 부피의 배지를 첨가하였다. 첨가된 플라스크는 CO₂ 8%, 37도로 설정된 배양기에서 100rpm으로 4일간 배양했다. 이렇게 배양된 시료는 8,000 g에서 15 분 동안 원심분리 하여 세포 찌꺼기를 제거한 다음, 상등액은 0.22㎛ 여과기(Corning)로 여과하여 항체 분리정제를 위한 배양액을 준비하였다.

6. 항체의 분리정제

실시예 5에서 준비된 상등액을 평형화 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl)으로 평형화시킨 재조합 프로틴-A 세파로즈 컬럼 (Hitrap rProteinA FF, 5 ㎖, GE healthcare)에 통과시켰다. 컬럼에 결합된 항체를 0.1 M Na-citrate(pH 3.0), 100 mM NaCl 용액으로 용출 시킨후, 1 M Tris-HCl (pH 9.0)으로 중화시키고 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4, Welgene) 완충액에서 투석시켰다. 정제된 항체를 Bis-Tris 4-12% 농도구배 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE gel, Invitrogen) 상에서 환원 (reduced) 조건으로 전기영동 하였다. 그 결과, 약 55kDa의 중쇄와 약 25 kDa의 경쇄가 관찰되었다.

7. 항체의 항원 친화도 분석

7.1. 항원 도메인과의 친화도 분석

7개의 도메인으로 구성된 VCAM-1에서 항 VCAM-1 항체가 결합하는 위치를 확인하고자 ELISA 방법을 사용하였다. 재조합 인간 VCAM-1 도메인 1~2/Fc 키메라(이하 VD2, A&R therapeutics), VCAM-1 도메인 1~4/Fc 키메라(이하 VD4, A&R therapeutics), VCAM-1 도메인 1~7/Fc 키메라(이하 VD7, R&D, 862-VC)를 각각 2㎍/㎖ 농도에서 마이크로플레이트의 웰(well)에 밤새 4℃로 코팅하였다. PBS를 사용하여 상기 플레이트를 1회 세척한 후 3% BSA(bovine serum albumin)가 첨가된 PBS를 사용하여 2시간 동안 37℃에서 차단시키고, 7H 항체를 포함하고 있는 세포 배양액(1:50)을 넣어 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS를 사용하여 플레이트를 4회 세척한 후 재조합 인간 VCAM-1 항원에 결합한 항VCAM-1 항체의 양을 항-Fab 단일클론항체 호스래디시 퍼옥시다제가 컨주게이트된 항-F(ab′)2 항체의 작용에 의해 검출하였다. 광학적 농도는 TMB 기질 용액(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine)을 사용하여 실온에서 약 5분간 반응시키고 1N(노르말) 황산 용액으로 반응을 멈춘 뒤 450nm에서 측정하였다. H6 항체의 경우, 정제된 항체를 100~125ng/ml로 희석하여 반응시킨 후 호스래디시 퍼옥시다제가 컨주게이트된 항-kappa light chain 항체의 작용에 의해 검출하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 H6 항체는 VCAM-1 도메인 1~2 (VD2), 1~4(VD4), 1~7(VD7) 모두에 강한 결합능을 갖고 있었으며, 특히 H6 항체는 VCAM-1의 7개 도메인 중 1~2 도메인(VD2)에 우수한 결합능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 7H 항체도 VCAM-1 도메인 중 1~2 도메인(VD2)에 우수한 결합능을 가지고 있는 것으로 확인되었다.

7.2. 비아코아 ( BIACORE )를 이용한 친화도 분석

인간 VCAM-1항원에 대한 항 VCAM-1 항체 H6와 7H의 결합력(affinity)을 확인하기 위해 각 항원을 리간드(ligand)로서 센서칩(Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1003-99)에 고정화시킨 후 항체를 농도별로 희석하여 비아코아 기기를 이용 고정화된 리간드에 흘려주어 항원-항체간의 결합 및 해리반응을 유도함으로써 해당 항원-항체 간 결합력 상수인 결합/해리 상수 Kd 값을 확인하였으며 이에 대한 실험 결과를 도3에 나타내었다 (참고문헌: Thomas Hofer, Wisit Tangkeangsirisin , Michael G. Kennedy , Rose G. Mage , Stephen J. Raiker , Karthik Venkatesh , Hakjoo Lee , Roman J. Giger , Christoph Rader Chimeric rabbit/human Fab and IgG specific for members of the Nogo-66 receptor family selected for species crossreactivity with an improved phage display vector Journal of Immunological Methods 318 (2007) 75.87 ; Paula Gomes a, David Andreu Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor Journal of Immunological Methods 259, 2002.217-230 ; Kikuchi Y, Uno S, Nanami M, Yoshimura Y, Iida S, Fukushima N, Tsuchiya M. Determination of concentration and binding affinity of antibody fragments by use of surface plasmon resonance. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 100, No. 3, 311-317, 2005).

비아코아(BIACORE) 시험은 1)센서칩과 리간드 사이의 커플링(coupling) 조건을 확인하는 완충액 선별단계(Pre-concentration), 2)리간드를 센서칩에 고정화시키는 단계, 3)고정화된 리간드를 이용하여 분석 물질을 결합시키는 단계의 3단계로 시험이 진행된다.

1) 완충액 선별단계( Pre - concentration )

본 시험은 통상 해당 실험용으로 사용되는 비아코아용 센서 칩인 CM5 센서칩(Sensor chip CM5, BIACORE, BR-1003-99)을 사용하였으며 리간드를 칩에 고정화시키기 전에 리간드와 칩 간 정전기적 상호 작용을 확인하기 위해 커플링 완충액(coupling buffer)으로 사용하는 pH 4.0~5.5 사이의 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액을 이용하여 정전기적 상호 작용이 좋은 완충액을 선택하였다.

2) 리간드 고정화 단계

센서칩 CM5(Sensor chip CM5)에 리간드를 고정화시키기 위해서 우선 칩을 활성화시켜야 하며 이를 위해 N-hydroxysuccinimide (NHS)와 N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (Amine Coupling Kit, BR-1000-50)를 혼합하여 아미노 그룹과 반응성이 좋은 NHS-ester로 바꾸어 준 후 주입하였다. 고정화시키고자 하는 1㎎/㎖ 농도 리간드를 각 pH 4.0~5.5 사이의 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액 97㎕을 이용하여 3/100 희석한 후 유속(flow rate)을 10 ㎕/min으로 하여 약 3분간 주입하였다. 음성 대조군으로서 러닝 버퍼(running buffer)인 HBS-EP 완충액(BIACORE AB, 스웨덴) 이용하여 동일하게 희석한 시료를 사용함) 리간드가 미리 설정한 고정화 수치값인 target RU(resonance unit)로 고정화되기 위해 자동으로 순차적으로 주입(serial inject)되어지며 target RU에 도달하게 되면 리간드가 고정화되고 남은 칩 부분을 불활성화시키기 위해 1M 에탄올아민(Amine Coupling Kit, BR-1000-50)을 처리하며 이때 유속은 10 ㎕/min으로 하여 약 3분간 주입하였다. 최종 리간드의 고정화수치(RU)값은 에탄올아민 주입이 끝나고 나서 확인된 RU값과 리간드 주입 시작시의 RU값의 차이에 대해 제공되는 고정화 리포트(immobilization report)로 최종 확인되었다.

3) 고정화된 리간드를 이용하여 분석 물질을 결합시키는 단계

해당 시험은 비특이적 결합 (non-specific binding)값을 제거해 주기 위해 비아코아 기기에서 제공되는 flow cell 2-flow cell 1 방법(mode)을 선택하였으며, 이때 flow cell 2에는 리간드로서 재조합 VCAM1/Fc 항원을 고정화시키고 flow cell 1에는 Bovine Serum Albumin(BSA)를 고정화시킨 후 분석 시료인 항 VCAM-1 항체인 H6를 동시에 flow cell 1, 2에 흘려준 후 flow cell2의 sensogram RU에서 flow cell1의 sensogram RU을 자동 제거해주었으며, 이후 유속을 30ul/min으로 하여 약 3분간 분석 시료를 주입하여 결합시킨 후 다시 120초간 해리를 유도시켰다. 이와 같은 과정을 통하여 해당 항원과 항체간의 결합/해리 곡선(association/dissociation curve)를 얻을 수 있었으며 이후 BIAevaluation 프로그램(BIACORE AB, 스웨덴)을 통하여 도 3과 같이 결합/해리 상수 KD 값을 산출하였다. 시험 결과, 인간 VCAM-1항원에 대해 H6 항체가 약 0.6nM 수준의 우수한 결합력을 가지고 있었고, 7H 항체는 6.3nM 수준의 결합력을 갖는 것으로 확인되었다.

8. 항체에 의한 백혈구 세포 접착 저해능 분석

8.1. 인간 VCAM -1 항원과 백혈구 세포간 접착 저해능 분석

96-웰 플레이트 (Maxisorp, Nunc)의 웰 당 재조합 인간 VCAM-1 (10 ㎍/㎖, Cat.No.: 809-VR-200, R&D systems) 100 ㎕를 넣고 1시간 동안 코팅한 후, 항체 H6 에 대해 각각 0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎍씩 VCAM-1이 코팅된 웰에 첨가하여 1시간 동안 항원에 결합하도록 하였다. 이때 양성 대조군으로 4B2 마우스 항-인간 VCAM-1 단클론 항체 (Cat.No.: BBA5, R&D), 음성 대조군으로 항체 처리를 하지않고 항원만을 처리하였다. 결합이 진행되는 동안 인간 백혈구 세포인 U937 (Cat.No.: CRL-1593.2, ATCC)을 5 μM의 BCECF-AM (Cat.No.: 216254, Calbiochem)으로 형광 염색을 시켰다. 그 다음 과정으로 U937 세포 표면에 있는 Fc 수용체를 불화성화 시키기 위해 100 % 인간혈청 (Cat.No.: H4522, Sigma)을 처리하였다. 형광 염색과 Fc 수용체 불활성화 과정을 거친 백혈구 세포를 1% 송아지 혈청이 포함된 RPMI 1640(Cat.No.: 22400-089, Invitrogen) 배지에 1.0 X 10⁶세포/㎖이 되게 부유시켰다. 준비된 U937 세포를 항원과 항체가 결합된 플레이트에 웰 당 100 ㎕ 씩 넣고 37 ℃, 5 % CO₂ 정체 배양기에서 15분 동안 접착시킨 후, 1% 송아지 혈청이 포함된 RPMI1640 배지를 웰에 가득 찰 때까지 넣고, 봉합 테이프로 배지가 세지 않게 붙인 다음 플레이트를 뒤집은 채로 200 X 중력 (g force)에서 5분 동안 원심분리 했다. 원심분리한 플레이트를 뒤집은 채로 봉합 테이프를 떼고 손목 힘으로 털어서 배지 및 접착하지 않은 U937 세포를 완전하게 제거한 후, 세포용해 완충액 (50 mM Tris-HCl(pH8.5), 0.1% SDS)을 웰 당 150 ㎕씩 넣고 15분 동안 접착되어 있는 U937 세포를 용해하였다. 그런 다음 플레이트를 형광 분석기 (GeminiX, Molecular Device )에 삽입하고, 흡수 파장 485 nm/방출 파장 530 nm에서 형광 강도를 측정하였다. 결과분석은 각 실험의 조건 당 3 반복 (triplicate)해서 나온 평균값을 산출하였고, 항체를 처리하지 않은 군에 대비해서 형광 강도가 얼마나 떨어졌는지를 계산하여 저해능 정도를 분석하였다. 분석결과 H6 항체는 1 ㎍ 이상에서 80% 이상의 저해능을 보였다 (도 4 참조).

8.2. 인간내피세포와 백혈구 세포간 접착 저해능 분석

96-웰 플레이트 (Microtest tissue culture 96-well plate, BD-Falcon)의 웰 당 인간내피세포인 HUVEC 세포를 2X10⁴개씩 깔고 약 3일 동안 EGM-2 배지(Lonza)에서 제조사의 지시에 따라 배양하였다. 세포가 단층 (monolayer)으로 깔렸는지 현미경으로 확인하고, 인간 TNF-α를 20 ng/㎖의 농도로 24시간 동안 자극(stimulation)시켰다. 이후에 TNF-α 를 제거하기 위해 EGM-2 배지 200 ㎕/well 로 2 번 씻어낸 다음, 항체 H6에 대해 각각 0.01, 0.1, 1.0, 10.0 ㎍씩 HUVEC 단층이 깔린 웰에 첨가하여 1시간 동안 항원에 결합하도록 하였다. 이때 양성 대조군으로 0.5, 5.0 ㎍의 4B2 마우스 항-인간 VCAM-1 단클론 항체 (Cat.No.: BBA5, R&D)와 마우스 항-α4 인테그린 항체, 음성 대조군으로 항체처리를 하지 않고 항원만을 처리하였다. 결합이 진행되는 동안 인간 백혈구 세포인 U937 (Cat.No.: CRL-1593.2, ATCC)을 5 μM의 BCECF-AM (Cat.No.: 216254, Calbiochem)으로 형광 염색을 시켰다. 그 다음 과정으로 U937 세포 표면에 있는 Fc 수용체를 불화성화 시키기 위해 100 % 인간혈청 (Cat.No.: H4522, Sigma)을 처리하였다. 형광 염색과 Fc 수용체 불활성화 과정을 거친 U937 세포를 1% 송아지 혈청이 포함된 RPMI 1640 (Cat.No.: 22400-089, Invitrogen)배지에 1.0 X 10⁶세포/㎖이 되게 부유시켰다. 준비된 U937 세포를 항체가 결합된 HUVEC에 웰 당 100 ㎕ 씩 넣고 은박지로 빛을 차단한 다음 37 ℃, 5 % CO₂ 정체 배양기에서 10분 동안 접착시킨 후, 플레이트를 뒤집은 채로 손목의 힘으로 배지 및 접착하지 않은 세포를 제거하고, 1% 송아지 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지를 웰에 가득 찰 때까지 넣고, 봉합 테이프로 배지가 세지 않게 붙인 다음 다시 플레이트를 뒤집은 채로 400 X 중력 (g force)에서 5분 동안 원심분리 했다. 원심분리한 플레이트를 뒤집은 채로 봉합 테이프를 떼고 손목 힘으로 털어서 배지 및 접착하지 않은 U937 세포를 완전하게 제거한 후, 세포용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH8.5), 0.1% SDS)을 웰 당 150 ul씩 넣고 15분 동안 접착되어 있는 U937 세포를 용해하였다. 그런 다음 플레이트를 형광 분석기 (GeminiX, Molecular Device )에 삽입하고, 흡수 파장 485 nm/방출 파장 530 nm에서 형광 강도를 측정하였다. 결과 분석은 각 실험의 조건당 3 반복 (triplicate)해서 나온 평균값을 산출하였고, 항체를 처리하지 않은 군에 대비해서 형광 강도가 얼마나 떨어졌는지를 계산하여 저해능 정도를 분석하였다. 분석결과 항체 H6는 0.1 ~10.0 ㎍에서 약 25 ~ 65%의 저해능을 보였다(도 5 참조). 이 결과는 실시예 8.1. VCAM-1 항원과 백혈구 세포 접착 저해능 분석결과와 유사한 양상이었다.

9. 백혈구 세포의 인간 내피세포로의 투과 저해능 분석

인간 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell(HUVEC), Cambrex, C2517A) 2x10⁴cell/300 ㎕ (EGM-2 media)를 트랜스웰(transwell) (6.5mm insert, 5um polycarbonate membrane, Corning, 3421)의 인설트(insert)에서 약 4일간 배양하여 단일막(monolayer)을 형성하게 한 후 VCAM-1의 발현 유도 인자 human TNF-α(20ng/㎖, abcam, ab9642)를 처리하여 14~16시간 동안 VCAM-1의 발현을 유도시켰다. HUVEC은 계대(passage) 1~5 사이의 세포를 사용하였다.

백혈구(human promonocytic leukocyte, U937, CRL-1593.2 TM)는 1% FBS/RPMI 1640(Gibco, 22400)배지로 2회 세정(washing)(1100prm, 3분간 centrifuge) 후 5x10⁶cell/㎖ 로 인간 혈청(Sigma, H4522)에 현탁하여 실온에서 15분간 배양하여 Fc receptor를 차단하였다. HUVEC이 있는 인서트(insert)에서 TNF-α 가 첨가된 배지를 털어낸 후 항체 H6를 각각 1% FBS/RPMI 배지 100ul에 넣고, Fc receptor가 차단된 U937 세포 일부는 항-알파-4 인테그린(anti-alpha 4 integrin) 항체 또는 재조합 인간 VCAM-1 항원에 현탁하여 30분간 37℃에서 전처리하였다. 전처리가 끝난 HUVEC에 U937 세포 5x10⁵cell/200 ㎕ 1% FBS/RPMI 배지를 첨가하고 항-알파-4 인테그린(anti-alpha 4 integrin) 항체에 현탁했던 U937도 같은 세포수를 HUVEC에 첨가하였다. 이때 U937 백혈구의 내피투과 이동(transendothelial migration)을 유도하기 위하여 다닥 웰에 10nM의 C5a (R&D, 2037C5)를 400㎕ 씩 넣어 플레이트를 37℃ 인큐버(incubator)에서 2~6시간 배양하였다. 이 후 인서트(insert)를 제거하고 바닥 웰(bottom well)로 이동한 백혈구를 e-tube에 회수하여 1,500rpm에서 3분간 원심분리(centrifuge)하여 media를 제거한 후 1X PBS 600㎕에 현탁하여 세포 숫자를 세었다(Cell counter, Beckman Coulter TM , Vi-Cell XR 2.03).

측정된 세포 수를 이용하여 TNF-α 를 처리한 HUVEC 시험군 (Human IgG control 처리군)의 C5a에 의한 백혈구의 이동에서 TNF-α 및 C5a 미처리 시험군의 비특이적 백혈구 이동 수를 차감한 수를 100% 이동으로 계산하여 각 시험 항체의 이동 저해능 (inhibition of migration(%))을 산출하였다. 분석 결과 H6항체가 25% 정도의 투과 저해능을 보이고 있음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

10. RhoA ( Ras homolog gene family , member A) 활성 저해능 확인

HUVEC(인간 제대 혈관 내피 세포) 2x10⁵ 개를 6-웰 플레이트에 접종하고 약 3일간 배양하여 각 웰에 세포가 단일막(monolayer)을 형성하도록 키웠다. 배양액에 존재하는 혈청을 제거하기 위해 EBM-2 배지(Cat. No.: CC-3156, Lonza)로 1회 세척하고, 인간 TNF-α를 20ng/mL의 농도로 0.25% 의 송아지 혈청이 포함된 EBM-2 배지에 희석하여 넣은 후 14~16시간 동안 처리하여 VCAM-1의 발현을 유도하였다. 배양액을 제거하고 항체 H6와 대조항체(IgG4, Cat. No.: I4764, Sigma)를 각각 10ug/ml 농도로 넣은 후 30분간 37 ℃에서 반응시켰다. 세포 표면의 VCAM-1을 교차결합시키는데 사용되는 항 VCAM-1 항체(Cat. No.: BBA5, R&D)를 10ug/ml 농도로 첨가하여 30분간 37 ℃에서 반응시키고 HRP 표지된 항-마우스 항체(Cat. No.: A9917, Sigma)를 1:100 의 비율로 첨가하여 5분간 37 ℃에서 반응시켰다. 반응이 끝난 즉시 얼음 위에 플레이트를 둔 상태로 배지를 제거하고 차가운 PBS로 1회 세척하였다. 플레이트의 잔여 PBS를 완전히 제거한 후 RhoA activation kit(Cat. No.: BK124, Cytoskeleton)에 포함된 세포용해 완충액을 각 웰에 100ul씩 넣어 세포를 용해하여 회수하였다. 이후 과정은 키트의 매뉴얼대로 실험을 진행하였으며 3회 반복 실험하였다.

실험 결과 세포 표면에 발현된 VCAM-1을 교차 결합시킴으로써 유도된 RhoA 활성은 H6 항체에 의해 약 56% 저해되는 것으로 확인되었다.

11. ROS ( Reactive oxygen species ) 활성 저해능 확인 실험

HUVEC(인간 제대 혈관 내피 세포) 2x10⁵ 개를 6-웰 플레이트에 접종하고 약 3일간 배양하여 각 웰에 세포가 단일막(monolayer)을 형성하도록 키웠다. 배양액에 존재하는 혈청을 제거하기 위해 EBM-2 배지(Cat. No.: CC-3156, Lonza)로 1회 세척하고, 인간 TNF-α를 20ng/mL의 농도로 0.25% 의 송아지 혈청이 포함된 EBM-2 배지에 희석하여 넣은 후 14~16시간 동안 처리하여 VCAM-1의 발현을 유도하였다. 배양액을 제거하고 EBM-2 배지로 2회 세척한 후, 항체 H6와 대조항체(IgG4, Cat. No.: I4764, Sigma)를 각각 10ug/ml 농도로 넣은 후 30분간 37 ℃에서 반응시켰다. 세포를 EBM-2 배지로 2회 세척하고 세포 표면의 VCAM-1을 교차결합시키는데 사용되는 항 VCAM-1 항체(Cat. No.: BBA5, R&D)를 10ug/ml 농도로 넣어 30분간 37 ℃에서 반응시켰다. 세포를 EBM-2 배지로 2회 세척하고 HRP 표지된 항-마우스 항체(Cat. No.: A9917, Sigma)를 1:100 의 비율로 희석하여 넣은 후 37 ℃에서 30분간 반응시키고, EBM-2 배지로 2회 세척하였다. 배지를 완벽히 제거한 후, EBM-2 배지에 희석한 10um DCF(2',7'-dichlorofluorescein diacetate)를 150ul씩 세포에 처리한 후 형광값(측정파장 495nm-527nm)을 10분 간격으로 3시간 동안 관찰하여 3시간째 측정된 값으로 항체의 효능을 평가하였으며 3회 반복 실험하였다.

실험 결과 세포 표면에 발현된 VCAM-1을 교차 결합시킴으로써 유도된 ROS 활성은 H6 항체에 의해 약 33% 저해되는 것으로 확인되었다.

12. Internalization 확인 실험

HUVEC(인간 제대 혈관 내피 세포) 2x10⁵ 개를 6-웰 플레이트에 접종하고 약 3일간 배양하여 각 웰에 세포가 단일막(monolayer)을 형성하도록 키우고, human TNF-α (20ng/ml, Cat. No.: ab9642, abcam)를 14~16시간 동안 처리하여 VCAM-1의 발현을 유도하였다. HUVEC은 1~5계대 사이의 세포를 사용하였다. human TNF-α 를 제거하기 위해 PBS로 1회 세척한 후, 플레이트를 4℃에 20분간 거치하였다. 항체 H6 를 1% BSA가 첨가된 PBS에 10ug/ml 로 희석하여 HUVEC 에 처리한 후 4℃에서 30분간 결합을 유도하고 PBS로 1회 세척하였다. 플레이트를 37℃에 각각 2, 10, 30, 60분간 거치하여 VCAM-1 에 결합된 항체의 internalization을 유도한 후 PBS로 세척하였다. VCAM-1 발현 확인용 시험군을 제외하고 산성 PBS(pH 2.5) 를 1ml 넣고 5분간 실온에 거치하여 세포 표면에 결합하고 있는 항체를 제거한 후, PBS로 세척하였다. 세포를 trypsin(Cat. No.: CC-5034, Clonetics) 처리하여 회수한 후 4% 포름알데히드(in PBS)를 넣어 실온에서 10분간 반응시켰다. PBS로 세포를 1회 세척한 후 0.2% Triton X-100(in PBS) 를 넣어 다시 10분간 반응시키고 PBS로 1회 세척하였다. FITC가 결합된 goat anti-human IgG 항체(Cat. No.: F9512, Sigma)를 넣고 4℃에서 30분간 결합을 유도한 후 PBS로 1회 세척하여 유세포 분류기(Flow cytometry)로 세포를 분석하였으며 2회 반복 실험하였다.

실험 결과 isotype control(회색)에 비해 세포 표면에 VCAM-1이 발현된(화살표, 하늘색) 정도가 뚜렷하였다. 또한 각 시간별로 internalization을 유도한 결과 VCAM-1에 항체가 결합한지 2분째부터 internalization이 진행되어 30분째에 최대에 이르는 것을 확인하였다.

13. in vitro 부착 분석( adhesion assay )을 통한 VCAM -1 항체의 염증세포 부착 억제효과 분석

VCAM-1 항체가 혈관 내피세포에 부착함으로서 염증세포의 부착을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스의 대동맥 혈관 내피세포를 마트리젤 방법(Matrigel method)으로 분리하여 배양한 후 24웰 배양 디쉬에 1 x 10⁵ 개씩 접종한 후 TNFa를 처리하여 VCAM-1 발현을 야기시킨 후 녹색형광단백질(green fluorescence protein)을 발현하는 형질 전환 마우스의 골수 세포에서 단핵구 세포 표면마커인 CD11b를 잡는 마그네틱 비드(magnetic bead)를 사용하여 분리하여 혈관 내피세포에 1x10⁶ 개씩 처리 한 후 30분 동안 배양 후 붙지 않은 세포를 PBS 세척을 통해 제거 한 후 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정하고 다시 PBS로 세척 후 형광현미경을 통해 이미지를 획득하여 부착된 단핵구 세포를 이미지 분석 소프트웨어를 통해 세포수를 계수하여 분석하였다.

부착된 단핵구 세포의 분석 결과 대조군 항체를(4BT, 10㎍/ml) 처리한 혈관 내피세포 보다 VCAM-1 항체를 (7H, 10㎍/ml) 처리한 혈관 내피세포에서 약 20%의 감소 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 9).

14. in vitro 투과 분석( transmigration assay )을 통한 VCAM -1 항체의 염증세포 투과 억제 효과 분석

VCAM-1 Ab가 혈관 내피세포에 부착함으로서 염증세포의 투과를 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스의 대동맥 혈관 내피세포를 마트리젤 방법(matrigel method)으로 분리하여 배양한 후 transwell의 위쪽 챔버(chamber)에 5 x 10⁴ 개씩 접종하고 TNFa를 처리하여 VCAM-1 발현을 야기시킨 후 마우스의 골수 세포를 분리하여 혈관 내피세포에 1x10⁵ 개씩 처리 한 후 4시간, 18시간 후에 아래쪽 챔버로 빠져 나온 세포수를 세어 분석한 결과 4시간 후 측정에서 대조군 항체를 (4BT, 10㎍/ml) 처리한 그룹 보다 VCAM-1 Ab (7H, 10㎍/ml) 처리한 그룹에서 약 25%의 감소 효과가 나타났고 18시간 후에서는 약 29%의 감소 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

15. VCAM-1 Ab (7H)의 in vivo 부착성 확인(binding test)을 위한 en face 공초점 현미경 분석(confocal microscopy assay)

VCAM-1 항체의 심혈관 치료제로서의 효과를 확인하기 위해 우선적으로 마우스에 주입 시 VCAM-1을 발현하는 대동맥 혈관 내피세포에 특이적으로 부착되는지 확인하기 위하여 PBS, 대조군 항체 (4BT, 10mg/kg), VCAM-1 항체 (7H, 1mg/kg), VCAM-1 항체 (7H, 10mg/kg)의 4개 그룹으로 나누어 2주간 4회를 복강주사를 통해 주입과 고지질 식이를 병행한 후 각 마우스의 대동맥을 회수하여 Alexa 594 표지된 항-인간 IgG 이차 항체와 반응시키고 혈관 내피세포의 VCAM-1 발현여부를 재확인하기 위하여 염소 항-mVCAM-1 항체와 Alexa 488이 표지된 항-염소 IgG 이차 항체와 반응시키고 대동맥을 펼쳐 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 확인한 결과 각 마우스의 대동맥에서 VCAM-1이 잘 발현하는 것을 확인하였고 오직 고농도의 VCAM-1 Ab (7H, 10mg/kg)를 주입한 마우스에서만이 항체가 잘 붙어있는 것을 확인할 수 있었다(도 11).

16. 몸무게 변화 및 식이 사료 량 측정

12주간 사료 및 Ab 투여에 의한 마우스의 체중 변화를 측정하기 위해 주 1회 각 그룹의 마우스 몸무게와 식이 후 남은 사료 량을 측정한 결과 일반 식이를 실시한 1 그룹을 제외하고 고지질 식이를 실시한 2~4 그룹은 그룹간의 차이는 보이지 않고 사료 섭취량 또한 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 12).

17. 혈액 분석 결과

각 실험군의 동물의 혈액을 분리하기 위하여 heparin으로 항응고처리된 tube로 혈액을 채취하여 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈액 내 총 콜레스테롤(total cholesterol, CHL), 트리글리세리드(triglyceride, TG), 고밀도 지단백(high density lipoprotein, HDL), 저밀도 지단백(low density lipoprotein, LDL)의 측정은 자동혈액화학분석기(HITACHI 7150, Japan)를 이용하여 분석하였다.

	마릿수	투여 물질 및 농도
Group 1	5	Normal chow diet	PBS
Group 2	15	HF (western) diet	대조군(4BT, 10mg/kg)
Group 3	15	HF (western) diet	VCAM-1 Low Dose(7H, 1mg/kg)
Group 4	15	HF (western) diet	VCAM-1 High Dose(7H, 10mg/kg)

일반식이(Normal chow)와 PBS(phosphate buffered saline) 투여를 실시한 1그룹에서는 총 콜레스테롤(T-CHO) 평균 및 표준편차가 615.20±61.67(mg/dl)으로 가장 적은 수준을 보였고 고지질 식이(High-fat diet)와 4BT Ab(10mg/kg)를 투여한 2그룹에서는 총 콜레스테롤 평균 및 표준편차가 1380.00±237.03(mg/dl), 고지질 식이(High-fat diet)와 7H Ab(1mg/kg)를 투여한 3그룹에서는 1367.20±143.68(mg/dl), 고지질 식이(High-fat diet)와 7H Ab(10mg/kg)를 투여한 4그룹에서는 1323.60±209.38(mg/dl)를 보여 대조군(2그룹)에 비하여 감소하는 유의적인 차이를 보이지 않았고 HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 또한 유의적인 차이를 보이지 않아 7H Ab의 투여에 의한 콜레스테롤 대사 및 배출에는 영향이 없음을 확인하였지만 중성지질과 포도당 수치가 4그룹에서 감소하였고 간독성 여부 확인을 위해 실시한 GOT, GPT 및 ALB 수치 검사에서 차이를 보이지 않았다(도 13).

18. 대동맥 궁에 형성된 죽상경화반의 확인 및 면적 측정

12주간 고지질(fat 20%, cholesterol 0.15%) 식이를 투여한 ApoE -/- mouse를 희생시켜 심장 및 오름대동맥부터 흉부대동맥까지 절제하여 포르말린에 고정한 후 심장을 트리밍(trimming)한 다음 OCT 화합물에 포매하여 초저온 냉동고(deep freezer)에서 동결시킨 후 대동맥궁을 동결절편기로 6의 두께로 잘라 슬라이드를 제작하였다. 지방염색을 위하여 슬라이드를 증류수에 담궜다가 순수 프로필렌 글리콜(absolute propylene glycol)에 1분 담근 후 Oil-red 용액에서 16시간 염색한 후 85% 프로필렌 글리콜(propylene glycol)에서 2분간 담그고 증류수로 수세한 후 수성 봉입제로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다. 죽상경화반의 면적 측정을 위해 각각의 조직을 촬영한 후 이미지 측정 소프트 웨어(image measure soft ware, Axio Vision, Carl Zeiss)를 이용하여 면적을 측정하여 결과를 비교하였다.

일반식이(Normal chow)와 PBS(phosphate buffered saline) 투여를 실시한 1그룹에서는 평균 병변 면적 및 표준편차가 88.55±21.65(10³μm²)으로 가장 적은 병변을 형성하였고 고지질 식이(High-fat diet)와 4BT Ab(10mg/kg)를 투여한 2그룹에서는 평균 병변 면적 및 표준편차가 345.20±74.03(10³μm²)으로 가장 큰 병변 형성률을 보였고 고지질 식이(High-fat diet)와 7H Ab(1mg/kg)를 투여한 3그룹에서는 323.68±86.02(10³μm²), 고지질 식이(High-fat diet)와 7H Ab(10mg/kg)를 투여한 4그룹에서는 294.78±2.62(10³μm²)로 대조군(2그룹)에 비하여 감소하는 경향성을 확인하였다(도 14).

19. 대동맥에 형성된 죽상경화반의 En face 기법을 통한 병변 분석

심장과 대퇴 동맥까지 절제한 후 주변의 지방조직과 adventitia 부위를 깔끔히 제거하고 심장 기저부의 동맥을 절단하여 심장과 분리한 후 미세가위와 미세핀셋을 이용하여 절개하여 혈관 내부가 보이도록 펼친 후 핀으로 고정한 다음 10% 중성완충 포르말린(neutral buffered formalin solution)으로 16시간 고정한 후 순수 프로필렌 글리콜(absolute propylene glycol)에 1분 담근 후 Oil-red O 용액에서 16시간 염색한 후 85% 프로필렌 글리콜(propylene glycol)에서 2분간 담그고 증류수로 세척한 후 해부현미경(Leica)을 이용하여 이미지를 획득 후 Axio Vision AC 이미지 분석 프로그램으로 대동맥 총 면적에 대한 병변 퍼센트를 측정하였다.

일반식이(Normal chow)와 PBS(phosphate buffered saline) 투여를 실시한 1그룹에서는 평균 병변 면적 및 표준편차가 1.75±0.47(%)으로 가장 적은 병변을 형성하였고 고지질 식이(High-fat diet)와 4BT Ab(10mg/kg)를 투여한 2그룹에서는 평균 병변 면적 및 표준편차가 8.01±4.25(%)으로 가장 큰 병변 형성률을 보였고 고지질 식이(High-fat diet)와 7H Ab(1mg/kg)를 투여한 3그룹에서는 7.02±3.64(%), 고지질 식이(High-fat diet)와 7H Ab(10mg/kg)를 투여한 4그룹에서는 5.43±1.61(10³μm²)로 대조군(2그룹)에 비하여 P < 0.05로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 15 및 도 16).

20. VCAM -1 항체 투여에 의한 독성여부를 확인하기 위한 주요장기의 병리학적 분석

마우스 복강에 주사한 항체에 의한 독성 여부를 판별하기 위하여 각 그룹의 간, 신장 및 비장을 10% 포름알데히드에 고정하여 파라핀 블록을 제작하였고 미세절편기를 사용하여 조직 절편을 획득한 후 핵과 세포질 염색을 위하여 헤마톡실린 & 에오신(matoxylin & Eosine) 염색을 실시한 후 관찰한 결과 고지질 식이를 통해 간에서 보이는 지방간 이외의 염증세포 침착 및 조직 괴사와 같은 독성으로 인한 표현형은 보이지 않았다(도 17).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간 혈관세포접합 분자-1(VCAM-1)에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 것을 특징으로 하며, 서열번호 2로 정의되는 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 정의되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위와 서열번호 6으로 정의되는 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 정의되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 재조합 인간 단일클론항체.
제1항에 있어서, 상기 재조합 인간 단일클론항체는 인간 혈관세포접합 분자-1(VCAM-1)의 도메인 1 또는 2에 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 단일클론항체.
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제2항에 있어서, 상기 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 1로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체.
제2항에 있어서, 상기 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 5로 정의되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체.
제2항에 있어서, 상기 재조합 인간 단일클론항체의 인간 VCAM-1 항원에 대한결합/해리 상수(KD value)가 0.1x10^-9M -7.0x10^-9M인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 단일클론항체.
인간 혈관세포접합 분자-1(VCAM-1)에 특이적으로 결합하여 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 것을 특징으로 하며, 서열번호 10으로 정의되는 중쇄 CDR1; 서열번호 11로 정의되는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 정의되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위와 서열번호 14로 정의되는 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 정의되는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16으로 정의되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 재조합 인간 단일클론항체.
제7항에 있어서, 상기 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 9로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체.
제7항에 있어서, 상기 재조합 인간 단일클론항체는 서열번호 13으로 정의되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인간 단일클론항체.
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제1항, 제2항, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 인간 단일클론항체를 이용하여, 인간을 제외한 대상에서 백혈구 및 활성화된 내피세포 사이의 접합 및 상기 활성화된 내피세포로의 백혈구의 투과를 저해하는 방법.
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제1항, 제2항, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 인간 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환, 및 대장질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제20항에 있어서, 상기 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α; TNF-α) 매개성 질환은 천식, 당뇨병, 포도막염, 강직성 척추염, 패혈증, 내독소 쇼크, 혈류역학 쇼크, 패혈증 증후군, 허혈성 재관류 손상, 말라리아 감염, 마이코박테리아 감염, 수막염, 건선, 울혈성 심장마비, 섬유증 질병, 이식 거부, 암, 자가면역 질병, 에이즈 기회감염성 감염, 관절염, 류마티스성 척추염, 통풍, 강직성 통풍염, 크론 질병, 궤양성 방광삼각염, 다발성 경화증, 전신계 홍반성 낭창 나증(leprosy) 동반 제2형 나반응(erythema nodosum leprosum; ENL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항, 제2항, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 재조합 인간 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 심근경색, 협심증, 뇌졸증, 부정맥, 고혈압, 고지혈증 및 동맥경화로 구성되는 군으로부터 선택되는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물.