KR101275335B1 - 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단백질의 추출 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터의 단백질을 용해시키고, 후속해서 정량할 수 있는 방법에 관한 것이다. 상기 방법으로 샘플로부터 무손상 전장 단백질을 추출하고, 이를 후속 분석할 수 있다.
단백질 추출, 포르말린, 생물학적 샘플, 완충제, 계면활성제, 단백질분해 활성 화합물, 프로테아제
Description
본 발명은 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터의 단백질, 특히 무손상 전장 단백질을 가용화시킨 후 정량할 수 있는 방법에 관한 것이다.
많은 나라에서, 후속 면역조직화학적 조사를 위해 포르말린에 조직을 고정시키는 것은 예를 들어 질환에 걸린 조직으로부터 건강한 조직을 식별하기 위한 표준 절차이다. 포르말린에 고정되고 파라핀에 포매된 (FFPE) 조직은 수십 년 동안 수집되었으며, 이는 무수한 진단적 연구의 근원이다. 요법 전/동안/후 등의 상이한 질환 단계로부터의 대부분의 기관으로부터의 조직이 이용가능하다. FFPE 조직은 형태가 고도로 유지된다는 이점을 제공한다. 하지만, 가교결합 거대분자 (DNA, RNA, 단백질) 때문에, 더이상 충분하게 조사될 수 없다. 현재의 견해에 따르면, 포르말린에 고정된 조직은 후속 정량에 충분한 양으로 통상적이고 신뢰성있게 단백질을 단리하는데 부적합하다 (예를 들어, 문헌 [Espina et al. 2003]). 따라서, 거대분자의 후속 정량을 위해 포르말린에 조직을 고정시키는 것에 대한 대안이 추구되고 있다. 특히, 조직의 동결 (냉동절편) 및 현재 논의된 실험적 고정 방법, 예를 들어 70％ 에탄올이 본원에 인용된다 (예를 들어, 문헌 [Ahram et al. 2003]). 동결 재료는 사실상 거대분자의 좋은 근원이지만, 조직의 수집, 가공 및 저장에 비용이 많이 든다. 실험적 고정 방법은 거대분자의 형태 유지와 완전성 사이의 좋은 절충안이지만, 이는 후향적 연구에 있어서 그다지 역할을 하지 못한다.
인간 게놈 프로젝트에 의해 확인된 후보 분자는 대규모 후향적 조사 및 전향적 조사에 있어서 그의 임상적 이용가능성에 대해 단백질 수준에서 시험되어야 할 것이다. DNA 및 RNA 분석은 이전에는 포르말린에 고정된 재료로 실행가능한 것으로 여겨지지 않았다. 오늘날, 이러한 분석은 심지어 레이저-기반 조직 현미해부에서조차도 통상적이다. 이는 단백질 분석에도 적용될 수 있다. 핵산의 단리 방법은 단백질의 단리 방법과는 상당히 상이하다. 예를 들어, 프로테아제는 단백질 단리에는 사용될 수 없는데, 그것은 이러한 방식으로는 단백질이 소화되고 따라서 더이상 무손상이 아니기 때문이다. 발현 병리학 방법 (Expression Pathology) (WO 2004/080579 A2)은 정확히 이러한 관점과 관련되며, 단백질분해 단편 - 즉, 펩티드를 단리하기 위해 열의 효과와 조합으로 프로테아제를 이용한다. 이들은 후속 단계에서 질량 분광법에 의해 분석될 수 있다. 따라서, 발현 병리학 방법은 본원에 기재된 방법과는 상이하다. 단백질 가교결합 - 포르말린에 의해 일어남 - 은 충분한 열 처리에 의해 파괴될 수 있다.
이러한 방법의 하기 예가 공지되어 있다.
(1) 크로마틴 면역침전법 (ChiP). ChiP는 표적 단백질이 생체내에서 특정 DNA 서열에 결합하는지 여부를 검출할 수 있는 절차이다. 무손상 세포를 포르말린에 고정시켜 DNA-단백질 및 단백질-단백질 가교결합을 일으킨다. 그 후, 세포를 용해시키고, DNA를 절단하여 이를 보다 작은 단편으로 분할한다. 그 후, DNA-단백질 복합체를 표적 단백질에 대한 항체에 의해 면역침전시킨다. 그 후, DNA-단백질 결합을 열의 작용에 의해 파괴시키고, 단백질을 프로테아제에 의해 파괴시킨다. 마지막으로, 특정 DNA 서열이 특이적 항체를 이용하여 공동-면역침전되었는지 여부를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 확인한다. 여기서, 열 작용은 포르말린에 의해 유발된 가교결합이 파괴되는 원리이다.
(2) 항원 복구. 항원은 대개 포르말린 고정을 통해 그의 면역반응성을 상실한다. 따라서, 많은 항체를 사용한 면역조직화학적 연구는 한계 내에서만 가능하였다. 오늘날은, 대부분의 항원의 면역반응성이 회복될 수 있는 (항원 복구) 방법이 이용가능하다. 여기서의 원리는 - 조직 절편의 탈파라핀화 및 재-수화 후 - 수용액 내에서의 조직에 대한 열의 작용이다. 하지만, 면역조직화학에서 반응의 정량은 한계 내에서만 가능하다.
WO 2004/080579 A2에서 공지된 생분자 용해물의 제조 방법은 포르말린에 고정된 조직 샘플을 완충제 시스템 중에서 재-가열한 후, 단백질분해 효소로 처리하여 조직을 분해시키는 것이다.
하지만, 현재는 포르말린에 고정된 조직으로부터의 무손상 단백질을 현대적 방법으로 신뢰성있게 정량적이고 감도높게 조사할 수 있는데 이용가능한 방법은 없다. 조직 절편 내의 개별 세포에 대해 지정하고 면역반응성을 측정하는 면역조직화학 (IHC)은 현재 포르말린에 고정된 조직 상에서 단백질을 조사하는 유일한 방법이다. 하지만, IHC는 한계 내에서만 정량가능하다. 포르말린 고정은 사실상 조직 의 형태를 우수하게 유지하지만, 단백질 서로 및 다른 거대분자, 예를 들어 DNA와의 강한 가교결합을 유발한다. 일반적으로 매우 낮은 수율로 단백질을 제공하였기 때문에 실패하였던 포르말린에 고정된 조직으로부터 단백질을 단리하려는 이전의 시도 (예를 들어, 문헌 [Ahram et al. 2003])는 신뢰성이 없으며, 웨스턴 블롯 조사에만 제한되고 (예를 들어, 문헌 [Ikeda et al. 1998]), 종종 무손상 단백질의 검출 또는 정량이 되지 않는다. 이께다(Ikeda) 등은 사실상 FFPE 조직으로부터의 단백질의 단리에 적합한 방법을 기재하고 있기는 하지만, 이 방법은 정량적 단리가 되지 않는다. 그 이유는 60℃에서의 인큐베이션 단계가 명백히 단백질을 정량적으로 단리하는데 충분하지 않다는 것이다. 이는 최소의 고정된 조직 샘플, 예를 들어 생검에서 단백질을 정량할 수 있어야 한다. 현재의 방법으로는 예를 들어 단백질 어레이를 사용한 측정을 위해 이러한 샘플로부터 적절한 양의 단백질을 단리하는 것은 불가능하다. 결과적으로, 상기 방법은 일상적인 임상적 관행상 질환 마커를 결정하는데 부적합하다. 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단백질의 정량에 대한 증가하는 수요는 임상에 있어서나 연구에 있어서나 웨스턴 블롯만으로는 충족될 수 없다. 현재, 고처리량 방법, 예를 들어 단백질 어레이의 개발은 매우 중요해지고 있다. 포르말린에 고정된 조직으로부터의 무손상 단백질은 현재 단백질 어레이로는 조사될 수 없는 것으로 여겨진다 (문헌 [Espina et al. 2003]).
따라서, 본 발명의 과제는 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터의 단백질의 추출을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제는 완충제가 계면활성제를 포함하고, 단백질분해 활성 화합물은 포함하지 않으며, 완충제 중의 생물학적 샘플을 먼저 가열하고, 60℃ 초과의 온도에서 추가로 인큐베이션하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플이 단백질을 방출시키는데 충분한 온도에서 완충제 중에서 인큐베이션되는, 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터의 단백질의 정량적 추출 방법에 의해 해결된다. 본 발명의 추가의 개선점은 각각의 종속항에 뒤따른다.
본원에 기재된 본 발명은 임상적 연구 및 실험적 연구에서 현재의 고처리량 방법, 예를 들어 단백질 어레이에 적합한 단백질의 후속 분석을 위한, 특히 정량을 위한, 조직 샘플과 같은 고정된 생물학적 샘플로부터의 단백질 추출의 상당한 최적화에 관한 것이다. 상이한 질환 단계 또는 과정으로부터의 샘플은 이러한 방식으로 항체 검출에 의한 분석 및 정량을 위해 이용가능하다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단백질 추출 방법은 우수한 결과를 제공하며, 당업계의 현상태의 단점을 회피한다. 이전에 이용된 기술은 명백히 성공으로 이어지지 못했는데, 그 이유는 (a) 샘플이 지나치게 짧게 가열되었거나 (예를 들어, 100℃에서 단지 50초); (b) 프로테아제가 사용되었거나 (단리가능한 무손상 단백질이 없음); (c) 계면활성제가 사실상 사용되었지만, 샘플의 적절한 가열이 뒤따르지 않았기 때문이다 (예를 들어, 60℃ 이하, 따라서 지나치게 낮은 단백질 수율). 오직 본원에 기재된 방법, 즉 예를 들어 (a) 프로테아제-무함유 완충제의 사용, (b) 계면활성제의 사용, 및 (c) 보다 높은 온도의 가열 (60℃ 초과에서 50초 초과 동안)로만 후속의 정확한 정량에 충분한 양의 무손상 단백질을 예상치 못한 방식으로 수득하였다.
이어서, 단리된 무손상 단백질을 검출하는 추가의 방법은 예를 들어 웨스턴 블롯, 단백질 어레이, 면역침전법, SELDI-TOF 질량 분광법, ELISA 및 2-D 겔 전기영동일 수 있다.
하기에서, 본 발명은 실시양태에 기초하여 추가로 설명될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 임상적 적용의 예를 나타낸다.
도 2는 조직 샘플을 60℃보다 높은 온도에서 인큐베이션함으로써 단백질 수율을 개선시키는 예를 나타낸다. 60℃에서 샘플을 인큐베이션한 후의 웨스턴 블롯 (좌측)과 본 발명의 방법 (60℃ 초과, 예를 들어 80℃, 우측)을 비교한 알파-튜불린 (무손상 단백질, 50 kDa)의 수율이 나타나 있다.
도 3은 포르말린에 고정된 조직으로부터의 추출 후의 2가지 단백질 (E-카드헤린, 알파-튜불린)의 상관관계를 나타낸다.
도 4는 웨스턴 블롯 (단백질의 무손상성의 검출, 항체 특이성의 입증) 및 역상 단백질 어레이의 가장 단순한 형태 (도트 블롯) 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 5는 상이한 환원제를 함유하는 완충제로 FFPE 절편으로부터 추출한 후의 베타-액틴의 상관관계를 나타낸다.
하나의 무손상 단백질 또는 몇 개의 무손상 단백질을 본 방법으로 검출하고 정량할 수 있다. 전체적으로 상이한 세포 구획, 예를 들어 세포핵, 세포질 또는 세포막으로부터의 단백질을 신뢰성있게 단리하고, 정량적으로 측정할 수 있다. 단 리된 무손상 단백질을 희석, 즉 일련 희석할 수 있으며, 따라서 내부 표준 곡선을 그릴 수 있다. 이러한 방식으로, 단백질의 검출 및 정량을 선형 영역에서 수행하도록 할 수 있다. 필요할 경우, 사용된 검출제, 예를 들어 항체의 교차 반응이 일어나지 않도록 하기 위해, 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 사전에 조사할 수 있다 (웨스턴 블롯에서 정확한 크기의 특정 밴드 하나만). 본원에 기재된 방법에 의해 단리된 정량가능한 무손상 단백질은 이미 일상적인 임상적 관행으로 수행되는 면역조직화학적 분석으로부터의 결과를 최적의 방식으로 보충한다. 따라서, 먼저, 무손상 단백질의 정확하고 감도높은 정량 (본 발명의 과제) 및 단백질의 세포적 지정 (면역조직화학)이 고정된 조직에서 가능하다. 공지된 질환 마커, 예를 들어 유암 환자에서의 Her2/neu를 이제 이전에는 알려지지 않았던 정확성으로 임상적으로 측정할 수 있다. 더욱이, 신규한 질환 마커는 단리된 무손상 단백질을 통상적인 단백질 방법, 예를 들어 질량 분광법에 의해 분석하는 방법에 의해, 건강한 조직 및 질환에 걸린 조직 사이를 비교함으로써 확인될 수 있다. 본 발명의 방법으로 동물 조직을 또한 조사할 수 있다. 동물 모델은 많은 인간 질환, 예를 들어 종양 질환에 대해 이미 이용가능하다. 동물 조직을 전형적으로 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 포매시키고, 병리조직학적으로 검사한다. 본 단백질 단리 방법은 예를 들어 단백질 어레이에 의해 상기 모델에서 공지된 질환 마커 및 신규한 질환 마커를 정확하고, 감도높고, 효과적으로 정량하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 추가의 과제는 포르말린에 고정된 인간 또는 동물 생물학적 샘플, 예컨대 조직으로부터의 무손상 단백질을 신뢰성있고 고수율로 단리할 수 있는 적용 팩 ("키트")을 제공하 는 것이다. 상기 적용 팩의 성분은 예를 들어 적어도 (a) 프로테아제-무함유 완충제 시스템 및 (b) 계면활성제이다. 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단백질 단리의 상세한 프로토콜은 적용 팩과 함께 포함될 수 있다.
본 방법은 임상적 연구 및 기초 지향 조사 둘다에 이용될 수 있다. 여전히 더 중요한 것은 본원에 기재된 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단백질 단리 방법이 일상적인 임상적 관행에 최적으로 도입될 수 있다는 점이다. 이러한 방식으로, 상당히 보다 정확한 진단적 및 치료적 방법이 사용될 수 있다.
도 1은 통상적으로 포르말린에 고정된 조직으로부터의 무손상 단백질의 임상적 적용의 예를 나타낸다. 이러한 방식으로, 심지어 화학적으로 개질된 단백질, 예를 들어 인산화된 단백질 또는 글리코실화된 단백질도 검출할 수 있다. 지금까지는, 면역조직화학만이 포르말린에 고정된 재료 상의 단백질 조사에 임상적으로 이용된다. 본 단백질 정량 방법은 공지된 질환 마커 및 신규한 질환 마커의 발현에 대한 보충적인 정보를 임상적 관행상 아직 알려지지 않았던 정확성으로 제공한다.
단백질 어레이의 구축을 통해, 정량적 단백체 조사는 그 방식상 임상적 관행의 일부가 되고 있다. 하지만, 포르말린에 고정된 조직 샘플은 미약한 단백질 수율 때문에 현재 이러한 고처리량 방법으로는 조사될 수 없다. 본 방법은 이러한 결점을 제거한다. 본 방법에 도입될 수 있는 단백질 검출용 마이크로어레이의 3가지 예시적인 전략이 본원에 기재될 것이다. 1. 소위 샌드위치 면역어레이 (항체 어레이 I). 이러한 형태의 어레이에서, 단백질-결합 분자, 예를 들어 항체는 고체 표면에 커플링된다. 기재된 방법에 따라 단리된 단백질 (항원)은 항체에 의해 특이적으로 결합되며, 그 후 검출용으로 태그화된 제2의 특이적 항원-결합 항체로 검출될 수 있다. 2. 항원 포획 어레이 (항체 어레이 II). 여기에서도 역시, 단백질 결합 분자, 예를 들어 항체는 고체 표면에 커플링된다. 본 방법에 따라 단리된 단백질은 검출제, 예를 들어 형광 염료와 커플링된 후, 항체에 의해 먼저 특이적으로 결합된다. 이러한 방식으로, 결합된 단백질을 직접 검출할 수 있다. 상이한 조직으로부터, 예를 들어 종양 조직 및 정상 조직으로부터 단리된 단백질의 비교에 의해, 대상 단백질의 상대적 양을 상이한 형광 염료 (예를 들어, Cy-3 및 Cy-5)를 사용하여 비교적으로 보여줄 수 있다. 3. 직접 단백질 어레이 (역상 단백질 어레이). 상기 방법에서, 기재된 방법에 따라 단리된 단백질은 적합한 표면, 예를 들어 니트로셀룰로스 또는 PVDF 상으로 직접적으로 떨어지며, 결합된 단백질은 특이적 항원으로 (제2의 검출 항체로) 직접적 또는 간접적으로 검출된다. 신호 증폭 방법 (예를 들어, 다코(DAKO)의 CSA)은 용액 내에서의 매우 감도높고 특이적인 단백질 검출을 가능하게 한다. 상기 방법은 공지된 도트 블롯과 매우 유사하다.
본 발명은 포르말린에 고정된 조직 샘플로부터의 단백질 정량 방법을 제공한다. 상기 기술은 먼저 근-임상 조건하에 조직 샘플 내의 질환 마커의 정확한 측정을 가능하게 한다. 예견하지 못한 방식으로, 이전에 성공적이지 못했던 기술들의 조합은 작은 조직 샘플 (예를 들어, 생검)의 조사에 필요한 고정된 조직으로부터의 무손상 단백질의 고수율에 필수적임이 밝혀졌다. 이전의 방법에서는, 조직 샘플을 예를 들어 먼저 100℃로 가열한 후, 60℃에서 보다 긴 시간 동안 가열한다. 샘플 을 60℃에서 장시간 가열하는 것은 단백질을 고수율로 수득하는데 충분하지 않음이 밝혀졌다. 샘플을 60℃ 초과, 예를 들어 80℃로 가열할 때 상당히 높은 양의 용해된 단백질을 수득하였다 (도 2). 본 발명에 따른 방법은 하기 단계로 상응하게 이루어질 수 있다.
(a) 포르말린에 고정되고 파라핀에 포매된 조직 샘플의 블록을 절단한다;
(b) 절편을 파라핀으로부터 유리시킨다;
(c) 조사될 조직 영역을 수작업으로 또는 레이저 현미경 절개에 의해 조직 절편으로부터 절제한다 (임의로, 전 조직을 조사할 수 있음);
(d) 절제된 조직 조각을 계면활성제를 함유하고 단백질분해 활성 화합물은 없는 완충제에 옮긴다. 단백질의 완전성을 위해, 예를 들어 트립신 또는 프로테이나제 K와 같은 프로테아제는 사용할 수 없다;
(e) 완충제 내의 샘플을 먼저 (95℃ 내지 100℃로) 가열한다. 인큐베이션 시간은 예를 들어 5분 내지 40분으로 다양할 수 있다. 가열 시간은 예를 들어 샘플의 크기에 의존한다;
(f) 그 후, 샘플을 60℃ 초과의 온도 (예를 들어, 80℃)에서 인큐베이션한다. 60℃ 초과에서의 인큐베이션 시간은 예를 들어 1시간 내지 6시간으로 다양할 수 있다. 하지만, 60℃보다 높은 온도에서의 최대 인큐베이션 시간은 16시간 미만이어야 한다;
(g) 무손상 단백질은 이제 충분한 양으로 용액에 존재하며, 예를 들어 정량될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 바람직한 실시양태에서, DTT를 함유하는 추출 완충제가 사용된다. 환원제로서 DTT를 사용하면 특히 유익한 수율로 단리된 무손상 단백질을 수득할 수 있음이 확인되었다. 본 실시양태의 이점은 특히 수득된 용해물을 당업자에게 공지된 시판되는 단백질 정량 분석, 예를 들어 바이오래드(BioRad) DC(등록상표) 또는 피어스(Pierce)의 BCA 분석(등록상표)으로 직접적이고 특히 우수하게 정량할 수 있으며, 추가의 분석에 사용할 수 있다는 점이다. 샘플을 희석하지 않아도 되며, 따라서 측정 부정확성이 회피되고, 동일한 양의 단백질이 후속 분석 (예를 들어, 웨스턴 블롯)에 사용되도록 한다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 임상적 적용의 예를 나타낸다. 포르말린에 고정된 조직으로부터의 고수율의 무손상 단백질은 먼저 통상적으로 수득된 생검 또는 절개 재료에 대한 조직학, 면역조직학 및 정량적 단백질 발현의 통합을 가능하게 한다. 상기 방법은 예를 들어 상이한 질환 단계 (전악성, 침입성)에서 또는 요법 전후에 단백질 어레이에 의한 질환 마커의 정확한 조사를 가능하게 한다.
도 2는 조직 샘플을 60℃보다 높은 온도에서 인큐베이션함으로써 단백질 수율을 개선시키는 예를 나타낸다. 60℃에서 샘플을 인큐베이션한 후의 웨스턴 블롯 (좌측)과 본 발명의 방법 (60℃ 초과, 예를 들어 80℃, 우측)을 비교한 알파-튜불린 (무손상 단백질, 50 kDa)의 수율이 나타나 있다.
도 3은 포르말린에 고정된 조직으로부터의 추출 후의 2가지 단백질 (E-카드헤린, 알파-튜불린)의 상관관계를 나타낸다. 2가지 단백질의 신호 강도는 서로 높게 상관되며, 즉 무손상 단백질은 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단리 후 서로 상관될 수 있다 (정량됨). 정상적인 결장 조직으로부터의 단백질 용해물의 상이한 희석액 (1:2 내지 1:16)을 웨스턴 블롯에 의해 분석한다. 예를 들어, 슬라이드로부터 벗겨내기 전후 조직이 나타나 있다 (화살표). Unverd. = 희석되지 않은 샘플.
도 4는 웨스턴 블롯 (단백질의 완전성의 검출, 항체 특이성의 입증) 및 역상 단백질 어레이의 가장 단순한 형태 (도트 블롯) 사이의 상관관계를 나타낸다. 정상적인 결장 조직으로부터의 단백질 용해물의 상이한 희석액 (1:2 내지 1:64)을 웨스턴 블롯 및 도트 블롯에 의해 조사한다. 각각의 경우, 퍼센트 값을 영상분석 평가를 위해 희석되지 않은 샘플에 대해 플롯팅한다 (바닥) (희석되지 않은 샘플 = 100％). 음성, 음성 대조군 (추출 완충제); 양성 대조군 (고-냉동 결장 조직으로부터의 단백질 용해물).
도 5는 상이한 환원제를 함유하는 완충제로 FFPE 절편으로부터 추출한 후의 베타-액틴의 상관관계를 나타낸다. (A) 무손상 단백질을 2가지 추출 완충제 EB (β-머캅토에탄올 함유) 및 EB2 (DTT 함유)로 정상적인 뇌 조직으로부터 단리하였다. 단백질 용해물의 희석액을 β-액틴 면역착색법에 의해 도트 블롯으로 분석하였다. 신호 강도는 높게 상관된다. (B) 추출 완충제 EB2로 제조된 단백질 용해물의 단백질 농도를 시판되는 단백질 정량 키트로 측정하였다. (C) 단백질 정량 키트를 사용한 단백질 정량 및 도트 플롯에서의 상관관계에 기초하여, 2가지 단백질 용해물 각각 20 ㎍을 SDS-PAGE로 분리하고, β-액틴의 양을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 2가지 샘플로부터의 신호 강도는 높게 상관되며, 정량될 수 있다.
본 발명의 의미 내에서, 완충제 또는 완충제 시스템은 1.0 내지 9.0 범위 내의 특정 pH 값을 갖는 완충제에 관한 것이다.
당업자에게 공지되어 있으며 세포 용해에 적합한 모든 계면활성제는 본 발명에 따른 방법에 계면활성제로서 사용될 수 있다. 특히, SDS, 나트륨 데옥시콜레이트, CHAPS, 트리톤(Triton) X100, 노니데트(Nonidet) P40 또는 트윈(Tween) 20이 계면활성제로서 사용된다.
계면활성제의 농도는 예를 들어 0.1 내지 10％일 수 있다. 특히 바람직한 농도 범위는 약 1 내지 5％이다.
또한, 완충제는 환원제, 예컨대 1,4-디티오-DL-트레이트, DTE, TCEP 또는 MEA를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 의미 내에서, 단백질분해 활성 화합물은 모든 단백질-절단 화합물, 예를 들어 단백질분해 효소, 예컨대 프로테아제, 특히 트립신, 키모트립신, 파파인, 펩신, 프로나제 및 엔도프로테이나제 Lys-C를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 의미 내에서, 단백질분해 활성 화합물은 또한 단백질 절단에 적합한 비-효소적 물질, 예컨대 브로모시안이다.
본 발명의 의미 내에서, 생물학적 샘플은 전체 유기체, 조직 절편, 조직 샘플, 체액, 세포 또는 바이러스 재료일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 조직 샘플 및/또는 세포 배양물과 함께 이용된다. 샘플은 인간 또는 동물 생물학적 샘플일 수 있지만, 박테리아, 바이러스 또는 단세포 유기체로부터의 샘플일 수도 있다.
생물학적 샘플은 바람직하게는 포르말린에 고정되고/거나, 포르말린에 고정되고 파라핀에 포매된다.
따라서, 본 발명은 완충제가 계면활성제를 포함하고, 단백질분해 활성 화합물은 포함하지 않으며, 완충제 중의 생물학적 샘플을 먼저 가열하고, 60℃ 초과의 온도에서 추가로 인큐베이션하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플이 단백질을 방출시키는데 충분한 온도에서 완충제 중에서 인큐베이션되는, 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터의 단백질의 추출 방법을 기재한다.
생물학적 샘플을 바람직하게는 완충제 중에서 5 내지 40분 동안 가열한다. 특히 바람직하게는, 생물학적 샘플을 20분 내지 16시간 동안 인큐베이션한다.
본 발명의 특정 이점은 방출된 단백질이 본질적으로 무손상이라는 점이다.
계면활성제는 바람직하게는 SDS, 나트륨 데옥시콜레이트, CHAPS, 트리톤 X100, 노니데트 P40 또는 트윈 20이다.
완충제는 바람직하게는 추가의 환원제, 예컨대 1,4-디티오-DL-트레이톨, DTE, TCEP 또는 MEA를 포함한다.
생물학적 샘플이 포르말린 고정된 파라핀 포매된 샘플일 경우, 이를 단백질 추출 전에 탈파라핀화시킨다.
본 발명에 따른 방법의 이점은 추출된 단백질을 추가로 분획화시킬 수 있다는 점이다.
특히, 추출된 단백질을 한 번 또는 몇 번의 단계로 분획화시킬 수 있다.
추가의 이점은 단백질을 후속해서 정량할 수 있다는 점이다.
단백질의 정량은 바람직하게는 라우리(Lowry) 또는 BCA의 방법에 의해 수행하며, 다른 정량 방법, 특히 단백질 어레이도 사용될 수 있다.
그 후, 추출된 단백질을 단백질분해 효소, 예컨대 트립신, 키모트립신, 프로테이나제 K, 파파인, 펩신, 프로나제, 엔도프로테이나제 Lys-C, 엔도프로테이나제 Glu-C - 또는 글리코시다제 - 예컨대 엔도글리코시다제 H, N-글리코시다제 F, 뉴로아미니다제 또는 포스파타제에 의해 추가로 처리할 수 있다.
단백질이 하나 이상의 생화학적 분석에 사용될 수 있다는 것이 이점이다.
예를 들어, 바람직한 생화학적 분석은 단백질 어레이, 예컨대 마이크로어레이, 특히 샌드위치 면역어레이, 항원 포획 어레이 또는 직접 단백질 어레이이다.
생화학적 분석은 바람직하게는 하나 또는 몇 가지의 진단적 또는 임상적 관련 마커 단백질을 측정할 수 있다.
그에 의해, 2가지 이상의 생물학적 샘플로부터의 마커 단백질을 서로 비교할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 질환에 걸린 조직 및 건강한 조직을 식별할 수 있다. 또한, 분석은 하나 이상의 관련 마커를 분석하기 위해 보다 높은 다중 수준으로 수행될 수 있다.
특히 바람직한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 예를 들어 파라핀 포매된 포르말린 고정된 샘플이다.
특히 바람직한 완충제는 단백질분해 활성 화합물로서 프로테아제를 함유하지 않는다.
더욱이, 본 발명은
(a) 단백질분해 활성 화합물을 포함하지 않는 완충제 시스템, 및
(b) 계면활성제
를 포함하는, 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터의 무손상 단백질의 정량적 추출용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 키트는 계면활성제로서 SDS, 나트륨 데옥시콜레이트, CHAPS, 트리톤 X100, 노니데트 P40 또는 트윈 20을 포함한다.
특히 바람직한 완충제는 단백질분해 활성 화합물로서 프로테아제를 함유하지 않는다.
실시예 1: 포르말린에 고정된 조직으로부터의 단백질 추출
하기에, 본 방법에 따른 전형적인 단백질 추출을 상세히 기재한다. 표준 방법에 비해 본 방법의 상당한 개선점 (높은 단백질 수율)은 도 2에 예시되어 있다. 실험 작동자는 프로토콜의 하나 또는 기타 단계를 다소 변형시킬 것이다. 다소 상이한 조성 및 pH 값을 갖는 완충제가 사용될 수 있다. 하지만, 계면활성제, 예를 들어 SDS의 사용, 95℃ 내지 100℃에서의 샘플의 가열, 및 60℃ 초과 (예를 들어, 80℃)에서의 후속 인큐베이션은 필수적이며, 또한 프로테아제는 사용될 수 없다. 각각의 가열 처리 시간 및 완충제의 부피는 다양할 수 있다. 또한, 조직의 수작업 분쇄는 가변적이다. 이는 기계적으로 (예를 들어, 막자를 사용), 또는 예를 들어 초음파로 수행될 수 있다. 전형적인 시간 및 부피는 본원에 열거되어 있다. 포르말린에 고정된 조직으로부터의 2가지 단백질의 상관관계의 결과는 도 3에 나타나 있다. 포르말린에 고정된 조직으로부터의 무손상 단백질을 사용한 첫번째 단백질 어레이는 도 4에 나타나 있다 (역상 단백질 어레이, 도트 블롯).
전형적인 절차:
1. 동일한 파라핀 블록으로부터 2 x 10 ㎛ 절편을 제조하였다.
2. 절편을 탈파라핀화시켰다.
2.1. 10분 동안 크실렌 처리를 2회 반복하였다.
2.2. 10분 동안 100％ 에탄올 처리하였다.
2.3. 10분 동안 96％ 에탄올 처리하였다.
2.4. 10분 동안 70％ 에탄올 처리하였다.
2.5. 절편을 증류수에 옮겼다.
3. 절편을 증류수로부터 제거하고, 잠시 동안 건조시켰다 (하지만, 완전 건조시키지 않아야 함)
4. 조직 영역을 카눌라로 긁어내었다.
5. 카눌라 상의 절개된 조직을 100 ㎕ 추출 완충제 (EB)* (1.5 mL 반응 용기 당 2개의 절편으로부터의 조직)에 옮겼다.
6. 얼음 위에 놓고, 추출 완충제 중에서 테플론 막자로 잘 분쇄하였다.
7. 얼음 위에 놓고, 볼텍싱하였다.
8. 6 단계 및 7 단계를 1회 반복하였다.
9. 용액을 주사기를 통해 주의깊게 수 회 뽑아내었다.
10. 얼음 위에 놓고, 볼텍싱하였다.
11. 얼음 위에 놓고, 볼텍싱하였다 (발포체가 많을 경우, 짧게 원심분리함)
12. 20분 동안 100℃에서 처리하였다 (수조).
13. 2시간 동안 80℃에서 처리하였다 (진탕기, 750 rpm).
14. 15분 동안 4℃에서, 12500 rpm으로 원심분리하였다.
15. 상청액을 새로운 1.5 mL 반응 용기에 넣어서 단백질 용해물을 준비하였다.
* 추출 완충제 (EB)의 제조: T-PER(등록상표) (피어스)/Laemmli 1:2
a. 5 x Laemmli 완충제 원액 (브로모페놀 블루가 없음) 10 mL 배치
2.5 mL 1.25 M 트리스(Tris)/HCl (pH 6.8)
4.5 mL 글리세롤
2.8 mL 베타-머캅토에탄올
1 g SDS
증류수로 10 mL가 되게 함
[1 M 트리스는 121.14 g에 상응하고, 1.25 M 트리스는 151.43 g에 상응함. 1000 mL은 151.43 g, 50 mL은 7.6 g; 진한 HCl로 pH 6.8로 조정함]
b. 2 x Laemmli 완충제: 1000 ㎕ 5 x Laemmli 완충제 + 1500 ㎕ 증류수
c. 5 mL 추출 완충제에 대해:
2.5 mL T-PER(등록상표) (피어스)
+ 2.5 ml 2 x Laemmli 완충제
+ ½ 완성형 미니 프로테아제 억제제 정제 (바이엘(Bayer))
분취액을 -20℃에서 동결시킴.
실시예 2: 대안적인 추출 완충제 EB2를 사용한 FFPE 조직으로부터의 단백질 추출
본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에서, DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨)를 사용하였다. DTT는 바람직하게는 예를 들어 바이오래드 사의 DC 단백질 분석 키트(등록상표) 또는 피어스 사의 마이크로 BCA 분석 키트(등록상표)를 사용한 단리된 단백질의 정량에 사용된다 (도 5).
SDS 농도와, 100℃ 및 80℃에서의 상응하는 인큐베이션 시간은 변화시키지 않았다. 본 실시양태의 이점은 분석을 방해하는 성분 - 여기서는 특정 환원제 - 없이 시판되는 단백질 정량 키트로 준비된 단백질 용해물의 농도를 직접적으로 측정할 수 있다는 점이다. 단백질 농도는 선형 영역에서 보다 잘 측정될 수 있으며, 적절할 경우, 단지 높은 단백질 함량 때문에 샘플을 희석해야 한다. 이러한 방식으로, 보다 더 정확한 측정 결과를 얻었으며, 따라서 각각의 양의 단백질은 하류의 적용에 사용될 수 있다.
1. 샘플 파라핀 블록으로부터 2 x 10 ㎛ 절편을 절단하고, 반응 용기에 옮겼다.
2. 절편을 탈파라핀화시켰다.
2.1. 10분 동안 크실렌 처리를 2회 반복하였다.
2.2. 10분 동안 100％ 에탄올 처리하였다.
2.3. 10분 동안 96％ 에탄올 처리하였다.
2.4. 10분 동안 70％ 에탄올 처리하였다.
3. 100 ㎕ 추출 완충제 (EB2)*를 첨가하였다.
4. 얼음 위에 놓고 볼텍싱하였다.
5. 용액을 피펫으로 주의깊게 수 회 뽑아내었다.
6. 얼음 위에 놓고, 볼텍싱하였다 (발포체가 많을 경우, 짧게 원심분리함)
7. 20분 동안 100℃에서 처리하였다 (수조).
8. 2시간 동안 80℃에서 처리하였다 (진탕기, 750 rpm).
9. 15분 동안 4℃에서, 12500 rpm으로 원심분리하였다.
10. 상청액을 새로운 1.5 mL 반응 용기에 넣어서 단백질 용해물을 준비하였다.
11. 시판되는 단백질 정량 키트에 의해 정량하였다.
대안적인 추출 완충제 2 (EB2)
90 mM 트리스/HCl (pH 6.8)
20％ 글리세롤
2％ SDS
1 mM DTT (1,4-디티오-DL-트레이톨)
분취액을 -20℃에서 동결시킴
Claims (21)
- 생물학적 샘플을 완충제(buffer) 중에서 먼저 95℃ 초과의 온도에서 가열하고, 그 후 60℃ 초과의 온도에서 추가로 인큐베이션하며, 상기 완충제는 계면활성제를 포함하되 단백질분해 활성 화합물은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 포르말린에 고정된 생물학적 샘플로부터 단백질을 추출하는 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적 샘플을 완충제 중에서 5 내지 40분 동안 95℃ 초과의 온도에서 가열하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 샘플을 20분 내지 16시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 방출되는 단백질이 무손상인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 계면활성제가 SDS, 나트륨 데옥시콜레이트, CHAPS, 트리톤(Triton) X100, 노니데트(Nonidet) P40 또는 트윈(Tween) 20인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 완충제가 환원제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 샘플이 파라핀 포매된 포르말린 고정된 샘플일 경우, 생물학적 샘플을 단백질 추출 전에 탈파라핀화시키는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 추출 후에 단백질을 추가로 분획화시키는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 추출된 단백질을 한 번 또는 몇 번의 방법 단계로 분획화시키는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 추출된 단백질을 후속해서 정량하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 단백질의 정량을 라우리(Lowry) 또는 BCA의 방법에 의해 수행하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 추출된 단백질을 단백질분해 효소로 처리하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 하나 이상의 생화학적 분석에 사용되는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 생화학적 분석이 단백질 어레이인 방법.
- 제13항에 있어서, 생화학적 분석이 하나 이상의 진단적 또는 임상적 관련 마커 단백질을 측정하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 2가지 이상의 생물학적 샘플로부터의 마커 단백질을 서로 비교하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 샘플이 조직 샘플인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질분해 활성 화합물이 프로테아제인 방법.
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