KR101276140B1 - 과실 저장병 방제용 천산용 추출물과 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저장병해인 녹색곰팡이병균(Penicillium digitatum)에 대한 항균활성이 있는 약용식물인 천산용(Dioscorea nipponica Makino)으로부터 프로토다이오신의 추출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 추출 방법은 건조된 천산용을 준비하는 단계, 준비된 천산용을 용매와 혼합한 후 배양하는 단계, 배양된 추출물을 한약재용 거즈에 여과시키는 단계 및 여과된 물질을 회전감압농축기 및 감압농축기를 이용하여 용매를 제거하고 동결건조시키는 단계로 제조되는 것을 특징으로 한다.

Description

과실 저장병 방제용 천산용 추출물과 그 제조방법{Dioscoreacea extract for preventing storage disease of fruits and manufacturing method thereof}

본 발명은 천산용으로부터 프로토다이오신의 추출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 과실류 저장병해인 페니실륨속(Penicillium) 병원균에 대한 항균활성이 뛰어난 약용식물인 천산용으로부터 프로토다이오신의 추출 방법에 관한 것이다.

과실류에 있어서 페니실륨(Penicillium)속 균들에 의한 병은 작물의 생육기간에 발병하기보다는 주로 수확 후 포장하고 저장, 운송되는 과정에서 상처에 의해 발생하는 병으로, 이로 인한 작물의 손실은 전체 수량의 10~30%가 되며, 일부 후진국들은 30% 이상의 큰 비중을 차지한다. 또한 부가가치가 높은 배, 사과, 감귤, 포도 등 과실류의 저장중에 병이 발생하게 되면 상품성이 크게 떨어져 경제적으로 큰 손실을 입게 된다.

감귤류의 저장병 중에서도 우리가 보통 푸른곰팡이병으로 혼용해서 부르는 페니실륨 디지타툼(P. digitatum )에 의한 녹색곰팡이병과 푸른곰팡이병을 일으키는 페니실륨 이탈리쿰(P. italicum)에 의한 손실은 전체 저장중에 발생하는 손실의 90% 이상을 차지하고 있다. 이 중에서 감귤의 저장시 가장 큰 피해를 입히는 병은 녹색곰팡이병으로서 P. digitatum에 의한 녹색곰팡이병은 감염부위에서 수백만 개의 포자가 형성되어 비산함으로서 이들이 접종원으로 작용하게 되며 병 발생 최적 온도는 25℃ 내외로 6~37℃에서 생장할 수 있다

반면, P. italicum은 P. digitatum보다 더 낮은 온도에서 생장이 가능하고, 심지어 0℃에서도 생장할 수 있다. 이 두 병원균 중에서도 P. digitatum은 과실 저장병을 일으키는 페니실륨속(Penicillium app.)은 병원균들 중에서도 가장 강력한 병원성을 지니고 있고, 포자 형성량 또한 매우 많아 녹색곰팡이병에 의한 경제적인 손실이 매우 크다. 따라서 녹색곰팡이병 방제가 그만큼 매우 중요하다.

이렇게 주요 감귤 저장 부패병인 녹색곰팡이병과 푸른곰팡이병의 가장 효과적인 방제제로 유기합성농약인 소디움 바이카보네이트(sodium bicarbonate), 이마자릴(IMZ:imazalil), 치아벤다졸(TBZ:thiabendazole), 피리메탄일(PYR:pyrimethanil), 플루다이옥소닐((FLUD:fludioxonil)과 소디움 오-페닐페네이트(sodium o-phenylphenate)의 단제 및 혼합제가 널리 사용돼 왔다. 하지만 imazalil, thiabendazole과 sodium o-phenylphenate에 대한 약제 저항성을 나타내는 P. digitatum 균이 발생함에 따라 새로운 방제제의 개발이 요구돼 왔다.

국내의 경우 감귤 저장병 방제를 위한 약제가 활성화되어 있지 않으며 수확 10일 전에 유기합성 농약인 치오파네이트-메틸(thiophanate-methyl) 1,000배액을 수상 살포하면 방제에 효과가 있다고 보고되었다. 그러나 이 약제 또한 저항성균이 발생하면서 방제 효과가 매우 떨어져 있는 실정이다. 따라서 유기합성 농약을 대체할 수 있고 저항성균 출현 등의 문제를 해결할 수 있는 새로운 방제 방법이 요구된다.

전세계적으로 식물병 방제에 있어서 화학적 합성농약의 사용은 리오(Rio)협약 등에 의하여 감소 추세에 있으며 인체에 무해하고 친환경적인 병 방제 방법이 요구되면서 저장 과실의 부패를 막기 위해 저독성, 친환경 농약을 이용한 방제 방법들의 개발이 중요시되고 있다.

저독성이면서도 친환경적인 Penicillium 방제법으로 식물 추출물을 이용한 방제와 미생물을 이용한 방제가 시도되고 있다. 또한, P. digitatum에 대한 과일의 병에 대한 저항성을 향상시키기 위해 식물생장을 조절하는 재스몬산(jasmonic acid), 아미노산(amino acid)과 그 유도체인 베타-아미노부틸산(β-aminobutyric acid)과 같은 천연 화합물의 이용과 UV와 뜨거운 물로 씻는 등의 물리적인 병 방제 방법에 관한 연구가 수행되고 있다.

유기합성농약의 사용을 극소화하고 인축에 무해하며 병해에 대한 활성이 높은 우수한 천연농약을 개발하고자 제충국, 담배 및 데리스의 주성분인 피레드린(pyrethrin), 니코틴(nicotine) 및 로테논(rotenone)의 유기인계나 카르바메이트(carbamate)계 등이 유기합성농약에 비해 저독성을 띄는 근연화합물 농약으로 개발되었다. 또한 이러한 추세에 발맞추어 여러 종의 식물체로부터 많은 병 방제 물질을 탐색하고 있으며 일부 물질의 강한 항균성분도 확인되었다.

그러나 아직까지 천연물의 방대한 자원에 비해 천연물 유래의 생물농약개발은 매우 극소수에 불과하다. 또한, Penicillium 균은 자체 분비하는 항생물질로 인해 미생물에 항균성이 있으므로 미생물농약의 개발 및 이용이 매우 어렵다. 이러한 의미에서 천연물 유래 생물농약의 방제 방법은 미생물 제제가 갖는 문제점을 해결할 수 있고, 화학농약에 비해 개발비가 저렴한 장점이 있다. 게다가 추후 병해충 종합관리 방법은 필수적이며, 생물적 방제법이 함께 이용되어야 하기 때문에 친환경 천연물 유래 농약의 개발이 요구된다.

상기의 필요성에 따라 본 발명은 과실류의 저장병을 친환경적으로 방제할 수 있는 천연물 유래 천연농약을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유기합성 농약을 대체할 수 있고 저항성균의 출현 문제를 해결하기 위하여 대량생산이 가능한 제조방법을 제공함에 있다.

상기의 해결하려는 과제를 위한 본 발명에 따른 천산용으로부터 프로토다이오신의 추출 방법은, (1) 건조된 천산용을 준비하는 단계, (2) 준비된 천산용을 부탄올을 용매로 하여 천산용 1kg에 용매 500ℓ의 비율로 혼합한 후 진탕 배양하는 단계, (3) 배양된 추출물을 한약재용 거즈에 여과시키는 단계, (4) 여과된 물질을 회전감압농축기를 이용하여 용매를 제거하는 단계, (5) 용매가 제거된 추출물을 감압농축기를 이용하여 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시예로서 상기 진탕배양하는 단계는 20~30℃에서 적어도 48시간 진탕 배양할 수 있고, 상기 프로토다이오신(protodioscin)은 과실류 저장병 방제용으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 천산용 추출물은 녹색곰팡이병균인 Penicillium digitatum에 대한 항균활성이 우수하여 과실류에서 발생하는 저장병을 예방할 수 있는 효과가 있다.

또한, 천산용 추출물 제조방법은 간단한 공정으로 천산용 추출물을 대량생산할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 감염된 감귤류로부터 발견된 균사체와 포자 형태의 동정 병원체를 나타내는 사진이다.
도 2는 Penicilliun digitatum에 대한 약용식물 추출물의 항진균활성을 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 도면과 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 도면과 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

1. 병원균의 동정

Penicillium속에 의한 저장병 방제 연구를 위해 우선적으로 실제 과실상에서 발생하는 Penicillium균을 분리하여 동정하였다. 병해를 입은 과실로부터 병원균 분리를 위해 무균상에서 감귤과실 표면에 발생한 병원균의 포자 및 균사를 분리, PDA 배지에 접종 후 24℃ 배양기에서 24시간 배양 후 자라난 것을 단균사 및 단포자 분리하여 각각 감자한천배지(PDA:Potato Dextrose Agar medium)에 옮기고 24℃ 배양기에서 3일간 배양하였다. 배양된 것들의 동정을 위해 배지상에서 자라는 형태 및 포자의 색 등을 확인하였고, 현미경 상에서 400배로 검경하여 포자 및 균사 모양을 관찰하였다. 확인결과, 감염된 감귤과실로부터 Penicillium digitatum과 Penicillium italicum을 순수 분리 동정할 수 있었다.

도 1은 감염된 감귤류로부터 발견된 균사체와 포자 형태의 동정 병원체를 나타내는 사진으로서, A는 감염된 감귤류, B는 PDA 배지의 Penicilliun digitatum , C는 PDA 배지의 Penicillium italicum 을 보여주고 D 내지 E는 균사체와 포자의 모양을 현미경으로 찍은 사진이다.

위에서 분리한 2가지의 병원균 외에도 저장병을 일으키는 Penicillium속 균주의 확보를 위해 KACC(Korea Agricultural Culture Collection center)로부터 표1과 같은 5가지의 Penicillium속을 분양받아 실험에 사용하였다. 분양받은 Penicillium속들은 감귤, 배, 포도, 사과 등 부가가치가 높은 과실뿐만 아니라 버섯, 마늘 및 채소 등의 저장 시에도 발생하는 주요 Penicillium속 병원균들이다.

2. 항균활성 약용작물의 선발

유용 항균물질 함유 가능성이 높을 것으로 예상되는 아래 표 2의 천산용을 비롯한 32가지 약용식물에서 저장병해인 Penicillium digitatum에 대한 항진균활성을 검사하기 위하여 균사생육 저해 정도를 확인하였다.

32가지 각각의 식물을 분쇄기로 분쇄하여 건조시킨 후 100g을 100% 메탄올 5ℓ에 넣고 24℃에서 48시간 진탕 배양시키고, 그 추출물을 거즈와 여과지(filter paper)를 이용하여 3회 여과하였다. 여과되어 나온 물질은 회전감압농축기를 이용하여 매탄올을 완전히 제거하고 동결건조 하였다.

동결건조된 식물 추출물을 100배 농도로 조정한 후 종이 접시에 점적한 다음 Penicillium digitatum을 도말한 PDA 배지에 올려놓고 검정을 수행한 결과 표 2 및 도 2의 18번인 천산용 추출물에서 균사 생육이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 표 2는 Penicillium digitatum에 대하여 5 mg/㎖ 농도의 약용식물의 항진균활성을 나타낸다.

(- : 생육촉진, + : 25% 미만, ++ : 25~50%, +++ : 50~75%)

3. 천산용 추출물의 대량생산

본 발명에서 사용하는 천산용은 마과 약용식물로써 그 학명은 Dioscorea nipponica Makino 이다.

위에서 살펴본 바와 같이 천산용은 Penicillium digitatum에 대한 항균능력이 우수하였다. 실험에 사용된 약제는 시중의 한약 약전상가에서 구입하여 실험을 공시하였지만 구입할 때마다 재료의 모습이나 형태가 다르고 특히 뿌리에서 나는 향기나 맛에 차이가 있었다. 현재 국내에 유통되고 있는 한약 재료는 대다수가 중국산이며 간혹 국산의 경우 매우 고가였다. 항균활성 실험에서 우수한 결과를 나타낸 천산용은 국산천산용이었고 안정적으로 활성이 있는 물질을 얻어낼 수 있었으나 중국산 천산용을 이용하였을 때는 그 결과가 일정하지 않았다. 시중에 유통되는 천산용은 중국산 북경천산용과 한국산 천산용이라는 통용명으로 유통되고 있었다. 국내 자생하는 천산용의 특성과 재배 농가 등을 조사한 결과 국내에서 천산용의 대량 재배 가능성을 확인할 수 있었다. 천산용의 인공 재배방법은 좀 더 구체적인 연구결과가 필요하지만 인삼재배방법과 매우 흡사하다고 판단된다.

이와 같은 천산용 추출물은 다음과 같은 실시예로 대량 생산할 수 있다.

1) 500ℓ 반응기에 1kg의 건조된 천산용과 100% 용매인 메탄올 또는 부탄올 500ℓ를 넣고 24℃에서 48시간 진탕 배양한다.

2) 배양된 추출물을 한약재용 거즈를 통하여 5회 여과한다.

3) 여과된 물질은 20ℓ대형 회전감압농축기를 이용하여 용매를 제거하고, 200ℓ대형 감압농축기에서 동결건조시킨다.

4. 추출물의 유효성분 분석

천산용 추출물의 유효성분 분석 결과, 항균활성을 갖는 물질의 유효성분이 protodioscin으로 확인되었다.

[ 실험예 1]

천상용 추출물(protodioscin)의 항균 활성 능력을 알아보기 위하여 상기 실시예 1에서 얻어진 추출물과 JIAHERB로부터 구입한 protodioscin을 TDW에 녹여 각각 50ppm, 100ppm, 200ppm, 300ppm, 400ppm, 500ppm의 농도로 제작하였으며, P. digitatum과 P. italicum이 접종된 PDA 배지에서 균사 생장 저해율을 측정하였다.

P. digitatum에 대한 protodioscin의 균사 생장 저해율을 측정한 결과, 천상용에서 추출한 protodioscin의 경우 50ppm에서 21.3%의 균사 생장 억제를 보여 JIAHERB로부터 구입한 protodioscin의 50ppm에서의 4.2%의 억제효과 대비 5.1배의 균사 생장 억제 효과를 나타내었다. 그러나 100ppm 이상의 농도에서는 평균 6.3% 활성이 떨어지는 것을 확인하였으며, 이는 전문적 추출물 생산 기업과의 추출물 생산 공정의 차이에 따른 것으로 파악된다.

P. italicum에 대한 protodioscin의 균사 생장 저해율을 측정한 결과는 상대적 저농도인 50ppm에서 모두 균사생장 억제 효과가 나타나지 않았다. 천산용에서 추출한 protodioscin의 100ppm, 200ppm, 300ppm, 400ppm, 500ppm 에서는 34.6%, 45.8%, 56.4%, 62.5%, 62.8%의 균사생육 억제가 나타났으며, JIAHERB로부터 구입한 protodioscin의 100ppm, 200ppm, 300ppm, 400ppm, 500ppm 에서는 35.5%, 47.7%, 60.1%, 61.2%, 63.9%의 균사생육 억제가 나타나 P. italicum에 대한 protodioscin의 균사 생장 저해효과는 같은 것으로 확인되었다.

배지상 protodioscin의 항균능에 대한 실험결과 같은 농도의 protodioscin에서도 P. digitatum 대비 P. italicum의 균의 균사억제 효과가 평균 7.25% 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과에 따라 현장 평가 및 제형화를 위한 타겟은 P. digitatum이 적절하다고 판단되며, 또한 현장실험 및 제품화를 위해서는 protodioscin 200ppm 이상의 농도가 사용돼야 하거나 효과증진을 위한 보조제의 탐색 및 연구가 필요하다고 평가되었다.

Claims (6)

1. (1) 건조된 천산용을 준비하는 단계;
   (2) 준비된 천산용을 부탄올을 용매로 하여 천산용 1kg에 용매 500ℓ의 비율로 혼합한 후 진탕 배양하는 단계;
   (3) 배양된 추출물을 한약재용 거즈에 여과시키는 단계;
   (4) 여과된 물질을 회전감압농축기를 이용하여 용매를 제거하는 단계; 및
   (5) 용매가 제거된 추출물을 감압농축기를 이용하여 동결건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 건조된 천산용으로부터 프로토다이오신(protodioscin)의 추출 방법
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 (2)단계는 20~30℃에서 적어도 48시간 진탕 배양되는 것을 특징으로 하는, 건조된 천산용으로부터 프로토다이오신(protodioscin)의 추출 방법
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 프로토다이오신은 과실류 저장병 방제용으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 건조된 천산용으로부터 프로토다이오신(protodioscin)의 추출 방법

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