TW201945544A - 靶向ｃｔｌａ－４抗體、其製備方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種靶向CTLA-4的抗體、其製備方法和用途。具體地，本發明公開了一種新的靶向CTLA-4的全人單克隆抗體。本發明還公開了製備所述的單克隆抗體的方法。本發明的單克隆抗體能夠高特異性地結合CTLA-4抗原，其具有很高的親和力並且具有顯著抗腫瘤等活性。

Description

靶向ＣＴＬＡ－４抗體、其製備方法和用途
本發明涉及生物醫藥領域，更具體地涉及一種CTLA-4抗體及其製備方法和應用。
單克隆抗體的應用是過去20年時間腫瘤治療中最成功及最具變革意義的治療手段之一。與傳統化學藥物相比，抗體藥物具有更高的特異性及更低的毒性。雖然單抗藥物取得了持續不斷的成功，但仍面臨諸多挑戰。
鼠源單克隆抗體最大的缺陷則是它所誘發的HAMA(人抗鼠抗體)反應。因而，鼠單抗在腫瘤、器官移植等疾病的診斷和治療上有較大的局限性；嵌合抗體仍保留著30%的鼠源序列，可引起不同程度的HAMA反應。臨床顯示不同的嵌合抗體有著不同程度的免疫原性；人源化抗體又稱移植抗體。簡單CDR移植常常導致抗原抗體親和力下降，由於其仍至少具有10%的異源蛋白，在臨床應用中還是受到不同程度的限制。因而有待于進一步研製更完善的治療性抗體-完全人抗體。
1994年，美國Abgenix和Genpham兩公司報告了利用轉基因小鼠製備完全人抗體，從而解決了人體不能被隨意免疫這一人抗體製備研究的難題。此後完全人抗體製備技術的不斷發展成熟，所獲人單克隆抗體已具有較強的抗腫瘤活性。
癌症免疫治療是癌症治療最新突破，利用患者自身免疫系統來攻擊腫瘤細胞。
免疫檢查點是指免疫系統中存在的一些抑制性信號通路，通過調節外周組織中免疫反應的持續性和強度避免組織損傷，並參與維持對於自身抗原的耐受。利用免疫檢查點的抑制性信號通路抑制T細胞活性是腫瘤逃避免疫殺傷的重要機制。針對免疫檢查點的阻斷是眾多啟動抗腫瘤免疫的有效策略之一。
免疫檢查點蛋白的抑制劑具有治療各種腫瘤類型(如轉移性黑素瘤，肺癌，乳腺癌，腎細胞癌等)的潛力。最近癌症免疫治療方法的研究已經顯示出可喜的成果，特別是對轉移癌癌症病例。此外，癌症免疫治療在治療血液癌症方面具有巨大的潛力，包括霍奇金淋巴瘤，多發性骨髓瘤，骨髓發育不良綜合征，非霍奇金淋巴瘤等。免疫檢查點抑制劑引起的副作用是可以忽略的，可逆的和可控的，有效的免疫檢查點抑制劑可以顯著提高癌症患者的總生存期。免疫檢查點抑制劑可以與靶向治療或常規放射治療和化學療法結合使用，並且這種組合療法可有效治療許多類型的癌症。
CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4或CD152)是作為主要免疫檢查點分子之一的I型跨膜蛋白，其包含細胞外Ig-V樣結構域，Ig-C樣結構域，跨膜結構域和胞內C-末端結構域。CTLA-4主要在調節性T細胞胞內為組成型表達，在活化的T細胞表面為誘導型表達，並與配體B7.1(CD80)和B7.2(CD82)相互作用誘導抑制性信號，導致T細胞活化、增值抑制和細胞因數產生減少，CTLA-4在Treg細胞表面呈組成型高表達，參與Treg對其他效應T細胞活性的下調。
CTLA-4在T細胞啟動早期階段活性的調節至關重要，從而成為外周淋巴系統免疫耐受的主要調控機制，CTLA-4通過與CD28競爭配體，及通過其自身對TCR信號通路的抑制，調節T細胞對抗原的反應強度，從而使機體表現出對自身抗原或外源弱抗原識別的耐受。
研究認為阻斷CTLA-4/B7配體相互作用，可以提高機體對腫瘤抗原的識別活性，刺激抗原特異性T細胞的增值，從而達到啟動免疫系統並增強抗腫瘤免疫應答，並且已在多個同系小鼠腫瘤模型中被證明，CTLA-4的阻斷促進抗腫瘤活性。因此，藥物阻斷CTLA-4/B7.1及B7.2途徑可以為各種癌症和其他免疫疾病提供新的治療方法。
目前，本領域現有的CTLA-4抗體還有許多的不足，比如治療視窗較小、適應症有限、治療成本高等，所以開發CTLA-4的阻斷型抗體是治療多種癌的迫切需求。
為了克服目前缺少全人CTLA-4抗體及現有CTLA-4抗體在活性及安全性方面的缺點，本發明提供一種親和力高、特異性強的CTLA-4抗體及其製備方法。
在本發明的第一方面，提供了一種抗體的重鏈可變區，所述的重鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO：8n+2所示的CDR1，
SEQ ID NO：8n+3所示的CDR2，和
SEQ ID NO：8n+4所示的CDR3；
其中，各n獨立地為0、1、2、3或4；
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
在另一較佳例中，所述重鏈可變區具有SEQ ID NO：8n+1所示的胺基酸序列，其中，n為0、1、2、3或4。
在本發明的第二方面，提供了一種抗體的重鏈，所述的重鏈具有如請求項1所述的重鏈可變區。
在本發明的協力廠商面，提供了一種抗體的輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO：8n+6所示的CDR1'，
SEQ ID NO：8n+7所示的CDR2'，和
SEQ ID NO：8n+8所示的CDR3'；
其中，各n獨立地為0、1、2、3或4；
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
在另一較佳例中，所述輕鏈可變區具有SEQ ID NO：8n+5所示的胺基酸序列，其中，n為0、1、2、3或4。
在本發明的第四方面，提供了一種抗體的輕鏈，所述的輕鏈具有如請求項3所述的輕鏈可變區。
在本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有：
(1)如本發明的第一方面所述的重鏈可變區；和/或
(2)如本發明的協力廠商面所述的輕鏈可變區；
或者，所述抗體具有：如本發明的第二方面所述的重鏈；和/或如本發明的第四方面所述的輕鏈，
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
在另一較佳例中，上述任一CDR的胺基酸序列中包含經過添加、缺失、修飾和/或取代1、2或3個胺基酸的衍生CDR序列，並且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所構成的衍生抗體能夠保留與CTLA-4結合的親和力。
在另一較佳例中，所述的衍生抗體與CTLA-4結合的親和力F1與相應非衍生的抗體與CTLA-4結合的親和力F0之比(F1/F0)為0.5-2，較佳地為0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一較佳例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量為1-5個(如1-3個，較佳地1-2個，更佳地1個)。
在另一較佳例中，所述的經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列為同源性為至少96%的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述的抗體還包括重鏈恒定區和/或輕鏈恒定區。
在另一較佳例中，所述的重鏈恒定區為人源的，和/或所述的輕鏈恒定區為人源的。
在另一較佳例中，所述抗體選自下組：嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、或其組合。
在另一較佳例中，所述的全人抗體在人中的免疫原性Z1與非全人的抗體(如鼠源抗體)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)為0-0.5，較佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
在另一較佳例中，所述的抗體是部分或全人源化、或全人的單克隆抗體。
在另一較佳例中，所述的抗體為雙鏈抗體、或單鏈抗體。
在另一較佳例中，所述抗體為抗體全長蛋白、或抗原結合片段。
在另一較佳例中，所述抗體為雙特異性抗體、或多特異性抗體。
在另一較佳例中，所述抗體具有選自下組的一個或多個特性：
(a)抑制腫瘤細胞遷移或轉移；
(b)抑制腫瘤生長。
在另一較佳例中，所述的抗體具有如本發明的第一方面所述的重鏈可變區和如本發明的協力廠商面所述的輕鏈可變區；
其中，所述的重鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO：2所示的CDR1，
SEQ ID NO：3所示的CDR2，和
SEQ ID NO：4所示的CDR3；
其中，所述的輕鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO：6所示的CDR1'，
SEQ ID NO：7所示的CDR2'，和
SEQ ID NO：8所示的CDR3'；
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：8n+1所示的胺基酸序列；和/或所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：8n+5所示的胺基酸序列，其中，各n獨立地為0、1、2、3或4。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，並且所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，並且所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，並且所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，並且所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述的抗體選自下組：97A8D1、92C8B6、31C12F3、40C4C6
97B8E1。
所述重鏈可變區的胺基酸序列與如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。
所述輕鏈可變區的胺基酸序列與如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性。
在另一較佳例中，所述的抗體為去岩藻糖基化抗體。
在另一較佳例中，所述的抗體為去岩藻糖基化抗體97A8D1。
在本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白包括：
(i)如本發明的第一方面所述的重鏈可變區、如本發明的第二方面所述的重鏈、如本發明的協力廠商面所述的輕鏈可變區、如本發明的第四方面所述的輕鏈、或如本發明的第五方面中任一項所述的抗體；以及
(ii)任選的協助表達和/或純化的標籤序列。
在另一較佳例中，所述的標籤序列包括6His標籤。
在另一較佳例中，所述的重組蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一較佳例中，所述的重組蛋白為單體、二聚體、或多聚體。
在另一較佳例中，所述重組蛋白包括：
(i)如本發明的第五方面所述的抗體，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，並且所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，以及
(ii)任選的協助表達和/或純化的標籤序列。
在另一較佳例中，所述重組蛋白包括：
(i)去岩藻糖基化抗體(例如去岩藻糖基化抗體97A8D1)；
(ii)任選的協助表達和/或純化的標籤序列。
在本發明的第七方面，提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼選自下組的多肽：
(1)如本發明的第一方面所述的重鏈可變區、如本發明的第二方面所述的重鏈、如本發明的協力廠商面所述的輕鏈可變區、如本發明的第四方面所述的輕鏈、或如本發明的第五方面中任一項所述的抗體；以及
(2)如本發明的第六方面所述的重組蛋白。
在另一較佳例中，編碼所述重鏈可變區的多核苷酸如SEQ ID NO：41、43、45、47或49所示；和/或，
編碼所述輕鏈可變區的多核苷酸如42、44、46、48或50所示。
在另一較佳例中，編碼所述重鏈可變區序列的多核苷酸如SEQ ID NO：41所示；並且編碼所述輕鏈可變區序列的多核苷酸如42所示。
在另一較佳例中，編碼所述重鏈可變區的多核苷酸如SEQ ID NO：43所示；並且編碼所述輕鏈可變區的多核苷酸如44所示。
在另一較佳例中，編碼所述重鏈可變區的多核苷酸如SEQ ID NO：45所示；並且編碼所述輕鏈可變區的多核苷酸如46所示。
在另一較佳例中，編碼所述重鏈可變區的多核苷酸如SEQ ID NO：47所示；並且編碼所述輕鏈可變區的多核苷酸如48所示。
在另一較佳例中，編碼所述重鏈可變區的多核苷酸如SEQ ID NO：49所示；並且編碼所述輕鏈可變區的多核苷酸如50所示。
在本發明的第八方面，提供了一種載體，所述載體含有本發明的第七方面中任一項所述的多核苷酸。
在另一較佳例中，所述的載體包括：細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。
在本發明的第九方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述宿主細胞含有本發明的第八方面所述的載體或基因組中整合有本發明的第七方面中任一項所述的多核苷酸。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分選自下組：如本發明的第一方面所述的重鏈可變區、如本發明的第二方面所述的重鏈、如本發明的協力廠商面所述的輕鏈可變區、如本發明的第四方面所述的輕鏈、或如本發明的第五方面中任一項所述的抗體、如本發明的第六方面所述的重組蛋白、或其組合；以及
(ii)藥學上可接受的載體。
在另一較佳例中，所述的藥物組合物為液態製劑。
在另一較佳例中，所述的藥物組合物為注射劑。
在另一較佳例中，所述的藥物組合物包括0.01~99.99 %的如本發明的第五方面中任一項所述的抗體、如本發明的第六方面所述的重組蛋白、或其組合和0.01~99.99%的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的品質百分比。
在本發明的第十一方面，提供了一種活性成分的用途，所述活性成分選自下組：如本發明的第一方面所述的重鏈可變區、如本發明的第二方面所述的重鏈、如本發明的協力廠商面所述的輕鏈可變區、如本發明的第四方面所述的輕鏈、或如本發明的第五方面中任一項所述的抗體、如本發明的第六方面所述的重組蛋白、或其組合，其中所述活性成分被用於製備預防和/或治療CTLA-4相關腫瘤和/或病毒感染相關的疾病的藥物。
在另一較佳例中，所述CTLA-4相關的疾病選自下組：黑色素瘤，間皮瘤，非小細胞肺癌，乳腺癌，肝癌，滑膜肉瘤，轉移性結腸癌，腎癌，膀胱癌，前列腺癌，卵巢癌，丙型肝炎病毒慢性感染，晚期實體癌，消化器官惡性腫瘤，轉移性非小細胞肺癌，前列腺腫瘤，子宮內膜癌，子宮內膜癌肉瘤，復發黑色素瘤，頭頸部鱗狀細胞癌，肉瘤，默克爾細胞癌，皮膚T細胞淋巴瘤，輸卵管癌，腹膜腫瘤，肌肉浸潤性膀胱癌，廣泛的階段小細胞肺癌，成人急性髓細胞性白血病，非典型慢性粒細胞白血病，先前治療的骨髓增生異常綜合征，卵巢上皮細胞癌，泌尿系統惡性腫瘤，成人III級淋巴瘤樣肉芽腫，B細胞慢性淋巴細胞白血病，皮膚B細胞非霍奇金淋巴瘤，眼內淋巴瘤，睾丸絨毛膜癌，神經母細胞瘤，食管癌等。
在本發明的第十二方面，提供了一種體外檢測樣品中CTLA-4蛋白的組合物，其包括如本發明的第五方面中任一項所述的抗體、如本發明的第六方面所述的重組蛋白、或其組合作為活性成分。
在本發明的第十三方面，提供了一種治療腫瘤或者病毒感染疾病的方法，包括：使用如本發明的第五方面中任一項所述的抗體、如本發明的第六方面所述的重組蛋白、或其組合。
在另一較佳例中，所述腫瘤為癌症。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或較佳的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
本發明人通過廣泛而深入的研究，採用大鼠-人嵌合抗體的轉基因小鼠，採用293F-HuCTLA-4細胞(例如重組表達的293F-HuCTLA4細胞)對轉基因小鼠進行免疫，意外地獲得高活性的抗CTLA-4的全人抗體。實驗結果表明，所述的與人源和猴源的CTLA-4蛋白均具有高度親和力(KD 為2.15E-09nM)，能夠抑制CTLA-4與其受體B7.1和B7.2的結合，能在PHA誘導的人T淋巴細胞或SEB介導啟動的人外周血單核細胞中顯著增加IL-2的表達水準，並且缺乏與人CD28等同類蛋白抗原的交叉反應。所獲得全人抗CTLA-4抗體，具有親和力更高、體外及體內活性更強等特點。並且所述全人CTLA-4抗體(例如97A8D1)體內抗腫瘤效果優於現有技術中的抗體Ipilimumab。在此基礎上完成了本發明。

術語
CTLA-4
CTLA-4即細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4，結構上屬於CD28免疫球蛋白超家族，在啟動的T細胞呈誘導型表達和在調節性T細胞組成型表達，作為免疫檢驗點蛋白，通過與CD28競爭性結合配體，從而下調T細胞的活性。對於轉基因小鼠和荷瘤小鼠的研究表明，CTLA-4參與腫瘤對免疫系統識別和殺傷的逃避，所以阻斷CTLA-4的活性，可能提高機體對腫瘤生長的抑制。

抗體
如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恒定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一個恒定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成介面。
如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為構架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈b-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分b折疊結構。每條鏈中的CDR通過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等, NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669頁(1991))。恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恒定區的胺基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為k和l)中的一類。根據其重鏈恒定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區分別稱為a、d、e、g、和m。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型是本領域人員所熟知的。
一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為可變區域(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，通過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可以通過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。
本發明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。因此，本發明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。
在本發明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單克隆抗體，包括人的和非人的部分，可以通過標準的DNA重組技術獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單克隆抗體的可變區，和來自人免疫球蛋白的恒定區的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397,在此通過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補決定區(CDRs)和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此通過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單克隆抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。
在本發明中，抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。
在本發明中，本發明的抗體還包括其保守性變異體，指與本發明抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。


抗 CTLA-4 的抗體
本發明提供一種針對CTLA-4 的高特異性和高親和力的抗體，其包括重鏈和輕鏈，所述重鏈含有重鏈可變區(VH)胺基酸序列，所述輕鏈含有輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
較佳地，重鏈可變區(VH)包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO：2所示的CDR1，
SEQ ID NO：3所示的CDR2，和
SEQ ID NO：4所示的CDR3；
輕鏈可變區(VL)包括以下三個互補決定區CDR：
SEQ ID NO：6所示的CDR1'，
SEQ ID NO：7所示的CDR2'，和
SEQ ID NO：8所示的CDR3'；
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
在另一較佳例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列較佳為同源性或序列相同性為至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少為90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
本領域普通技術人員公知的測定序列同源性或相同性的方法包括但不限於：電腦分子生物學(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.編，牛津大學出版社，紐約，1988；生物計算：資訊學和基因組專案(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.編，學術出版社，紐約，1993；序列資料的電腦分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編，Humana Press，新澤西，1994；分子生物學中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.，學術出版社，1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.與Devereux，J.編M Stockton Press，紐約，1991和Carillo，H.與Lipman，D.，SIAM J. Applied Math.，48：1073(1988)。測定相同性的較佳方法要在測試的序列之間得到最大的匹配。測定相同性的方法編譯在公眾可獲得的電腦程式中。較佳的測定兩條序列之間相同性的電腦程式方法包括但不限於：GCG套裝程式 (Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公眾可從NCBI和其它來源得到BLASTX程式 (BLAST手冊，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman演算法也可用於測定相同性。
本發明的抗體可以是雙鏈或單鏈抗體，並且可以是選自動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，更佳為人源化抗體、人-動物嵌合抗體，更佳為全人源化抗體。
本發明所述抗體衍生物可以是單鏈抗體、和/或抗體片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或該領域內其他已知的抗體衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗體或其他亞型的抗體中的任意一種或幾種。
其中，所述動物較佳為哺乳動物，如鼠。
本發明抗體可以是靶向人CTLA-4的嵌合抗體、人源化抗體、CDR嫁接和/或修飾的抗體。
本發明上述內容中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，較佳為不超過初始胺基酸序列總胺基酸數量的40%，更佳為不超過35%，更佳為1-33%，更佳為5-30%，更佳為10-25%，更佳為15-20%。
本發明上述內容中，更佳地，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，可以是1-7個，更佳為1-5個，更佳為1-3個，更佳為1-2個。
在另一較佳例中，所述靶向CTLA-4的抗體為97A8D1、92C8B6、31C12F3、40C4C6或97B8E1。
在另一較佳例中，所述抗體97A8D1的重鏈可變區(VH)胺基酸序列為如SEQ ID NO.：1所示的胺基酸序列。
在另一較佳例中，所述抗體97A8D1的輕鏈可變區胺基酸序列為如SEQ ID NO.：5所示的胺基酸序列。

抗體的製備
本發明抗體或其片段的DNA分子的序列可以用常規技術，比如利用PCR擴增或基因組文庫篩選等方法獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼所述的本發明的抗體(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。較佳的動物細胞包括(但並不限於)：CHO-S、HEK-293細胞。
通常，在適合本發明抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。然後用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的抗體。
所得單克隆抗體可用常規手段來鑒定。比如，單克隆抗體的結合特異性可用免疫沉澱或體外結合試驗(如放射性免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來測定。單克隆抗體的結合親和力例如可用Munson等, Anal. Biochem.,107：220(1980)的Scatchard分析來測定。
本發明的抗體可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於：常規的複性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。

應用
本發明還提供了本發明抗體的用途，例如用於製備用於治療CTLA-4相關的疾病的藥物。所述CTLA-4相關的疾病包括腫瘤發生、生長和/或轉移、病毒感染等相關疾病等。
本發明抗體的用途，包括(但並不限於)：
(i)治療腫瘤發生、生長和/或轉移。所述腫瘤包括(但並不限於)：乳腺癌(如三陰性乳腺癌)、胰腺癌、肺癌(如非小細胞肺癌、廣泛的階段小細胞肺癌、轉移性非小細胞肺癌)、惡性膠質瘤、消化器官惡性腫瘤、胃癌、肝癌、食道癌、腎癌、結直腸癌、轉移性結腸癌、膀胱癌、前列腺腫瘤(如前列腺癌)、子宮內膜癌、子宮內膜癌肉瘤、宮頸癌、卵巢癌、輸卵管癌、白血病(如成人急性髓細胞性白血病、非典型慢性粒細胞白血病)、骨髓癌、肉瘤(如血管肉瘤、滑膜肉瘤)、黑色素瘤、復發黑色素瘤、間皮瘤、晚期實體癌、頭頸部鱗狀細胞癌、默克爾細胞癌、皮膚T細胞淋巴瘤、腹膜腫瘤、肌肉浸潤性膀胱癌、先前治療的骨髓增生異常綜合征、卵巢上皮細胞癌、泌尿系統惡性腫瘤、成人III級淋巴瘤樣肉芽腫、B細胞慢性淋巴細胞白血病、皮膚B細胞非霍奇金淋巴瘤、眼內淋巴瘤、睾丸絨毛膜癌、神經母細胞瘤、食管癌。尤其是三陰性乳腺癌、胰腺癌、惡性膠質瘤和肺癌、更佳為三陰性乳腺癌和/或胰腺癌；
(ii)治療病毒感染性疾病。所述病毒包括(但並不限於)：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(慢性感染)、愛滋病毒。

藥物組合物
本發明還提供了一種組合物。在較佳例中，所述的組合物是藥物組合物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。
本發明的藥物組合物可直接用於結合CTLA-4蛋白分子，因而可用於預防和治療腫瘤等疾病。此外，還可同時使用其他治療劑。
本發明的藥物組合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,較佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本發明上述的單克隆抗體以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的抗體用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約20毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。

本發明的主要優點在於：
(1)本發明採用的轉基因小鼠，與野生型小鼠比能夠更容易獲得全人源抗體，從而降低抗體的免疫原性；與全人抗體的轉基因小鼠比，獲得的抗體數量多、親和力強，序列多樣性好並且活性高。
(2)本發明採用雜交瘤技術獲得抗體，與噬菌體庫獲得的抗體相比，抗體親和力高，序列表達良好。
(3)本發明採用重組表達的293F-HuCTLA-4細胞，與蛋白或者多肽類免疫原相比，表達的目的蛋白構象更趨天然；與其他重組表達細胞相比，其表達量更高。
(4)本發明獲得了序列不同的抗體，能夠與CTLA-4抗體特異性結合，其結合活性低於納摩爾(nM)。
(5)本發明所獲得抗體具有很好的刺激T細胞啟動活性，其能夠阻斷CTLA-4與其兩個配體(B7.1和B7.2)的結合，通過逆轉CTLA-4對T細胞啟動活性的抑制，從而啟動T細胞分泌IL-2。
(6)本發明所獲得的抗體，在小鼠(例如人CTLA-4轉基因小鼠)體內表現出顯著抑制腫瘤生長和提高小鼠存活率的活性。
(7)本發明所獲得抗體具有一系列的優異特徵：可變區序列與現有抗體同源性低(同源性＜92%)，各項活性均好於來自對比文件的抗體。
下面結合具體實施例，進一步詳陳本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如美國Sambrook. J等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件(例如商品說明書)。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售管道獲得。
實施例中所述的室溫為本領域常規的室溫，一般為10-30℃。
若無特別說明，實施例中所述的PBS為PBS磷酸緩衝液，pH7.2。

材料
H2L2轉基因鼠獲自(購自)和鉑醫藥(上海)有限責任公司，該鼠產生具有完全人類可變區的由兩條重鏈和兩條輕鏈(H2L2)組成的傳統四聚體抗體的小鼠。產生的抗體親和力成熟，可變區完全人源化，具有優異的溶解性。基因工程小鼠技術是產生完全人類抗體的主要工具之一[1] 。

通用方法
本發明先製備人源CTLA-4作為免疫原，採用人源抗體轉基因小鼠技術進行全人源抗體的製備[Lonberg, et al.1994，Nature 368(6474)：856-859，Lonberg, N. and Huszar, D.1995，Intern. Rev. Immunol.13：65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. ,1995，Ann. N.Y. Acad. Sci. 764：536-546]，獲得CTLA-4抗體的先導抗體。再通過對先導抗體的初步生產、純化和檢定，獲得具備抗體親和力高(親和力KD＜1*10-9 M)、有效封閉CTLA-4與受體B7.1和B7.2的結合、在人外周血單核細胞或T淋巴細胞反應中顯著增加IL-2的表達水準、與人CD28等同類蛋白抗原缺乏交叉反應等優異生物性特性的CTLA-4抗體。然後通過分子生物學方法測序獲知CTLA-4抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。

實施例 1 CTLA-4 抗體的製備
(一)免疫原A的製備
將人源CTLA-4蛋白胞外區胺基酸序列Lys36-Asp161克隆到帶有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC載體(購自Invitrogen，V044-50)並按已建立的標準分子生物學方法製備質粒，具體方法參見Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis T.(1989). Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Second Edition(Plainview, New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。對HEK293細胞(購自Invitrogen)進行暫態轉染(PEI，Polysciences)並使用FreeStyleTM 293(Invitrogen)在37℃下進行擴大培養。4天后收集細胞培養液，離心去除細胞成分，得含CTLA-4蛋白胞外區的培養上清液。將培養上清液上樣到蛋白A親和層析柱(Mabselect Sure，購自GE Healthcare)，同時用紫外(UV)檢測儀監測紫外吸收值(A280nm)的變化。上樣後用PBS磷酸鹽緩衝液(pH7.2)清洗蛋白A親和層析柱直到紫外吸收值回到基線，然後用0.1M甘氨酸鹽酸(pH2.5)洗脫，收集從蛋白A親和層析柱上洗脫下來的帶hFc標籤的CTLA-4蛋白(CTLA-4-hFc)，用PBS磷酸鹽緩衝液(pH7.2)在4℃冰箱透析過夜。透析後的蛋白經0.22微米無菌過濾後分裝於-80℃保存，即獲得純化的免疫原A。免疫原A在使用前需要進行一系列質控檢測，如檢測其蛋白濃度、純度、分子量和生物活性等，結果如圖1和表1所示。表1說明CTLA-4與B7.1或B7.2在蛋白水準的結合隨B7.1或B7.2的濃度變化而變化，其中對照蛋白為非CTLA-4融合蛋白，表中的資料為OD450nm 值。
其中，免疫原A生物活性採用ELISA檢測，具體為：
將帶hFc標籤的CTLA-4蛋白(CTLA-4-hFc，即免疫原A)，用PBS稀釋至1μg/mL，以100μl/孔加入ELISA微孔板，4℃孵育過夜。用ELISA封閉液(含1%BSA，pH7.4的PBS磷酸緩衝液，所述百分比為品質百分比)37℃封閉兩小時後，再加入梯度稀釋的生物素標記的B7.1或B7.2-hFc，37℃溫育1小時。生物素標記的B7.1-hFc或B7.2-hFc的製備方法如下：將B7.1-hFc或B7.2-hFc與生物素化試劑反應即可。所述B7.1-hFc或B7.2-hFc的製備方法與免疫原A的製備方法相同，其中B7.1胞外區蛋白(Val35-Asn242)的胺基酸序列資訊參見Uniprot資料庫，編號P33681；B7.2胞外區蛋白(Ala24-Pro247)的胺基酸序列資訊參見Uniprot資料庫，編號P42081；所述生物素化試劑購自Sigma，商品號B3295；與生物素化試劑反應的操作步驟參見該生物素化試劑的說明書。加入鏈黴親和素標記的辣根過氧化物酶(購自Sigma商品號S2438)，室溫孵育30分鐘，用洗液將未結合的鏈黴親和素標記的辣根過氧化物酶洗去，加入100微升/孔TMB顯色液。室溫孵育15分鐘後，加入50微升1N鹽酸終止顯色反應，用ELISA讀板機讀取OD450nm 讀數。

具體活性結果如表1和圖1所示，表明表達的配體和受體蛋白有正確的構象，適合進行免疫、建立受體-配體結合阻斷檢測方法及進行抗體活性鑒定。

(二)免疫原B的製備
人源CTLA-4全長胺基酸序列被突變為CTLA-4 (Y201V)，並克隆到pIRES載體(購自Clontech)並製備質粒。對HEK293細胞系和CHOK1細胞系(均購自Invitrogen)進行質粒轉染(轉染使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent，購自Roche公司，貨號Cat #06 366 236 001，並按說明書操作)後，在含0.5 μg/ml嘌呤黴素的含10%(w/w)FBS的DMEM培養基中選擇性培養2周，用有限稀釋法在96孔培養板中進行亞克隆，並置於37℃，5%(v/v)CO2 培養。大約2周後選擇部分單克隆孔擴增到6孔板中。對擴增後的克隆用已知的CTLA-4抗體染色，經流式細胞分析法進行篩選。選擇長勢較好、螢光強度較高、單克隆的細胞系繼續擴大培養並液氮凍存，即獲得免疫原B。具體選擇結果如表2和圖2所示，表2中陽性細胞(%)指陽性細胞占總細胞數目的百分比。圖2說明，HEK293細胞有較高水準CTLA-4的表達，適合用做免疫原和進行抗體結合活性鑒定。


(三)雜交瘤細胞的製備和抗體篩選
Harbour轉基因小鼠引入了人免疫球蛋白可變區基因和大鼠免疫球蛋白恒定區基因，而小鼠本身的Ig表達則被沉默(F.G. Franklin, et al, patent #WO 2010/070263 Al)。該轉基因小鼠經抗原免疫後能產生與正常小鼠(如Balb/c)相當的免疫反應和抗體效價。
A、免疫原A免疫採用6~8周齡Harbour人源抗體轉基因小鼠(購自北京維通利華公司)，小鼠在SPF條件下飼養。初次免疫時，免疫原A蛋白用弗氏完全佐劑乳化後腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射100微克免疫原A蛋白。加強免疫時，免疫原A蛋白用弗氏不完全佐劑乳化後腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白。初次免疫與第一次加強免疫之間間隔2周，以後每次加強免疫之間間隔3周。每次加強免疫1周後采血，用ELISA和FACS檢測血清中免疫原A的抗體效價和特異性，結果如圖3和表3所示。表3說明，經CTLA-4-hFc免疫的小鼠的免疫後血清對免疫原均有不同程度的結合，呈現抗原抗體反應，其中最高稀釋度在一千(1000)左右。其中空白對照為1%(w/w)BSA，其中批次指第三次加強免疫後第七天的小鼠血清，表中的資料為OD450nm 值。
B、免疫原B免疫採用6~8周齡Harbour人源抗體轉基因小鼠(購自北京維通利華公司)，小鼠在SPF條件下飼養。將按步驟(二)中的得到的含人源CTLA-4的HEK293-hCTLA-4(Y201V)穩定細胞系在T-75細胞培養瓶中擴大培養至90%匯合度，吸盡培養基。用DMEM基礎培養基(購自Invitrogen)洗滌2次，然後用無酶細胞解離液(購自Invitrogen)37℃處理直至細胞從培養皿壁上可脫落，收集細胞。用DMEM基礎培養基洗滌2次，進行細胞計數後將細胞用磷酸鹽緩衝液(pH7.2)稀釋至2×107 細胞每毫升。每只小鼠每次免疫時腹腔注射0.5毫升細胞懸液。第一次與第二次免疫之間間隔2周，以後每次免疫間隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周後采血，用ELISA檢測血清中抗體效價和特異性。表3和圖3為HEK-CTLA-4細胞免疫血清，用ELISA進行抗體效價檢測的結果。


通常以免疫原A或B進行免疫，大部分小鼠經3次免疫後ELISA效價可達到1：1000以上，說明H2L2小鼠可對免疫原產生較好的體液免疫反應，其脾細胞可以用來進行雜交瘤細胞製備。
A或B步驟完成前，將所選擇的每只小鼠最後一次免疫腹腔注射100微克純化的CTLA-4-hFc(針對免疫原A和免疫原B)進行免疫反應的小鼠)或含人源CTLA-4的HEK293-hCTLA-4穩定細胞(針對免疫原B進行免疫反應的小鼠)，5天后處死小鼠，收集脾細胞。加入NH4 OH至終濃度1%(w/w)，裂解脾細胞中參雜的紅細胞，獲得脾細胞懸液。用DMEM基礎培養基1000轉每分鐘離心清洗細胞3次，然後按活細胞數目5：1比率與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0混合(購自ATCC)，採用高效電融合或PEG方法(參見METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220)進行細胞融合。融合後的細胞稀釋到含20%胎牛血清、1×HAT的DMEM培養基中，所述百分比為品質百分比。然後按1×105 /20微升每孔加入到96孔細胞培養板中，放入5% CO2 、37℃培養箱中，所述百分比為體積百分比。14天后用ELISA和Acumen(微孔板細胞檢測法)篩選細胞融合板上清，將ELISA中OD450nm ＞1.0和Acumen中MFI值＞100的陽性克隆擴增到24孔板，在含10%(w/w)胎牛血清的DMEM(Invitrogen)的培養基中，在37℃，5%(v/v)CO2 條件下擴大培養。培養3天后取24孔板中擴大培養的培養液進行離心，收集上清液，對上清液進行抗體亞型分析。用ELISA、FACS確定對CTLA-4蛋白和CTLA-4陽性細胞的結合活性，配體受體結合實驗確定抗體樣品對CTLA-4受體的封閉活性。
根據24孔板篩選結果，挑選ELISA實驗中OD450nm ＞1.0、FACS實驗中MFI值＞50和配體受體結合實驗中雜交瘤細胞培養上清對CTLA-4受體的封閉抑制率達到60%的雜交瘤細胞為符合條件的陽性克隆。選擇符合條件的雜交瘤細胞用有限稀釋法在96孔板進行亞克隆，在含10%(w/w)FBS的DMEM培養基中(購自Invitrogen)37℃，5%(v/v)CO2 條件下培養。亞克隆後10天用ELISA和Acumen進行初步篩選，挑選陽性單克隆擴增到24孔板繼續培養。3天后用FACS確定抗原結合陽性並用CTLA-4受體配體結合實驗評估生物活性(評估標準為ELISA實驗中OD450nm ＞ 1.0、FACS實驗中MFI值＞50和配體受體結合實驗中雜交瘤細胞培養上清對B7.1配體的封閉抑制率達到60%)。
根據24孔板樣品檢測結果，陽性克隆在含10%(w/w)FBS的DMEM(購自Invitrogen)培養基中，在37℃，5%(v/v)CO2 條件下進行擴大培養，細胞懸浮於凍存液[含有20%(w/w)FBS和10%(w/w)DMSO的DMEM]中，按常規方法液氮凍存即得本發明雜交瘤細胞，並可用於後續的抗體生產、純化和胺基酸序列測定。

實施例 2 嵌合抗體的鑒定
(一)流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與CTLA-4表達細胞的結合
將實施例1步驟(二)中所述含有編碼人源CTLA-4全長核苷酸序列的pIRES質粒轉染293F細胞株得含人CTLA-4的293F穩轉細胞株(此處稱為HEK293-hCTLA-4穩定細胞株)，將帶有猴源CTLA-4全長基因的pIRES質粒，其中猴源CTLA-4核苷酸酸序列的資料庫登錄號為XM_005574014.1，轉染HEK293細胞株的含猴CTLA-4的HEK293穩轉細胞株(此處稱為HEK293-cCTLA-4穩定細胞株)。將HEK293-hCTLA-4穩定細胞株和HEK293-cCTLA-4穩定細胞株在T-75細胞培養瓶中擴大培養至90%匯合度，吸盡培養基，用HBSS緩衝液(Hanks Balanced Salt Solution，購自Invitrogen)洗滌2次，然後用無酶細胞解離液(Versene solution，購自Life technology公司)處理和收集細胞。用HBSS緩衝液洗滌細胞2次，進行細胞計數後將細胞用HBSS緩衝液稀釋至2×106 細胞每毫升，加入1%山羊血清封閉液，所述百分比為品質百分比。冰上孵育30分鐘，然後用HBSS緩衝液離心洗滌2次。將收集的細胞用FACS緩衝液(含有1%BSA的HBSS，所述百分比為品質百分比)懸浮至2×106 細胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反應板中，加入實施例2所得的純化的CTLA-4抗體待測樣品每孔100微升，冰上孵育2小時。用FACS緩衝液離心洗滌2次，加入每孔100微升螢光(Alexa 488)標記的二抗(購自Invitrogen)，冰上孵育1小時。用FACS緩衝液離心洗滌3次，加入每孔100微升固定液[4%(v/v)多聚甲醛]懸浮細胞，10分鐘後用FACS緩衝液離心洗滌2次。用100微升FACS緩衝液懸浮細胞，用FACS(FACS Calibur，購自BD公司)檢測和分析結果。


結果如圖4和圖5，表4和表5所示，待測抗體可結合細胞表面的人或猴CTLA-4蛋白，各抗體活性相當，表明抗體與CTLA-4結合能力較強。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為MFI所測細胞群的平均螢光強度值。

(二)檢測CTLA-4抗體阻斷CTLA-4蛋白與其配體B7.1或B7.2的結合
CTLA-4蛋白的受體配體結合試驗檢測CTLA-4抗體阻斷CTLA-4蛋白與其配體B7.1或B7.2的結合。
CTLA-4胞外區蛋白(CTLA-4-hFc)用PBS稀釋到終濃度1.0µg/mL，然後以100µl每孔加到96孔ELISA板。用塑膠膜封好4℃孵育過夜，第二天用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板2次，加入封閉液[含0.01%(v/v)Tween20和1%(w/w)BSA的PBS]室溫封閉2小時。倒掉封閉液，先加入實施例2所得的純化的CTLA-4抗體待測樣品50µl每孔，後加入生物素標記的B7.1胞外區蛋白(B7.1-hFc)或B7.2-hFc，每孔100微升，混勻後37℃孵育。2小時後，用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的親和素稀釋液(購自Sigma)每孔100微升，37℃孵育2小時後，用洗板液[含0.01%(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100µl每孔，室溫孵育30分鐘後，加入終止液(1.0N HCl)100µl每孔。用ELISA讀板機(SpectraMax 384plus, Molecular Device)讀取A450nm數值，結果如圖6，圖7和表6、表7所示。


結果表明，所得抗體可不同程度的抑制CTLA-4蛋白與其配體B7.1或B7.2的結合，所測抗體活性相當。其中IgG對照為人IgG，表中的資料為抑制率(%)。

(三)淋巴細胞刺激實驗檢測CTLA-4抗體對淋巴細胞活性的影響
淋巴細胞刺激實驗檢測CTLA-4抗體阻斷CTLA-4蛋白與其受體B7.1和B7.2的結合從而解除其對T淋巴細胞活性的抑制，從而刺激T細胞的增殖。

1.　Ficoll分離全血獲取外周血單核淋巴細胞PBMC
將新鮮獲取的全血用磷酸緩衝液PBS以1：1的體積比例稀釋得稀釋後的全血，用無菌吸管輕輕將稀釋後的全血鋪平在Ficoll液面(購自GE Healthcare)，Ficoll與稀釋後的全血的體積比為3：4，避免震盪混勻，以400g轉速室溫20℃梯度離心30分鐘，離心後的離心管分為三層，上層為血漿，中間乳白色分層即為單核淋巴細胞。用無菌吸管輕輕吸取中間層細胞，收集至新的離心管，用PBS磷酸緩衝液稀釋至三倍體積，100g轉速室溫離心10分鐘，棄上清。將淋巴細胞用PBS磷酸緩衝液重懸至10mL，重複前面步驟取出血小板。最後將淋巴細胞重懸至10mL含有10%胎牛血清的多組份RPMI1640培養基(購自Invitrogen)備用，即為外周血單核淋巴細胞PBMC，所述百分比為品質百分比。

2.　SEB依賴的PBMC刺激實驗
試驗前，配製等體積比稀釋的待測實施例2所得的純化的CTLA-4抗體，得待測樣品溶液。
將獲得的外周血單核淋巴細胞PBMC以1×105 個細胞100微升每孔鋪至96孔細胞培養板，然後將所述的待測樣品溶液加入培養板，室溫培養30分鐘。最後加入超抗原SEB，每反應孔中含有50微升100ng/ml SEB，保證每個反應孔250μL體積，將反應板於37℃、5%CO2 培養箱培養72小時後收集上清，得細胞上清液，於-20℃凍存，所述百分比為體積百分比。

3.　細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測
細胞上清中細胞因數白介素IL-2酶聯免疫吸附檢測使用R&D system相關檢測試劑盒Quantikine ELISA human IL-2(S2050)，並按照說明書操作。除檢測抗體外的所有檢測試劑均由檢測試劑盒提供。
測定細胞上清中細胞因數白介素IL-2含量的酶聯免疫吸附檢測採用雙抗夾心ELISA試劑盒(購自R&D Systems，IL-2 Cat # S2050)。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書要求，所有檢測試劑均由試劑盒提供。具體實驗簡述如下：將IL-2多克隆抗體包被于ELISA微孔板上，將步驟2.獲得的細胞上清液作為待測樣品，加入標準品和待測樣品室溫孵育2小時。每孔加入400微升洗液，重複洗板4次；再加入抗人IL-2的辣根過氧化物酶標抗體，室溫孵育2小時，與微孔板上的IL-2形成免疫複合物，清洗微孔；加入底物顯色，避光室溫30分鐘，最終加入終止液，用酶標儀測定A450nm吸光度。檢測CTLA-4抗體在步驟2.所述PBMC刺激實驗中對IL-2分泌的影響。結果如圖8，和表8所示。

結果表明，在PBMC淋巴細胞刺激試驗中待測抗體可使PBMC的IL-2分泌增強，並且啟動作用呈濃度梯度依賴性，其中97A8D1活性率優於其他抗體。其中hIgG對照為人IgG，表中的資料為IL-2值(pg/mL)。

實施例 3 輕重鏈可變區胺基酸序列測定
總RNA分離：將實施例1亞克隆培養所得的上清液檢驗過抗原結合後(即經過實施例3-6的檢定和活性測定後)，通過離心搜集5×107 個雜交瘤細胞，加入1mL Trizol混勻並轉移到1.5mL離心管中，室溫靜置5分鐘。加0.2mL氯仿，振盪15秒，靜置2分鐘後於4℃，12000g離心5分鐘，取上清轉移到新的1.5mL離心管中。加入0.5mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10分鐘後於4℃，12000g離心15分鐘，棄上清。加入1mL 75%乙醇(所述百分比為體積百分比)，輕輕洗滌沉澱，4℃，12000g離心5分鐘後棄上清，將沉澱物晾乾，加入DEPC處理過的H2 O溶解(55℃水浴促溶10分鐘)，即得總RNA。
逆轉錄與PCR：取1μg總RNA，配置20μl體系，加入逆轉錄酶後於42℃反應60分鐘，於7℃反應10分鐘終止反應。配置50μl PCR體系，包括1μl cDNA、每種引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的緩衝體系、250μmol dNTPs。設置PCR程式，預變性95℃3分鐘，變性95℃30秒，退火55℃ 30秒，延伸72℃35秒，35個迴圈後再額外於72℃延伸5分鐘，得PCR產物。其中逆轉錄所用的試劑盒為PrimeScript RT Master Mix，購自Takara，貨號RR036；PCR所用的試劑盒為Q5超保真酶，購自NEB，貨號M0492。
克隆與測序：取5μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測陽性樣品使用柱回收試劑盒純化，其中回收試劑盒為NucleoSpin® Gel & PCR Clean-up，購自MACHEREY-NAGEL，貨號740609。進行連接反應：樣品50ng，T載體50ng，連接酶0.5μl，緩衝液1μl，反應體系10μl，於16℃反應半小時得連接產物，其中連接的試劑盒為T4 DNA連接酶，購自NEB，貨號M0402；取5μl連接產物加入100μl的感受態細胞(Ecos 101competent cells，購自Yeastern，貨號FYE607)中，冰浴5分鐘。而後於42℃水浴熱激1分鐘，放回冰上1分鐘後加入650μl無抗生素SOC培養基，於37℃搖床上以200RPM的速度復蘇30分鐘，取出200μl塗布於含抗生素的LB固體培養基上於37℃孵箱過夜培養。次日，使用T載體上引物M13F和M13R配置30μl PCR體系，進行菌落PCR，用移液器槍頭蘸取菌落於PCR反應體系中吹吸，並吸出0.5μl點於另一塊含100nM氨苄青黴素的LB固體培養皿上以保存菌株。PCR反應結束後，取出5μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性樣品進行測序。其中，測序的步驟參見Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)。
測序結果如表9所示：

其中，表9中的數字即為序列表“SEQ ID NO：”編號，如編碼97A8D1的重鏈蛋白可變區的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：41。
其中，編碼97A8D1的重鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：41中的第88位至第105位；
編碼97A8D1的重鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：41中的第148位至第198位；
編碼97A8D1的重鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：41中的第289位至第321位；
編碼97A8D1的輕鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：42中的第73位至第108位；
編碼97A8D1的輕鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：42中的第151位至第177位；
編碼97A8D1的輕鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：42中的第268位至第294位；
編碼92C8B6的重鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：43中的第88位至第105位；
編碼92C8B6的重鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：43中的第148位至第198位；
編碼92C8B6的重鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：43中的第289位至第327位；
編碼92C8B6的輕鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：44中的第73位至第105位；
編碼92C8B6的輕鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：44中的第148位至第174位；
編碼92C8B6的輕鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：44中的第265位至第294位；
編碼31C12F3的重鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：45中的第88位至第105位；
編碼31C12F3的重鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：45中的第148位至第198位；
編碼31C12F3的重鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：45中的第286位至第327位；
編碼31C12F3的輕鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：46中的第73位至第105位；
編碼31C12F3的輕鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：46中的第148.位至第174位；
編碼31C12F3的輕鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：46中的第265位至第291位；
編碼40C4C6的重鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：47中的第88位至第105位；
編碼40C4C6的重鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：47中的第148位至第198位；
編碼40C4C6的重鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：47中的第289位至第327位；
編碼40C4C6的輕鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：48中的第73位至第105位；
編碼40C4C6的輕鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：48中的第148位至第174位；
編碼40C4C6的輕鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：48中的第265位至第291位。
編碼97B8E1的重鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：49中的第88位至第105位；
編碼97B8E1的重鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：49中的第148位至第198位；
編碼97B8E1的重鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：49中的第289位至第330位；
編碼97B8E1的輕鏈蛋白可變區中CDR1域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：50中的第73位至第105位；
編碼97B8E1的輕鏈蛋白可變區中CDR2域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：50中的第148位至第174位；
編碼97B8E1的輕鏈蛋白可變區中CDR3域的核苷酸序列為序列表SEQ ID NO：50中的第265位至第291位。

實施例 4 全人抗體 IgG 轉化和製備
(一)質粒構建與準備：實施例2已從雜交瘤細胞的培養上清液中獲得了純化的CTLA-4抗體，並根據實施例7的測序結果明確了CTLA-4抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區序列。將CTLA-4抗體的重鏈可變區序列重組到包含信號肽和人源重鏈抗體IgG1恒定區的表達載體(其中表達載體購買自Invitrogen)中，將CTLA-4抗體的輕鏈可變區序列重組到包含信號肽和人源抗體輕鏈kappa恒定區的表達載體當中，得重組質粒並經測序驗證(測序方法與實施例7中測序方法相同)。使用堿裂解法試劑盒(購自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高純度的重組質粒，品質為500μg以上，經0.22μm濾膜(購自Millopore)過濾，供轉染使用。
(二)細胞轉染：在培養基Freestyle 293 expression medium(購自Invitrogen)培養293E細胞(購自Invitrogen)。搖床設置為37℃、130RPM，8% CO2 (v/v)濃度。
Freestyle 293 expression medium在轉染時添加10% (v/v)F68(購自Invitrogen)至F68終濃度為0.1%(v/v)，得含0.1%(v/v)F68的Freestyle 293表達培養基，即培養基A。
取5mL培養基A和200μg/mL PEI(購自Sigma)混勻，得培養基B。取5mL培養基A和100μg/mL步驟(1)所得的重組質粒混勻，得培養基C。5分鐘後將培養基B和培養基C合併混勻，靜置15分鐘，得混合液D。將10mL混合液D緩緩加入100mL含293E細胞的培養基Freestyle 293 expression medium中至293E的細胞密度為1.5×106 /mL，邊加邊振盪，避免PEI過度集中，放入搖床培養。第二天加入蛋白腖至終濃度為0.5%(w/v)。第5~7天，測培養液抗體效價。第6~7天，離心(3500RPM，30分鐘)收集上清，經0.22μm濾膜過濾，得濾好的細胞上清液，以供純化。
(三)抗體純化：對於連續生產的無內毒素的層析柱和Protein A填料(購自GE)，使用0.1M NaOH處理30分鐘或者5個柱體積的0.5M NaOH沖洗。對於長期未使用的柱料和層析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用無內毒的水沖洗至中性，用10倍柱體積的1%(v/v)Triton×100對柱料清洗。使用5個柱體積的PBS(PBS磷酸緩衝液，pH7.2)進行平衡，將步驟(2)所得過濾好的細胞上清液上柱，必要時收集流穿液。上柱完成後，使用5倍柱體積的PBS清洗。用5倍柱體積的0.1M pH3.0的Glycine-HCl進行洗脫，收集洗脫液，並用0.5倍柱體積洗脫液的pH8.5的1MTris-HCl(1.5M NaCl)中和，收穫全人CTLA-4抗體。上述所用溶液均需要新配置。收穫全人CTLA-4抗體後，在1×PBS中透析4小時，避免內毒素污染。透析結束後，使用分光光度或試劑盒測定濃度，使用HPLC-SEC測定抗體純度，使用內毒素檢測試劑盒(購自Lonza)檢測抗體內毒素含量。

實施例 5 流式細胞實驗 (FACS) 檢測全人抗體與 CTLA-4 表達細胞的結合
對所獲全人CTLA-4抗體與細胞表達CTLA-4的結合活性進行鑒定，檢測結果分別如圖9、圖10和表10、表11所示。


結果表明，經過全人IgG轉化並製備所得全人CTLA-4抗體能夠以較高的活性與人和猴的CTLA-4結合，抗體活性接近。

實施例 6 檢測 CTLA-4 抗體阻斷 CTLA-4 蛋白與其配體 B7.1 或 B7.2 的結合
對所獲全人CTLA-4抗體進行阻斷活性鑒定，檢測結果分別如圖11、圖12和表12、表13所示。


圖11、圖12和表12、表13表明，經過全人IgG轉化並製備所得全人CTLA-4抗體能夠阻斷CTLA-4與B7.1和B7.2的結合，所測抗體阻斷活性相當。

實施例 7 淋巴細胞刺激實驗檢測 CTLA-4 抗體對淋巴細胞活性的影響
實驗方法見實施例2(三)，檢測結果見表14和圖13。

從表14、圖13可見，全人源化抗體在SEB依賴的PBMC啟動試驗中，能夠顯著刺激IL-2分泌，並且該活性具有濃度梯度依賴效應，表明CTLA-4抗體能夠逆轉CTLA-4對T細胞啟動的抑制作用，所測抗體活性水準相當。其中IgG對照為人IgG1(hIgG1)，表14中的資料為IL-2濃度。

實施例 8 PHA 誘導的 CD3+T 淋巴細胞實驗檢測 CTLA-4 抗體阻斷 B7.1 或 B7.2 與 CTLA-4 結合後對 T 淋巴細胞的啟動
檢測CTLA-4抗體阻斷B7.1或B7.2與CTLA-4結合後對T淋巴細胞的啟動。
T細胞組成型表達CD28，PHA可非特異性啟動T細胞，從而誘導CTLA-4的膜表達；Raji細胞組成型表達CTLA-4/CD28的配體B7.1和B7.2；當啟動的T細胞與Raji細胞孵育時，CTLA-4和CD28競爭性結合配體，由於CTLA-4對配體的親和力高於CD28，所以與Raji細胞孵育時，表現為T細胞啟動的部分下調，當CTLA-4的配體結合能力被阻斷時，T細胞啟動的下調會被逆轉，即表現為IL-2分泌的提高。

( 一 )PHA 誘導人 CD3+ 細胞的活化
從全血中用使用試劑FICOLL PAQUE PLUS，並按照其說明書操作分離PBMC細胞。具體步驟如4.4.2中(5)所述。
使用人CD3+細胞提取試劑盒(MagCellectTM Human CD3+T Cell Isolation Kit)對所得的PBMC細胞按說明書進行操作，得分離純化的CD3+細胞，將人CD3+T細胞接種到6孔板中，加入10 μg/mL PHA，處理72小時，以獲得CTLA-4過表達的CD3+T細胞囊。

( 二 ) 絲裂黴素處理 Raji 細胞
使用前，將Raji細胞用10 μg/mL絲裂黴素，37℃處理1.5小時，用PBS洗3次以去除殘留的絲裂黴素。同時配製等體積比稀釋的待測的純化CTLA-4抗體，得待測樣品溶液。

( 三 )Raji 介導的 T 細胞囊的啟動
將步驟①所得的CD3+T細胞囊接種至96孔細胞培養板，接種密度分別為1×105 cells/孔 接種體積為每孔50 μL，加入待測樣品溶液，每孔50 μL，共同孵育30分鐘，然後加入步驟②的Raji細胞，以100 μL 3×104 cells/孔鋪至96細胞培養板，於37℃，5% CO2培養箱孵育4天。收集細胞上清，用於細胞因數檢測，所述百分比為體積百分比。

( 四 ) 細胞上清中細胞因數白介素 IL-2 酶聯免疫吸附檢測
將步驟③所得的細胞上清中細胞因數白介素IL-2進行酶聯免疫吸附檢測。使用R&D system相關檢測試劑盒Quantikine ELISA human IL-2(S2050)，並按照說明書操作。除檢測抗體外的所有檢測試劑均由檢測試劑盒提供。
CTLA-4全人源抗體在PHA誘導的T淋巴囊細胞啟動試驗中對IL-2分泌的影響見圖14。結果表明，所測抗體均能刺激T細胞分泌IL2，並且該效應與抗體濃度呈劑量相關性，即隨抗體濃度提高IL2水準也升高，其中92C8B6和97A8D1活性最好。

實施例 9 抗 CTLA-4 抗體親和力的分析測定
將抗人Fc IgG固定在流通池1和2上：將HBS-EP+(10 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，3mM EDTA，0.05% P20，pH 7.4)用作運行緩衝液，使用固定嚮導範本進行抗人Fc IgG的固定。串聯S CM5感測器晶片的流通池1和2用新鮮混合的50 mmol/L NHS和200 mmol/L EDC活化。用10 mmol/L NaAC(pH4.5)稀釋抗人Fc IgG至20 μg/mL，注射到活化的流通池1和2中。剩餘的活性偶聯位點用1 mol/L乙醇胺封閉。
將重組His標記的hCTLA-4 ECD蛋白稀釋至50 nmol /L，隨後用HBS-EP+緩衝液以2倍比例連續稀釋4次。His標記的hCTLA-4 ECD蛋白濃度為0 nmol/L，3.125 nmol/L，6.25 nmol/L，12.5 nmol/L，25 nmol/L和50 nmol/L。用HBS-EP+作為運行緩衝液進行KD測量。每個抗體以10 μL/min的流速注射到CM5感測器流動池2上以達到回應230RU。然後將製備的His標記的hCTLA-4ECD蛋白以30 μL/min的流速注入流通池1和2，持續180秒。緩衝液流動維持400秒以進行解離測量(30 μL/min)。為了從表面除去測試的抗體，將10 mmol/L甘氨酸-HCl pH1.5注射20秒(30 μL/min)。流動池1用作參考流動池。對於每個濃度的連續稀釋的His-標記的CTLA-4ECD蛋白重複上述步驟。使用Biacore T200評估軟體1.0評估每種抗體的KD值，並且使用1：1結合模型擬合數據。結果見表15。

結果表明，所測抗體的KD值均在納摩水準，且與工具抗體相當，表明這些抗體對人CTLA-4 ECD均有較好的親和力，其中，97A8D1抗體對人CTLA-4 ECD的親和力最好，適合作為候選抗體進行體內活性的確認。

實施例 10 抗 CTLA-4 抗體小鼠體內抗腫瘤活性評價
採用MC38同系小鼠模型，使用人CTLA-4基因敲入的C57BL/6小鼠評價抗體在小鼠體內的抗腫瘤活性。實驗設計為，選擇50只人CTLA-4基因敲入的C57BL/6小鼠，分為6組，每組10只，使用Ipilimumab和同型抗體hIgG1作為對照，樣品為92C8B6、97A8D1和97B8E1。給藥途徑為腹腔注射，給藥劑量為10 mg/kg，在0、3、6、10天腹腔注射，第24天處死小鼠，測量腫瘤體積，小鼠體重，腫瘤重量及小鼠存活率。實驗結果見圖15。
圖15結果表明，本發明的抗體(包括92C8B6、97A8D1和97B8E1)能夠顯著抑制腫瘤生長，抑制效果顯著優於對照抗體Ipilimumab(例如97A8D1的中位生存期為22.5天，優於Ipilimumab的中位生存期19天)。

實施例 11 去岩藻糖抗 CTLA-4 抗體的製備和表徵
在該實施例中，在缺乏岩藻糖基轉移酶的細胞系中表達全人抗CTLA-4抗體
97A8D1，使得該細胞系產生去岩藻糖基化的蛋白質。通過液質聯用技術分析
去岩藻糖基化抗體97A8D1和岩藻糖基化抗體97A8D1經過Ide Z和EndoS酶解後的分子量，確定抗體Fc端是否帶有岩藻糖。分析結果見圖16。
圖16結果表明，經過酶處理後,去岩藻糖基化抗體97A8D1去糖後Fc分子量為23755 Da(圖16A), 不去糖的Fc分子量為23957Da(圖16B),兩者分子量相差202Da (GlcNAc)。經過酶處理後，岩藻糖基化抗體97A8D1去糖後Fc分子量為23755Da(圖16C)，不去糖的Fc分子量為24104Da(圖16D)，兩者分子量相差349Da(Fuc+GlcNAc)，又因為去岩藻糖基化抗體的Fc分子量(23957Da)比岩藻糖基化抗體的Fc分子量(24104Da)少147Da，所以在分子量水準上推測去岩藻糖基化抗體不含岩藻糖，岩藻糖基化抗體含有岩藻糖。

實施例 12 淋巴細胞刺激實驗檢測去岩藻糖基化抗 CTLA-4 抗體對淋巴細胞活性的影響
實驗方法見實施例2(三)，檢測結果見表18和圖17。

從表18、圖17表去岩藻糖基化和岩藻糖基化抗CTLA-4抗體均能夠逆轉CTLA-4對T細胞啟動的抑制作用，但去岩藻糖基化抗CTLA-4抗體活性要優於岩藻糖基化抗CTLA-4抗體。

討論
(1)可以通過對野生型小鼠進行免疫獲得抗體，但是需要對鼠源抗體進行人源化改造而獲得人源化抗體，缺點在於改造後的抗體免疫原性可能更強、抗體結構可能會改變從而導致活性丟失或可生產性變差。
(2)可以通過對全人源轉基因小鼠進行免疫獲得全人抗體，但是所獲得抗體的數量或親和力會較差。
(3)可通過構建免疫小鼠抗體庫用噬菌體展示技術對抗體進行表達和活性篩選，但是涉及到抗體重輕鏈的隨機重新組合，會導致形成的抗體可生產性較差。
(4)可通過構建人源抗體庫用噬菌體展示技術對抗體進行表達和活性篩選，但是因為未經免疫，所得抗體親和力會較差。
(5)免疫原可以為多肽，蛋白，其他種類細胞和基因等，但是會存在構象不正確、表達量低、免疫原性差等問題。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
本發明涉及的序列資訊如下：
CTLA-4抗體的胺基酸序列編號對應的胺基酸序列，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'、CDR3'分別用底線標示出來：

CTLA-4 抗體的編碼胺基酸序列對應的核苷酸序列，其中CDR1、CDR2、CDR3、CDR1'、CDR2'、CDR3'的編碼核苷酸序列分別用底線標示出來：





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圖1 CTLA-4-hFc蛋白與生物素標記的配體B7.1-hFc或B7.1-hFc的結合活性。
圖2 CTLA-4(Y201V)蛋白轉染的HEK293細胞FACS檢測結果。
圖3 ELISA檢測HEK293-CTLA-4細胞免疫後Harbour轉基因小鼠血清抗體效價。
圖4(A)和(B)FACS檢測CTLA-4抗體與CHOK1-hCTLA-4的結合反應。
圖5(A)和(B)FACS檢測CTLA-4抗體與293F-cCTLA-4的結合反應。
圖6(A)、(B)和(C)CTLA-4抗體對CTLA-4蛋白與其受體B7.1的結合的抑制。
圖7(A)、(B)和(C)CTLA-4抗體對CTLA-4蛋白與其受體B7.2的結合的抑制。
圖8 CTLA-4抗體在PBMC淋巴細胞刺激試驗中對IL-2分泌的影響。
圖9(A)和(B)流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與人CTLA-4表達細胞的結合。
圖10(A)和(B)流式細胞實驗(FACS)檢測抗體與猴CTLA-4表達細胞的結合。
圖11(A)和(B)全人CTLA-4抗體對CTLA-4蛋白與其受體B7.1的結合的抑制。
圖12(A)和(B)全人CTLA-4抗體對CTLA-4蛋白與其受體B7.2的結合的抑制。
圖13 CTLA-4全人源抗體在SEB依賴的PBMC啟動試驗中對IL-2分泌的影響。
圖14(A)、(B)(C)和(D)CTLA-4全人源抗體在PHA誘導的T淋巴囊細胞啟動試驗中對IL-2分泌的影響。
圖15 CTLA-4抗體對荷瘤小鼠存活率的影響。
圖16 (A)、(B)(C)和(D)用液質聯用測定去岩藻糖基化和岩藻糖基化抗CTLA-4抗體Fc段分子量。
圖17去岩藻糖基化和岩藻糖基化抗CTLA-4抗體在SEB依賴的PBMC啟動試驗中對IL-2分泌的影響。
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Claims (17)

  1. 一種抗體的重鏈可變區，其特徵在於，該重鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR： SEQ ID NO：8n+2所示的CDR1， SEQ ID NO：8n+3所示的CDR2，和 SEQ ID NO：8n+4所示的CDR3； 其中，各n獨立地為0、1、2、3或4； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
  2. 一種抗體的重鏈，其特徵在於，該重鏈具有如請求項1所述的重鏈可變區。
  3. 一種抗體的輕鏈可變區，其特徵在於，該輕鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR： SEQ ID NO：8n+6所示的CDR1'， SEQ ID NO：8n+7所示的CDR2'，和 SEQ ID NO：8n+8所示的CDR3'； 其中，各n獨立地為0、1、2、3或4； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
  4. 一種抗體的輕鏈，其特徵在於，該輕鏈具有如請求項3所述的輕鏈可變區。
  5. 一種抗體，其特徵在於，該抗體具有： (1) 如請求項1所述的重鏈可變區；和/或 (2) 如請求項3所述的輕鏈可變區； 或者，該抗體具有：如請求項2所述的重鏈；和/或如請求項4所述的輕鏈， 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
  6. 如請求項5所述的抗體，其中，該抗體具有如請求項1所述的重鏈可變區和如請求項3所述的輕鏈可變區； 其中，該重鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR： SEQ ID NO：2所示的CDR1， SEQ ID NO：3所示的CDR2，和 SEQ ID NO：4所示的CDR3； 其中，該輕鏈可變區包括以下三個互補決定區CDR： SEQ ID NO：6所示的CDR1'， SEQ ID NO：7所示的CDR2'，和 SEQ ID NO：8所示的CDR3'； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留CTLA-4結合親和力的衍生序列。
  7. 如請求項5所述的抗體，其中，該抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO：8n+1所示的胺基酸序列；和/或該抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO：8n+5所示的胺基酸序列，其中，各n獨立地為0、1、2、3或4。
  8. 如請求項6所述的抗體，其中，該抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO： 1所示的胺基酸序列，並且該抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO： 5所示的胺基酸序列。
  9. 一種重組蛋白，其特徵在於，該重組蛋白包括： (i) 如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5-8中任一項所述的抗體；以及 (ii) 任選的協助表達和/或純化的標籤序列。
  10. 一種多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼選自下組的多肽： (1)如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5-8中任一項所述的抗體；以及 (2)如請求項9所述的重組蛋白。
  11. 如請求項10所述的多核苷酸，其中，編碼該重鏈可變區的多核苷酸如SEQ ID NO：41、43、45、47或49所示；和/或， 編碼該輕鏈可變區的多核苷酸如42、44、46、48或50所示。
  12. 如請求項11所述的多核苷酸，其中，編碼該重鏈可變區序列的多核苷酸如SEQ ID NO：41所示；並且編碼該輕鏈可變區序列的多核苷酸如42所示。
  13. 一種載體，其特徵在於，該載體含有如請求項10-12中任一項所述的多核苷酸。
  14. 一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，該宿主細胞含有如請求項13所述的載體或基因組中整合有如請求項10-12中任一項所述的多核苷酸。
  15. 一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有： (i) 活性成分，所述活性成分選自下組：如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5-8中任一項所述的抗體、如請求項9所述的重組蛋白、或其組合；以及 (ii)藥學上可接受的載體。
  16. 一種活性成分的用途，其特徵在於，該活性成分選自下組：如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5-8中任一項所述的抗體、如請求項9所述的重組蛋白、或其組合，其中該活性成分被用於製備預防和/或治療CTLA-4相關腫瘤和/或病毒感染相關的疾病的藥物。
  17. 一種體外檢測樣品中CTLA-4蛋白的組合物，其特徵在於，其包括如請求項5-8中任一項所述的抗體、如請求項9所述的重組蛋白、或其組合作為活性成分。
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