KR101273187B1 - 신경근 장애의 치료를 위한 폴리(에틸렌글리콜)(ｐｅｇ)-부착된 ｉｇｆ-ｉ 변이체의 용도 - Google Patents

신경근 장애의 치료를 위한 폴리(에틸렌글리콜)(ｐｅｇ)-부착된 ｉｇｆ-ｉ 변이체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경근 장애, 특히 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 치료, 예방 및/또는 진행 지연을 위한 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-부착된 IGF-I 변이체의 약학적 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신경근 장애, 특히 ALS의 치료, 예방 및/또는 진행 지연을 위한 약학 조성물의 제조를 위한 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 용도에 관한 것으로, 이때 상기 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 이것이 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)로부터 유래되고 아미노산 위치 27, 65 및 68에 있는 아미노산 중 1 또는 2개의 아미노산이 극성 아미노산이되 라이신이 아니도록 상기 아미노산 위치 27, 65 및 68에서 1 또는 2개의 아미노산 변경을 보유하고 PEG가 1개 이상의 라이신 잔기에 부착되어 있다.

Description

신경근 장애의 치료를 위한 폴리(에틸렌글리콜)(ＰＥＧ)-부착된 ＩＧＦ-Ｉ 변이체의 용도{USE OF PEGYLATED IGF-I VARIANTS FOR THE TREATMENT OF NEUROMUSCULAR DISORDERS}
본 발명은 신경근 장애, 구체적으로 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 치료, 예방 및/또는 진행 지연을 위한 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-부착된 IGF-I 변이체의 약학적 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신경근 장애, 구체적으로 ALS의 치료, 예방 및/또는 진행 지연을 위한 약학 조성물의 제조를 위한 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 용도에 관한 것으로, 이때 상기 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)로부터 유도되고 아미노산 위치 27, 65 및 68의 아미노산들 중 1개 또는 2개의 아미노산이 극성 아미노산이되 라이신이 아니도록 상기 아미노산 위치 27, 65 및 68에서 1개 또는 2개의 아미노산 변경을 보유하고, PEG는 하나 이상의 라이신 잔기에 부착되어 있다.
신경근 장애는 (후천성 또는 선천성) 신경병증, 근육 위축증, ALS 및 척추근 위축증(SMA)을 포함하는 병태 및 매우 희귀한 근육 장애를 포함한다. 신경근 장애는 수의근을 조절하는 신경에 영향을 미친다. 신경이 건강하지 않게 되거나 죽게 되는 경우, 신경계와 근육 사이의 소통이 단절된다. 그 결과, 근육은 약화되고 쇠약해진다. 이러한 약화는 연축, 경련, 통증, 동통, 관절 문제 및 움직임 문제를 야기할 수 있다. 종종, 상기 약화는 심장 기능 및 호흡 능력에도 영향을 미친다. 유년기부터 성년기까지 임의의 시간에 일어날 수 있는 진행성 근육 약화의 많은 원인이 존재한다.
근육 위축증(MD)은 신경근 장애의 하위군이다. MD는 선천성 근육 질환의 패밀리를 대표한다. 몇몇 유형의 MD는 소아에 영향을 미치고(예를 들어, 뒤시엔느(Duchenne) 위축증) 20 내지 30년 이내에 사망을 초래한다. 다른 유형의 MD는 성년기에 존재하고 보다 서서히 진행된다. (디스트로핀(dystrophin) 유전자 내의 돌연변이에 의해 야기되는) 뒤시엔느 위축증 및 10대 및 성년기 발병 미요시(Miyoshi) 위축증 또는 이의 변이체, (디스페를린(dysferlin) 유전자 내의 돌연변이에 의해 야기되는) 지대위축증 2B 또는 LGMD-2B를 포함하는 여러 위축증에 대한 유전자가 동정되었다. 이들은 근육 내의 관련 단백질의 발현을 방해하여 근육 기능장애를 야기하는 "기능 상실" 돌연변이이다. 천연 상태에서 자연적으로 발생되거나 관련 유전자의 불활성화 또는 결실에 의해 발생된 상기 돌연변이들에 대한 마우스 모델들이 존재한다. 이 모델들은 근육에서 상실 단백질을 대체하여 정상적인 근육 기능을 회복시키는 요법을 시험하는 데 유용하다.
신경근 장애는 중추신경계(CNS)의 운동 신경의 파괴 및 운동 신경 경로의 퇴행성 변화에 기인하는 일군의 신경 장애에 속하면서 운동 신경 외의 신경의 파괴에 의해 야기되는 다른 신경퇴행성 질환, 예컨대, 파킨슨병, 알쯔하이머병(AD), 올리브교소뇌위축(olivopontocerebellar atrophy) 등과 구별되는 운동 신경 질환(MND)도 포함한다. 국립 신경 질환 및 졸중 연구소(NINDS)는 신체의 상부 또는 하부에서 신경에 영향을 미치는 진행성 퇴행성 장애를 MND라고 지칭한다. NINDS에 따르면 몇몇 MND는 유전된다. 일반적으로, MND는 중년기에 발병한다. 증상은 삼키기 곤란함, 사지 약화, 불명료한 언어, 손상된 보행, 안면 약화 및 근육 경련을 포함할 수 있다. 이 질환의 후기에는 호흡이 영향을 받을 수 있다. 대부분의 MND의 원인은 알려져 있지 않으나 환경, 독성, 바이러스 또는 유전적 인자 모두가 원인으로 의심받는다. MND의 유형은 성인 척추근 위축증(SMA), 로우 게리그병(Lou Gehrig's Disease)로도 공지되어 있는 ALS, SMA 타입 1 또는 베르드니그-호프만(Werdnig-Hoffman)으로도 공지되어 있는 영아 진행성 척추근 위축증(SMA1), SMA 타입 2로도 공지되어 있는 중기 척추근 위축증(SMA2), SMA 타입 3 또는 쿠겔베르그-벨란더(Kugelberg-Welander)로도 공지되어 있는 청소년 척추근 위축증(SMA3), 케네디병 또는 X-결합된 척수 연수근 위축증(SBMA)으로도 공지되어 있는 SBMA를 포함한다. 운동 신경 질환은 운동 신경이 퇴행하여 사멸하는 질환이다. 상부 운동 신경 및 하부 운동 신경을 포함하는 운동 신경은 수의근에 영향을 미쳐 수의근이 수축되게 자극한다. 상부 운동 신경은 뇌 피질로부터 유래되고 섬유를 뇌간 및 척수를 통해 보내고 하부 운동 신경을 조절하는 데 관여한다. 하부 운동 신경은 뇌간 및 척수에 위치하고 섬유를 근육으로 보낸다. 하부 운동 신경 질환은 하부 운동 신경 퇴행을 수반하는 질환이다. 하부 운동 신경이 퇴행하는 경우, 상기 신경이 정상적으로 활성화시키는 근육 섬유가 분리되고 수축되지 않아 근육 약화 및 감소된 반사를 야기한다. 상기 두 유형의 신경 중 한 유형의 신경의 손실은 MND의 임상적 징후인 약화, 근육 위축증(쇠약) 및 통증 없는 약화를 초래한다.
ALS는 척수, 뇌간 및 뇌 피질에서 운동 신경의 선별적 및 진행적 손실을 특징으로 하는 치명적인 운동 신경 질환이다. ALS는 전형적으로 진행성 근육 약화 및 신경근 호흡 부전을 야기한다. ALS의 약 10%가 Cu/Zn 수퍼록사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)-1 효소(SOD1)를 코딩하는 유전자의 점 돌연변이와 관련되어 있다. ALS의 이 일차적 원인의 발견은 다양한 치료 가능성을 시험하기 위한 토대를 제공하였다. 신경 위축증, 축삭 퇴행 및 세포 사멸의 예방을 포함하는, 신경영양 인자(NTF)의 강력한 신경보호 활성은 1990년대 초 ALS의 치료에 대한 큰 희망을 제공하였다. 섬모 신경영양 인자(CNTF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF) 및 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I)은 ALS 환자에서 이미 평가되었다. ALS 환자에서 상기 인자들을 시험하는 원리는 발달 과정 동안 천연적으로 발생하는 세포 사멸 패러다임(paradigm), 외상성 신경 손상 또는 ALS와 유사한 동물 모델, 예컨대, pmn 또는 와블러(wobbler) 마우스에 대한 상기 신경영양 인자의 효과를 기초로 한 것이었다. IGF-I(Lai EC et al., Neurology 1997, 49: 1621-1630)을 제외하고, 이 재조합 단백질들의 전신 전달은 ALS 환자에서 임상적으로 유리한 효과를 유도하지 못하였다(Turner MR et al., Semin. Neurol. 2001; 21: 167-175). 바람직하지 않은 부작용 및 제한된 생체이용성은 상기 단백질들의 잠재적인 임상적 이점의 평가를 복잡하게 만들었다. 신경영양 인자들을 적용함에 있어서 실제적으로 곤란한 점은 상기 단백질들 모두가 비교적 짧은 반감기를 가진 반면 신경퇴행성 질환은 만성 질환이고 장기간의 치료를 필요로 한다는 점이다.
동시에, 상이한 ALS-결합된 SOD1 돌연변이를 과발현하는 형질전환 마우스의 여러 균주가 발생되었다(Newbery HJ et al., Trends Genet. 2001; 17: S2-S6). 상기 마우스는 ALS의 임상적 및 신경병리학적 특징의 대다수를 매우 흡사하게 나타냄으로써 신경영양 인자의 임상전 잠재력을 조사하는 데 있어서 보다 적절한 동물 모델을 제공하였다. 재조합 신경영양 단백질의 직접적인 투여는 실망스럽다. 운동 신경의 신경병리에 대한 유리한 효과는 미미하거나 전무하다(Azari MF et al., Brain Res. 2003; 982: 92-97; Feeney SJ et al., Cytokine 2003; 23: 108-118; Dreibelbis JE et al., Muscle Nerve 2002; 25: 122-123). 그러나, 신경영양 인자, 예컨대, 아교세포계-유래 신경영양 인자(GDNF), IGF-I 또는 카디오트로핀-1(CT-1)의 바이러스 벡터-매개 전달은 거동 개선 또는 신경병리학적 개선을 보였는데(Wang LJ et al., J. Neurosci. 2002; 22: 6920-6928; Bordet T et al., Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 1925-1933 and Kaspar BK et al., Science 2003, 301: 839-842), 이는 적절한 투여 섭생법을 이용하여 효능을 수득할 수 있음을 암시한다.
IGF-I은 인슐린과 구조적으로 관련된 순환하는 동화작용 호르몬이다. 순환계에서, IGF-I의 99% 이상은 IGF에 대한 고도 친화성을 나타내어 IGF-I 기능을 조절하는 IGF-I 결합 단백질(IGFBP)에 결합되어 있다. 상기 인자는 특정 단백질분해효소를 통해 단백질분해에 의해 IGFBP로부터 국소적으로 방출될 수 있다. IGF-I은 신체의 모든 세포에서 국소적으로 생성되지만, 혈청 IGF-I의 주요 공급원은 간이다(Sjogren, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96 (1999) 7088-7092; Yakar, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96 (1999) 7324-7329). IGF-I은 그의 내분비 기능 이외에 발달되고 있는 뇌 및 성숙한 뇌에서 주변분비 역할을 수행한다(Werther, G.A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778). 시험관내 연구는 IGF-I이 도파민성 신경(Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570), 희소돌기아교세포(McMorris, F. A., and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L., and McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390) 및 척추 운동 신경(Hughes, R.A., et al., J. Neurosci. Res. 36 (1993) 663-671; Neff, N.T., et al., J. Neurobiol. 24 (1993) 1578-1588; Li, L., et al., J. Neurobiol. 25 (1994) 759-766)을 비롯한, CNS 내의 여러 유형의 신경들에 대한 강력한 비-선별적 영양인자임을 보여준다. 혈관-뇌 장벽(BBB)을 통과하는 수용체-매개 수송을 통해 말초 IGF-I이 뇌 내로 들어가는 것은 입증된 바 있다(Rosenfeld, R.G. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987) 159-166; Duffy, K.R., et al., Metab. Clin. Exp. 37 (1988) 136-140; Pan, W. and Kastin, A.J.. Neuro endocrinology 72 (2000) 171-178). 주로 SOD1 형질전환 마우스에서 수득되는 임상전 데이터는 IGF-I이 경막내로 전달되거나 서방출 장치 또는 유전자 요법을 통해 전달된 경우 ALS-관련 파라미터에 대한 효능을 보임을 입증하는 강력한 증거를 제공한다(Kaspar et al., Science 301: 839, 2003; Boillee and Cleveland, Trends Neurosci 27:235, 2004; Dobrowolny et al., J Cell Biol. 168: 193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235: 61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82: 452, 2005). 이것은 인간에서 사용되기에 적합한 IGF-I 투여량의 비경구 적용에 대한 ALS 모델에서의 효능에 관한 공개된 데이터가 존재하지 않기 때문에 IGF-I의 일정한 전달이 요구됨을 암시한다.
미국 특허 제5,093,317호에는 콜린성 신경 세포의 생존이 IGF-I의 투여에 의해 상승됨이 기재되어 있다. 또한, IGF-I은 말초 신경 재생을 자극하고(Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398) 오르니틴 데카복실레이즈(ornithine decarboxylase) 활성을 상승시키는 것으로 공지되어 있다(미국 특허 제5,093,317호). 미국 특허 제5,861,373호 및 국제특허출원 공개 제WO 93/02695 A1호에는 활성 농도의 IGF-I 및/또는 이의 유사체를 환자의 CNS에서 증가시킴으로써 아교 세포 및/또는 비-콜린성 신경 세포에 주로 영향을 미치는 CNS의 손상 또는 질환을 치료하는 방법이 기재되어 있다. 국제특허출원 공개 제WO 02/32449 A1호는 치료 유효량의 IGF-I 또는 이의 생물 활성 변이체를 포함하는 약학 조성물을 포유동물의 비강에 투여함으로써 상기 포유동물의 CNS에서 허혈성 손상을 감소시키거나 예방하는 방법에 관한 것이다. IGF-I 또는 이의 변이체는 허혈과 관련된 허혈성 손상을 감소시키거나 예방하기에 효과적인 양으로 비강을 통해 흡수되어 포유동물의 CNS 내로 수송된다. 유럽 특허 제0 874 641 A1호는, AIDS-관련 치매, AD, 파킨슨병, 픽병, 헌팅톤병, 간성 뇌병증, 피질-기저 신경절 증후군, 진행성 치매, 경직성 마비를 동반하는 가족성 치매, 진행성 핵상마비, 다발성 경화증, 쉴더(Schilder)의 뇌 경화증 또는 급성 괴사 출혈성 뇌척수염으로 인한 CNS의 신경 손상을 치료하거나 예방하는 약제의 제조를 위한 IGF-I 또는 IGF-II의 용도로서, 상기 약제가 유효량의 상기 IGF를 BBB 또는 혈액-척수 장벽 외부에 비경구 투여하기 위한 형태인, 용도를 청구한다.
그러나, 임상에서 사용되기 위해서는, 외부 투여 후 말초에서의 IGF-I의 짧은 반감기가 분명한 단점이고 심각한 문제를 발생시키는 높은 투여 빈도를 필요로 한다. IGF-I의 급성 과다적재(overload)로 인한 부작용(IGF-I을 사용한 임상 시험에서 종종 관찰되는 저혈당증; NDA 보고 21-839(http://www.fda.gov/cder/foi/nda/2005/021839-S000-Increlex_Pharm.pdf)) 또한 참조함)은 허용되는 최대 투여량을 지속된 효능이 아직 달성되지 않은 수준까지 제한한다. 이 단점을 극복하고 보다 우수한 활성을 위한 보다 높은 투여량을 달성하기 위해, 흡수 속도가 보다 느리고 혈액 체류 시간이 보다 길고 안정하되 생체활성이 유지되는 변경된 IGF-I이 요구될 것이다. 상기 변경된 IGF-I이 그의 신경보호 작용을 여전히 발휘할 수 있게 하기 위해, BBB 수송이 완전히 작동될 것 또한 요구된다.
임상전 사용에 있어서, 혈액 중의 화합물 농도의 큰 변동 없이 일정한 공급을 위해 소형펌프 및 미세구와 같은 서방출 장치 내로 IGF-I을 캡슐화하여 전술된 문제점들 중 적어도 일부를 해결하기 위한 시도가 있었다(Carrascosa C et al., Biomaterials 25; 707-714; 국제특허출원 공개 제WO 03/077940 A1호). 그러나, 이 방법을 이용하는 경우 IGF-I의 피하 주사와 동일한 급성 부작용을 인간에서 발생시킬 혈중 IGF-I의 높은 초기 농도가 관찰되었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 비경구 주사된 특이적으로 PEG-부착된 IGF-I(PEG-IGF-I) 변이체가, 요구되는 약동학적 프로파일을 가짐을 발견하였다. 상기 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 PEG가 부착되지 않은 IGF-I보다 10배 더 높은 투여량 및/또는 혈장 농도를 초과하는 투여량 및/또는 혈장 농도까지 급성 저혈당 활성을 나타내지 않았다. PEG 부착이 IGF-I의 결합 및 수용체-매개 BBB 투과를 손상시킬 것이 명백히 예측되었다. 이하에 상세히 기재된 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 놀랍게도 하기 1) 내지 3)을 보이면서, PEG가 부착되지 않은 IGF-I을 사용할 때 요구되는 투여량보다 훨씬 더 낮은 투여량에서 신경근 장애의 동물, 즉 마우스 모델에서 신경보호 활성 및 기능적 활성을 나타낸다: 1) BBB 수송이 완전히 작동되고, 2) 상기 분자가 생체내에서 그의 생물학적 활성을 완전히 유지하고, 3) IGF-I에 비해 10배 더 높은 투여량을 초과하는 PEG-IGF-I 투여량에서만 저혈당증이 관찰되어 인간에서 보다 우수한 효능을 위한 훨씬 더 높은 PEG-IGF-I의 투여를 허용한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 이하에 기재된 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 약학적 유효량으로 신경 장애의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 신경 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이하에 기재된 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 약학적 유효량으로 MND, 특히 ALS의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 MND, 특히 ALS를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 실시양태에서, 본 발명은 이하에 기재된 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 신경근 장애, 바람직하게는 MND, 훨씬 더 바람직하게는 ALS의 치료, 예방 및/또는 진행 지연에 유용한 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 양태는 신경 장애, 바람직하게는 MND, 훨씬 더 바람직하게는 ALS의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 이하에 기재된 PEG-부착된 IGF-I의 용도에 관한 것이다.
도 1은 마우스에서 100 ㎍/㎏ 재조합 인간 IGF-I(rhIGF-I) 또는 PEG-IGF-I을 피하 주사한 후 혈청 검출을 보여준다. PEG-IGF-I 또는 rhIGF-I의 혈청 농도는 표시된 시점에서 ELISA 기법에 의해 검출되었다.
도 2는 마우스에서 100 ㎍/㎏ rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I을 피하 주사한 후 해마의 CA1 신경의 IGF-I 면역반응성을 보여준다. 표시된 시점에서, 뇌는 제거되고 hIGF-I에 대해 면역염색되었다. 해마의 CA1 영역으로부터 얻은 디지털 이미지는 신경 내의 염색 강도에 대해 분석되었다.
도 3은 비글 개에서 PEG-IGF-I(200 내지 5000 ㎍/㎏)을 피하 주사한 후 혈장 글루코스 농도를 보여준다. 글루코스 농도는 로슈 아쿠체크(Roche AkkuCheck) 장치를 이용하여 각 시점에서 혈적(blood drop)으로부터 평가되었다. 화살표는 5000 ㎍/㎏ 투여량에서 수컷 개에서 중증 저혈당증의 유의한 발생을 표시한다.
도 4는 rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I을 사용하여 치료한 지 5일 후 마우스의 일차 운동 신경의 시험관내 생존율을 보여준다. C57B1/6 마우스로부터 얻은 일차 운동 신경을 다양한 농도의 PEG-IGF-I 또는 rhIGF-I의 존재 또는 부재 하에 배양하고 시험관내에서 5일째 날에 상 대비 현미경으로 생존율을 평가하였다.
도 5는 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 2일마다(q2d) 피하 처리된 pmn 마우스의 움켜쥠 강도를 보여준다. 동물들은 앞다리의 근력에 대해 매주 시험되었고, 숫자는 시점마다 분석된 동물을 표시한다(**, p<0.01).
도 6은 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 2일마다 피하 처리된 pmn 마우스의 로타로드(rotarod) 성능을 보여준다. 동물들은 운동 조화에 대해 매주 시험되었고, 숫자는 시점마다 분석된 동물을 표시한다(*, p<0.05).
도 7은 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 2일마다 피하 처리된 pmn 마우스의 안면 핵에서의 운동 신경 생존율을 보여준다. 동물들은 생후 34일째 날에 희생되었고 조직학적 분석을 위해 조직을 처리하였다. 운동 신경 수의 입체학적 조사가 맹검으로 수행되었고, 값은 마우스 당 총 수를 표시한다(**, p<0.01).
도 8은 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 2일마다 피하 처리된 pmn 마우스의 허리 척수에서의 운동 신경 생존율을 보여준다. 동물들은 생후 34일째 날에 희생되었고 조직학적 분석을 위해 조직을 처리하였다. 운동 신경 수의 입체학적 조사가 맹검으로 수행되었고, 값은 마우스 당 총 수를 표시한다(**, p<0.001).
도 9는 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 2일마다 피하 처리된 pmn 마우스의 근위 횡격막 신경에서의 유수 축삭 수를 보여준다. 동물들은 생후 34일째 날에 희생되었고 조직학적 분석을 위해 조직을 처리하였다. 유수 축삭의 수의 입체학적 조사가 맹검으로 수행되었고, 값은 횡격막 신경 당 총 수를 표시한다(*, p<0.05).
도 10은 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 2일마다 피하 처리된 pmn 마우스의 원위 횡격막 신경에서의 유수 축삭 수를 보여준다. 동물들은 생후 34일째 날에 희생되었고 조직학적 분석을 위해 조직을 처리하였다. 유수 축삭의 수의 입체학적 조사가 맹검으로 수행되었고, 값은 횡격막 신경 당 총 수를 표시한다(**, p<0.01).
도 11은 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 3.5일마다 피하 처리된 SOD1(G93A) 마우스의 체중 분석을 보여준다. 체중은 주마다 평가되었고 100%로 설정된 최초 검사에서의 체중에 대해 표준화되었다(*, p<0.05).
도 12는 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 3.5일마다 피하 처리된 SOD1(G93A) 마우스의 질환 발병을 보여준다. 동물들은 주마다 조사되었고 질환 발병은 뒷다리 약화, 비정상적인 보행 및 도립된 와이어 메쉬를 잡기 어려움에 의해 정의된다. 카플란-메이에르(Kaplan-Meier) 도표는 생후 34주째부터 처리된 개개의 마우스의 질환 발병을 보여준다. 막대 그래프는 두 군에 대한 질환 발병의 평균 연령을 보여준다(p<0.05).
도 13은 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 3.5일마다 피하 처리된 SOD1(G93A) 마우스의 움켜쥠 강도를 보여준다. 동물들은 앞다리의 근력에 대해 주마다 시험되었다. 시간이 경과하는 동안 죽는 동물들의 LOCF(마지막 관측값 선행 대체법; last observation carried forward) 분석은 마지막으로 측정된 값을 추가 데이터에 포함시킴으로써 수행되었다(*, p<0.05; **, p<0.01).
도 14는 비히클 또는 150 ㎍/㎏의 PEG-IGF-I로 3.5일마다 피하 처리된 SOD1(G93A) 마우스의 로타로드 성능을 보여준다. 동물들은 운동 조화에 대해 주마다 시험되었다. 시간이 경과하는 동안 죽는 동물들의 LOCF 분석은 마지막으로 측정된 값을 추가 데이터에 포함시킴으로써 수행되었다(*, p<0.05; **, p<0.01).
도 15는 ALS 마우스 모델에서 입증된 신경근 단위와 관련된 PEG-IGF-I의 생체내 작용을 보여준다. PEG-IGF-I은 신경근 기능을 개선시킬 뿐만 아니라 뇌간 및 척수에서 운동 축삭 및 운동 신경을 보호하므로 신경근 접합의 유지를 담당하는 모든 부분에 대해 작용함이 암시된다.
달리 정의하지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이하에 기재된다.
정의
용어 "신경근 장애"는 근육의 기능을 (고유의 근육 병리를 통해) 직접적으로 또는 (신경 병리를 통해) 간접적으로 손상시키는 질환 및 병을 포괄한다. 신경근 장애의 예로는 하기 질환들이 있으나 이들로 한정되지 않는다: 운동 신경 질환, 예컨대, ALS(로우 게리그병으로도 공지되어 있음), 척추근 위축증 타입 1(SMA1, 베르드니그-호프만병), 척추근 위축증 타입 2(SMA2), 척추근 위축증 타입 3(SMA3, 쿠겔베르그-벨란더병) 및 척추 연수근 위축증 타입 3(SBMA, 케네디병 및 X-결합된 SBMA로도 공지됨); 근육 위축증, 예컨대, 뒤시엔느 근육 위축증(DMD, 가성 비대증으로도 공지되어 있음), 벡커(Becker) 근육 위축증(BMD), 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss) 근육 위축증(EDMD), 지대근 위축증(LGMD), 안면견갑상완근 위축증(FSH 또는 FSHD, 란도우지-데제린(Landouzy-Dejerine)으로도 공지되어 있음), 근긴장성 위축증(MMD, 스테이네르트병(Steinert Disease)으로도 공지되어 있음), 안구인두근 위축증(OPMD), 원위근 위축증(DD, 미요시병) 및 선천성 근육 위축증(CMD); 근육의 대사 질환, 예컨대, 인산화효소 결핍증(MPD 또는 PYGM, 맥아들병(McArdle Disease)으로도 공지되어 있음), 산 말테이즈(Maltase) 결핍증(AMD, 폼페병(Pompe Disease)으로도 공지되어 있음), 포스포프럭토카이네이즈 결핍증(타루이병(Tarui Disease)으로도 공지되어 있음), 탈분지(Debrancher) 효소 결핍증(DBD, 코리병(Cori Disease) 또는 포르베스병(Forbes Disease)으로도 공지되어 있음), 마이토콘드리아 근병증(MITO), 카르니틴(Carnitine) 결핍증(CD), 카르니틴 팔미틸 트랜스퍼레이즈(Carnitine Palmityl Transferase) 결핍증(CPT), 포스포글리세레이트 카이네이즈(Phosphoglycerate Kinase) 결핍증, 포스포글리세레이트 뮤테이즈(Phosphoglycerate Mutase) 결핍증, 락테이트 탈수소효소(Lactate Dehydrogenase) 결핍증, 미요아데닐레이트 데아미네이즈(Myoadenylate Deaminase) 결핍증, 팔미틸 트랜스퍼레이즈(Palmityl Transferase) 결핍증(CPT), 포스포글리세레이트 카이네이즈 결핍증, 포스포글리세레이트 뮤테이즈 결핍증, 락테이트 탈수소효소 결핍증 및 미요아데닐레이트 데아미네이즈 결핍증; 말초 신경 질환, 예컨대, 샤르코-마리-투쓰병(Charcot-Marie-Tooth Disease)(CMT, 유전성 운동 및 감각 신경병증(HMSN) 또는 종아리근 위축증(PMA)으로도 공지되어 있음), 프리에드레히 운동실조증(Friedreich's Ataxia; FA) 및 데제린-솟타스병(Dejerine-Sottas Disease)(DS); 염증성 근병증, 예컨대, 피부근육염(DM), 다발근육염(PM) 및 봉입체(inclusion body) 근육염(IBM); 신경근 접합의 질환, 예컨대, 중증근육무력증(MG), 램버트-이톤(Lambert-Eaton) 증후군(LES) 및 선천성 근육무력 증후군(CMS); 내분비 이상으로 인한 근병증, 예컨대, 갑상선기능항진 근병증(HYPTM) 및 갑상선기능저하 근병증(HYPOTM); 다른 근병증, 예컨대, 선천성 근긴장증(MC, 톰센병(Thomsen Disease) 및 벡커병(Becker Disease)으로도 공지됨), 선천성 이상근긴장증(PC), 중심핵 질환(CCD) 및 네말린(Nemaline) 근병증(NM); 및 근세관성 근병증/중심핵 근병증(MTM 또는 CNM)), 주기적 마비(PP, 2종의 유형: 저칼륨 마비 및 고칼륨 마비).
"MND"는 운동 기능을 가진 신경, 즉 운동 추진력을 전달하는 신경에 영향을 미치는 질환을 의미한다. 이러한 신경은 "운동 신경"으로도 지칭된다. 상기 신경은 골격근 섬유를 자극하는 알파 섬유를 발생시키는 전방 척수의 알파 신경; 외부융합 및 내부융합 근육 섬유를 자극하는 베타 섬유를 발생시키는 전방 척수의 베타 신경; 근육 방추의 내부융합 섬유를 자극하는 감마(근육방추) 섬유를 발생시키는 전방 척수의 감마 신경; 구심성 추진력의 기원이 되는 근육을 제외한 근육을 공급하는 이명 신경; 구심성 추진력의 기원이 되는 근육을 공급하는 동명 신경; 세포체(cell body)가 척수의 복측 회색질 기둥에 위치하고 골격근에서 종결되는 하부 말초 신경; 개재신경으로부터 추진력을 받는 말초 신경; 및 추진력을 운동 피질로부터 뇌 신경의 운동 핵 또는 척수의 복측 회색질 기둥으로 전달하는 뇌 피질 내의 상부 신경을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
운동 신경 장애의 비제한적 예로는 다양한 근위축증, 예컨대, 유전성 척추근 위축증을 포함하는 유전성 근위축증, 급성 영아 척추근 위축증, 예컨대, 베르드니그-호프만병, 소아 진행성 근육 위축증(예컨대, 근위 유형, 원위 유형 및 연수 유형), 성인 또는 성년 발병 척추근 위축증(예컨대, 근위 유형, 견갑비골 유형, 안면견갑상완 유형 및 원위 유형), ALS 및 원발성 측삭 경화증(PLS)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 용어는 운동 신경 손상도 포함한다.
로우 게리그병으로도 지칭되는 용어 "근위축성 측삭 경화증"(또는 "ALS")은 피질, 뇌간 및 척수의 운동 신경에 영향을 미치는 치명적인 질환이다(Hirano, (1996) Neurology, 47(4 Suppl. 2): S63-6). 이 질환의 병인은 공지되어 있지 않지만, ALS에서 신경 세포 사멸은 과도한 세포외 글루타메이트로 인한 신경 세포의 과다-흥분의 결과이다. 글루타메이트는 글루타민성 신경에 의해 방출되는 신경전달제이고 아교 세포 내로 흡수되어 글루타민 합성효소에 의해 글루타민으로 전환되고, 상기 글루타민은 상기 신경으로 다시 들어가 글루타미네이즈에 의해 가수분해되어 글루타메이트를 형성함으로써 신경전달제 풀(poll)을 보충한다. 정상적인 척수 및 뇌간에서, 세포외 글루타메이트의 농도는 세포외 체액 중에 낮은 마이크로몰 농도로 유지되는데, 이는 부분적으로 신경을 지지하는 기능을 수행하는 아교 세포가 흥분 아미노산 수송제 타입 2(EAAT2) 단백질을 사용하여 글루타메이트를 즉시 흡수하기 때문이다. ALS 환자에서 정상적인 EAAT2 단백질의 결핍은 상기 질환의 병리에 있어서 중요한 것으로서 확인되었다[예를 들어, 문헌(Meyer et al. (1998) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 65: 594-596; Aoki et al. (1998) Ann. Neural. 43: 645-653; Bristol et al. (1996) Ann Neural. 39: 676-679) 참조]. EAAT2의 감소된 농도에 대한 한 가지 이유는 EAAT2가 비정상적으로 스플라이싱되는 것이다(Lin et al. (1998) Neuron, 20: 589-602). 비정상적인 스플라이싱은 EAAT2 단백질의 C-말단 영역에 위치한 45 내지 107개 아미노산이 결실된 스플라이스 변이체를 생성한다(Meyer et al. (1998) Neurosci Lett. 241: 68-70). EAAT2의 결핍 또는 결함으로 인해, 세포외 글루타메이트는 축적되어 신경이 계속 연소되게 한다. 글루타메이트의 축적은 신경의 계속적인 연소가 초기 세포 사멸을 야기하기 때문에 신경 세포에 대한 독성 효과를 나타낸다. ALS의 병리에 대해서는 많은 것이 공지되어 있지만 산발적 형태의 발병기전 및 가족성 ALS에서의 돌연변이체 SOD 단백질의 병인 성질에 대해서는 공지되어 있는 바가 거의 없다(Bruijn, et al. (1996) Neuropathol. Appl. Neurobiol, 22: 373-87; Bruijn, et al. (1998) Science 281: 1851-54). 글루타메이트 독성, 저산소증, 산화 스트레스, 단백질 응집, 신경필라멘트 및 마이토콘드리아 기능장애를 포함하는 많은 모델이 추측된다[Cleveland, et al. (1995) Nature 378: 342-43; Cleveland, et al. Neurology, 47(4 Suppl. 2): S54-61, discussion S61-20996; Cleveland, (1999) Neuron, 24: 515-20; Cleveland, et al. (2001) Nat. Rev. Neurosci., 2: 806-19; Couillard-Despres, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 9626-30; Mitsumoto, (1997) Ann. Pharmacother., 31 : 779-81; Skene, et al. (2001) Nat. Genet. 28: 107-8; Williamson, et al (2000) Science, 288: 399].
현재, ALS에 대한 치유법은 없고 이 질환의 진행 예방 또는 회복에 효과적인 것으로 입증된 요법도 없다. 최근 여러 약물들이 식약청(FDA)에 의해 승인되었다. 현재까지, ALS를 치료하고자 하는 시도는 세포보호 효과를 가진 장쇄 지방 알코올을 사용한 신경 퇴행의 치료(미국 특허 제5,135,956호 참조); 피루브산염을 사용한 신경 퇴행의 치료(미국 특허 제5,395,822호 참조); 및 글루타민 합성효소를 사용하여 글루타메이트 캐스케이드(cascade)를 차단함에 의한 신경 퇴행의 치료(미국 특허 제5,906,976호 참조)를 포함한다. 예를 들어, 글루타메이트 방출 억제제는 릴루졸(Riluzole)은 ALS의 치료용으로 미국에서 승인받았고 적어도 일부 ALS 환자의 생명을 3개월까지 연장시키는 듯하다. 그러나, 일부 보고에 따르면, 릴루졸 요법은 생존 기간을 근소하게 연장시키지만 ALS 환자에서 근력의 어떠한 개선도 제공하지 못한다. 따라서, 릴루졸의 효과는 릴루졸 요법이 ALS 환자에 대한 삶의 질을 개선시키지 못한다는 점에서 제한된다(Borras-Blasco et al., (1998) Rev. Neurol, 27: 1021-1027).
이하에서 사용되는 바와 같이, "분자량"은 PEG의 평균 분자량을 의미한다.
본 발명에 따른 "PEG 또는 PEG 기"는 필수 부분으로서 폴리(에틸렌 글리콜)을 가진 잔기를 의미한다. 이러한 PEG는 결합 반응에 필요한 화학적 기; 상기 분자의 화학적 합성으로부터 발생된 화학적 기; 또는 상기 분자의 일부를 상기 분자 서로로부터 최적의 거리에 위치시키기 위한 스페이서(spacer)인 화학적 기를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 이러한 PEG는 서로 연결되어 있는 하나 이상의 PEG 측쇄로 구성될 수 있다. 하나보다 많은 수의 PEG 쇄를 가진 PEG 기는 다중암(multiarm)을 가진 PEG 또는 분지쇄 PEG로 지칭된다. 분지쇄 PEG는 예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드를 다양한 폴리올(글리세롤, 펜타에리쓰리올 및 소르비톨을 포함함)에 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 4개의 암을 가진 분지쇄 PEG는 펜타에리쓰리올 및 에틸렌 옥사이드로부터 제조될 수 있다. 분지쇄 PEG는 통상적으로 2 내지 8개의 암을 가지며 예를 들어, 유럽 특허 제0 473 084호 및 미국 특허 제5,932,462호에 기재되어 있다. 라이신의 일차 아미노 기를 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄를 가진 PEG(PEG2)가 특히 바람직하다(Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69).
본원에서 사용된 "실질적으로 균질한"은 생성된, 함유된 또는 사용된 유일한 PEG-부착된 IGF-I 변이체 분자가 1 또는 2개의 PEG 기가 부착된 IGF-I 변이체 분자임을 의미한다. 제제는 소량의 미반응된(즉, PEG 기가 결여된) 단백질을 함유할 수 있다. 펩티드 맵핑(mapping) 및 N-말단 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인되는 바와 같이, 하기 실시예는 90% 이상의 PEG-IGF-I 변이체 접합체 및 5% 이하의 미반응된 단백질을 함유하는 제제를 제공한다. PEG-부착된 IGF-I 변이체의 이러한 균질한 제제의 단리 및 정제는 통상적인 정제 방법, 바람직하게는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 "1개의 PEG에 부착되어 있는"은 IGF-I 변이체가 IGF-I 변이체 분자 당 1개의 라이신에서만 PEG에 부착되어 있음으로써 1개의 PEG 기만이 이 부위에서 공유결합되어 있음을 의미한다. 1개의 PEG에 부착되어 있는 순수한 IGF-I 변이체(N-말단 PEG 부착을 갖지 않음)는 제제의 80% 이상, 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 제제의 92% 이상이 1개의 PEG에 부착되어 있는 IGF-I 변이체이고 나머지가 예를 들어, 미반응된(PEG에 부착되어 있지 않은) IGF-I 및/또는 N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체이다. 따라서, 본 발명에 따른, 1개의 PEG에 부착되어 있는 IGF-I 변이체 제제는 예를 들어, 약학적 사용에 있어서 균질한 제제의 이점을 나타내기에 충분할 정도로 균질하다. 이것은 2개의 PEG에 부착되어 있는 종에도 적용된다.
본원에서 사용된 "PEG-부착된 IGF-I 변이체" 또는 "아미노-반응성 PEG 부착"은 IGF-I 변이체가 IGF-I 변이체 분자의 1 또는 2개 라이신에의 아미노-반응성 커플링에 의해 1 또는 2개의 폴리(에틸렌 글리콜) 기에 공유결합되어 있음을 의미한다. PEG 기는 라이신 측쇄의 일차[엡실론]-아미노 기인 IGF-I 변이체 분자의 부위에 결합되어 있다. PEG 부착이 N-말단[알파]-아미노 기 상에서 추가로 일어날 가능성도 있다. 사용되는 합성 방법 및 변이체로 인해, PEG-부착된 IGF-I 변이체는 N-말단 PEG 부착의 존재 또는 부재 하에 K65, K68 및/또는 K27에서 PEG에 부착되어 PEG 부착 부위가 상이한 분자에서 상이할 수 있거나 분자 당 폴리(에틸렌 글리콜) 측쇄의 양 및/또는 분자 내의 PEG 부착 부위 면에서 실질적으로 균질할 수 있는 IGF-I 변이체들의 혼합물로 구성될 수 있다. 바람직하게는, IGF-I 변이체는 1개의 PEG에 부착되어 있고/있거나 2개의 PEG에 부착되어 있고, 특히 N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체들로부터 정제된다.
본원에서 사용된 "PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)"은 시판되는 수용성 중합체 또는 당업계에 잘 공지되어 있는 방법에 따른 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 수용성 중합체를 의미한다(Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18). 용어 "PEG"는 임의의 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 포괄하도록 넓게 사용되고, 이때 에틸렌 글리콜(EG) 단위체의 수는 460 이상, 바람직하게는 460 내지 2300, 특히 바람직하게는 460 내지 1840이다(230개의 EG 단위체는 약 10 kDa의 분자량을 의미함). EG 단위체 수의 상한은 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 가용성에 의해서만 제한된다. 통상적으로, 2300개의 단위체를 함유하는 PEG보다 더 큰 PEG는 사용되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 PEG는 한 말단 상에서 하이드록시 또는 메톡시로 종결되고(메톡시 PEG, mPEG) 다른 말단 상에서 에테르 산소 결합을 통해 연결기(linker) 부분에 공유결합된다. 상기 중합체는 직쇄 또는 분지쇄이다. 분지쇄 PEG는 예를 들어, 문헌(Veronese, F. M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207)에 기재되어 있다.
본 발명은 한 양태는 약학적 유효량의 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 신경근 장애, 바람직하게는 운동 신경 질환, 가장 바람직하게는 ALS의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 신경근 장애, 바람직하게는 운동 신경 질환, 가장 바람직하게는 ALS를 치료하는 방법에 관한 것이다. 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 치료될 질환은 수퍼록사이드 디스뮤테이즈 1의 돌연변이를 초래하는 유전적 결함에 의해 야기되는 ALS이다.
이 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 27, 65 및 68에 존재하는 1 또는 2개의 아미노산이 극성 아미노산이되 라이신이 아니도록 상기 아미노산 위치 27, 65 및 68에서 1 또는 2개의 아미노산 변경을 보유하는 재조합 인간 IGF-I 뮤테인(mutein)의 라이신 잔기에 PEG가 부착되어 있음을 특징으로 한다.
본원에서 사용된 "극성 아미노산"은 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S) 및 쓰레오닌(T)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 지칭한다. 라이신 또한 극성 아미노산이지만 배제되는데, 이는 라이신이 본 발명에 따라 치환되기 때문이다. 바람직하게는 극성 아미노산으로서 아르기닌이 사용된다.
야생형 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 하기 아미노산 변경을 특징으로 하는 재조합 인간 IGF-I 뮤테인의 PEG-부착된 형태가 바람직하다:
(a) K65R 및 K68R(서열번호 2),
(b) K27R 및 K68R(서열번호 3), 또는
(c) K27R 및 K65R(서열번호 4).
K68에서 1개의 PEG에 부착되어 있음을 특징으로 하는, 아미노산 변경 K27R 및 K65R을 가진 재조합 인간 IGF-I 뮤테인(서열번호 4)의 PEG-부착된 형태가 특히 바람직하다.
상기 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 포함하는 조성물 또한 바람직하고, 이때 상기 IGF-I 변이체들은 일차 아미노산 서열에서 동일하고 이들이 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 27, 65 및 68에 존재하는 1 또는 2개의 아미노산이 극성 아미노산이되 라이신이 아니도록 상기 아미노산 위치 27, 65 및 68에서 1 또는 2개의 아미노산 변경을 보유한다는 점에서도 동일하다. 바람직하게는, 분자 비율은 9:1 내지 1:9(비율은 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체/N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 의미함)이다. 분자 비율이 1:1 이상(N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 1개 부분 당 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체의 1개 이상의 부분), 바람직하게는 6:4 이상(N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 4개 부분 당 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체의 6개 이상의 부분)이다. 바람직하게는, 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체 둘다 1개의 PEG에 부착되어 있다. 바람직하게는, 상기 조성물에서, 변이체는 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG-부착된 IGF-I 변이체 둘다에서 동일하다. IGF-I 변이체는 바람직하게는 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 하기 아미노산 변경을 가진 IGF-I 뮤테인들로 구성된 군으로부터 선택된다:
(a) K65R 및 K68R(서열번호 2),
(b) K27R 및 K68R(서열번호 3), 또는
(c) K27R 및 K65R(서열번호 4).
서열번호 2 내지 4에 따른 재조합 인간 IGF-I 뮤테인의 바람직한 PEG-부착된 형태는 본원에 참고로 완전히 도입되는 국제특허출원 공개 제WO 2008/025528 A1호에 기재된 또 다른 극성 아미노산으로 독립적으로 치환된 라이신 27, 65 및/또는 68로 구성된 군으로부터 선택된 1 또는 2개의 아미노산을 포함하는 라이신-PEG-부착된 IGF-I 또는 라이신-PEG-부착된 IGF-I 변이체의 제조 방법에 따를 경우 수득될 수 있다. 국제특허출원 공개 제WO 2008/025528 A1호에 기재된 방법은 N-말단 PEG 부착을 보유하지 않는 서열번호 2 내지 4에 따른 재조합 인간 IGF-I 뮤테인의 제조를 허용한다.
또한, PEG-부착된 IGF-I 변이체는 N-말단에서 3개 이하(바람직하게는 3개)의 아미노산이 절단되어 있는 변이체인 것이 바람직하다. 각각의 야생형 돌연변이체는 데스(1-3)-IGF-I로 명명되고 N-말단으로부터 아미노산 잔기 글리신, 프롤린 및 글루타메이트를 결여하고 있다(Kummer, A., et al., Int. J. Exp. Diabesity Res. 4 (2003) 45-57).
바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜) 기의 총 분자량은 20 kDa 이상, 더 바람직하게는 약 20 내지 100 kDa, 특히 바람직하게는 20 내지 80 kDa이다. 폴리(에틸렌 글리콜) 기는 직쇄 또는 분지쇄이다.
본원에서 사용된 아미노-반응성 PEG 부착은 반응성(활성화된) 폴리(에틸렌 글리콜), 바람직하게는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)의 N-하이드록시석신이미딜 에스터를 사용하여 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄를 IGF-I 변이체의 일차 라이신 아미노 기에 무작위적으로 부착시키는 방법을 지칭한다. 이 커플링 반응은 폴리(에틸렌 글리콜)을 IGF-I의 라이신 잔기의 반응성 일차[엡실론]-아미노 기에 부착시키고 경우에 따라 IGF-I의 N-말단 아미노산의 [알파]-아미노 기에 부착시킨다. 이러한 PEG와 단백질의 아미노 기 접합은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 방법의 검토는 문헌(Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417)에 의해 제공된다. 상기 문헌에 따르면, PEG와 단백질의 일차 아미노 기의 접합은 상기 일차 아미노 기의 알킬화를 수행하는 활성화된 PEG를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 반응의 경우, 활성화된 알킬화 PEG, 예를 들어, PEG 알데하이드, PEG-트레실 클로라이드 또는 PEG 에폭사이드가 사용될 수 있다. 다른 유용한 시약은 아실화 PEG, 예컨대, 카복실화된 PEG의 하이드록시석신이미딜 에스터 또는 말단 하이드록시 기가 클로로포르메이트 또는 카보닐이미다졸에 의해 활성화되는 PEG이다. 다른 유용한 PEG 시약은 아미노산 암을 가진 PEG이다. 이러한 시약들은 소위 분지쇄 PEG를 함유함으로써, 2개 이상의 동일하거나 상이한 PEG 분자가 펩티드 스페이서(바람직하게는 라이신)에 의해 서로 연결되고 예를 들어, 라이신 스페이서의 활성화된 카복실레이트로서 IGF-I 변이체에 결합된다. 단일-N-말단 커플링은 문헌(Kinstler, O., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 477-485)에도 기재되어 있다.
유용한 PEG 시약은 예를 들어, 넥타 쎄라페틱스 인코포레이티드(Nektar Therapeutics Inc.)로부터 입수가능하다.
실제 필요에 따라 PEG에 대한 임의의 분자량, 예를 들어, 약 20 내지 100 kDa(n은 460 내지 2300임)이 사용될 수 있다. PEG에서 반복 단위체의 수 "n"은 달톤으로 기재된 분자량에 대한 근사치이다. 예를 들어, 2개의 PEG 분자가 연결기에 부착되고, 이때 PEG 분자 각각의 분자량이 10 kDa으로 동일한 경우(n은 각각 약 230임), 연결기 상의 PEG의 총 분자량은 약 20 kDa이다. 연결기에 부착된 PEG의 분자량은 상이할 수도 있는데, 예를 들어, 연결기 상의 2개의 분자들 중 1개의 PEG 분자는 5 kDa이고 다른 1개의 PEG 분자는 15 kDa일 수 있다. 분자량은 항상 평균 분자량을 의미한다.
아미노-반응성 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 제조에 적합한 방법 및 바람직한 시약은 국제특허출원 공개 제WO 2006/066891호에 기재되어 있다. 예를 들어, 해당 방법이 전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 생성하는 한, 절차에 있어서 문헌(Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417)에 기재된 방법에 의거한 변경을 가할 수 있다. 본 발명에 따른 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 제조에 특히 바람직한 방법은 본원에 참고로 완전히 도입되는 국제특허출원 공개 제WO 2008/025528 A1호에 기재되어 있다.
표적 단백질에서 3개 이하의 잠재적 활성 일차 아미노기(2개 이하의 라이신 및 1개의 말단 아미노산)의 발생은 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄의 부착점에서 상이한 일련의 PEG-부착된 IGF-I 변이체 이성질체들을 발생시킨다.
PEG-부착된 IGF-I 변이체는 이 변이체에 무작위적으로 부착된 1 또는 2개의 직쇄 또는 분지쇄 PEG 기를 함유함으로써, 상기 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 모든 PEG 기들의 총 분자량은 바람직하게는 약 20 내지 80 kDa이다. 이 범위의 분자량으로부터의 작은 편차가 있을 수 있다. 그러나, 감소된 IGF-I 수용체 활성화 및 BBB 수송으로 인해 분자량이 증가할수록 활성이 감소될 것으로 예측된다. 따라서, 20 내지 100 kDa의 PEG 분자량이 MND, 특히 ALS의 효과적인 치료에 있어서 유용한, PEG와 IGF-I 변이체의 접합체에 대한 최적화된 범위로서 이해되어야 한다.
약학 제제
전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 낮은 투여 간격, 즉 연장된 투여 간격과 함께 신체 전체에 걸쳐 IGF-I 수용체에 대한 지속된 접근을 가능하게 하는 순환계에서의 개선된 안정성을 특징으로 한다.
PEG-부착된 IGF-I 변이체는 당업자에게 공지된, 약학 조성물의 제조 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물의 제조를 위해, 본 발명의 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 바람직하게는 약학 조성물의 원하는 성분들을 함유하는 수용액에 대한 투석을 통해 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물 형태로 조합된다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 에를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Oslo et al. (e.g. pp. 1435-1712))에 기재되어 있다. 전형적인 조성물은 유효량, 예를 들어, 약 0.1 내지 100 mg/㎖의 본 발명에 다른 물질 및 적정량의 담체를 함유한다. 상기 조성물은 비경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 바람직하게는 복강내, 피하, 정맥내 또는 비강내 경로를 통해 투여된다.
본 발명에 따른 약학 제형은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 통상적으로, PEG-부착된 IGF-I 변이체의 용액을 약학 조성물에서 사용될 완충제에 대해 투석하고, 원하는 최종 단백질 농도를 농축 또는 희석으로 조절한다.
이러한 약학 조성물은 주사 또는 관주, 바람직하게는, 복강내, 피하, 정맥내 또는 비강내 경로를 통한 투여를 위해 사용될 수 있고 약학적으로 허용가능한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 유효량의 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 함유한다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 성분(예를 들어, 아르기닌, 아세테이트, 포스페이트)의 희석제, pH 및 이온 강도 조절제, 첨가제, 예컨대, 세제 및 가용화제(예를 들어, 트윈(TM) 80/폴리소르베이트, 플루로닉(TM) F68), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타비스설파이트), 방부제(티머솔(TM), 벤질 알코올) 및 벌킹제(예를 들어, 사카로스, 만니톨)(물질을 중합체 화합물, 예컨대, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립자 제제 또는 리포좀 내로 도입시킴)를 포함한다. 상기 조성물은 PEG-부착된 IGF-I 변이체의 방출 및 제거의 물리적 상태 안정성 속도에 영향을 미칠 수 있다.
투여량 및 약물 농도
전형적으로, 표준 치료 섭생법에서, 환자는 1주 내지 약 3개월에 이르는 일정한 기간 또는 심지어 이보다 긴 기간에 걸쳐 주 당 0.001 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 8 mg/kg의 PEG-부착된 IGF-I 변이체로 치료받는다. 약물은 ㎖ 당 전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체 0.1 내지 100 mg을 함유하는 약학 제제의 주 당 1회 피하, 정맥내 또는 복강내 볼루스 주사 또는 관주로서 투여된다. 이 치료는 임의의 표준 치료 전, 표준 치료 도중 또는 표준 치료 후 PEG-부착된 IGF-I을 투여함으로써 임의의 표준(예를 들어, 화학요법) 치료와 병행될 수 있다. 이것은 표준 치료만 수행한 경우에 비해 개선된 결과를 제공한다.
전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 성공적인 치료를 위해 주 당 단지 1 또는 2회 투여될 수 있음이 발견되었다. 따라서, 신경근 장애, 바람직하게는 MND, 훨씬 더 바람직하게는 ALS의 치료 방법은 3 내지 8일, 바람직하게는 7일 당 0.001 내지 3 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 3 mg/kg의 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 1회 투여분으로 하여 유효량의 전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 상기 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함해야 한다. 1개의 PEG에 부착되어 있는 IGF-I 변이체를 PEG-부착된 IGF-I 변이체로서 사용하는 것이 바람직하다.
전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체는, 신경근 장애, 바람직하게는 MND, 훨씬 더 바람직하게는 ALS의 치료용 약제로서, 6 내지 8일, 바람직하게는 7일 당 0.001 내지 3 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 3 mg/kg의 PEG-부착된 IGF-I 변이체를 1 또는 2회 투여분으로 하여 상기 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량으로 투여되는 약제의 제조를 위해 사용될 수 있다. 1개의 PEG에 부착되어 있는 IGF-I 변이체를 PEG-부착된 IGF-I 변이체로서 사용하는 것이 바람직하다.
전술된 PEG-부착된 IGF-I 변이체는 신경근 장애, 바람직하게는 MND, 훨씬 더 바람직하게는 ALS의 치료를 위한 제2 약리 활성 화합물과 병용되되 별도로 사용되거나, 순차적으로 사용되거나 또는 조합물 형태로 동시에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조합물의 제2 약리 활성 화합물은 글루타메이트 방출에 대한 억제 효과, 전압-의존적 나트륨 채널의 불활성화 효과, 또는 전달제(transmitter)와 흥분 아미노산 수용체의 결합 다음에 일어나는 세포내 사건을 방해하는 능력을 가진 1종 이상의 신경보호제이다.
제2 약리 활성 화합물은 바람직하게는 릴루졸이다. 릴루졸은 손상된 뉴론과 관련된 TTX-S 나트륨 채널을 차단한다(Song JH, Huang CS, Nagata K, Yeh JZ, Narahashi T. Differential action of riluzole on tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin-resistant sodium channels J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997; 282: 707-14). 이것은 칼슘 이온의 유입을 감소시키고 글루타메이트 수용체의 자극을 간접적으로 방해한다. 운동 신경에 대한 신경전달제 글루타메이트의 효과는 직접적인 글루타메이트 수용체 차단과 함께 감소된다.
본원에서 사용된 용어 "릴루졸"은 2-아미노-6-(트라이플루오로메톡시)벤조티아졸, 6-(트라이플루오로메톡시)벤조티아졸-2-아민 또는 CAS-1744-22-5를 지칭한다. 이 실시양태의 보다 넓은 의미에서, 용어 "릴루졸"은 글루타메이트 방출에 대한 억제 효과, 전압-의존적 나트륨 채널의 불활성화 및 전달제와 흥분 아미노산 수용체의 결합 다음에 일어나는 세포내 사건을 방해하는 능력으로 구성된 군으로부터 선택된, 릴루졸에서 관찰된 1종 이상의 약리 활성을 나타내는 활성 성분도 포함한다. ALS에서 릴루졸의 사용은 미국 특허 제5,527,814호에 기재되어 있고, 상기 화합물 및 이의 제조는 유럽 특허 제050 551호에 개시되어 있다. 다른 신경보호 화합물은 예를 들어, 문헌(Yagupolskii et al., Zhurnal Obschei Khimii 33 (7), 2301-7 (1963))에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
하기 실시예, 참고문헌 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위한 목적으로 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 기재된 절차에 대한 변경을 가할 수 있음을 이해해야 한다.
서열목록
서열번호 1
야생형 인간 IGF-I의 아미노산 서열(스위스프로트(SwissProt) P01343에 따른 IGF-I 전구체 단백질의 아미노산 1 내지 70)
서열번호 2
아미노산 변경 K65R 및 K68R을 보유하는 인간 IGF-I 뮤테인의 아미노산 서열
서열번호 3
아미노산 변경 K27R 및 K68R을 보유하는 인간 IGF-I 뮤테인의 아미노산 서열
서열번호 4
아미노산 변경 K27R 및 K65R을 보유하는 인간 IGF-I 뮤테인의 아미노산 서열
[실시예]
방법
마우스 배아 운동 신경 배양
12.5일령의 마우스의 배아로부터 수득된 척추 운동 신경의 배양물은 단일클론 래트 항-p75 항체(케미콘(Chemicon); 독일 호프하임 소재)를 사용하는 패닝(panning) 기법으로 제조하였다. 개개의 허리 척수의 복외측 부분을 절개하여 10 μM 2-머캡토에탄올이 함유된 행크의 균형잡힌 염 용액(HBSS)으로 옮겼다. 트립신(0.05%, 10분)으로 처리한 후, 단일 세포 현탁액을 분쇄를 이용하여 생성하였다. 상기 세포를 래트 항-p75 코팅된 배양 접시(그레이너(Greiner); 독일 뉘르팅겐 소재) 상에 플레이팅하고 실온에서 30분 동안 방치하였다. 이어서, 개개의 웰을 HBSS로 3회 세척한 후, 탈극화 식염수(0.8% NaCl, 35 mM KCl 및 1 μM 2-머캡토에탄올)를 사용하여 부착 세포를 상기 플레이트로부터 단리하였다. 세포를 문헌(Miller, T. M. et al., J. Biol. Chem. 272, 9847-9853, 1997)에 기재된 바와 같이 폴리-오르니틴 및 라미닌으로 미리코팅된 4-웰 배양 접시(그레이너)에 3000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를, 5% CO2 대기 하에 37℃에서 B27 보충제, 10% 말 혈청, 500 μM 글루타맥스 및 500 ㎍/㎖ 아포트랜스페린이 함유된 신경기저 배지(라이프 테크놀리지스(Life Technologies); 독일 칼스루헤 소재) 중에서 생장시켰다. 먼저, 배지의 50%를 1일째 날에 교체한 후, 2일마다 교체하였다. 플레이팅된 세포의 초기 카운팅은 4시간 후 모든 세포가 배양 접시에 부착되었을 때 수행하였다. 이어서, 밝은 상으로 보이는 세포를 5일째 날에 추가로 카운팅하였다. 10개 필드(1.16 ㎟/필드)를 각각의 시점에서 각각의 웰에서 카운팅하였다.
혈청 rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I 농도 및 CA1 신경에서의 신경내 IGF-I 염색
혈청 rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I 농도를 평가하기 위해, 100 ㎍/kg rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I의 일회 피하 주사 후 C57B1/6 마우스로부터 혈액 샘플을 다양한 시점에서 채취하였다(시점 당 n=4 마우스). 혈청을 준비하고 ELISA 어세이로 처리하였다. rhIGF-I의 검출을 위해, 시판되는 rhIGF-I 어세이(DSL)를 이용하였다. PEG-IGF-I의 검출을 위해, 스트렙타비딘-코팅된 어세이 마이크로플레이트를 바이오틴-부착된 항-PEG(IgM) 포획 항체로 코팅하였다. 혈청 샘플을 디곡시겐(Dig)-부착된 IGFBP-4와 함께 15시간 동안 항온처리하여 내재 IGFBP와 결합된 임의의 IGF-I을 IGFBP-4로 교체하였다. 세척 후, 플레이트를 항-Dig-POD(Fab)와 함께 항온처리하고 ABTS 색채 반응으로 검출하였다. 흡광도 신호를 405 및 490 nm에서 스펙트라맥스 M2e 판독기로 정량하였다.
100 ㎍/kg rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I의 일회 피하 주사 후 다양한 시점에서 C57B1/6 마우스를 이소플루란 마취 하에 마취시키고 뇌를 제거하였다.
뇌반구를 드라이 아이스 중에서 급속-동결시키고 파라포름알데하이드(포스페이트-완충 식염수, 즉 PBS 중의 4%) 중에서 후고정(postfixing)하였다. 이어서, 40 ㎛의 시상 슬라이스를 진동절단기(제이스(Zeiss))로 절단하였다. 면역반응성의 반-정량적 분석을 위해, 24개의 슬라이스를 측면 가장자리로부터 2 mm 떨어진 위치부터 절개하였다. 슬라이스의 1/4, 즉 마우스 당 총 6개의 슬라이스를 카운팅을 위해 사용하였다. 슬라이스를 염소-항-hIGF-I 항체(R&D 시스템스)로 면역염색하고 핵 안료로 대비염색하였다. 이차 검출은 당나귀-항-염소-Cy3(잭슨)으로 표지함으로써 수행하였다. 픽셀플라이(PixelFly) 카메라(글루가머(Klughammer))를 이용하여 동일한 강도에서 CA1 신경의 디지털 사진을 완전히 맹검으로 평가하고, 이미지프로(ImagePro) 4.5 소프트웨어(미디아 사이버넥틱스(Media Cybernetics))를 이용하여 반-자동적으로 수득한 CA1 세포 층을 가로지른 염색 강도를 평가하였다. 마우스 당 6개의 슬라이스로부터 얻은 강도 값의 평균을 산출하였다.
혈당의 평가
비글(Beagle) 개를 PEG-IGF-I(200 내지 5000 ㎍/kg 피하 주사)로 처리하고, 6일(144시간) 이하의 다양한 시간 경과 후 혈액 샘플을 채취하였다. 혈당은 악쿠체크 장치(로슈)를 이용하여 혈적으로부터 평가하였다.
기능 평가
마우스를 정기적으로 모니터링하여, 상기 마우스가 뒷다리 약화, 비정상적인 보행 및 도립된 와이어 메쉬를 잡기 어려움을 보이는 경우 정의되는 질환 발병을 평가하였다. SOD1(G93A) 형질전환 마우스에서 질환의 발병은 변동가능하지만(Gurney et al., Science 264 (5166): 1772-1775, 1994), 출생 후 3주째 동안 pmn 마우스에서 일어난다(Schmalbruch et al., J Neuropathol Exp Neural 50(3): 192-204, 1991). 진행되는 약화를 평가하기 위해, 돌연변이체 마우스를 생후 24일째 날(pmn 돌연변이체 마우스) 또는 생후 35주째 날(SOD G93A 돌연변이체 마우스)부터 주마다 기능적 운동 시험으로 시험하였다. 움켜쥠 강도를 측정하는 전기 계측기(콜럼버스 인스트루먼츠(Columbus Instruments), 미국 오하이오주 콜럼버스 소재) 상에서의 5회 시도의 평균을 산출하여 앞다리의 움켜쥠 강도(뉴턴으로 표시됨)를 기록하였다. 추가로, 막대가 4 내지 40 rpm(분 당 회전수)의 선형 가속화를 겪는 동안 로타로드 장치(Hugo Basile Bio. Res. App.) 상에서 균형을 유지하는 능력에 대해 마우스를 시험하였다. 각각의 마우스가 상기 막대 상에서 유지하는 시간(초)(잠복기)을 시험 기간 당 3회 기록하였다. 생후 24일째 날(pmn 마우스) 또는 생후 34주째 날(SOD1 마우스)에서의 평균 값은 100%로서 간주되었고 후속 분석으로부터 얻은 결과는 이 값에 대해 표준화되었다.
조직학적 분석
PEG-IGF-I 및 비히클(즉, PEG-IGF-I을 함유하지 않은 각각의 완충제)로 처리된 pmn 마우스의 안면 핵 및 허리 척수에서 운동 신경 세포체의 수를 생후 34일째 날에 측정하였다. 또한, 횡격막 신경의 근위 부분 및 원위 부분에서 유수 축삭의 수를 이 마우스 돌연변이체들에서 카운팅하였다. 0.1 M 포스페이트 완충제(pH 7.4) 중의 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 동물들에게 경심 관류하고, 뇌간 및 허리 척수(L1-L6)를 절개하였다. 안면 핵을 포함하는 뇌간 영역(7 ㎛) 및 허리 척수(12.5 ㎛)로부터 일련의 단면을 절개하였다. 니슬(Nissl) 염색 후, 5번째 단면마다(안면 핵) 운동 신경을 카운팅하거나 10번째 단면마다(척수) 운동 신경을 카운팅하고, 미보정된 카운트를 분할 핵에 대해 보정하였다(Masu et al., Nature 365:27-32, 1993). 횡격막 신경을 4% 파라포름알데하이드 및 2% 글루타르알데하이드가 함유된 0.1 M 카코딜레이트 완충제 중에서 밤새 후고정하였다. 오스뮴처리 및 탈수 후, 모든 샘플을 스퍼르(Spurr) 배지에 함침하였다. 광 현미경 조사를 위한 세미틴(Semithin)(0.5 ㎛) 횡단면을 유리 칼로 절단하고 아주르-메틸렌블루(azur-methylenblue)로 염색하였다. 온전한 유수 섬유의 수를 디지털 카메라(액션캠(ActionCam); 아그파(Agfa), 벨기에 모트셀 소재)가 장착된 레이카(Leica)(독일 누슬로흐 소재) 광 현미경 하에 신경 횡단면으로부터 얻은 사진으로부터 측정하였다.
실시예 1
rhIGF-I 및 PEG-IGF-I의 전체적 노출을 평가하기 위해, 100 ㎍/㎏ rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I의 일회 피하 주사 후 약물 농도를 특이적 검출 어세이를 이용하여 C57B1/6 마우스에서 평가하였다. 이때, PEG-IGF-I은 rhIGF-I에 비해 훨씬 더 긴 반감기 및 더 높은 혈청 노출을 보였다(도 1). 이 증가된 말초 노출이 뇌 내로 전달되는 지를 더 조사하기 위해, 상기 마우스의 뇌 슬라이스를 인간 IGF-I을 인식하는 항체로 면역염색하고, CA1 영역의 신경내 염색을 평가하였다. CA1 신경의 IGF-I 염색은 rhIGF-I의 피하 주사로부터 2시간 및 6시간 경과 후 증가되었지만 24시간 경과 후 기준 수준으로 복귀하였다(도 2). 대조적으로, 증가된 IGF-I 염색은 PEG-IGF-I 주사 후 24시간 및 48시간 경과 후 관찰되었고 48시간에서 더 높은 수준에 도달하였다(도 2). 이 데이터는 rhIGF-I 및 PEG-IGF-I 둘다의 뇌 도입이 말초 노출과 유사한 속도를 보임을 입증하고 rhIGF-I에 비해 PEG-IGF-I의 훨씬 더 높은 말초 노출이 rhIGF-I에 비해 더 우수하고 더 오래 지속된 PEG-IGF-I의 뇌 도입이라는 결과를 가져옴을 보여준다.
실시예 2
비글 개에서의 독성 시험에서, rhIGF-I은 피하 투여된 150 ㎍/kg이라는 비교적 낮은 투여량에서조차도 저혈당증을 급성적으로 유도하는 높은 잠재력을 보였다(NDA 보고 21-839). PEG-IGF-I의 저혈당 잠재력을 분석하기 위해, 수컷 비이글 개 및 암컷 비이글 개에게 200 내지 5000 ㎍/kg의 PEG-IGF-I을 1회 피하 투여하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 2000 ㎍/kg 이하에서는 일관된 저혈당증이 관찰되지 않았다. 그러나, 5000 ㎍/kg의 투여량에서 2마리의 개 중 1마리의 개가 중증 저혈당증을 앓았고(도 2의 화살표 참조) 글루코스 관주에 의해 회복되어야 했으므로, 글루코스 시험을 이 시점에서 중단하였다. 이와 더불어, 이 데이터는 2000 ㎍/kg 이하의 피하 투여된 PEG-IGF-I이 150 ㎍/kg의 rhIGF-I에서 관찰된 저혈당증(NDA 보고 21-839)과 유사한 저혈당증 잠재력을 보이지 않음을 입증한다.
실시예 3
rhIGF-I에 비교된 PEG-IGF-I의 시험관내 활성을 조사하기 위해, 이들 두 화합물을 운동 신경 생존율에 대한 그들의 효능에 대해 비교하였다. E 12.5 연령의 C57B1/6 마우스 배아로부터 얻은 일차 운동 신경을 상이한 농도의 rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I의 부재 또는 존재 하에 배양하고 5일 후 생존 운동 신경을 상 대비 현미경으로 카운팅하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 두 화합물들은 운동 신경에 대한 동일한 보호 효과를 보였다. 이 데이터는 rhIGF-I 및 PEG-IGF-I이 동일한 생물 활성을 나타냄을 보여준다.
실시예 4
rhIGF-I의 경우, 여러 국소 투여 섭생법 또는 지속된 투여 섭생법은 ALS에 대해 널리 사용되는 동물 모델인 SOD1(G93A) 마우스에서 효능을 보였다(Kaspar et al., Science 301 :839, 2003; Dobrowolny et al., J Cell Biol 168:193, 2005; Nagano et al., J Neural Sci 235:61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82:452, 2005). 따라서, 본 발명자들은 ALS에 대한 2종의 독립적인 모델, 즉 pmn 마우스 및 SOD1(G93A) 마우스에서 질환의 임상적 발병 직전에 150 ㎍/kg의 투여량으로 피하 투여된 PEG-IGF-I의 생체내 효능을 조사하였다.
산발형 ALS에 대한 모델에서 PEG-IGF-I을 시험하기 위해, pmn 마우스를 사용하였다(Bommel et al., J Cell Biol 159:563, 2002). 이 ALS 모델은 생후 2주까지 기능적 손상의 제1 증상을 보였고 생후 5 내지 6주째에서 사망에 이르렀다. 따라서, pmn 마우스에게 생후 13일째 날, 즉 질환이 막 발병되기 시작하는 시점에서 비히클(n=12) 또는 150 ㎍/kg PEG-IGF-I(n=13)을 2일마다(q2d) 피하 투여하였다. 움켜쥠 강도를 분석하여 앞다리의 근력을 주마다 평가함으로써, 생후 45일째 날에 PEG-IGF-I의 명백한 효과를 관찰하였는데, 이때 PEG-IGF-I로 처리된 생존 pmn 마우스는 비히클-처리된 동물에 비해 훨씬 더 높은 성능을 보였다(p<0.05, n=4-5, 도 5). 로타로드 상에서 보낸 시간을 시험함으로써 운동 조화를 분석한 결과, 생후 38일째날 PEG-IGF-I-처리된 pmn 마우스가 비히클-처리된 마우스보다 유의하게 더 우수한 성능을 보였다(p<0.05, n=8-12, 도 6). 나아가, 생후 13일째부터 비히클 또는 PEG-IGF-I(150 ㎍/kg 피하)로 처리되고 생후 34일째 날에 관주된 pmn 마우스로부터 조직학적 분석을 수행하였다. 안면 운동 신경의 입체학적 카운팅은 PEG-IGF-I 처리 군에서 생존 운동 신경의 유의하게 더 높은 수를 보였다(p<0.01, n=6-12, 도 7). 유사하게, 허리 척수에서 운동 신경의 생존율은 유의하게 증가되었다(p<0.001, n=5-6, 도 8). 마지막으로, 횡격막 신경의 유수 축삭 수의 분석은 비히클-처리된 pmn 마우스와 PEG-IGF-I-처리된 pmn 마우스를 비교할 때 근위 횡격막에서 유의하게 높은 수의 유수 축삭을 보일 뿐만 아니라((p<0.05, n=4-5, 도 9) 원위 횡격막에서도 유의하게 높은 수의 유수 축삭을 보였다(p<0.01, n=5-6, 도 10).
가족성 ALS에 대해 가장 널리 사용되는 모델에서 PEG-IGF-I을 시험하기 위해, SOD1(G93A) 마우스(낮은 카피)를 사용하였다. 이 마우스는 생후 34 내지 35주째까지 질환의 첫 증상을 보이고 이로부터 약 4 내지 5주 후 사망에 이른다. 따라서, SOD1(G93A) 마우스에게 생후 34주째, 즉 질환이 막 발병되기 시작하는 시점부터 비히클(n=6) 또는 150 ㎍/kg PEG-IGF-I(n=7)을 주 당 2회(q3.5d) 피하 투여하였다. 실험 기간 전체에 걸친 통계학적 분석력을 보장하기 위해, LOCF 분석을 수행하였다. 이 방법(임상 시험에서도 사용됨)은 모든 후속 시점에 대해 사망 전 동물의 마지막 측정치를 유지한다. 체중 변화의 분석은 질환의 초기(약 37주)에서의 체중 감소가 PEG-IGF-I-처리된 마우스에서 유의하게 지연됨을 보였다(37, 38 및 39주의 경우 p<0.05, n=6-7 LOCF, 도 11). 초기 증상, 즉 뒷다리 약화, 비정상적인 보행 및 도립된 와이어 메쉬를 잡기 어려움에 의해 측정되는 질환 발병 자체는 생후 38.5주부터 42.5주까지 4주 동안 평균적으로 지연되었다(p<0.05, n=6-7, 도 12). 움켜쥠 강도를 분석하여 앞다리의 근력을 주마다 평가함으로써, PEG-IGF-I의 유의한 보호 효과를 모든 동물들이 사망할 때까지 꾸준히 생후 35주째부터 관찰하였다(35, 38, 42 및 43주의 경우 p<0.05, 36, 39, 40 및 41주의 경우 p<0.01, n=6-7 LOCF, 도 13). 로타로드 상에서 보낸 시간을 시험하여 운동 조화를 분석한 결과는 PEG-IGF-I-처리된 SOD1(G93A) 마우스가 비히클-처리된 마우스보다 유의하게 더 우수한 성능을 보임을 입증한다(37, 38, 39 및 41주의 경우 p<0.05, 40, 42 및 43주의 경우 p<0.01, n=6-7 LOCF, 도 14).
pmn 마우스 및 SOD1(G93A) 마우스로부터 얻은 생체내 데이터를 조합할 때, 본 연구는 PEG-IGF-I이 모든 관련 표적에서 ALS 모델의 신경근 기능을 방해하고 질환의 모든 단계에서 작용할 잠재력을 가짐을 보여준다. PEG-IGF-I은 가장 가능하게는 신경근 접합 및 결합을 보호하여 근육에 대한 동화작용 효과를 암시하는 근력 및 기능을 보존하는 것으로 밝혀졌다. PEG-IGF-I이 척수 및 안면 핵에서 운동 축삭 및 운동 신경체를 구제하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 운동 신경에 대한 직접적인 보호 효과를 암시한다(도 15). 이 퇴행이 ALS의 후기에 일어나기 때문에, PEG-IGF-I은 초기 및 후기 둘다에서 질환의 경과에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 있다.
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Claims (18)

  1. 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-부착된 IGF-I 변이체를 포함하는, 신경병증, 근육 위축증 및 운동 신경 질환(motor neuron disease, MND)으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경근 장애의 치료, 예방 또는 진행 지연을 위한 약학 조성물로서, 상기 PEG-부착된 IGF-I 변이체가 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 하기 아미노산 변경을 갖고 PEG가 1개 이상의 라이신 잔기에 부착되어 있음을 특징으로 하는 약학 조성물:
    (a) K65R 및 K68R(서열번호 2),
    (b) K27R 및 K68R(서열번호 3), 또는
    (c) K27R 및 K65R(서열번호 4).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    PEG-부착된 IGF-I 변이체가 K68에서 1개의 PEG에 부착되어 있고 야생형 인간 IGF-I 아미노산 서열(서열번호 1)의 하기 아미노산 변경을 가짐을 특징으로 하는 약학 조성물:
    K27R 및 K65R(서열번호 4).
  4. 제1항에 있어서,
    PEG의 총 분자량이 20 내지 100 kDa인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    PEG-부착된 IGF-I 변이체가 N-말단 아미노산에서 추가로 PEG에 부착되어 있는, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    PEG-부착된 IGF-I 변이체가 K65 또는 K68에서 1개의 PEG에 부착되어 있거나 K65 및 K68에서 2개의 PEG에 부착되어 있는, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    PEG-부착된 IGF-I 변이체가, N-말단에서 3개 이하의 아미노산이 절단되어 있음을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    PEG-부착된 IGF-I 변이체가, PEG 기가 분지쇄 PEG 기임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경근 장애가 운동 신경 질환(MND)인, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    MND가 근위축성 측삭 경화증(ALS)인, 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    PEG-부착된 IGF-I 변이체가 제2 약리 활성 화합물과 병용되되 별도로 사용되거나, 순차적으로 사용되거나 또는 조합물 형태로 동시에 사용되는, 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    병용되는 제2 약리 활성 화합물이 글루타메이트 방출에 대한 억제 효과, 전압-의존적 나트륨 채널의 불활성화 효과, 또는 전달제(transmitter)와 흥분 아미노산 수용체의 결합 다음에 일어나는 세포내 사건을 방해하는 능력을 나타내는 1종 이상의 신경보호제인, 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    제2 약리 활성 화합물이 릴루졸인, 약학 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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