KR20230170992A - 항 igf-i 수용체 항체 - Google Patents

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ser
gly
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히로시 에구치
아키라 다노쿠라
겐이치로 다카기
히로츠구 가토
사토시 야마무라
나오코 나미키
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데이진 화-마 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하고, 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖는, 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 제공한다.

Description

항 IGF-I 수용체 항체 {ANTI-IGF-I RECEPTOR ANTIBODY}
본 발명은, 항 IGF-I 수용체 항체에 관한 것이다. 구체적으로는, 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하는 항 IGF-I 수용체 항체에 관한 것이다.
1. IGF-I
IGF-I 은, 인슐린형 성장 인자 (Insulin-like growth factor) 이고, 주로 간장으로부터 분비되고, IGF-I 수용체에 작용함으로써, 각종 장기에서 여러 가지 생리 기능을 발현한다. 이러한 점에서 IGF-I 은, 여러 가지 질환에 대한 치료가 기대된다. IGF-I 은, 프로인슐린의 아미노산 서열과 비교하여, 약 40 ％ 로 높은 상동성을 갖는 점에서, 인슐린 수용체에도 결합하여, 인슐린형의 작용을 발현하는 경우가 있다 (비특허문헌 1). 또, IGF-I 수용체는, 인슐린 수용체의 아미노산 서열과 비교하여, 약 60 ％ 로 높은 상동성을 갖는 점에서, 양수용체는 헤테로 2 량체를 형성하는 경우가 있다 (비특허문헌 1). 또한, 인슐린은, 인슐린 수용체에 작용함으로써, 강력한 혈당 저하 작용을 발현하는 점에서, 혈당 강하약으로서 치료에 사용되고 있다.
2. IGF-I 수용체
IGF-I 수용체는 α 사슬 및 β 사슬로 구성되고, L1, CR, L2, Fn1, Fn2 및 Fn3 의 6 개의 세포 외 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포 내 도메인을 포함하는 막 관통 단백질이다 (비특허문헌 2). IGF-I 수용체의 세포 내 도메인은, 티로신키나아제를 갖는다. 세포 외 도메인인 CR (cysteine-rich domain) 은, IGF-I 이 IGF-I 수용체에 결합했을 때의 당해 수용체의 입체 구조의 변화에 수반하는, 세포 내의 티로신키나아제의 활성화에 관여한다. IGF-I 수용체는, 호모 2 량체 복합체 (호모형) 를 형성하고, IGF-I 이 결합하면, 수용체 키나아제를 활성화함으로써 신호를 보낸다. 또, 인슐린 수용체와의 헤테로 2 량체 복합체 (헤테로형) 를 형성하고, 인슐린 또는 IGF-I 이 결합하면, 수용체 키나아제를 활성화함으로써 신호를 보낸다 (비특허문헌 3, 4).
3. IGF-I 의 생리 작용
IGF-I 은, 신장이나 체중 증가 등의 성장 촉진 작용, 및 당대사 촉진이나 혈당 저하 작용 등의 인슐린형 대사 작용이 밝혀져 있다. 인간 재조합 IGF-I 인 메카세르민은, 인슐린 수용체 이상증인 고혈당, 고인슐린 혈증, 흑색 표피종 및 다모와 같은 증상을 개선하는 것이 확인되어 있다. 또, 성장 호르몬 저항성 저신장증의 성장 장해를 개선하는 것이 확인되어 있다 (비특허문헌 5).
IGF-I 의 성장 촉진 작용으로서, IGF-I 은 인간 연골 세포의 DNA 합성능을 항진시키는 것이 알려져 있다. 또, IGF-I 의 투여는, 하수체 적제 래트의 체중을 증가시키고, 대퇴골 골장을 신장시킨다 (비특허문헌 5).
4. IGF-I 의 근육량 증가 작용
IGF-I 을 개재한 세포 증식 활성의 항진은, IGF-I 수용체의 지속적인 활성화가 필요하다 (비특허문헌 6). IGF-I 수용체를 과잉 발현시킨 동물에서는 근육량이 증가되어 있다 (비특허문헌 7). 또, IGF-I/IGFBP3 의 지속 투여는, 대퇴골 근위부 골절 환자의 악력을 항진시키고, 도움 없이 앉은 자세로부터의 기립 능력을 개선시킨다 (비특허문헌 8). 고령의 사람 및 마우스의 근육 중의 IGF-I 농도는, 약령과 비교하여 저하되는 것이 알려져 있는데 (비특허문헌 9, 10), IGF-I 을 근조직 특이적으로 강제 발현시킨 고령 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 근육량이 개선되었다 (비특허문헌 11).
5. 근육량을 증가시키는 선행품
그렐린 수용체의 작동약인 아나모렐린은, 폐용성 근위축증인 카켁시아의 임상 시험에 있어서, 제지방량을 증가시켰다. 한편, 부작용으로서 구토 및 혈당치의 상승이 확인된다 (비특허문헌 12).
마이오스타틴은, 액티빈 수용체 II (ActRII) 에 작용하여, Akt/mTOR 을 저해하는, 골격근 형성의 부 (負) 의 제어 인자이다 (비특허문헌 13 ∼ 15). 항마이오스타틴 항체인 LY2495655 는, 전인공 고관절 치환술을 실시한 환자 및 고령자의 근육량을 증가시킨다 (비특허문헌 16, 17).
또, 항 ActRII 항체인 비마그루맙은, 신경근 질환 환자의 근육량을 증가시킨다 (비특허문헌 18). 그러나, 골격근의 형성을 촉진시키고, 치료를 위해 사용할 수 있는 약은 현재로서는 존재하지 않는다.
6. 성장을 촉진시키는 선행품
인간 재조합 GH 제제 (성장 호르몬 제제) 는 GH 수용체를 활성화하고, IGF-I 을 분비시켜, 성장 촉진 효과가 확인된다. 한편, 1 일 1 회 투여의 피하 주사제이기 때문에, 복약 컴플라이언스 (투여 망각 등) 에서 기인한 성장 효과의 저하가 확인되어 있다 (비특허문헌 19). GH 제제의 동태를 개선하고, 주 1 회 또는 2 주에 1 회 투여의 지속형 GH 제제가 개발중이다.
그러나, 복약 컴플라이언스를 개선하고, 성장 촉진 작용을 갖는, 치료를 위해 사용할 수 있는 약은 현재로서는 존재하지 않는다. 또한, GH 제제는, GH 수용체 활성화에 대한 감수성이 저하된, GH 수용체 이상, 또는 GH 치료에 저항성을 갖는 환자에 대하여, 성장 효과의 저하가 확인되어 있다 (비특허문헌 20).
IGF-I 은, GH 수용체의 하류에서 작용하는 점에서, GH 수용체 활성화에 대한 감수성이 저하된 환자에 대해서도 성장 촉진 작용을 갖는 유일한 치료약이다. 그러나, IGF-I 제제는 1 일 2 회 투여의 주사제이고, 복약 컴플라이언스가 나쁠 뿐만 아니라, 부작용으로서 저혈당이 확인되어 있다 (비특허문헌 21). IGF-I 의 복약 컴플라이언스, 및 저혈당을 개선시키고, 치료를 위해 사용할 수 있는 약제는 현재로서는 존재하지 않는다.
7. IGF-I 의 혈당 저하 작용
IGF-I 의 인슐린형 작용으로서, 혈당 저하 작용이 알려져 있다. IGF-I 은, 래트 근육 유래 세포에 있어서 글루코오스 흡수 작용을 항진시킨다 (비특허문헌 5). 또, IGF-I 의 투여는, 래트의 혈당치를 저하시킨다 (비특허문헌 5).
IGF-I 에 의한 혈당 저하 작용은, 임상상의 부작용으로서 저혈당을 야기시키는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 21). 또한, IGF-I 은, 인간에 대한 투여에 의해 저혈당을 일으키는 점에서, 치료 개시시에는, 저용량부터 순차적으로 적당량을 투여하고, 투여 후의 혈당치 등을 포함하는 각종 임상 소견의 관찰이 필요해진다 (비특허문헌 5).
IGF-I 은, IGF-I 수용체의 하류 시그널인 Akt 의 인산화의 항진을 개재하여 혈당 저하 작용을 발현한다. Akt 의 활성형 변이체는, 3T3-L1 세포의 글루코오스 흡수를 항진시킨다 (비특허문헌 22). 한편, Akt2 를 결손시킨 마우스는, 혈당치가 상승하였다 (비특허문헌 23). 또, 래트 근육 유래 세포에 있어서 Akt 저해제는, 인슐린 자극에 의한 글루코오스 흡수를 저해한다 (비특허문헌 24). 또한, IGF-I 은, 혈당 저하 작용에 관여하는 인슐린 수용체를 활성화시키는 것이 알려져 있다. 이러한 점들로부터, IGF-I 에 의한 혈당 저하 작용에는, Akt 의 과잉된 활성화 및 인슐린 수용체의 활성화가 관여하는 것을 생각할 수 있다.
8. IGF-I 의 짧은 혈중 반감기
IGF-I 의 혈중 반감기는, 짧기 때문에 치료에서는 자주 투여가 필요해진다. 실제로, 인간 재조합 IGF-I 인 메카세르민은, 혈중 반감기가 약 11 시간 내지 16 시간이고, 저신장증의 치료에서는 1 일 1 회 내지 2 회의 투여가 필요하다 (비특허문헌 5).
혈중의 IGF-I 의 약 70 내지 80 ％ 는 IGFBP3 과 결합하고 있다. IGF-I 의 유리체가 생리 활성을 나타낸다. IGFBP3 과의 결합은, IGF-I 의 혈중 반감기를 약 10 시간 내지 16 시간으로 유지하고 있다 (비특허문헌 1).
IGF-I 과 IGFBP3 의 배합제인 IPLEX 는, 혈중 반감기가 약 21 시간 내지 26 시간으로 IGF-I 과 비교하여 길고, 1 일 1 회의 투여를 가능하게 한 약제이다 (비특허문헌 23). 그러나, IPLEX 는 시장으로부터 철퇴되었다.
IGF-I 의 동태를 개선시킨 PEG 화 IGF-I 도 개발이 시도되었지만, 치료에 사용되고 있는 약제는 존재하지 않는다 (특허문헌 1).
9. IGF-I 의 작용에 의해 기대되는 치료 효과
IGF-I 은 다종의 장기에 작용하고, 그 생리 기능은 다방면에 걸치는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 21).
IGF-I 은, 중추 신경계에 있어서, IGF-I 수용체의 활성화를 개재하여, 미토콘드리아의 보호 및 항산화 작용에 의한 신경 보호 작용이 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 26, 27). IGF-I 은, 상해 후의 신경 돌기의 형성을 촉진시킨다 (비특허문헌 28).
IGF-I 은, 성장 촉진의 주요한 인자이다 (비특허문헌 29, 30). 실제로, 인간 재조합 IGF-I 인 메카세르민은, 저신장증의 치료약으로서 임상에서 사용되고 있다.
IGF-I 은, 간경변의 치료에 유용하다고 생각되고 있다. 간경변은, 간장해 또는 만성 간질환으로부터 병태 진전한 것으로, 간장의 섬유화를 수반하는 질환이다. 간경변 모델 동물에 있어서, IGF-I 의 투여는, 간장의 섬유화를 억제하였다 (비특허문헌 31).
IGF-I 은, 신장의 발달, 기능에도 관여하는 것이 알려져 있다. 신장의 메산기움 세포에 있어서, IGF-I 은, 당 독성에 의한 산화 스트레스 및 아포토시스에 대하여 보호 작용이 있다 (비특허문헌 32). IGF-I 은, 신증의 치료약으로서 기대된다.
IGF-I 의 투여에 의해 개선이 기대되는 병태에는, 저신장증, 라론증, 간경변, 간섬유화, 노화, 자궁내 태아 발육 지연 (IUGR), 신경 질환, 뇌졸중, 척수 손상, 심혈관 보호, 당뇨병, 인슐린 저항성, 메타볼릭 신드롬, 신증, 골조송증, 낭포성 섬유증, 창상 치유, 근강직성 디스트로피, 에이즈 근감약증, HIV 에 수반하는 지방 재분포 증후군, 화상, 크론병, 베르너 증후군, X 연쇄성 복합 면역 부전증, 난청, 신경성 무식욕증 및 미숙아 망막증이 있다 (비특허문헌 21).
IGF-I 은, 그 다채로운 생리 작용으로부터, 여러 가지 질환의 치료약으로서 기대된다. 그러나, 부작용인 혈당 저하 작용, 및 짧은 반감기에 의한 복수 회의 투여가 임상에서 사용하기 위한 과제이다.
10. IGF-I 수용체 아고니스트 항체
항체 제제는, 일반적으로 반감기가 길고, 월에 1 회 내지 2 회의 투여로 유효성을 나타낸다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, in vitro 에서의 수용체 활성화 작용이 보고되어 있지만, in vivo 에 있어서 IGF-I 수용체에 대한 아고니스트 활성을 나타낸 항체의 보고는 없다 (비특허문헌 33 ∼ 37).
항체 3B7 및 항체 2D1 은, in vitro 에 있어서 세포의 DNA 합성을 항진한다 (비특허문헌 34).
항체 11A1, 11A4, 11A11 및 24-57 은, in vitro 에 있어서 IGF-I 수용체의 티로신의 인산화를 항진한다 (비특허문헌 35).
항체 16-13, 17-69, 24-57, 24-60, 24-31, 및 26-3 은, in vitro 에 있어서 세포의 DNA 합성, 및 글루코오스 흡수의 항진 작용을 갖는 것이 개시되어 있고, 이들 항체는 혈당 저하 작용을 가질 가능성이 있다 (비특허문헌 36, 37).
그러나, 지금까지 초대 배양 세포, 그 중에서도 인간 근아세포를 사용한 in vitro 에서의 세포 증식 활성을 나타낸 IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 보고는 없고, 하물며 in vivo 에서의 근육량 증가 작용을 나타내는 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는 없었다.
11. IGF-I 수용체 안타고니스트 항체
IGF-I 수용체에 결합하는 항체는 IGF-I 과 IGF-I 수용체의 결합을 저해하는 안타고니스트 작용을 이용하여, 악성 종양 등의 치료에 대한 응용이 시도되고 있다. 그러나, 기존의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체는 단독 치료에 있어서 고혈당 등의 부작용이 많을 뿐만 아니라 (비특허문헌 38), 다른 항암제와의 병용에 의해 고혈당의 발현율이 상승하는 점에서 (비특허문헌 39), 치료에 대한 적용은 한정적인 것이 되는 것으로 생각되고 있다.
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본 발명은, 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하는, 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은, IGF-I 수용체를 개재하여, 근육량 또는 성장판 연골의 두께를 증가시키고, 혈당치를 저하시키지 않는 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하고, 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖는, 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[2] 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성이, 천연형 IGF-I 과 동일한 정도 이상인, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[3] 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성의 in vitro 에 있어서의 EC50 값이, 천연형 IGF-I 에 대하여 1/20 이하인, [1] 또는 [2] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[4] 배양하의 척추 동물 유래 세포에 접촉시킨 경우에 있어서의, 상기 배양 세포와의 접촉 시간에 대한 상기 배양 세포의 증식 유도 작용의 지속성이, 천연형 IGF-I 과 비교하여 개선되어 있는, [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[5] 천연형 IGF-I 이 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간 IGF-I 인, [2] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[6] 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성의 in vitro 에 있어서의 EC50 값이, 0.1 nmol/L 이하인, [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[7] 척추 동물에 비경구 투여됨으로써, 상기 척추 동물의 근육량 및/또는 체장의 증가를 유도하는 활성을 갖는, [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[8] 척추 동물에 1 주일에 1 회 이하의 빈도로 투여하는, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[9] 척추 동물이, 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개 혹은 닭을 포함하는 비인간 동물, 나아가서는 인간 IGF-I 수용체를 발현시킨 비인간 동물인, [1] 내지 [8] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[10] 척추 동물 유래 세포의 증식을 유도하는 용량에 있어서, 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는, [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[11] in vitro 에 있어서의 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 나타내는 EC50 값의 100 배 이상의 용량에 있어서도 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는, [10] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[12] 척추 동물 유래 세포가 인간 또는 인간 이외의 포유 동물에 유래하는 근아세포인, [10] 또는 [11] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[13] 척추 동물에 비경구 투여되고, 상기 척추 동물의 근육량 및/또는 체장의 증가를 유도하는 용량에 있어서, 상기 척추 동물의 혈당치를 저하시키지 않는 것을 특징으로 하는, [7] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[14] 척추 동물에 비경구 투여되고, 상기 척추 동물의 근육량 및/또는 체장의 증가를 유도하는 유효 용량에 대하여 10 배 이상의 용량에 있어서도, 상기 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는 것을 특징으로 하는, [13] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[15] IGF-I 수용체의 CR 도메인에 결합하는, [1] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[16] IGF-I 수용체의 CR 도메인에 결합하고, IGF-I 또는 IGF-II 와 IGF-I 수용체의 결합을 저해하는, 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[17] IGF-I 수용체의 CR 도메인의 서열에 있어서의 ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet (X1 은 Gly 또는 Ser, X2 는 Ser 또는 Thr) 를 포함하는 에피토프 또는 그 근방에 결합하는 것을 특징으로 하는, [15] 또는 [16] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[18] IGF-I 수용체의 CR 도메인의 서열에 있어서의 ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 를 포함하는 에피토프 또는 그 근방에 결합하는 것을 특징으로 하는, [17] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[19] 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개 혹은 닭을 포함하는 비인간 동물의 IGF-I 수용체와 교차 반응성을 갖는, [1] 내지 [18] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[20] 상기 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 항원 항체 반응은, 해리 평형 정수 (KD) 가 1 × 10-8 M 이하의 친화성 강도를 갖는 것을 특징으로 하는, [1] 내지 [19] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[21] 상기 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가, 1) ∼ 4) 중 적어도 하나의 특징을 갖는, [16] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
1) 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖는다.
2) 척추 동물에 비경구 투여함으로써, 상기 척추 동물의 근육량 및/또는 체장의 증가를 유도하는 활성을 갖는다.
3) 척추 동물 유래 세포의 증식을 유도하는 용량에 있어서, 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는다.
4) 척추 동물에 비경구 투여되고, 상기 척추 동물의 근육량 및/또는 체장의 증가를 유도하는 용량에 있어서, 상기 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는다.
[22] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가, 1) ∼ 4) 의 적어도 하나의 특징을 갖는, [16] 내지 [21] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
1) IGF-I 에 의한 척추 동물 유래 세포의 증식을 저해한다.
2) 척추 동물에 비경구 투여함으로써, 상기 척추 동물에 있어서의 IGF-I 에서 기인하는 세포 증식성 질환에 있어서의 세포 증식을 억제한다.
3) IGF-I 에 의한 척추 동물 유래 세포의 증식을 저해하는 용량에 있어서, 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수에 영향을 주지 않는다.
4) 척추 동물에 비경구 투여되고, 상기 척추 동물에 있어서의 IGF-I 에서 기인하는 세포 증식성 질환에 있어서의 세포 증식을 억제하는 용량에 있어서, 상기 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는다.
[23] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가, Fab, scFv, Diabody 혹은 이중 특이성 항체, 또는 그것들의 유도체인, [1] ∼ [22] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[24] 중사슬 가변 영역의 CDR-1(CDR-H1) 서열로서 서열 번호 3 또는 서열 번호 3 중 어느 1 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
중사슬 가변 영역의 CDR-2(CDR-H2) 서열로서 서열 번호 4 또는 서열 번호 4 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
중사슬 가변 영역의 CDR-3(CDR-H3) 서열로서 서열 번호 5 또는 서열 번호 5 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
경사슬 가변 영역의 CDR-1(CDR-L1) 서열로서 서열 번호 6 또는 서열 번호 6 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
경사슬 가변 영역의 CDR-2(CDR-L2) 서열로서 서열 번호 7 또는 서열 번호 7 중 어느 1 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열, 및
경사슬 가변 영역의 CDR-3(CDR-L3) 서열로서 서열 번호 8 또는 서열 번호 8 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열
을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 [1] 내지 [23] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[25] 면역 글로불린의 프레임워크 서열을 추가로 포함하는, [24] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[26] 면역 글로불린의 프레임워크 서열이, 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 닭, 마우스 혹은 래트를 포함하는 비인간 동물의 면역 글로불린의 각 클래스에 있어서의 프레임워크 서열인, [25] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[27] 중사슬 가변 영역으로서 서열 번호 9 또는 서열 번호 9 와 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 경사슬 가변 영역으로서 서열 번호 10 또는 서열 번호 10 과 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 [1] 내지 [26] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[28] 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 닭, 마우스 혹은 래트를 포함하는 비인간 동물의 면역 글로불린의 각 클래스에 있어서의 정상 영역을 추가로 포함하는, [1] 내지 [27] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[29] [1] 내지 [28] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자.
[30] [29] 에 기재된 핵산 분자를 적어도 하나 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
[31] 숙주 세포에 [30] 에 기재된 벡터가 도입된 재조합체 세포.
[32] [31] 에 기재된 재조합체 세포를 배양하고, 상기 재조합체 세포로부터 산생되는 상기 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 정제하는 공정을 포함하는, [1] 내지 [28] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 제조 방법.
[33] [1] 내지 [28] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, [29] 에 기재된 핵산 분자, [30] 에 기재된 벡터, 혹은 [31] 에 기재된 재조합체 세포를 포함하는 의약 조성물.
[34] [1] 내지 [28] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, [29] 에 기재된 핵산 분자, [30] 에 기재된 벡터, 혹은 [31] 에 기재된 재조합체 세포 이외의 활성 성분을 추가로 포함하는, [33] 에 기재된 의약 조성물.
[35] 활성 성분이 성장 호르몬 또는 그 아날로그, 인슐린 또는 그 아날로그, IGF-II 또는 그 아날로그, 항마이오스타틴 항체, 마이오스타틴 안타고니스트, 항액티빈 IIB 형 수용체 항체, 액티빈 IIB 수용체 안타고니스트, 가용성 액티빈 IIB 형 수용체 또는 그 아날로그, 그렐린 또는 그 아날로그, 폴리스타틴 또는 그 아날로그, 베타 2 아고니스트, 및 선택적 안드로겐 수용체 모듈레이터로부터 1 개 이상 선택되는, [34] 에 기재된 의약 조성물.
[36] 활성 성분이 코르티코스테로이드, 제토약, 온단세트론염산, 그라니세트론염산, 메트로클로프라미드 (metroclopramide), 돔페리돈, 할로페리돌, 시클리진, 로라제팜, 프로클로르페라진, 덱사메타손, 레보메프로마진, 트로피세트론, 암 백신, GM-CSF 저해약, GM-CSF DNA 백신, 세포에 기초하는 백신, 수상 세포 백신, 재조합 바이러스 백신, 열 쇼크 단백질 (HSP) 백신, 동종 종양 백신, 자기 종양 백신, 진통약, 이부프로펜, 나프록센, 트리살리실산콜린마그네슘, 옥시코돈염산, 항혈관 형성약, 항혈전약, 항 PD-1 항체, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 항 PD-L1 항체, 아테졸리주맙, 항 CTLA4 항체, 이필리무맙, 항 CD20 항체, 리툭시맙, 항 HER2 항체, 트라스투주맙, 항 CCR4 항체, 모가물리주맙, 항 VEGF 항체, 베바시주맙, 항 VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 단편, 항 TWEAK 항체, 항 TWEAK 수용체 항체, 가용성 TWEAK 수용체 단편, AMG 706, AMG 386, 항증식약, 파르네실 단백질 트랜스페라아제 저해약, αvβ3 저해약, αvβ5 저해약, p53 저해약, Kit 수용체 저해약, ret 수용체 저해약, PDGFR 저해약, 성장 호르몬 분비 저해약, 안지오포이에틴 저해약, 종양 침윤 매크로파지 저해약, c-fms 저해약, 항 c-fms 항체, CSF-1 저해약, 항 CSF-1 항체, 가용성 c-fms 단편, 페그비소만트, 젬시타빈, 파니투무맙, 이리노테칸, 및 SN-38 로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 포함하는, [34] 또는 [35] 에 기재된 의약 조성물.
[37] [1] ∼ [28] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, [29] 에 기재된 핵산 분자, [30] 에 기재된 벡터, 및 [31] 에 기재된 재조합체 세포 중, 어느 하나 이상을 포함하는, IGF-I 에 관련한 상태의 치료 또는 예방에 사용되는 의약.
[38] IGF-I 에 관련한 상태가, 폐용성 근위축, 저신장증, 당뇨병성 신증, 만성 신부전, 라론증, 간경변, 간섬유화, 노화, 자궁내 태아 발육 지연 (IUGR), 신경 질환, 뇌졸중, 척수 손상, 심혈관 보호, 당뇨병, 인슐린 저항성, 메타볼릭 신드롬, 골조송증, 낭포성 섬유증, 창상 치유, 근강직성 디스트로피, 에이즈 근감약증, HIV 에 수반하는 지방 재분포 증후군, 화상, 크론병, 베르너 증후군, X 연쇄성 복합 면역 부전증, 난청, 신경성 무식욕증 및 미숙아 망막증, 터너 증후군, 프래더·윌리 증후군, 실버·러셀 증후군, 특발성 저신장, 비만, 다발성 경화증, 섬유근 통증, 궤양성 대장염, 저근육량, 심근 허혈 및 저골밀도로부터 선택되는, [37] 에 기재된 의약.
[39] 비경구 투여되는, [37] 또는 [38] 에 기재된 의약.
[40] 비인간 동물에 투여되는 동물용 의약인, [37] 내지 [39] 중 어느 한 항에 기재된 의약.
[41] 상기 동물용 의약이, 근육량 및/또는 체장의 증대, 성장의 촉진, 유즙 산생량의 증대, 번식의 촉진, 또는 노화의 예방의 목적으로 투여되는, [40] 에 기재된 의약.
[42] 비인간 동물이, 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 또는 닭인, [40] 또는 [41] 에 기재된 동물용 의약.
[43] IGF-I 또는 IGF-II 의 IGF-I 수용체에 대한 작용에서 기인하는 질환의 치료 또는 예방에 사용되는, [37] ∼ [42] 중 어느 한 항에 기재된 의약.
[44] IGF-I 또는 IGF-II 의 IGF-I 수용체에 대한 작용에서 기인하는 질환이, 간장암, 신경아세포종, 횡문근 육종, 골육종, 소아암, 선단 거대증, 난소암, 췌장암, 양성 전립선 비대증, 유암, 전립선암, 골암, 폐암, 결장 직장암, 경부암, 활막 육종, 방광암, 위암, 윌름스 종양, 전이성 카르티노이드 및 혈관 작동성 장관 펩티드 분비 종양에 관련하는 설사, 비포마, 베르너-모리슨 증후군, 벡위스-비데만 증후군, 신장암, 신세포암, 이행 상피암, 유잉 육종, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 뇌종양, 교아종, 비교아종성 뇌종양, 수막종, 하수체 선종, 전정 신경초종, 미분화 신경 외배엽성 종양, 수아종, 성상 세포종, 핍돌기 교종, 뇌실 상의종, 맥락총유두종, 거인증, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 혈관의 평활근 재협착, 부적절한 미소 혈관 증식, 당뇨병성 망막증, 그레이브스병, 다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스, 만성 갑상선염, 중증 근무력증, 자기 면역성 갑상선염 그리고 베체트병으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환인, [43] 에 기재된 의약.
[45] 척추 동물 유래의 세포를 in vitro 에서 배양하는 방법으로서, 배양의 과정에서 상기 척추 동물 유래의 세포가, [1] 내지 [28] 중 어느 한 항에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, [29] 에 기재된 핵산 분자, [30] 에 기재된 벡터, 및 [31] 에 기재된 재조합체 세포 중 어느 하나 이상과 접촉되는 공정을 포함하는, 배양 방법.
[46] 상기 접촉의 공정이, 척추 동물 유래의 세포의 증식 촉진 또는 분화 유도의 목적으로 실시되는, [45] 에 기재된 배양 방법.
[47] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가 고상에 흡착 또는 고정되어 있는, [45] 또는 [46] 에 기재된 배양 방법.
[48] IGF-I 수용체 유전자의 CR 도메인에 변이가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 상기 IGF-I 수용체의 CR 도메인이, 유전자 재조합에 의해, ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 유전자 재조합 동물.
[49] 이종의 IGF-I 수용체 유전자가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 상기 동물의 내재적으로 보유하는 IGF-I 수용체의 아미노산 서열에 대하여, 도입된 IGF-I 수용체 유전자의 코드하는 아미노산 서열의 CR 도메인에 있어서의 ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet 의 부분의 서열 중 X1 및/또는 X2 의 아미노산 잔기가, 상기 동물의 내재적으로 보유하는 IGF-I 수용체의 아미노산 서열과 일치하지 않는 IGF-I 수용체 유전자가 도입되어 있는, 유전자 재조합 동물.
또한, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 서열 번호 2 에 기재된 천연형 인간 IGF-I 수용체의 CR 도메인의 서열에 있어서의 ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 로 이루어지는 에피토프에 결합하고, 인간 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖는, 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[2] 인간 유래 세포의 증식 유도 활성이, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 IGF-I 과 동일한 정도 이상인, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[3] 인간 유래 세포의 증식 유도 활성의 in vitro 에 있어서의 EC50 값이, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 IGF-I 에 대하여 1/20 이하인, [1] 또는 [2] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[4] 배양하의 인간 유래 세포에 접촉시킨 경우에 있어서의, 배양 세포와의 접촉 시간에 대한 상기 배양 세포의 증식 유도 작용의 지속성이, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 IGF-I 과 비교하여 개선되어 있는, [1] 또는 [2] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[5] 인간 유래 세포의 증식 유도 활성의 in vitro 에 있어서의 EC50 값이, 0.1 nmol/L 이하인, [1] 또는 [2] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[6] 척추 동물의 근육량, 체장, 또는 이들 모두의 증가를 유도하는 활성을 갖는, [1] 또는 [2] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[7] 척추 동물이, 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개 혹은 닭을 포함하는 비인간 동물, 나아가서는 인간 IGF-I 수용체를 발현시킨 비인간 동물인, [6] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[8] 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖고, 척추 동물 유래 세포의 증식을 유도하는 용량에 있어서, 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[9] in vitro 에 있어서의 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 나타내는 EC50 값의 100 배 이상의 용량에 있어서도 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는, [8] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[10] 척추 동물 유래 세포가 인간 또는 인간 이외의 포유 동물에 유래하는 근아세포인, [8] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[11] 척추 동물의 근육량, 체장, 또는 이들 모두의 증가를 유도하는 용량에 있어서, 상기 척추 동물의 혈당치를 저하시키지 않는 것을 특징으로 하는, [6] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[12] 척추 동물의 근육량, 체장, 또는 이들 모두의 증가를 유도하는 유효 용량에 대하여 10 배 이상의 용량에 있어서도, 상기 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는 것을 특징으로 하는, [11] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[13] 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개 혹은 닭을 포함하는 비인간 동물의 IGF-I 수용체와 교차 반응성을 갖는, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[14] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 항원 항체 반응은, 해리 평형 정수 (KD) 가 1 × 10-8 M 이하의 친화성 강도를 갖는 것을 특징으로 하는, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[15] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가, 1) ∼4) 중 적어도 하나의 특징을 갖는, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
1) 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖는다.
2) 척추 동물의 근육량, 체장, 또는 이들 모두의 증가를 유도하는 활성을 갖는다.
3) 척추 동물 유래 세포의 증식을 유도하는 용량에 있어서, 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는다.
4) 척추 동물의 근육량, 체장, 또는 이들 모두의 증가를 유도하는 용량에 있어서, 상기 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는다.
[16] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가, 1) ∼4) 의 적어도 하나의 특징을 갖는, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
1) IGF-I 에 의한 척추 동물 유래 세포의 증식을 저해한다.
2) 척추 동물에 있어서의 IGF-I 에서 기인하는 세포 증식성 질환에 있어서의 세포 증식을 억제한다.
3) IGF-I 에 의한 척추 동물 유래 세포의 증식을 저해하는 용량에 있어서, 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수에 영향을 주지 않는다.
4) 척추 동물에 있어서의 IGF-I 에서 기인하는 세포 증식성 질환에 있어서의 세포 증식을 억제하는 용량에 있어서, 상기 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는다.
[17] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가, Fab, scFv, Diabody 혹은 이중 특이성 항체, 또는 그것들의 유도체인, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[18] 중사슬 가변 영역의 CDR-1(CDR-H1) 서열로서 서열 번호 3 또는 서열 번호 3 중 어느 1 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
중사슬 가변 영역의 CDR-2(CDR-H2) 서열로서 서열 번호 4 또는 서열 번호 4 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
중사슬 가변 영역의 CDR-3(CDR-H3) 서열로서 서열 번호 5 또는 서열 번호 5 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
경사슬 가변 영역의 CDR-1(CDR-L1) 서열로서 서열 번호 6 또는 서열 번호 6 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열,
경사슬 가변 영역의 CDR-2(CDR-L2) 서열로서 서열 번호 7 또는 서열 번호 7 중 어느 1 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열, 및
경사슬 가변 영역의 CDR-3(CDR-L3) 서열로서 서열 번호 8 또는 서열 번호 8 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열
을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[19] 면역 글로불린의 프레임워크 서열을 추가로 포함하는, [18] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[20] 면역 글로불린의 프레임워크 서열이, 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 닭, 마우스 혹은 래트를 포함하는 비인간 동물의 면역 글로불린의 각 클래스에 있어서의 프레임워크 서열인, [19] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[21] 중사슬 가변 영역으로서 서열 번호 9 또는 서열 번호 9 와 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 경사슬 가변 영역으로서 서열 번호 10 또는 서열 번호 10 과 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[22] 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 닭, 마우스 혹은 래트를 포함하는 비인간 동물의 면역 글로불린의 각 클래스에 있어서의 정상 영역을 추가로 포함하는, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체.
[23] [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자.
[24] [23] 에 기재된 핵산 분자를 적어도 하나 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
[25] 숙주 세포에 [24] 에 기재된 벡터가 도입된, 단리된 재조합체 세포.
[26] [25] 에 기재된 재조합체 세포를 배양하고, 상기 재조합체 세포로부터 산생되는 상기 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 정제하는 공정을 포함하는, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 제조 방법.
[27] [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, 상기 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 적어도 하나 포함하는 벡터, 혹은 숙주 세포에 상기 벡터가 도입된, 단리된 재조합체 세포를 포함하는, 폐용성 근위축, 저신장증, 당뇨병성 신증, 만성 신부전, 라론증, 간경변, 간섬유화, 노화, 자궁내 태아 발육 지연 (IUGR), 신경 질환, 뇌졸중, 척수 손상, 심혈관 보호, 당뇨병, 인슐린 저항성, 메타볼릭 신드롬, 골조송증, 낭포성 섬유증, 창상 치유, 근강직성 디스트로피, 에이즈 근감약증, HIV 에 수반하는 지방 재분포 증후군, 화상, 크론병, 베르너 증후군, X 연쇄성 복합 면역 부전증, 난청, 신경성 무식욕증 및 미숙아 망막증, 터너 증후군, 프래더·윌리 증후군, 실버·러셀 증후군, 특발성 저신장, 비만, 다발성 경화증, 섬유근 통증, 궤양성 대장염, 저근육량, 심근 허혈 및 저골밀도로부터 선택되는 상태의 치료 또는 예방용 의약 조성물.
[28] 상기 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 혹은 상기 재조합체 세포 이외의 활성 성분을 추가로 포함하는, [27] 에 기재된 의약 조성물.
[29] 활성 성분이 성장 호르몬 또는 그 아날로그, 인슐린 또는 그 아날로그, IGF-II 또는 그 아날로그, 항마이오스타틴 항체, 마이오스타틴 안타고니스트, 항액티빈 IIB 형 수용체 항체, 액티빈 IIB 수용체 안타고니스트, 가용성 액티빈 IIB 형 수용체 또는 그 아날로그, 그렐린 또는 그 아날로그, 폴리스타틴 또는 그 아날로그, 베타 2 아고니스트, 및 선택적 안드로겐 수용체 모듈레이터로부터 1 개 이상 선택되는, [28] 에 기재된 의약 조성물.
[20] 활성 성분이 코르티코스테로이드, 제토약, 온단세트론염산, 그라니세트론염산, 메트로클로프라미드 (metroclopramide), 돔페리돈, 할로페리돌, 시클리진, 로라제팜, 프로클로르페라진, 덱사메타손, 레보메프로마진, 트로피세트론, 암 백신, GM-CSF 저해약, GM-CSF DNA 백신, 세포에 기초하는 백신, 수상 세포 백신, 재조합 바이러스 백신, 열 쇼크 단백질 (HSP) 백신, 동종 종양 백신, 자기 종양 백신, 진통약, 이부프로펜, 나프록센, 트리살리실산콜린마그네슘, 옥시코돈염산, 항혈관 형성약, 항혈전약, 항 PD-1 항체, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 항 PD-L1 항체, 아테졸리주맙, 항 CTLA4 항체, 이필리무맙, 항 CD20 항체, 리툭시맙, 항 HER2 항체, 트라스투주맙, 항 CCR4 항체, 모가물리주맙, 항 VEGF 항체, 베바시주맙, 항 VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 단편, 항 TWEAK 항체, 항 TWEAK 수용체 항체, 가용성 TWEAK 수용체 단편, AMG706, AMG 386, 항증식약, 파르네실 단백질 트랜스페라아제 저해약, αvβ3 저해약, αvβ5 저해약, p53 저해약, Kit 수용체 저해약, ret 수용체 저해약, PDGFR 저해약, 성장 호르몬 분비 저해약, 안지오포이에틴 저해약, 종양 침윤 매크로파지 저해약, c-fms 저해약, 항 c-fms 항체, CSF-1 저해약, 항 CSF-1 항체, 가용성 c-fms 단편, 페그비소만트, 젬시타빈, 파니투무맙, 이리노테칸, 및 SN-38 로 이루어지는 군에서 선택되는 성분을 포함하는, [28] 또는 [29] 에 기재된 의약 조성물.
[31] 비인간 동물에 투여되는 동물용 의약인, [29] 에 기재된 의약 조성물.
[32] 동물용 의약이, 근육량, 체장, 또는 이들 모두의 증대, 성장의 촉진, 유즙 산생량의 증대, 번식의 촉진, 또는 노화의 예방의 목적으로 투여되는, [31] 에 기재된 의약 조성물.
[33] 비인간 동물이, 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 또는 닭인, [31] 에 기재된 의약 조성물.
[34] [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, [23] 에 기재된 핵산 분자, [24] 에 기재된 벡터, 또는 [25] 에 기재된 재조합체 세포를 포함하는, IGF-I 또는 IGF-II 의 IGF-I 수용체에 대한 작용에서 기인하는, 간장암, 신경아세포종, 횡문근 육종, 골육종, 소아암, 선단 거대증, 난소암, 췌장암, 양성 전립선 비대증, 유암, 전립선암, 골암, 폐암, 결장 직장암, 경부암, 활막 육종, 방광암, 위암, 윌름스 종양, 전이성 카르티노이드 및 혈관 작동성 장관 펩티드 분비 종양에 관련하는 설사, 비포마, 베르너-모리슨 증후군, 벡위스-비데만 증후군, 신장암, 신세포암, 이행 상피암, 유잉 육종, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 뇌종양, 교아종, 비교아종성 뇌종양, 수막종, 하수체 선종, 전정 신경초종, 미분화 신경 외배엽성 종양, 수아종, 성상 세포종, 핍돌기 교종, 뇌실 상의종, 맥락총유두종, 거인증, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 혈관의 평활근 재협착, 부적절한 미소 혈관 증식, 당뇨병성 망막증, 그레이브스병, 다발성 경화증, 전신성 에리테마토데스, 만성 갑상선염, 중증 근무력증, 자기 면역성 갑상선염 그리고 베체트병으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 치료 또는 예방에 사용되는, 의약 조성물.
[35] 척추 동물 유래의 세포를 in vitro 에서 배양하는 방법으로서, 배양의 과정에서 상기 척추 동물 유래의 세포가, [1] 에 기재된 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체, [23] 에 기재된 핵산 분자, [24] 에 기재된 벡터, 및 [25] 에 기재된 재조합체 세포 중 어느 하나 이상과 접촉되는 공정을 포함하는, 배양 방법.
[36] 접촉의 공정이, 척추 동물 유래의 세포의 증식 촉진 또는 분화 유도의 목적으로 실시되는, [35] 에 기재된 배양 방법.
[37] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체가 고상에 흡착 또는 고정되어 있는, [35] 에 기재된 배양 방법.
[38] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 척추 동물 유래 세포에 대한 작용을 평가하기 위한, IGF-I 수용체 유전자의 CR 도메인에 변이가 도입된 인간을 제외한 유전자 재조합 동물로서, 상기 IGF-I 수용체의 CR 도메인이, 유전자 재조합에 의해, ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 인간을 제외한 유전자 재조합 동물.
[39] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 척추 동물 유래 세포에 대한 작용을 평가하기 위한 인간을 제외한 유전자 재조합 동물로서, 상기 동물이 내재적으로 보유하는 IGF-I 수용체 유전자의 CR 도메인에 변이가 도입되고, 변이가 도입된 IGF-I 수용체 유전자의 코드하는 아미노산 서열의 CR 도메인에 있어서의 ProSerGlyPheIleArgAsnX1X2GlnSerMet 의 부분의 서열 중 X1, X2, 또는 이들 모두의 아미노산 잔기가, 상기 동물이 내재적으로 보유하는 IGF-I 수용체의 아미노산 서열과 일치하지 않는, 인간을 제외한 유전자 재조합 동물.
[40] 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체의 척추 동물 유래 세포에 대한 작용을 평가하기 위한 방법으로서, [39] 에 기재된 유전자 재조합 동물에, 상기의 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체 혹은 그 단편, 또는 그것들의 유도체는, 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하는 효과를 갖는다.
도 1 은, IGF-I 수용체의 CR 도메인의 아미노산 서열 (아미노산 서열은 1 문자 표기로 나타낸다) 을, 마우스, 래트, 인간, 모르모트 및 토끼에서, 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, IGF11-16 추정 에피토프의 변이체를 사용한 ELISA 의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, IGF11-16 과 IGF-I 의 약제 제거 후의 인간 근아세포의 증식 활성을 나타내는 도면이다.
도 4 는, IGF-I 및 IGF11-16 을 인간 분화 근세포에 첨가했을 때의 글루코오스 흡수 작용을 나타내는 도면이다.
도 5 는, 모르모트에 IGF-I 을 삼투압 펌프로 지속 투여 또는, IGF11-16 을 단회 피하 또는 정맥 내 투여하고, 2 주일 후의 장지신근의 중량을 나타내는 도면이다.
도 6 은, 절식 조건하의 모르모트에, IGF-I 을 단회 피하 투여했을 때의 혈당치의 시간 경과적 추이를 나타내는 도면이다.
도 7 은, 절식 조건하의 모르모트에, IGF11-16 을 단회 피하 투여했을 때의 혈당치의 시간 경과적 추이를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 절식 조건하의 모르모트에, IGF11-16 을 단회 정맥 내 투여했을 때의 혈당치의 시간 경과적 추이를 나타내는 도면이다.
도 9 는, 하수체 적출 모르모트 (HPX) 에 있어서의 IGF11-16 의 성장판 연골의 두께의 항진 작용을 나타내는 도면이다.
도 10 은, 하수체 적출 모르모트 (HPX) 에 있어서의 IGF11-16 의 경골의 길이의 항진 작용을 나타내는 도면이다.
도 11 은, 절식 조건하의 모르모트에, IGF-I 을 단회 피하 투여했을 때의 혈중 동태의 시간 경과적 추이를 나타내는 도면이다.
도 12 는, 절식 조건하의 모르모트에, IGF11-16 을 단회 피하 투여했을 때의 혈중 동태의 시간 경과적 추이를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시형태에 기초하여 설명하지만, 본 발명은 이들 실시형태에 전혀 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서에 있어서 인용하는 특허 공보, 특허 출원 공개 공보, 및 비특허 공보를 포함하는 모든 문헌은, 모든 목적에 있어서, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 받아들여진다.
[IGF]
IGF 란 인슐린형 성장 인자 (Insulin-like Growth Factor) 를 말하며, IGF-I 과 IGF-II 가 존재한다. IGF-I 및 IGF-II 는, 후술하는 IGF-I 수용체 (인슐린형 성장 인자-I 수용체 : Insulin-like Growth Factor-I Receptor) 에 결합하여, 세포 내에 세포 분열이나 대사의 시그널을 넣는 아고니스트 활성을 갖는 생체 내의 리간드이다. IGF-I 및 IGF-II 는, IGF-I 수용체와 구조적으로 유사성이 있는 인슐린 수용체 (INSR) 에도 약하게 교차적으로 결합하는 것이 알려져 있다. 본 명세서에서는, 생리적 기능 등이 보다 잘 알려져 있는 IGF-I 을 주로 취급하지만, IGF-I 수용체와 리간드의 결합을 개재하는 작용이나 질환 등의 검토를 실시하는 경우에는 IGF-I 과 IGF-II 의 양자의 작용을 포함하여 기재하는 경우가 있다.
IGF-I 은 소마토메딘 C 라고도 불리며, 70 아미노산으로 이루어지는 단일 폴리펩티드의 호르몬이다. 인간의 IGF-I 의 서열은 EMBL-EBI 의 UniProtKB-액세션 번호 P50919 등을 참조하여 입수할 수 있지만, 서열표의 서열 번호 1 에 성숙형 IGF-I 의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 70 아미노산으로 이루어지는 서열은, 많은 종에서 보존되어 있다. 본 발명에 있어서는, 「IGF-I」이라고만 기재된 경우에는, 특별히 언급이 없는 한, 호르몬 활성을 갖는 IGF-I 단백질을 의미한다.
IGF-I 은 간장 세포를 비롯하여 생체 내의 여러 가지 세포에서 산생되어 있고, 혈액이나 그 밖의 체액 중에도 존재한다. 따라서, 천연형의 IGF-I 은 동물의 체액이나, 동물로부터 분리한 초대 배양 세포나 주화 세포 등을 배양한 배양물로부터 정제하여 얻을 수 있다. 또, IGF-I 은 성장 호르몬에 의해 세포에서의 산생이 유도되기 때문에, 성장 호르몬이 투여된 동물의 체액이나, 동물로부터 분리한 초대 배양 세포나 주화 세포 등을 성장 호르몬 존재하에서 배양한 배양물로부터도 IGF-I 을 정제함으로써 얻을 수 있다. 또, 다른 방법으로서, IGF-I 의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자를 발현 벡터에 짜넣고 대장균 등의 원핵 생물이나 효모, 곤충 세포 또는 포유류 유래의 배양 세포 등의 진핵 세포의 숙주에 도입한 재조합체 세포나, IGF-I 유전자를 도입한 트랜스제닉 동물이나 트랜스제닉 식물 등을 사용하여, IGF-I 을 제조하는 것도 가능하다. 또한, 인간 IGF-I 은 연구용 시약 (Enzo Life Sciences, catalog : ADI-908-059-0100, Abnova, catalog : P3452 등), 의약품 (소마존 (등록상표) 메카세르민, INCRELEX (등록상표) 등) 으로서 입수하는 것도 가능하다. 사용하는 IGF-I 의 in vivo 및 in vitro 에서의 활성은, World Health Organization 의 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) 의 NIBSC 코드 : 91/554 의 IGF-I 표준 물질에서의 활성을 1 국제 유닛/마이크로그램으로서 비교함으로써, 그 비활성을 평가할 수 있다. 본 발명에 있어서의 IGF-I 은, 당해 NIBSC 코드 : 91/554 의 IGF-I 과 동등한 비활성을 갖는 것으로서 취급하는 것으로 한다.
[IGF-I 수용체]
IGF-I 수용체는 인슐린형 성장 인자-I 수용체 (Insulin-like Growth Factor-I Receptor) 를 말한다. 본 명세서에 있어서 「IGF-I 수용체」는, 특별히 언급이 없는 한, IGF-I 수용체 단백질을 의미한다. IGF-I 수용체는 α 사슬과 β 사슬로 이루어지는 서브유닛이 2 개 회합한 구조의 단백질이다. 서열 번호 2 에 나타낸 인간 IGF-I 수용체의 아미노산 서열에 있어서는, 그 아미노산 서열 중, 31 번째부터 735 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 부분이 α 사슬에 상당하고, β 사슬은 740 번째 이후의 서열에 상당한다. IGF-I 수용체의 α 사슬은 IGF-I 의 결합 부분을 갖고, β 사슬은 막 관통형의 구조이고, 세포 내에 대한 시그널을 전달하는 기능을 한다. IGF-I 수용체의 α 사슬은, L1, CR, L2, FnIII-1 및 FnIII-2a/ID/FnIII-2b 의 도메인으로 나누어진다. 서열 번호 2 에 나타낸 인간 IGF-I 수용체의 아미노산 서열에 있어서는, 31 번째부터 179 번째의 부분이 L1 도메인, 180 번째부터 328 번째의 부분이 CR 도메인, 329 번째부터 491 번째의 부분이 L2 도메인, 492 번째부터 607 번째의 부분이 FnIII-1 도메인 및 608 번째부터 735 번째까지가 FnIII-2a/ID/FnIII-2b 도메인에 상당한다. 그 중에서도 CR (cysteine-rich domain) 도메인은, IGF-I 이 IGF-I 수용체에 결합했을 때의 당해 수용체의 입체 구조의 변화에 수반하는, β 사슬의 세포 내 티로신키나아제의 활성화에 관여한다. 인간의 IGF-I 수용체의 아미노산 서열은, EMBL-EBI 의 UniProtKB-액세션 번호 P08069 등으로부터 참조하는 것이 가능하지만, 서열표의 서열 번호 2 에도 나타낸다.
IGF-I 수용체는 생체 내의 조직이나 세포의 넓은 범위에서 발현하고 있는 것이 알려져 있고, IGF-I 에 의한 세포 증식의 유도나 세포 내 시그널의 활성화 등의 자극을 받는다. 특히 근아세포는 IGF-I 의 IGF-I 수용체를 개재하는 작용을, 세포 증식 활성을 지표로 하여 평가 가능하다. 이러한 점에서 근아세포는, IGF-I 수용체에 결합하는 항체의 작용을 해석함에 있어서 유용하다. 또, 인간이나 그 밖의 척추 동물의 IGF-I 수용체의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자를 발현 벡터에 짜넣고, 곤충 세포 또는 포유류 유래의 배양 세포 등의 진핵 세포의 숙주에 도입한 재조합체 세포에 있어서, 그 세포막 상에 도입된 핵산이 코드하는 IGF-I 수용체를 발현시킴으로써, 인간이나 그 밖의 척추 동물의 IGF-I 수용체를 발현한 세포를 인공적으로 제조하는 것이 가능하다. 당해 IGF-I 수용체 발현 세포는 항체의 결합성의 해석이나 세포 내에 대한 시그널의 전달 등의 검토에 사용할 수 있다.
[항 IGF-I 수용체 항체]
항체란, 디술파이드 결합에 의해 상호 결합된 적어도 2 개의 중 (H) 사슬 및 2 개의 경 (L) 사슬을 포함하는 당 단백질이다. 각각의 중사슬은, 중사슬 가변 영역 (VH 라고 약기된다) 및 중사슬 정상 영역을 포함하고, 중사슬 정상 영역은, 3 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함한다. 각각의 경사슬은, 경사슬 가변 영역 (VL 이라고 약기된다) 및 경사슬 정상 영역을 포함한다. 경사슬 정상 영역은, 1 개의 도메인, CL 을 포함한다. 경사슬의 정상 영역에는 λ 사슬 및 κ 사슬이라고 불리는 2 종류가 존재한다. 중사슬의 정상 영역에는 γ 사슬, μ 사슬, α 사슬, δ 사슬 및 ε 사슬이 존재하고, 그 중사슬의 차이에 의해, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 라고 하는 항체의 아이소타입이 존재한다. VH 및 VL 영역은, 추가로 프레임워크 영역 (FR) 이라고 칭해지는, 보다 보존되어 있는 4 개의 영역 (FR-1, FR-2, FR-3, FR-4) 과, 상보성 결정 영역 (CDR) 이라고 칭해지는 초가변성의 3 개의 영역 (CDR-1, CDR-2, CDR-3) 으로 세분된다. VH 는, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로, FR-1, CDR-1(CDR-H1), FR-2, CDR-2(CDR-H2), FR-3, CDR-3(CDR-H3), FR-4 의 순서로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR 을 포함한다. VL 은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로, FR-1, CDR-1(CDR-L1), FR-2, CDR-2(CDR-L2), FR-3, CDR-3(CDR-L3), FR-4 의 순서로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR 을 포함한다. 중사슬 및 경사슬의 가변 영역은, 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 포함한다.
본 발명에 있어서의 항체는, 항체의 단편 및/또는 유도체여도 된다. 항체의 단편으로는, F(ab')2, Fab, Fv 등을 들 수 있다. 항체의 유도체로는, 정상 영역 부분에 인공적으로 아미노산 변이를 도입한 항체, 정상 영역의 도메인의 구성을 개변한 항체, 1 분자당 2 개 이상의 Fc 를 갖는 형태의 항체, 중사슬만 또는 경사슬만으로 구성되는 항체, 당사슬 개변 항체, 이중 특이성 항체, 항체 또는 항체의 단편 화합물이나 항체 이외의 단백질과 결합시킨 항체 콘주게이트, 항체 효소, 나노보디, 탠덤 scFv, 이중 특이성 탠덤 scFv, 다이아보디 (Diabody), VHH 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 간단히 「항체」라고 하는 경우에는, 별도 명기하지 않는 한, 항체의 단편 및/또는 유도체도 포함하는 것으로 한다.
또, 모노클로날 항체란, 고전적으로는 단일의 항체 산생 세포에 유래하는 클론으로부터 얻어진 항체 분자를 말하지만, 특정 아미노산 서열로 이루어지는 VH 와 VL 의 조합을 포함하는 단일 종류의 항체 분자를 말한다. 모노클로날 항체는, 그 항체의 단백질의 아미노산을 코드하는 유전자 서열을 갖는 핵산 분자를 얻는 것도 가능하고, 그러한 핵산 분자를 사용하여 유전자 공학적으로 항체를 제조하는 것도 가능하다. 또, H 사슬, L 사슬, 그것들의 가변 영역이나 CDR 서열 등의 유전자 정보를 사용하여 항체의 결합성이나 특이성의 향상을 위한 개변 등을 실시하는 것이나, 마우스 등의 동물의 항체로부터 인간형 항체로 개변함으로써 치료제에 사용하기 위해 적합한 구조의 항체를 제조하는 것은, 이 분야에서의 당업자에게는 잘 알려진 기술이다. 또, 항원을 감작하는 동물로서, 인간 항체 유전자가 도입된 비인간-트랜스제닉 동물을 사용함으로써, 인간형의 모노클로날 항체를 취득하는 것도 가능하다. 그 이외에도, 동물에 대한 감작을 필요로 하지 않는 방법으로서, 인간 항체의 항원 결합 영역 또는 그 일부를 발현하는 파지 라이브러리 (인간 항체 파지 디스플레이) 를 사용하여, 대응하는 항원과 특이적으로 결합하는 항체나 특정 아미노산 서열로 이루어지는 파지 클론을 취득하고, 그 정보로부터 인간 항체를 제조하는 기술도 당업자라면 적절히 실시할 수 있다 (예를 들어, Taketo Tanaka 등, Keio J. Med., 60권, p37-46 의 리뷰 등을 참조). 또, 인간 이외의 동물에 투여하는 항체를 디자인하는 경우에는, 인간화의 기술과 동일하게, 적절히 CDR 이나 가변 영역의 아미노산 서열 정보를 사용하여, 당업자라면 디자인하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 「항원 항체 반응」이란, IGF-I 수용체에 대하여, 항체가 평형 해리 정수 (KD) 1 × 10-8 M 이하의 친화성으로 결합하는 것을 말한다. 본 발명의 항체는, IGF-I 수용체에 대하여, 통상 1 × 10-8 M 이하, 그 중에서도 1 × 10-9 M 이하, 나아가서는 1 × 10-10 M 이하의 KD 로 결합하는 것이 바람직하다.
항체의 특이성이란, 항체가 어느 항원에 대하여 높은 항원 항체 반응이 일어나는 것을 말한다. 특히, 본 발명에 있어서는, IGF-I 수용체 특이적 항체란, IGF-I 수용체를 발현시킨 세포와 유의하게 항원 항체 반응을 나타내는 농도에 있어서, IGF-I 수용체의 1 차 구조 (아미노산 서열) 및 고차 구조와 높은 유사성을 갖는 INSR 에 대한 항원 항체의 반응성이 Mock 세포에 대한 반응성의 1.5 배 이하인 경우를 말한다.
항원 항체 반응의 측정은, 당업자라면 고상 또는 액상의 계에서의 결합 측정을 적절히 선택하여 실시하는 것이 가능하다. 그러한 방법으로는, 효소 결합 면역 흡착법 (enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA), 효소 면역 측정법 (enzyme immunoassay : EIA), 표면 플라즈몬 공명법 (surface plasmon resonance : SPR), 형광 공명 에너지 이동법 (fluorescence resonance energy transfer : FRET), 발광 공명 에너지 이동법 (luminescence resonance energy transfer : LRET) 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 또, 그러한 항원 항체 결합을 측정할 때에, 항체 및/또는 항원을 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 등으로 표지를 실시하고, 그 표지한 물질의 물리적 및/또는 화학적 특성에 적절한 측정 방법을 사용하여 항원 항체 반응을 검출하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서의 항 IGF-I 수용체 항체는, 아고니스트 항체와 안타고니스트 항체의 양방을 포함한다. 본 발명의 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, 단독으로 작용시킨 경우, 근아세포의 증식 활성의 항진 작용을 갖는다. 본 발명의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체는, IGF-I 과 동시에 작용시킨 경우, IGF-I 에 의한 근아세포의 증식 활성의 저해 작용을 갖는다.
본 발명에 있어서의, IGF-I 수용체의 특이적인 도메인에 강력하게 결합하는 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, in vitro 에서 근아세포의 증식 활성의 항진 작용을 갖는다.
또, 본 발명의 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, 근아세포의 증식 활성을 항진시키는 작용 농도, 보다 바람직하게는 작용 농도보다 10 배 높은 농도, 더욱 바람직하게는 100 배 높은 농도에서, in vitro 에서의 분화 근세포의 글루코오스 흡수 항진 작용을 갖지 않는다.
IGF-I 의 근육량 증가 작용을 나타내는 용량은, 현저한 혈당 저하 작용을 갖지만, 본 발명의 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, 근육량 증가 작용을 나타내는 용량, 보다 바람직하게는 그 용량보다 10 배 이상 높은 용량에서조차도, 혈당 저하 작용을 갖지 않는다.
또한, 모르모트에 대한 IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 단회 투여는, IGF-I 을 지속 투여했을 때의 근육량 증가 작용과 동일한 정도의 in vivo 활성을 갖는다. 또, 본 발명의 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, 혈중 반감기가 길고, 동물에 대한 단회 투여에 의해 근육량 증가 작용을 나타낸다.
이상으로부터, 본 발명의 IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, IGF-I 에서 기대되는, 폐용성 근위축 및 저신장증 등의 IGF-I 수용체가 관련하는 여러 가지 질환의 치료약 또는 예방약이 될 가능성을 갖고, IGF-I 의 문제점인, 혈당 저하 작용을 극복하고, 혈중 반감기를 장기화하는 것이 가능하다.
본 발명의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체는, IGF-I 이 IGF-I 수용체에 결합하는 것을 저해한다. 본 발명의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체의 일 양태로는, 당해 항체는 IGF-I 수용체를 활성화하지만, IGF-I 에 의한 IGF-I 수용체에 대한 작용을 저해한다. 이 경우, 당해 항체는 IGF-I 의 상가적인 아고니스트 활성, 예를 들어 근아세포의 IGF-I 에 의한 증식 유도 활성을 없애는 작용이 있다. 또, 본 발명의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체의 다른 양태로는, IGF-I 수용체와 결합하지만 IGF-I 수용체를 활성화시키지 않는 항체이다. 이와 같은 IGF-I 수용체의 가교에 의한 활성화를 일으키지 않는 안타고니스트 항체의 예로는, Fab, scFv 등의 항원 결합성이 1 가인 항체, 이중 특이성 항체와 같이 2 가의 결합 부위를 갖지만 그 편측의 결합 부위만이 IGF-I 수용체의 특이적 도메인에 결합하는 항체 또는 2 가의 결합 부위의 거리를 링커 등으로 변화시킨 항체 등이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체에 있어서, IGF-I 수용체와 결합하지만, 아고니스트 활성을 갖지 않는 항체는, 항체와 IGF-I 수용체의 항원 항체 반응을 측정하는 방법에 의해 IGF-I 수용체에 대한 결합성을 갖는 것, 근아세포 등의 세포에서의 세포 증식 시험에 의해 세포 증식의 유도 활성을 갖지 않는 것을 확인할 수 있다. 또, 당해 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체는, in vitro 에서의 분화 근세포의 글루코오스 흡수나 in vivo 에서의 혈당치에 대하여 영향을 주지 않는다. 따라서, 본 발명의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체는 고혈당 등의 부작용을 나타내지 않는 항 IGF-I 수용체 항체로서 유암, 대장암, 사르코마, 폐암, 전립선암, 갑상선암, 미엘로마 등의 악성 종양 등의 치료약 또는 예방약이 될 가능성을 갖고 있다.
[항 IGF-I 수용체 항체의 결합]
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, IGF-I 수용체의 CR 도메인을 에피토프로 한다. 한편, IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, IGF-I 수용체의 1 차 구조 (아미노산 서열) 및 고차 구조와 높은 유사성을 갖는 INSR 에는 결합성을 갖지 않는다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, IGF-I 수용체의 CR 도메인에 결합함으로써, IGF-I 수용체가 2 량체를 형성한 호모형의 수용체, 혹은 IGF-I 수용체와 INSR 이 2 량체를 형성한 헤테로형의 수용체를 활성화시키는 것을 생각할 수 있다.
[항 IGF-I 수용체 항체의 서열]
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하고, 세포 증식의 유도 활성을 갖는 것이면, 서열은 특별히 한정되지 않는다.
그러나, 각 CDR 서열로서, 특정 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로는 이하와 같다. 또한, 본 발명에 있어서 아미노산 서열의 「동일성」 (identity) 이란, 일치하는 아미노산 잔기의 비율을 의미하고, 상동성 (similarity) 이란, 일치 또는 유사한 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. 상동성 및 동일성은, 예를 들어 BLAST 법 (NCBI 의 PBLAST 의 디폴트 조건) 에 의해 결정할 수 있다.
여기서 「유사한 아미노산 잔기」란, 동일한 화학적 특징 (예를 들어, 전하 또는 소수성) 을 갖는 측사슬을 갖는 아미노산 잔기를 의미한다. 유사한 아미노산 잔기로는, 예를 들어 이하의 조합을 들 수 있다.
1) 지방족 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신 잔기.
2) 지방족 하이드록실 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 세린 및 트레오닌 잔기.
3) 아미드 함유 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 아스파라긴 및 글루타민 잔기.
4) 방향족 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판 잔기.
5) 염기성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 잔기.
6) 산성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 아스파르트산 및 글루타민산 잔기.
7) 황 함유 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 : 시스테인 및 메티오닌 잔기.
본 발명에 있어서, 중사슬 가변 영역의 CDR-1(CDR-H1) 서열로서 서열 번호 3 (SerTyrTrpMetHis) 또는 서열 번호 3 중 어느 1 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열이 바람직하다. 또, CDR-H1 서열로는 서열 번호 3 과 80 ％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 어느 아미노산 서열 중의 어느 아미노산 잔기 (이하 「제 1 아미노산 잔기」) 가 다른 아미노산 잔기 (이하 「제 2 아미노산 잔기」) 에 의해 치환되는 경우, 치환 전의 제 1 아미노산 잔기와 치환 후의 제 2 아미노산 잔기는, 구조 및/또는 성질이 서로 유사한 것인 것이 보다 바람직하다.
중사슬 가변 영역의 CDR-2(CDR-H2) 서열로서 서열 번호 4 (GluThrAsnProSerAsnSerValThrAsnTyrAsnGluLysPheLysSer) 또는 서열 번호 4 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열이 바람직하다. 또, CDR-H2 서열로는 서열 번호 4 와 82 ％ 이상, 그 중에서도 88 ％ 이상, 더욱 94 ％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.
중사슬 가변 영역의 CDR-3(CDR-H3) 서열로서 서열 번호 5 (GlyArgGlyArgGlyPheAlaTyr) 또는 서열 번호 5 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열이 바람직하다. 또, CDR-H3 서열로는 서열 번호 5 와 75 ％ 이상, 보다 바람직하게는 87 ％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.
경사슬 가변 영역의 CDR-1(CDR-L1) 서열로서 서열 번호 6 (ArgAlaSerGlnAsnIleAsnPheTrpLeuSer) 또는 서열 번호 6 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열이 바람직하다. 또, CDR-L1 서열로는 서열 번호 6 과 81 ％ 이상의 상동성, 그 중에서도 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.
경사슬 가변 영역의 CDR-2(CDR-L2) 서열로서 서열 번호 7 (LysAlaSerAsnLeuHisThr) 또는 서열 번호 7 중 어느 1 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열이 바람직하다. 또, CDR-L2 서열로는 서열 번호 7 과 85 ％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.
경사슬 가변 영역의 CDR-3(CDR-L3) 서열로서 서열 번호 8 (LeuGlnGlyGlnSerTyrProTyrThr) 또는 서열 번호 8 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열이 바람직하다. 또, CDR-L3 서열로는 서열 번호 8 과 77 ％ 이상, 보다 바람직하게는 88 ％ 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 이하의 CDR 서열의 조합을 갖는 것이 바람직하다.
CDR-H1 서열로서 서열 3 의 아미노산 서열,
CDR-H2 서열로서 서열 4 의 아미노산 서열,
CDR-H3 서열로서 서열 5 의 아미노산 서열,
CDR-L1 서열로서 서열 6 의 아미노산 서열,
CDR-L2 서열로서 서열 7 의 아미노산 서열, 및
CDR-L3 서열로서 서열 8 의 아미노산 서열.
또한, 항체에 있어서의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3 의 각 서열을 동정하는 방법으로는, 예를 들어 Kabat 법 (Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.5, pp.1709-1719) 이나 Chothia 법 (Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948) 을 들 수 있다. 이들 방법은, 이 영역의 당업자에게 있어서는 기술 상식이지만, 예를 들어 Dr. Andrew C.R. Martin's Group 의 인터넷 홈페이지 (http://www.bioinf.org.uk/abs/) 로부터 개요를 아는 것도 가능하다.
본 발명의 항체인 면역 글로불린의 프레임워크 서열은, 척추 동물의 면역 글로불린의 각 클래스에 있어서의 프레임워크 서열인 것이 바람직하다. 특히, 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개, 닭, 마우스 혹은 래트를 포함하는 비인간 동물의 면역 글로불린의 각 클래스에 있어서의 프레임워크 서열인 것이 바람직하다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역으로서, 특정 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로는 이하와 같다.
중사슬 가변 영역으로서 서열 번호 9, 서열 번호 9 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9 와 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이 바람직하다. 경사슬 가변 영역으로서 서열 번호 10, 서열 번호 10 중 어느 1 지점 또는 2 지점의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 혹은 삽입된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10 과 90 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이 바람직하다. 특히, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, IGF11-16 이 바람직하다. 즉, 중사슬 가변 영역으로서 서열 번호 9, 경사슬 가변 영역으로서 서열 번호 10 의 조합의 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
이상의 중사슬 및 경사슬의 각 CDR 및/또는 각 사슬 가변 영역의 아미노산 서열에, 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각 프레임워크 영역 및/또는 각 정상 영역의 아미노산 서열을 적절히 조합함으로써, 당업자라면 본 발명의 인간화 항 IGF-I 수용체 항체를 설계하는 것이 가능하다. 인간화 항체의 중사슬 및 경사슬의 각 프레임워크 영역 및/또는 각 정상 영역의 아미노산 서열은, 예를 들어 인간의 IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 의 각 클래스 또는 그 변이체로부터 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 IGF-I 수용체 아고니스트 항체인 경우에는, 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 인간 IgG 클래스 또는 그 변이체, 바람직하게는 인간 IgG4 서브클래스, 인간 IgG1 서브클래스 또는 그 변이체이다. 일례에서는, 안정화 IgG4 정상 영역은, Kabat 의 계에 의해, 힌지 영역의 위치 241 에 있어서 프롤린을 포함한다. 이 위치는, EU 부번 방식 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE Publishing, 1992, Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 63, 78-85, 1969) 에 의해, 힌지 영역의 위치 228 에 대응한다. 인간 IgG4 에서는, 이 잔기는 일반적으로 세린이고, 세린의 프롤린으로의 치환으로 안정화를 유도할 수 있다. 일례에서는, IgG1 의 정상 영역에 N297A 변이를 도입하여 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 보체를 고정시키는 능력을 가능한 한 억제할 수 있다.
[경합 결합]
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체와, IGF-I 수용체에 대하여 경합 결합하는 항체도, 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에 있어서 「경합 결합」이란, 복수 종의 모노클로날 항체가 항원과 공존할 때에, 일방의 항체의 항원에 대한 결합이, 타방의 항체의 항원에 대한 결합에 의해 저해되는 현상을 의미한다. 일반적으로는, 일정량 (농도) 의 모노클로날 항체에 대하여, 다른 모노클로날 항체의 양 (농도) 을 바꾸어 첨가해 나간 경우에, 전자의 일정량의 모노클로날 항체의 항원에 대한 결합량이 저하되는 첨가량 (농도) 을 측정함으로써 측정 가능하다. 그 저해의 정도는, IC50 또는 Ki 라고 하는 값으로 나타낼 수 있다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체와 경합 결합하는 모노클로날 항체란, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체, 예를 들어 IGF11-16 항체를 10 nM 로 사용하여 항원 항체 결합을 검출했을 때에, IC50 이 통상 1000 nM 이하, 그 중에서도 100 nM 이하, 나아가서는 10 nM 이하인 항체를 말한다. 경합 결합의 측정을 실시하는 경우, 사용하는 항체를 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 등으로 표지를 실시하고, 그 표지한 물질의 물리적 및/또는 화학적 특성에 적절한 측정 방법을 사용하여 검출함으로써 그 측정을 실시하는 것도 가능하다.
[교차 반응]
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 다른 척추 동물의 IGF-I 수용체에 대하여 교차 반응을 갖는 것이 바람직하다. 교차 반응이란, 그 항체가 항원 항체 반응을 하는 IGF-I 수용체의 동물종 (예를 들어 인간) 과는 상이한, 다른 동물종의 항원에 대한 항체의 결합성을 나타낸다. 그 항체가 항원 항체 반응을 하는 IGF-I 수용체의 동물종 이외인, 인간, 또는 모르모트, 원숭이, 토끼, 소, 돼지, 말, 양, 개 혹은 닭을 포함하는 비인간 동물의 IGF-I 수용체와 교차 반응성을 갖는 것이 바람직하다. 실시예 7 에 있어서 항 IGF-I 수용체 항체인 IGF11-16 항체는, 인간 IGF-I 수용체의 CR 도메인에 있어서의 ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 의 서열과 결합하는 것이 밝혀졌다. 원숭이 (게잡이 원숭이), 토끼, 모르모트, 소, 양, 말 및 개의 IGF-I 수용체의 상동적인 부분에 있어서, 이 ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 의 서열이 보존되어 있고, 이들 종 사이에서의 IGF-I 수용체와 결합 교차성이 있다. 또, 마우스 및 래트에 있어서는, 당해 상동적인 부분의 아미노산 서열이 ProSerGlyPheIleArgAsnSerThrGlnSerMet 로 되어 있고, 이 부분에 결합하는 항 IGF-I 수용체 항체를 취득함으로써, 마우스나 래트 등의 IGF-I 수용체와 결합하고, IGF11-16 과 동일한 성상이나 기능을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다.
또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체와 교차 반응하지 않는 동물의 종을 사용하여, 그 세포나 동물을 유전자 공학적으로 개변시킴으로써, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 교차 반응하는 IGF-I 수용체를 발현하는 세포나 동물을 제조하는 것도 가능하다.
[척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성, 근육량 및/또는 체장의 증가의 유도 활성]
본 발명의 어느 양태에 있어서의 항 IGF-I 수용체 항체는, 척추 동물 유래 세포의 증식 유도 활성을 갖는다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 존재는 이미 알려져 있었지만, 초대 배양 세포, 그 중에서도 근아세포에 있어서 세포의 증식 유도 활성을 나타낸 항체의 보고는 없었다. 또한, in vitro 에 있어서 IGF-I 의 EC50 값보다 저용량으로 세포의 증식 유도 활성을 갖는 항체의 보고도 없었다. 본 발명에 있어서의 척추 동물 유래 세포란, 바람직하게는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류에 유래하는 세포이고, 보다 바람직하게는 포유류 또는 조류에 유래하는 세포이고, 더욱더 바람직하게는, 인간, 원숭이, 토끼, 모르모트, 소, 돼지, 양, 말 또는 개에 유래하는 세포이다. 이들 종에 유래하는 세포로, IGF-I 수용체를 발현하고, 당해 IGF-I 수용체에 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 교차 반응하는 세포이면, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의해 세포 증식이 유도될 수 있다. 또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체와 교차 반응성이 있는 종의 IGF-I 수용체가 발현되도록 개변된 세포나 동물, 또는 당해 개변 동물에 유래하는 세포도, 본 발명에 있어서의 척추 동물 유래 세포에 포함된다.
척추 동물 유래 세포의 in vitro 에 있어서의 증식 유도 활성을 조사하기 위한 세포로는, 초대 배양 세포, 주화 세포 또는 그들 세포의 형질 전환체 세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 초대 배양 세포란, 생물의 장기나 조직으로부터 분리된 세포로, 통상은 어느 정도의 계대수로의 계대 배양이 가능한 것을 말한다. 척추 동물 유래의 초대 배양 세포는, 척추 동물의 장기나 조직으로부터 효소 처리, 물리적 방법에 의한 분산 또는 explant 법 등의 수법으로 얻을 수 있다. 또, 척추 동물로부터 얻어진 장기나 조직, 또는 그것들의 단편을 사용하는 것도 가능하다. 그들 당해 초대 세포를 조제하는 장기나 조직으로는, 바람직하게는 갑상선, 부갑상선이나 부신 등의 내분비 조직, 충수, 편도선, 림프절이나 비장 등의 면역 조직, 기관이나 폐 등의 호흡기, 위, 십이지장, 소장이나 대장 등의 소화기, 신장이나 방광 등의 비뇨기, 수정관, 고환이나 전립선 등의 웅성 생식기, 유방이나 난관 등의 자성 생식기, 심근이나 골격근 등의 근조직 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 간장, 신장 혹은 소화기 또는 근조직 등이고, 더욱더 바람직하게는 근조직이다. 본 발명에서의 항 IGF-I 수용체 항체의 증식 유도 활성을 조사하기 위해 사용되는 당해 초대 배양 세포로는, IGF-I 수용체를 발현하고, 그 IGF-I 수용체와 결합하는 IGF-I 에 의해 증식이 유도되는 세포가 사용된다. 그 대표로는, 근조직으로부터 분리된 초대 배양 세포인 골격근 근아세포 등이 사용된다. 인간이나 동물 유래의 초대 배양 세포는 분양이나 시판되고 있는 것을 입수하여 사용하는 것도 가능하고, 인간 초대 배양 세포는, 예를 들어 ATCC (등록상표), ECACC, Lonza, Gibco (등록상표), Cell Applications, ScienCell research laboratories, PromoCell 등의 기관이나 회사로부터 입수할 수 있다.
주화 세포란 생물에 유래하는 세포가 불사화되어 일정한 성질을 유지하면서 반영구적으로 증식할 수 있는 배양 세포를 말한다. 주화 세포에는 비종양 유래의 것과 종양 유래의 것이 존재한다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 증식 유도 활성을 조사하기 위한 척추 동물 유래의 주화 세포로는, IGF-I 수용체를 발현하고, 그 IGF-I 수용체와 결합하는 IGF-I 에 의해 증식이 유도되는 세포가 사용된다. IGF-I 수용체를 발현하고, IGF-I 에 의해 세포 증식이 유도되는 주화 세포로는, 예를 들어 인간 신경아세포종 SH-SY5Y, 인간 표피 각화 세포주 HaCaT, 인간 폐포 기저 상피선암 세포주 A549, 인간 결장선암 세포주 Caco-2, 인간 간암 유래 세포주 HepG2, 인간 자궁 경부암 세포주 Hela, 인간 자궁 경부암 세포주 SiHa, 인간 유암 세포주 MCF7, 인간 다능성 태생기암 NTERA-2 나 인간 골육종 세포주 U-2-OS 등이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 증식 유도를 조사하는 세포로는, 초대 배양 세포나 주화 세포의 형질 전환체 세포도 들 수 있다. 그러한 형질 전환 세포로는, 초대 배양 세포로부터 제조한 iPS 세포나 그 iPS 세포로부터 분화 유도한 세포나 조직 등을 들 수 있다. 또, 다른 형질 전환 세포로는, 초대 배양 세포나 주화 세포에 유전자를 도입하고 일과적 또는 지속적으로 발현시킨 세포도 당해 형질 전환 세포에 포함된다. 당해 세포에 도입하여 발현시키는 유전자로는, 인간 또는 다른 종의 IGF-I 수용체의 유전자를 포함해도 된다.
척추 동물 유래의 세포에 있어서의 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 세포 증식 유도를 조사하는 방법으로는, 세포수 계측, DNA 합성량의 측정, 대사 효소 활성의 변화량의 측정 등을 들 수 있다. 세포수 계측의 방법은, 혈구 산정반을 사용한 방법이나 콜터 카운터 등의 세포수 계측 장치를 사용한 방법이 있고, DNA 합성량을 측정하는 방법으로는, [3H]-티미딘이나 5-브로모-2'-디옥시우리딘 (BrdU) 의 흡수에 의한 측정 방법, 대사 효소 활성의 변화량을 보는 방법으로는, MTT 법, XTT 법이나 WST 법 등이 있지만, 당업자라면 적절히 그 밖의 방법 등으로도 실시할 수 있다. 세포 증식 유도 활성은, 시험에 사용하는 배양 세포에 대하여, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 반응시킨 경우 쪽이, 당해 항체를 반응시키지 않은 경우보다 세포의 증식이 상승되어 있는 것에 의해 판정할 수 있다. 이 경우, 당해 유도 활성의 대조로서, 동 조건에서 본래의 IGF-I 수용체의 리간드인 IGF-I 을 반응시킨 측정을 실시하면, 그 활성의 평가에 편리하다.
시험을 실시하는 배양 세포에 대하여, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체 및 IGF-I 을 각각의 농도를 변화시켜 반응시켰을 때에, 최대의 증식 활성의 50 ％ 를 나타낼 때의 농도를 EC50 값으로서 나타낸다. 인간 골격근 근아세포를 사용하여 증식 활성을 평가한 경우, 바람직하게는 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 세포 증식 유도 활성은 IGF-I 과 동등한 EC50 값이고, 보다 바람직하게는 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 EC50 값은 IGF-I 의 1/10 이하이고, 더욱 바람직하게는 1/20 이하이고, 더욱더 바람직하게는 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 EC50 값은 IGF-I 의 1/50 이하이다. 또, 인간 골격근 근아세포를 사용하여 증식 활성을 평가한 경우, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 EC50 값은, 바람직하게는 0.5 nmol/L 이하이고, 보다 바람직하게는 0.3 nmol/L 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.1 nmol/L 이하이다.
척추 동물 유래 세포의 in vivo 에 있어서의 증식 유도 활성을 조사하는 방법으로는, 당해 척추 동물에 비경구적으로 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 투여하고, 투여된 개체 전체, 또는 투여된 개체에 있어서의 장기 또는 조직의 중량, 크기, 세포수 등의 변화를 계측하거나, 당해 척추 동물 세포가 이식된 동물을 사용하여, 당해 이식을 받은 개체에 있어서 당해 이식된 척추 동물 세포를 포함하는 이식편의 중량, 크기, 세포수 등의 변화를 계측함으로써 조사할 수 있다. 개체 전체에서의 계측에서는, 체중, 체장, 사지 주위 길이 등의 측정이나, 임피던스법에 의한 체조성 측정, 크레아티닌, 신장 계수 등이 사용된다. 개체에서의 장기나 조직, 또는 이식편의 계측에 대해서는, 인간 이외의 동물에서는 직접 목적의 장기, 조직 또는 이식편을 회수하고, 중량, 크기나 포함되는 세포수의 산정 등이 실시된다. 또, 비침습적으로 개체의 장기, 조직 또는 이식편을 계측하는 방법으로는, X 선 촬영 이미지나 CT, MRI 에 의한 화상 해석, 동위 원소나 형광 물질에 의한 트레이서를 사용한 조영법 등이 사용된다. 대상이 되는 조직이 골격근인 경우에는, 근력의 변화 등이 지표가 된다. 그 밖에, 당업자라면 적절히 그 밖의 방법을 사용함으로써, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 척추 동물 유래 세포의 in vivo 에 있어서의 증식 유도 활성에 대한 작용을 조사할 수 있다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 in vivo 에 있어서의 세포 증식 유도 활성을 조사하기 위해서는, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 투여한 개체와, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체 이외의 항체 또는 다른 대조 물질이 투여된 개체의 사이에서, 상기에 나타낸 방법 등에 의한 계측 등을 실시한 결과를 비교함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 세포에 접촉시킨 시간에 대하여, 증식 유도하는 작용이 천연형 IGF-I 에 대하여 길기 때문에, 지속성이 개선되었다는 특징을 갖는다. 실시예 12 에서의 in vitro 에서의 세포 증식 유도 활성에 있어서, 천연형 IGF-I 은 세포에 접촉시킨 후에 IGF-I 을 포함하지 않는 배지로 세정하면 세포 증식 유도 활성이 소실되는 데 대하여, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체인 IGF11-16 항체는, 세포에 접촉시킨 후 IGF11-16 항체를 포함하지 않는 배지로 세정한 경우에도 세포의 증식 유도 활성이 지속되고 있었다. 또, 실시예 16 에 있어서, IGF-I 과 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체인 IGF11-16 항체의 혈중 동태를 비교하고 있는데, 천연형 IGF-I 은 동물에 대한 투여 후 24 시간까지 약 50 ％ 이상이 혈중으로부터 소실되는 데 대하여, IGF11-16 항체는 동물에 투여된 후, 48 시간 후에도 60 ％ 이상이 혈중에 존재하는 점에서, 장기간에 걸쳐 혈중에 존재하고 있는 것이 밝혀졌다. 이러한 점들로부터, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, in vitro 및 in vivo 에 있어서 긴 세포 증식 유도 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 in vivo 에서의 효과로는, 근육량 및/또는 체장의 증대 효과를 들 수 있다. IGF-I 은 골격근에 있어서 상기 서술한 근아세포의 증식이나 분화에 작용하는 것 외에, 근섬유를 굵게 하는 작용도 있고, 그러한 종합적인 작용으로서 근육량을 증대시키는 효과가 있다고 생각되고 있다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체도 IGF-I 과 동일하게 동물에 투여함으로써, 당해 동물의 근육량을 증대시키는 효과를 갖는다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 작용으로서, in vivo 에서 근육의 증대 작용을 갖는 것이 밝혀진 것은, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 처음이다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 근육량의 증대 효과를 계측하는 방법으로는, 개체 전체에서의 계측에서는, 체중, 체장, 사지 주위 길이 등의 측정이나, 임피던스법에 의한 체조성 측정, 크레아티닌, 신장 계수 등이 사용되고, 또, CT, MRI 에 의한 화상 해석, 동위 원소나 형광 물질에 의한 트레이서를 사용한 조영법 등의 방법이 사용되는 것 외에, 근력의 변화 등도 지표가 된다. 또, 인간 이외의 동물에서는 직접 근육을 채취하여 그 중량이나 크기를 계측하는 방법 등도 가능하다. 근육량의 증가의 효과는, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 투여된 개체와 당해 항체가 투여되지 않은 개체에서의 근육량의 증가를 비교하는 것, 또는, 하나의 개체에서 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 투여하기 전과 투여한 후에서의 근육량의 비교를 실시함으로써 평가할 수 있다. 근육량의 증가의 효과는, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 투여에 의해 근육량의 증가의 차가 보이면, 그 효과를 알 수 있는데, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 투여된 개체와 투여되지 않은 개체, 또는, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 투여되기 전과 후에서, 바람직하게는 103 ％ 이상, 보다 바람직하게는 104 ％ 이상의 근육량의 차가 확인됨으로써 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 투여에 의한 효과를 판단하는 것이 가능하다. IGF-I 은 뼈의 성장에도 관여하고, 체장 (인간의 경우에는 신장) 을 증대시키는 기능도 있다. 따라서, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체도, 동물에 투여함으로써 체장을 증대시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 체장 증대의 효과는, 개체의 체중, 체장, 사지 주위 길이 등의 측정에 의해 계측하는 것이 가능하다.
[척추 동물 유래 세포에서의 글루코오스 흡수 및/또는 동물에서의 혈당치에 대한 작용]
본 발명의 어느 양태에 있어서의 항 IGF-I 수용체 항체는, 척추 동물 유래의 분화 근세포에서의 세포 내로의 글루코오스의 흡수 작용 및/또는 척추 동물에서의 혈당치에 영향을 미치지 않는 특징을 갖는다. IGF-I 은 IGF-I 수용체에 대한 아고니스트 작용의 일부로서 세포로의 글루코오스의 흡수의 상승이나 혈당치의 강하 작용을 일으키는 것이 알려져 있지만, IGF-I 수용체 아고니스트 항체로서 기능하는 본 발명에서의 항 IGF-I 수용체 항체에서는 세포에서의 증식 유도 활성의 in vitro 에 있어서의 EC50 값의 100 배 이상의 용량에 있어서도 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수를 유도하지 않고, 동물에 비경구적으로 투여한 경우에 근육량의 증가를 유도하는 유효 용량의 추가로 10 배 이상에서도 혈당치를 변동시키지 않는다는 성상을 나타내는 것은 예상외의 효과이다. 또, IGF-I 수용체 안타고니스트 항체로서의 성상으로서도, 척추 동물 유래 세포의 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수 및/또는 척추 동물에서의 혈당치에 영향을 미치지 않는다는 특징은, 종래의 IGF-I 수용체 안타고니스트 항체를 인간의 치료에서 사용할 때의 미충족의 과제였던 고혈당 등을 회피하는 데에 있어서 유리한 효과이다. 본 발명에 있어서의 척추 동물 유래 세포란, 바람직하게는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류에 유래하는 세포이고, 보다 바람직하게는 포유류 또는 조류에 유래하는 세포이고, 더욱더 바람직하게는, 인간, 원숭이, 토끼, 모르모트, 소, 돼지, 양, 말 또는 개에 유래하는 세포이다. 또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체와 교차 반응성을 갖는 척추 동물종 유래의 IGF-I 수용체 혹은 결합성을 갖도록 변이를 도입한 IGF-I 수용체가 발현되도록 개변된 세포나 동물, 또는 당해 개변 동물에 유래하는 세포도, 본 발명에 있어서의 척추 동물 유래 세포에 포함된다.
본 발명에서의 항 IGF-I 수용체 항체의 척추 동물 유래 세포의 in vitro 에 있어서의 세포 내로의 글루코오스 흡수에 영향을 미치지 않는 특징을 조사하기 위한 세포로는, 초대 배양 세포, 주화 세포 또는 그들 세포의 형질 전환체 세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 초대 배양 세포란, 생물의 장기나 조직으로부터 분리된 세포로, 통상은 어느 정도의 계대수로의 계대 배양이 가능한 것을 말한다. 척추 동물 유래의 초대 배양 세포는, 척추 동물의 장기나 조직으로부터 효소 처리, 물리적 방법에 의한 분산 또는 explant 법 등의 수법으로 얻을 수 있다. 당해 초대 세포를 조제하는 장기나 조직으로는, 바람직하게는 갑상선, 부갑상선이나 부신 등의 내분비 조직, 충수, 편도선, 림프절이나 비장 등의 면역 조직, 기관이나 폐 등의 호흡기, 위, 십이지장, 소장이나 대장 등의 소화기, 신장이나 방광 등의 비뇨기, 수정관, 고환이나 전립선 등의 웅성 생식기, 유방이나 난관 등의 자성 생식기, 심근이나 골격근 등의 근조직 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 간장, 신장 혹은 소화기 또는 근조직 등이고, 더욱더 바람직하게는 근조직이다.
본 발명에서의 항 IGF-I 수용체 항체의 세포 내로의 글루코오스 흡수에 영향을 미치지 않는 특징을 조사하기 위해 사용되는 당해 초대 배양 세포로는, IGF-I 수용체를 발현하고, 그 IGF-I 수용체와 결합하는 IGF-I 에 의해 세포 내로의 글루코오스 흡수가 유도되는 세포가 사용된다. 그 대표로는, 근조직으로부터 분리된 초대 배양 세포인 골격근 근아세포를 분화시킨, 분화 근세포를 들 수 있다.
본 발명의 분화 근세포란, 분화한 근세포를 말하며, 완전하게 분화가 종료되지 않은 것도 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서의 「분화 근세포」는, 편의상, 분화 개시로부터 약 6 일 후의 세포를, 분화 근세포라고 한다. 인간이나 동물 유래의 초대 배양 세포는 분양이나 시판되고 있는 것을 입수하여 사용하는 것도 가능하고, 인간 초대 배양 세포는, 예를 들어 ATCC (등록상표), ECACC, Lonza, Gibco (등록상표), Cell Applications, ScienCell research laboratories, PromoCell 등의 기관이나 회사로부터 입수할 수 있다.
주화 세포란 생물에 유래하는 세포가 불사화되어 일정한 성질을 유지하면서 반영구적으로 증식할 수 있는 배양 세포를 말한다. 주화 세포에는 비종양 유래의 것과 종양 유래의 것이 존재한다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 세포 내로의 글루코오스 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위한 척추 동물 유래의 주화 세포로는, IGF-I 수용체를 발현하고, 그 IGF-I 수용체와 결합하는 IGF-I 에 의해 세포 내로의 글루코오스 흡수가 유도되는 세포가 사용된다. IGF-I 수용체를 발현하고, IGF-I 에 의해 세포 내로의 글루코오스 흡수가 유도되는 세포로는, 예를 들어 골격근 세포, 지방 세포, 표피 각화 세포 등이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 세포 내로의 글루코오스 흡수에 미치는 영향을 조사하는 세포로는, 초대 배양 세포나 주화 세포의 형질 전환체 세포도 들 수 있다. 그러한 형질 전환 세포로는, 초대 배양 세포로부터 제조한 iPS 세포나 그 iPS 세포로부터 분화 유도한 세포 등을 들 수 있다. 또, 다른 형질 전환 세포로는, 초대 배양 세포나 주화 세포에 유전자를 도입하고, 일과적 또는 지속적으로 발현시킨 세포도 당해 형질 전환 세포에 포함된다. 당해 세포에 도입하여 발현시키는 유전자로는, 인간 또는 다른 종의 IGF-I 수용체의 유전자를 포함해도 된다.
척추 동물 유래의 세포에 있어서의 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체에 의한 글루코오스 흡수에 미치는 영향을 조사하는 방법으로는, 세포 내 글루코오스 농도의 측정, 글루코오스 유연 트레이서 물질의 세포 내 흡수량의 측정, 글루코오스 트랜스포터의 변화의 측정 등을 들 수 있다. 글루코오스 농도의 측정 방법은, 효소법 등의 흡광도 측정법이 있고, 글루코오스 유연 트레이서 물질의 세포 내 흡수량을 측정하는 방법으로는, [3H]-2'-디옥시글루코오스의 흡수량의 측정, 글루코오스 트랜스포터의 변화를 보는 방법으로는, 세포 면역 염색법, 웨스턴 블롯 등이 있지만, 당업자라면 적절히 그 밖의 방법 등으로도 실시할 수 있다. 세포 내로의 글루코오스 흡수에 미치는 영향은, 시험에 사용하는 배양 세포에 대하여, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 반응시킨 경우의 세포 내로의 글루코오스 흡수가, 당해 항체를 반응시키지 않은 경우와 동일한 정도인 것에 의해 판정할 수 있다. 이 경우, 당해 유도 활성의 대조로서, 동 조건에서 본래의 IGF-I 수용체의 리간드인 IGF-I 을 반응시킨 측정을 실시하면, 그 활성의 평가에 편리하다.
시험을 실시하는 배양 세포에 대하여, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체 및 IGF-I 을 각각의 농도를 변화시켜 반응시켰을 때에, 무처치군의 세포 내로의 글루코오스 흡수를 100 ％ 로 한 경우의 글루코오스 흡수량으로서 나타낸다. 인간 분화 근세포를 사용하여 글루코오스 흡수량을 평가한 경우, 바람직하게는 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 글루코오스 흡수량은 동일 농도의 IGF-I 의 글루코오스 흡수량 이하이고, 보다 바람직하게는 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 글루코오스 흡수량은 무처치군의 110 ％ 이하이고, 더욱 바람직하게는 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 글루코오스 흡수량은 무처치군과 동등한 100 ％ 이다. 또, 인간 분화 근세포를 사용하여 글루코오스 흡수량을 평가한 경우, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 100 nmol/L 첨가한 경우의 글루코오스 흡수량은 바람직하게는 110 ％ 이하이고, 보다 바람직하게는 105 ％ 이하이고, 더욱 바람직하게는 95 내지 100 ％ 이다.
척추 동물 유래 세포의 in vivo 에 있어서의 글루코오스 흡수를 조사하는 방법으로는, 당해 척추 동물에 비경구적으로 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 투여하고 투여된 개체에 있어서의 장기 또는 조직 중의 글루코오스 함량 등의 변화를 계측함으로써 조사할 수 있다. 개체 전체에서의 계측에서는, 혈당치 등의 측정이나, 당화 단백질을 지표로 한 헤모글로빈 A1C 등이 사용된다. 개체에서의 장기나 조직 중의 글루코오스 흡수량 등의 측정에 있어서는, 인간 이외의 동물에 있어서는 직접 목적의 장기 또는 조직을 회수하고, 글루코오스 함량 또는 트레이서의 산정 등이 실시된다. 또, 비침습적으로 개체의 장기 또는 조직 중의 글루코오스 흡수를 측정하는 방법으로는, X 선 촬영 이미지나 CT, MRI 에 의한 화상 해석, 동위 원소나 형광 물질에 의한 트레이서를 사용한 조영법 등이 사용된다. 대상이 되는 조직이 골격근인 경우에는, 글루코오스 클램프 등도 지표가 된다. 그 밖에, 당업자라면 적절히 그 밖의 방법을 사용함으로써, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 척추 동물 유래 세포의 in vivo 에 있어서의 글루코오스 흡수에 미치는 영향을 조사할 수 있다.
또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는 척추 동물에 비경구 투여된 경우, 당해 척추 동물의 근육량의 증가를 유도하는 유효 용량에 대하여, 동일 용량, 바람직하게는 10 배 이상의 용량에 있어서도, 당해 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서의 항 IGF-I 수용체 항체의 척추 동물에서의 혈당치의 변화를 조사하기 위한 동물로는, 바람직하게는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류에 속하는 동물이고, 보다 바람직하게는 포유류 또는 조류에 속하는 동물이고, 더욱더 바람직하게는, 인간, 원숭이, 토끼, 모르모트, 소, 돼지, 양, 말 또는 개이다. 또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체와 교차 반응성이 있는 종의 IGF-I 수용체가 발현되도록 개변된 동물도, 본 발명에서의 항 IGF-I 수용체 항체의 척추 동물에서의 혈당치의 변화를 조사하기 위한 동물에 포함된다. 혈당치의 측정은, 관혈적 방법으로는 비색법이나 전극법 등이 사용되고, 검출을 위한 효소에는 글루코오스옥시다아제법 (GOD 법), 글루코오스디하이드로게나아제법 (GDH 법) 등이 있고, 비관혈적 방법으로는 광학적 측정법 등이 있지만, 당업자라면 적절히 그 밖의 방법도 선택할 수 있다. 혈당치는 인간의 경우, 공복시 혈당치의 정상 영역은 100 mg/dL 내지 109 mg/dL 이다. 혈당치에 대한 약제 투여에 의한 유해 사상은 (유해 사상 공통 용어 규준 ｖ4.0), 혈당치가 77 mg/dL-55 mg/dL 의 범위보다 낮은 값이 되는 경우는 저혈당, 109 mg/dL-160 mg/dL 의 범위보다 높은 값이 되는 경우는 고혈당으로 정의되고 있다. 약제 투여에 의한 혈당치에 미치는 영향이 없다란, 약제 투여 후의 혈당치가 55 mg/dL 보다 위이며 160 mg/dL 미만의 범위 내가 되는 것, 보다 바람직하게는 77 mg/dL 보다 위이며 109 mg/dL 미만의 범위 내가 되는 것이다. 단, 혈당치는 투여하는 동물에 따라 정상치나 그 변동의 폭이 상이하고, 또한 인간이더라도 투여시의 혈당치가 반드시 정상치의 범위라고는 할 수 없는 점에서, 본 발명에 있어서 척추 동물의 혈당치를 변동시키지 않는다란, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체가 투여된 척추 동물의 혈당치가 바람직하게는 30 ％ 이내, 보다 바람직하게는 20 ％ 이내, 더욱더 바람직하게는 10 ％ 이내의 변화인 것을 말한다.
[항 IGF-I 수용체 항체의 제법]
본 발명에 있어서의 항체는, 당업자에게 주지된 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체는, 폴리클로날 항체, 또는 모노클로날 항체 (밀스타인 (Milstein) 등, 네이처 (Nature) (England) 1983년 10월 6일 발행, 305권 5934호, p. 537 ∼ 540) 일 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 서열 번호 2 의 IGF-I 수용체의 펩티드를 항원으로서 포유 동물에 감작하고, 당해 동물의 혈청 등으로부터 회수할 수 있다. 또, 펩티드를 항원으로서 사용하는 경우에는, BSA 나 KLH 등의 캐리어 단백질이나 폴리리신 등에 결합시킨 형태로의 항원을 사용할 수 있다. 또한 항원으로서 사용하는 펩티드의 구체적 예로는, 서열 번호 2 의 부분 서열인 ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet 를 사용할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 당해 발명에 있어서의 모노클로날 항체는, 항원을 감작한 포유 동물로부터 면역 세포를 취출하여 골수종 세포 등과 세포 융합시킴으로써 얻어진 하이브리도마를 클로닝하고, 그 배양물로부터 회수할 수 있다. 그러한 모노클로날 항체의 취득 방법으로는, 실시예 1 에 기재되어 있고, 그것에 의해 얻어진 모노클로날 항체로는 서열 번호 9 의 VH 아미노산 서열, 서열 번호 10 의 VL 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체 (IGF11-16) 를 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
얻어진 모노클로날 항체는, 그 항체의 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 유전자 서열을 갖는 핵산 분자를 얻는 것도 가능하고, 그러한 핵산 분자를 사용하여 유전자 공학적으로 항체를 제조하는 것도 가능하다. 당해 항체의 유전자 정보, 예를 들어 H 사슬, L 사슬, 그것들의 가변 영역이나 CDR 서열 등의 정보를 사용하여, 항체의 결합성이나 특이성의 향상을 위한 개변 등을 실시하는 것이나, 마우스 등의 동물의 항체로부터 인간형 항체로 개변함으로써, 치료제에 사용하기 위해 적합한 구조의 항체를 제조하는 것은, 이 분야에서의 당업자에게는 잘 알려진 기술이다. 또, 항원을 감작하는 동물로서 인간 항체 유전자가 도입된 비인간-트랜스제닉 동물을 사용함으로써, 인간형의 모노클로날 항체를 취득하는 것도 가능하다. 그 이외에도, 동물에 대한 감작을 필요로 하지 않는 방법으로서, 인간 항체의 가변 영역 또는 그 일부를 발현하는 파지 라이브러리 (인간 항체 파지 디스플레이) 를 사용하여, 대응하는 항원과 특이적으로 결합하는 항체나 특정 아미노산 서열로 이루어지는 파지 클론을 취득하고, 그 정보로부터 인간 항체를 제조하는 기술도 당업자라면 적절히 실시할 수 있다 (예를 들어, Taketo Tanaka 등, Keio J. Med., 60권, p37-46 의 리뷰 등을 참조).
또, 전술한 모노클로날 항체를 제조하는 방법으로는, 각각 취득하고 싶은 항체를 산생하는 하이브리도마를 배양하고, 얻어진 배양 상청으로부터 통상적인 방법에 의해 항체를 정제하여 취득할 수 있다. 또, 다른 제조 방법으로는, 취득하고 싶은 항체를 산생하는 하이브리도마나 인간 항체 파지 디스플레이로 얻어진 파지 클론 등으로부터 항체를 코드하는 유전자, 보다 상세하게는 면역 글로불린의 중사슬 및/또는 경사슬을 코드하는 유전자를 취득하고, 당해 유전자를 발현하기 위한 벡터를 제조하고, 숙주 세포 (포유류 세포, 곤충 세포, 미생물 등) 에 도입하여, 당해 항체를 산생시키는 것도 가능하다. 이 때, 면역 글로불린의 중사슬 및/또는 경사슬을 코드하는 유전자에 대하여, 원하는 형질을 도입하기 위한 유전자 개변을 실시하는 것, 면역 글로불린의 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역 또는 CDR 영역의 구조 정보를 사용하여 인간형화 항체, 항체 키메라 단백질, 저분자 항체나 스캐폴드 항체를 제조하는 것은, 공지된 기술을 사용함으로써 당업자라면 실시할 수 있다. 또, 항체의 성능의 향상이나 부작용의 회피를 목적으로, 항체의 정상 영역의 구조에 개변을 넣는 것이나, 당사슬의 부분에서의 개변을 실시하는 것도, 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 적절히 실시할 수 있다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 당업자에게 주지된 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 통상은 모노클로날 항체 (Milstein et al., Nature, 1983, Vol.305, No.5934, pp.537-540) 인 바, 이러한 모노클로날 항체는, 예를 들어 이하의 수법으로 제조하는 것이 가능하다.
예를 들어, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체의 면역 글로불린의 중사슬 및/또는 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 분자를 제조한다. 여기서, 이러한 핵산 분자를 각종 벡터 또는 플라스미드에 도입함으로써, 당해 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 제조해도 된다. 이어서, 상기의 핵산 분자, 벡터, 또는 플라스미드로 숙주 세포를 형질 전환한다. 숙주 세포로는, 예를 들어 포유 동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 혹은 식물 세포 등의 진핵 세포, 또는 세균 세포를 들 수 있다. 다음으로, 이 형질 전환된 숙주 세포를, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 산생하기 위한 적절한 조건하에서 배양한다. 여기서, 필요에 따라, 얻어진 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 숙주 세포로부터 단리해도 된다. 이들의 순서에 사용되는 각종 수법은, 모두 당업자에게는 주지되어 있다.
또, 동물에 대한 감작을 사용하는 방법으로는, 항원을 감작하는 동물로서 인간 항체 유전자가 도입된 비인간-트랜스제닉 동물을 사용하고, IGF-I 수용체 및/또는 그 부분 펩티드 등을 감작시키고, 면역 세포를 취출하여 골수종 세포 등과 세포 융합시킴으로써 얻어진 하이브리도마를 클로닝하고, 얻어진 배양 상청으로부터 통상적인 방법에 의해 항체를 정제하여 회수함으로써 얻을 수 있다. 그러한 모노클로날 항체의 취득 방법으로는, 예를 들어 국제 공개 제2013/180238호에 기재되어 있다.
그 이외에도, 원하는 인간화 항체의 가변 영역 또는 그 일부를 발현하는 파지 라이브러리 (인간 항체 파지 디스플레이) 를 사용하여, 대응하는 항원과 특이적으로 결합하는 항체나 특정 아미노산 서열로 이루어지는 파지 클론을 취득하고, 그 정보로부터 인간화 항체를 제조하는 기술을 사용할 수도 있다 (예를 들어, Taketo Tanaka et al., The Keio Journal of Medicine, Vol.60, pp.37-46 의 리뷰 등을 참조).
여기서, 면역 글로불린의 중사슬 및/또는 경사슬을 코드하는 유전자에 대하여, 원하는 형질을 도입하기 위한 유전자 개변을 실시하거나, 면역 글로불린의 중사슬 및/또는 경사슬의 가변 영역 또는 CDR 영역의 구조 정보를 사용하거나 함으로써, 항체 키메라 단백질, 저분자 항체, 스캐폴드 항체 등을 제조하는 것은, 당업자라면 공지된 기술을 사용하여 실시 가능하다. 또, 항체의 성능의 향상이나 부작용의 회피를 목적으로, 항체의 정상 영역의 구조에 개변을 넣는 것이나, 당사슬의 부분에서의 개변을 실시하는 것도, 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 적절히 실시할 수 있다.
[항 IGF-I 수용체 항체를 함유하는 약]
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, IGF-I 에 관련한 상태 또는 IGF-I 수용체에 대한 작용에서 기인하는 질환의 치료약 또는 예방약으로서 이용 가능하다. 구체적으로는, IGF-I 에 관련한 상태 또는 IGF-I 수용체 아고니스트 항체에 의한 치료 또는 예방의 대상이 되는 질환으로는, 폐용성 근위축, 저신장증, 간경변, 간섬유화, 당뇨병성 신증, 만성 신부전, 라론증, 노화, 자궁내 태아 발육 지연 (IUGR), 심혈관 보호, 당뇨병, 인슐린 저항성, 메타볼릭 신드롬, 골조송증, 낭포성 섬유증, 근강직성 디스트로피, 에이즈 근감약증, HIV 에 수반하는 지방 재분포 증후군, 크론병, 베르너 증후군, X 연쇄성 복합 면역 부전증, 난청, 신경성 무식욕증 및 미숙아 망막증, 터너 증후군, 프래더·윌리 증후군, 실버·러셀 증후군, 특발성 저신장, 비만, 다발성 경화증, 궤양성 대장염, 저근육량, 심근 허혈, 저골밀도, IGF-I 수용체 안타고니스트 항체에 의한 치료 또는 예방의 대상이 되는 질환으로는, 신경아세포종, 횡문근 육종, 골육종, 소아암, 선단 거대증, 난소암, 췌장암, 양성 전립선 비대증, 유암, 전립선암, 골암, 폐암, 결장 직장암, 경부암, 활막 육종, 방광암, 위암, 윌름스 종양, 전이성 카르티노이드 및 혈관 작동성 장관 펩티드 분비 종양에 관련하는 설사, 비포마, 베르너-모리슨 증후군, 벡위스-비데만 증후군, 신장암, 신세포암, 이행 상피암, 유잉 육종, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 뇌종양, 교아종, 비교아종성 뇌종양, 수막종, 하수체 선종, 전정 신경초종, 미분화 신경 외배엽성 종양, 수아종, 성상 세포종, 핍돌기 교종, 뇌실 상의종, 맥락총유두종, 거인증, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 혈관의 평활근 재협착, 부적절한 미소 혈관 증식, 당뇨병성 망막증, 그레이브스병, 전신성 에리테마토데스, 만성 갑상선염, 중증 근무력증, 자기 면역성 갑상선염, 및 베체트병을 들 수 있다. 특히, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는 폐용성 근위축 및/또는 저신장증의 치료약 또는 예방약으로서의 사용이 바람직하다. 또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는 투여에 의해 혈당치의 변동을 발생시키지 않는 점에 있어서 우수하다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 함유하는 약은, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체 외에, 의약적으로 허용되는 담체 및/또는 그 밖의 첨가제를 함유하는, 의약 조성물의 형태로서 제제화해도 된다. 의약적으로 허용되는 담체 및/또는 그 밖의 첨가제를 사용한 제제는, 예를 들어 University of the Sciences in Philadelphia, “Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2000 에 기재된 방법으로 실시하는 것이 가능하다. 이와 같은 치료제 또는 예방제의 하나의 형태로는, 무균의 수성액 또는 유성액에 용해, 현탁, 또는 유화함으로써 조제된 액제 혹은 동결 건조제로서 제공된다. 이와 같은, 희석제로서의 용제 또는 용해액으로서, 수성액으로는 주사용 증류수, 생리 식염수 등을 들 수 있고, 그에 더하여 삼투압 조절제 (예를 들어, D-글루코오스, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 가 첨가되는 경우, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올 (예를 들어 에탄올), 폴리알코올 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면 활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50) 등이 병용되는 경우도 있다. 또, 용제 또는 용해액으로는 유성액이 사용되는 경우도 있고, 당해 유성액의 예로는 참깨유, 대두유 등을 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등이 병용되는 경우도 있다. 이와 같은 제제에 있어서는, 적절히, 완충제 (예를 들어, 인산염류 완충제, 아세트산염류 완충제), 무통화제 (예를 들어, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들어, 아스코르브산, 에리소르브산 및 그것들의 염 등), 착색제 (예를 들어, 구리클로로필, β-카로틴, 적색 2 호, 청색 1 호 등), 방부제 (예를 들어 파라옥시벤조산에스테르, 페놀, 염화벤제토늄, 염화벤잘코늄 등), 증점제 (예를 들어 하이드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 그것들의 염 등), 안정화제 (예를 들어 인혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨 등), 교취제 (예를 들어 멘톨, 감귤 향료 등) 의 첨가제가 사용되는 경우가 있다. 다른 형태로서, 점막 적용용 치료제 또는 예방제도 들 수 있고, 이 제제에 있어서는 점막에 대한 흡착성, 체류성 등을 부여하는 것을 주된 목적으로 하여, 첨가제로서 점착제, 점착 증강제, 점조제, 점조화제 등 (예를 들어, 무틴, 한천, 젤라틴, 펙틴, 카라기난, 알긴산나트륨, 로커스트 빈 검, 크산탄 검, 트래거캔스 검, 아라비아 고무, 키토산, 풀루란, 왁시 스타치, 수크랄페이트, 셀룰로오스, 및 그 유도체 (예를 들어, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리글리세린지방산에스테르, 아크릴산(메트)아크릴산알킬 공중합체, 또는 그 염, 폴리글리세린지방산에스테르 등) 가 함유되는 경우도 있다. 그러나, 생체에 공여되는 치료제 또는 예방제의 형태 및 용제나 첨가제는 이들에 한정되지 않고, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 함유하는 약은, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체 외에, 기존의 다른 약물 (활성 성분) 을 포함하고 있어도 된다. 또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 포함하는 약을, 기존의 다른 약물과 조합하고, 키트의 형태로 해도 된다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체와 조합하는 활성 성분으로서, 성장 호르몬 또는 그 아날로그, 인슐린 또는 그 아날로그, IGF-II 또는 그 아날로그, 항마이오스타틴 항체, 마이오스타틴 안타고니스트, 항액티빈 IIB 형 수용체 항체, 액티빈 IIB 수용체 안타고니스트, 가용성 액티빈 IIB 형 수용체 또는 그 아날로그, 그렐린 또는 그 아날로그, 폴리스타틴 또는 그 아날로그, 베타 2 아고니스트, 및 선택적 안드로겐 수용체 모듈레이터를 들 수 있다. 또, IGF-I 수용체 안타고니스트 항체와 조합하는 활성 성분으로서, 코르티코스테로이드, 제토약, 온단세트론염산, 그라니세트론염산, 메트로클로프라미드 (metroclopramide), 돔페리돈, 할로페리돌, 시클리진, 로라제팜, 프로클로르페라진, 덱사메타손, 레보메프로마진, 트로피세트론, 암 백신, GM-CSF 저해약, GM-CSF DNA 백신, 세포에 기초하는 백신, 수상 세포 백신, 재조합 바이러스 백신, 열 쇼크 단백질 (HSP) 백신, 동종 종양 백신, 자기 종양 백신, 진통약, 이부프로펜, 나프록센, 트리살리실산콜린마그네슘, 옥시코돈염산, 항혈관 형성약, 항혈전약, 항 PD-1 항체, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 항 PD-L1 항체, 아테졸리주맙, 항 CTLA4 항체, 이필리무맙, 항 CD20 항체, 리툭시맙, 항 HER2 항체, 트라스투주맙, 항 CCR4 항체, 모가물리주맙, 항 VEGF 항체, 베바시주맙, 항 VEGF 수용체 항체, 가용성 VEGF 수용체 단편, 항 TWEAK 항체, 항 TWEAK 수용체 항체, 가용성 TWEAK 수용체 단편, AMG 706, AMG 386, 항증식약, 파르네실 단백질 트랜스페라아제 저해약, αvβ3 저해약, αvβ5 저해약, p53 저해약, Kit 수용체 저해약, ret 수용체 저해약, PDGFR 저해약, 성장 호르몬 분비 저해약, 안지오포이에틴 저해약, 종양 침윤 매크로파지 저해약, c-fms 저해약, 항 c-fms 항체, CSF-1 저해약, 항 CSF-1 항체, 가용성 c-fms 단편, 페그비소만트, 젬시타빈, 파니투무맙, 이리노테칸, 및 SN-38 을 들 수 있다. 배합되는 항 IGF-I 수용체 항체 이외의 약물의 용량으로는, 통상적인 치료에 사용되는 용량으로 실시할 수 있지만, 상황에 따라 증감하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서의 치료제 또는 예방제는, 증상의 개선을 목적으로 하여, 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여의 경우에는, 예를 들어 경비제로 할 수 있고, 액제, 현탁제, 고형 제제 등을 선택할 수 있다. 또한 다른 비경구 투여의 형태로는, 주사제로 할 수 있고, 주사제로는, 피하 주사제, 정맥 주사제, 점적 주사제, 근육 주사제, 뇌실 내 주사제 또는 복강 내 주사제 등을 선택할 수 있다. 또한 그 밖의 비경구 투여에 사용하는 제제로는, 좌제, 설하제 (舌下劑), 경피제, 경비제 이외의 경점막 투여제 등도 들 수 있다. 또한, 스텐트나 혈관 내 전색제에 함유 혹은 도포하는 양태로, 혈관 내 국소 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 치료제 또는 예방제의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 또는 당해 의약 조성물에 함유되는 활성 성분의 종류 등에 따라 상이하지만, 통상 성인 1 인당, 1 회에 대하여 주제를 0.1 mg 내지 1 g 의 범위로, 바람직하게는 0.5 mg 내지 300 mg 의 범위로, 1 주 내지 4 주일에 1 회, 혹은 1 개월 내지 2 개월에 1 회 투여할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 1 주일에 1 회 이하의 빈도로 투여할 수 있다. 그러나, 투여량 및 투여 횟수는 여러 가지 조건에 의해 변동되기 때문에, 상기 투여량 및 횟수보다 적은 양 및 횟수로 충분한 경우도 있고, 또한 상기의 범위를 초과하는 투여량 및 투여 횟수가 필요한 경우도 있다.
[인간 이외의 동물에서의 용도]
본 발명의 어느 양태에 있어서의 항 IGF-I 수용체 항체는, 인간 이외의 동물에서의 축산 용도 또는 수의학적 용도에 사용할 수 있다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 축산 용도 또는 수의학적 용도로 사용할 수 있는 동물로는, 바람직하게는 인간 이외의 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류에 속하는 동물이고, 보다 바람직하게는 인간 이외의 포유류 또는 조류에 속하는 동물이고, 더욱더 바람직하게는, 원숭이, 토끼, 모르모트, 소, 돼지, 양, 말 또는 개로부터 선택되는 동물이다. 현재, 소 성장 호르몬이나 돼지 성장 호르몬이 소에서의 유즙 산생량의 증대나 새끼 돼지의 성장 촉진을 위해 사용되고 있는데, 이들 작용은 성장 호르몬에 의해 발현이 유도되는 IGF-I 의 작용에 의한 것으로 생각되고 있다 (h. Jiang 과 X. Ge, Journal of Animal Science, Vol.92, pp21-29, 2014). 따라서, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 그 아고니스트 작용을 이용함으로써, 동일하게 동물의 유즙 산생의 항진이나, 태아나 출생 후의 동물의 성장 촉진 등에 사용할 수 있다. 그 밖에, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 사용할 수 있는 용도의 예로는, 동물에 있어서의 근육량의 증량 또는 지방 중량에 대한 근육 중량비의 증대, 섭취 사료의 체조직으로의 효율적 변환, 번식 효율 증대나 종 보존을 위한 생식 능력의 증강, 동물에 있어서의 외상이나 소모성 질환에 의한 소모적 증상의 치료 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 다른 양태인 안타고니스트 작용을 이용함으로써, 동물에서의 악성 종양의 치료, 번식 빈도의 제어, 개체의 성장의 제어나 그 밖의 용도에도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 항 IGF-I 수용체 항체를 사용하는 경우, 투여하는 동물에 맞추어 항체의 프레임워크나 정상 영역의 아미노산 서열을 개변하여 면역원성을 저하시키는 등, 당업자라면 적절히 그 구조를 개변한 후에 사용하는 것도 가능하다.
[항 IGF-I 수용체 항체를 사용한 세포 배양 방법]
척추 동물 유래 세포를 in vitro 에 있어서 유지, 증식 및/또는 분화시키기 위한 세포 배양 기술에 있어서, IGF-I 또는 그 유도체가 많이 사용되고 있고, 세포 배양용의 시약으로서 시판되고 있다. IGF-I 은 안정성의 문제 등으로부터 장기의 배양에 있어서는 시간이 경과함에 따라 효과가 감약될 가능성이 있고, 안정적인 세포 배양을 실시하기 위해서는 적절히 농도를 조절하는 등의 대응이 필요해진다. 또, IGF-I 은 세포에 대한 글루코오스의 흡수를 유도하는 점에서, 세포 내 글루코오스 농도의 상승에 의해 세포의 대사나 특성의 변화가 유도되거나, 배지 중의 글루코오스 농도가 감소하여 배양 환경이 변화될 가능성이 있다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는 IGF-I 과 비교하여 안정성이 높고, 세포에 접촉하고 나서의 세포 증식을 유도하는 시간이 길고, IGF-I 보다 저농도에서 세포 증식 유도 활성을 나타내며, 또한, 세포 내로의 글루코오스 흡수를 유도하지 않는다는 특징을 갖는다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 세포 배양에 있어서 그 배지에 적당량을 첨가하여 사용되는 것 외에, 배양을 실시하는 용기의 고상에 흡착 또는 고정시켜 사용하는 것이 가능하고, 그것에 의해 사용량을 삭감하거나, 고상에 부착하는 세포에 대하여 유효하게 세포 증식 유도를 실시할 수 있다. 본 발명에 있어서의 척추 동물 유래 세포란, 바람직하게는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류에 유래하는 세포이고, 보다 바람직하게는 포유류 또는 조류에 유래하는 세포이고, 더욱더 바람직하게는, 인간, 원숭이, 토끼, 모르모트, 소, 돼지, 양, 말 또는 개에 유래하는 세포이다. 또, 당해 세포로는, 초대 배양 세포, 주화 세포 또는 그들 세포의 형질 전환체 세포, 유전자 재조합 동물에 유래하는 세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체를 사용한 배양의 대상으로는, 척추 동물 또는 그 유전자 개변 동물에 유래하는 장기나 조직 등도 포함된다. 본 발명의 항 IGF-I 수용체 항체는, 세포를 사용한 물질 생산을 위한 배양이나, 세포 자체를 사용하는 세포 의료·재생 의료에서의 배양 공정에서 사용할 수 있다.
실시예
[실시예 1] 마우스 모노클로날 항체의 제조
마우스 모노클로날 항체는, Kohler 등 (Nature 256 : 495-497, 1975) 의 하이브리도마법에 의해 제조할 수 있다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체는, 마우스에 인간 IGF-I 수용체를 발현시킨 세포를 사용하여 면역하고, 표준적인 하이브리도마 기술을 사용하여 제조하였다. 모든 동물 실험은, 시설의 규칙에 따라 실시하였다. 마우스로부터 채취한 비장 유래의 세포와 마우스 미엘로마 세포주 (P3U1) 의 융합에 의한 표준적인 방법을 사용하여 실시하였다. 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 함유하는 배지를 사용하여 하이브리도마를 선택하였다. 하이브리도마의 배양액을 사용하여, IGF-I 수용체를 발현시킨 세포를 사용한 Cell ELISA 에 의한 결합성 평가, 및 PathHunter (등록상표) 에 의한 IGF-I 수용체의 세포 내 티로신키나아제의 활성화의 평가를 실시하고, 양성 하이브리도마 함유 웰을 선택하였다. 이 웰에 포함되는 하이브리도마를 한계 희석법에 의해 싱글 클론화하였다. 이 싱글 클론화한 양성 하이브리도마를 무혈청 배양하고, 배양액 중으로부터 프로테인 A 칼럼 (Ab-Capcher, 프로테노바) 을 사용하여 모노클로날 항체를 정제하였다. 이 모노클로날 항체를 사용하여, 인간 근아세포 증식 활성 평가에 의해 IGF-I 수용체 아고니스트 항체인 IGF11-16 을 발견하였다.
[실시예 2] 항체 아이소타입의 결정
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 항체 아이소타입을 결정하기 위해, 항체의 아이소타입에 특이적인 항체를 사용하여, ELISA 를 실시하였다. PBS 로 2000 배 희석한 항마우스 IgG 항체 (TAGO, 6150) 를, 50 μL/웰로 96 웰 플레이트 (Nunc, MaxiSorp) 에 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치 (靜置) 하였다. 96 웰 플레이트를 3 ％ BSA/PBS 로 치환한 것을 ELISA 에 사용하였다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체를, 항마우스 IgG 항체를 고정화시킨 96 웰 플레이트에 30 μL/웰로 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 반응시켰다. 세정액으로 세정한 후, 마우스 IgG 의 각종 아이소타입에 특이적으로 반응하는 항체, 항마우스 IgG1 항체-ALP 콘주게이트 (SBA, 1070-04), 항마우스 IgG2a 항체-ALP 콘주게이트 (SBA, 1080-04), 항마우스 IgG2b 항체-ALP 콘주게이트 (SBA, 1090-04) 및 항마우스 IgG3 항체-ALP 콘주게이트 (SBA, 1100-04) 를 30 μL/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 기질 (PNPP) 을 100 μL/웰로 첨가하고, 실온에서 45 분간 반응시키고, 흡광도 405-550 ㎚ 를 산출하였다. 흡광도 405-550 ㎚ 의 값을 결합 활성으로서 평가하였다.
IGF11-16 은, 항마우스 IgG1 항체에 반응성을 나타내는 점에서, 항체의 아이소타입은 IgG1 이었다.
[실시예 3] 항체의 서열의 결정
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 경사슬 및 중사슬의 유전자 서열을 결정하기 위해, SMARTer (등록상표) RACE 법을 실시하였다. 항체를 산생하는 하이브리도마 유래의 RNA 로부터 개시 및 종시 코돈을 포함하는 항체의 중사슬 및 경사슬의 유전자의 단편을 SMARTer (등록상표) RACE 법에 의해 취득하고, 그 염기 서열을 결정하였다. 하이브리도마 유래의 Total RNA 를 주형으로 하여 SMARTer (등록상표) RACE 5'/3' Kit (634859, Clontech) 를 사용하여, 1st strand cDNA 를 합성한 후, PCR 반응에 의해 cDNA 를 증폭시켰다. 그 cDNA 를 주형으로 하여, 키트에 부속의 유니버설 서열에 대한 프라이머와, 항체의 중사슬 및 경사슬에 각각 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 마우스 항체의 경사슬 (kappa) 은 Accession 번호 BC080787, 마우스 항체의 IgG1 은 LT160966 을 참조하여 프라이머를 설계하였다. 마우스 항체의 경사슬에 대한 프라이머의 염기 서열은, ggtgaagttgatgtcttgtgagtgg 를 설계하고, 마우스 항체의 중사슬에 대한 프라이머의 염기 서열은, gctcttctcagtatggtggttgtgc 를 설계하고, 각각을 실험에 사용하였다. 얻어진 PCR 산물은 5' RACE PCR 산물로서 TA 클로닝에 사용하였다.
TA 클로닝에서는, 5' RACE PCR 산물을 전기 영동하여 목적으로 하는 분자량을 포함하는 cDNA 를 QIAEX II Gel Extraction Kit (20021, Qiagen) 를 사용하여 정제하였다. 정제 후의 cDNA 는 TaKaRa-Taq (R001A, Takara) 를 사용하여 72 ℃, 5 분간 반응시킴으로써 5' 및 3' 말단에 아데닌을 부가시켰다. 그 cDNA 를 TOPO (등록상표) TA 클로닝 (등록상표) 키트 (450641, Thermo fisher) 를 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라, Topoisomerase I-activated pCR (등록상표) II-TOPO (등록상표) 벡터 (이하, TOPO 벡터) 에 클로닝하였다. 목적의 cDNA 가 클로닝된 TOPO 벡터를 대장균 TOP10 으로 형질 전환시키고, 카나마이신 50 ㎍/㎖ 함유의 한천 배지에서 배양하였다. TOPO 벡터에 대한 목적으로 하는 cDNA 의 삽입은 콜로니 PCR 에 의해 확인하였다. 클로닝한 cDNA 의 염기 서열을 동정하였다. 동일하게 3' RACE PCR 산물의 염기 서열을 동정하고, 항체의 유전자의 전장 서열을 결정하였다. IGF11-16 의 경사슬의 전장 유전자 서열을 서열 번호 27 에, 전장 아미노산 서열을 서열 번호 28 에, IGF11-16 의 중사슬의 전장 유전자 서열을 서열 번호 29 에, 전장 아미노산 서열을 서열 번호 30 에 나타낸다. 또, IGF11-16 의 CDR-H1 은 서열 번호 3, CDR-H2 는 서열 번호 4, CDR-H3 은 서열 번호 5, CDR-L1 은 서열 번호 6, CDR-L2 는 서열 번호 7, CDR-L3 은 서열 번호 8, 중사슬 가변 영역은 서열 번호 9, 경사슬 가변 영역은 서열 번호 10 에 나타낸다.
[실시예 4] IGF-I 수용체에 대한 결합 활성 (ELISA)
인간 (서열 번호 2, NP_000866), 모르모트 (서열 번호 11, XP_003475316), 게잡이 원숭이 (서열 번호 12, NP_001248281), 토끼 (서열 번호 13, XP_017193273), 래트 (서열 번호 14, NP_494694) 및 마우스 (서열 번호 15, NP_034643) 의 IGF-I 수용체에 대한 IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 결합 활성을 검토하기 위해, 각종 IGF-I 수용체를 발현시킨 세포를 사용하여 Cell ELISA 를 실시하였다.
P3U1 세포에 리포펙션법에 의해 인간 (서열 번호 16), 모르모트 (서열 번호 17), 게잡이 원숭이 (서열 번호 18), 토끼 (서열 번호 19), 래트 (서열 번호 20) 및 마우스 (서열 번호 21) 의 IGF-I 수용체 유전자를 짜넣은 pEF1 발현 벡터 (Thermofisher) 를 도입하였다. 리포펙션 후에 하룻밤 이상 배양시킨 P3U1 세포를 0.8 × 105 세포/웰로 96 웰 플레이트 (폴리-D-리신 코트) 에 첨가하고, 10 ％ 완충 포르말린 (Mildform (등록상표) 10 NM, Wako) 을 사용하여 고정시켰다. 3 ％ BSA 를 함유한 인산 완충액으로 블로킹한 것을 ELISA 에 사용하였다.
ELISA 는, 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 10 nM 로 조제된 IGF11-16 항체 용액을 각 웰에 30 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 30 분 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 각 농도로 조제된 항마우스 IgG 항체 HRP 콘주게이트 용액을 각 웰에 30 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 각 웰에 기질 (TMB) 을 50 μL 첨가하고 반응을 개시시켰다. 약 20 분 후에 각 웰에 50 μL 의 0.5 M 황산을 첨가하고 450 및 550 ㎚ 의 흡광도를 측정하고, 흡광도 450-550 ㎚ 를 산출하였다. IGF-I 수용체 유전자를 포함하지 않는 벡터를 도입한 세포 (Mock 세포, 서열 번호 22) 에 대한 흡광도 450-550 ㎚ 의 값을 1 로 하여, 결합 활성을 산출하였다 (표 1).
Figure pat00001
IGF11-16 은, 인간, 모르모트, 게잡이 원숭이 및 토끼의 IGF-I 수용체를 발현시킨 세포에서는, Mock 세포와 비교하여, 결합 활성을 5 배 이상 상승시켰다. 한편, IGF11-16 의 래트 및 마우스의 IGF-I 수용체를 발현시킨 세포에 대한 결합 활성은, Mock 세포와 동일한 정도이고, 상승시키지 않았다. 이러한 점들로부터 IGF11-16 은, 인간, 모르모트, 게잡이 원숭이 및 토끼의 IGF-I 수용체에 결합하지만, 래트 및 마우스의 것에는 결합하지 않는 것이 밝혀졌다.
[실시예 5] 인슐린 수용체에 대한 결합 활성 (ELISA)
인슐린 수용체에 대한 IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 결합 활성을 검토하기 위해, 인간 인슐린 수용체를 발현시킨 세포를 사용하여 Cell ELISA 를 실시하였다.
HEK293T 세포에 리포펙션법에 의해 인간의 인슐린 수용체 유전자를 짜넣은 pEF1 발현 벡터 (Thermofisher) 를 도입하였다. 리포펙션 후의 HEK293T 세포를 0.8 × 105 세포/웰 (약 180 μL/웰) 로 96 웰 플레이트 (폴리-D-리신 코트) 에 첨가하고, 10 ％ 완충 포르말린 (Mildform (등록상표) 10 NM, Wako) 을 사용하여 고정시켰다. 3 ％ BSA 를 함유한 인산 완충액으로 블로킹한 것을 ELISA 에 사용하였다.
ELISA 는, 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 각 농도로 조제된 항체 용액을 각 웰에 30 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 반응시켰다. 세정액 (Tween 함유 트리스 완충액) 으로 2 회 세정하였다. 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 각 농도로 조제된 항마우스 IgG 항체 ALP 콘주게이트 용액을 각 웰에 30 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 각 웰에 기질 (PNPP) 을 100 μL 첨가하고 반응을 개시시켰다. 약 30 분 후에 405 및 550 ㎚ 의 흡광도를 측정하고, 흡광도 405-550 ㎚ 를 산출하였다. IGF-I 수용체의 유전자 및 인슐린 수용체의 유전자를 포함하지 않는 벡터를 도입한 세포 (Mock 세포, 서열 번호 22) 에 대한 흡광도 405-550 ㎚ 의 값을 1 로 하여, 결합 활성을 산출하였다 (표 2).
Figure pat00002
IGF11-16 의 0.5 nM 및 5 nM 은, 인간 IGF-I 수용체를 발현시킨 세포를 고정화한 ELISA 에서는, 흡광도 405-550 ㎚ 를, Mock 세포와 비교하여 약 3 배 이상까지 상승시켰다. 한편, 인간 인슐린 수용체를 발현시킨 세포를 고정화한 ELISA 에서는, IGF11-16 의 0.5 nM 및 5 nM 은, 흡광도 405-550 ㎚ 를 1.5 배 이상 상승시키지 않았다. 이러한 점에서, IGF11-16 은, 인슐린 수용체와 비교하여, IGF-I 수용체에 보다 강하게 결합하였다.
[실시예 6] IGF-I 수용체의 결합 부위의 해석 (ELISA)
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 IGF-I 수용체에 대한 에피토프를 동정하기 위해, IGF-I 수용체의 각종 도메인을, IGF-I 수용체와 유사 구조를 갖는 인슐린 수용체의 도메인과 치환한 변이체에 대한 IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 결합성을 측정하였다.
인간 IGF-I 수용체 (NP_000866) 의 세포 외 도메인을 인슐린 수용체의 세포 외 도메인으로 치환시킨 치환체, 또는, 인간 인슐린 수용체 (NP_000199) 의 세포 외 도메인을 IGF-I 수용체의 세포 외 도메인으로 치환한, 이하의 4 개의 치환체를 제조하였다.
(치환체 1) 인간 인슐린 수용체의 L1 도메인부터 L2 도메인까지를, 인간 IGF-I 수용체의 L1 도메인부터 L2 도메인으로 치환한 치환체, hIGFIR[L1-L2]/hINSR.
(치환체 2) 인간 IGF-I 수용체의 L1 도메인부터 L2 도메인까지를, 인간 인슐린 수용체의 L1 도메인부터 L2 도메인으로 치환한 치환체, hINSR[L1-L2]/hIGFIR.
(치환체 3) 인간 IGF-I 수용체의 L1 도메인을, 인간 인슐린 수용체의 L1 도메인으로 치환한 치환체, hINSR[L1]/hIGFIR.
(치환체 4) 인간 IGF-I 수용체의 L2 도메인을, 인간 인슐린 수용체의 L2 도메인으로 치환한 치환체, hINSR[L2]/hIGFIR.
P3U1 세포에 리포펙션법에 의해, 상기 4 종의 인간 IGF-I 수용체의 치환체의 유전자를 짜넣은 pEF1 발현 벡터 (Thermofisher) 를 도입하였다. (치환체 1) 의 hIGFIR[L1-L2]/hINSR 의 유전자를 서열 번호 23 에, (치환체 2) 의 hINSR[L1-L2]/hIGFIR 의 유전자를 서열 번호 24 에, (치환체 3) 의 hINSR[L1]/hIGFIR 의 유전자를 서열 번호 25 에, (치환체 4) 의 hINSR[L2]/hIGFIR 의 유전자를 서열 번호 26 에 나타낸다. 리포펙션 후에 하룻밤 이상 배양한 P3U1 세포를 0.8 × 105 세포/웰로 96 웰 플레이트 (폴리-D-리신 코트) 에 첨가하고, 10 ％ 완충 포르말린 (Mildform (등록상표) 10 NM, Wako) 을 사용하여 고정시켰다. 3 ％ BSA 를 함유한 인산 완충액으로 블로킹한 것을 ELISA 에 사용하였다.
ELISA 는, 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 10 nM 로 조제된 항체 용액을 각 웰에 30 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 30 분 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 5 nM 로 조제된 항마우스 IgG 항체 HRP 콘주게이트 용액을 각 웰에 30 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 각 웰에 기질 (TMB) 을 50 μL 첨가하고 반응을 개시시켰다. 약 20 분 후에 0.5 M 황산을 50 μL 첨가하고 반응을 정지하고, 450 및 550 ㎚ 의 흡광도를 측정하고, 흡광도 450-550 ㎚ 를 산출하였다. 각 치환체의 유전자를 포함하지 않는 벡터를 도입한 세포 (Mock 세포) 에 대한 흡광도 450-550 ㎚ 의 값을 1 로 하여, 결합 활성을 산출하였다 (표 3).
Figure pat00003
IGF11-16 은, hIGFIR[L1-L2]/hINSR, hINSR[L1]/hIGFIR 및 hINSR[L2]/hIGFIR 을 발현시킨 세포를 고정화한 ELISA 에서는, 흡광도 450-550 ㎚ 를 Mock 세포에 대하여 5 배 이상 상승시켰다. 한편, hINSR[L1-L2]/hIGFIR 을 발현시킨 세포에 대한 IGF11-16 의 결합 활성은, 약하였다. 이러한 점에서 IGFI1-16 은, IGF-I 수용체의 CR 도메인에 결합하는 것이 밝혀졌다.
[실시예 7] IGF11-16 의 에피토프의 결정
IGF11-16 의 에피토프인 CR 도메인으로부터, 더욱 상세한 에피토프를 동정하기 위해, IGF11-16 의 IGF-I 수용체에 대한 결합성의 종차로부터 결합 서열을 추정하였다. 도 1 에, 각각의 종에 있어서의 IGF-I 수용체의 CR 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
IGF11-16 은, 인간, 모르모트 및 토끼의 IGF-I 수용체에 결합하지만, 마우스 및 래트의 IGF-I 수용체에는 결합하지 않는다. 이러한 점에서, IGF-I 수용체의 CR 도메인의 아미노산 서열 중, 인간, 모르모트 및 토끼에 공통되고, 마우스 및 래트와는 상이한 아미노산 서열을, IGF11-16 의 에피토프로서 추정하였다.
IGF11-16 이 IGF-I 수용체의 CR 도메인의 어느 부위의 아미노산에 결합하는 것인지를 결정하기 위해, CR 도메인의 각종 아미노산 치환체에 대한 결합성을 ELISA 에 의해 측정하였다.
CR 도메인 중, IGF11-16 과의 결합이 추정되는 아미노산 서열을 변이시킨 IGF-I 수용체를 발현시킨 세포를 사용하여 Cell ELISA 를 실시하였다.
CR 도메인의 각종 아미노산 치환체는, 이하의 3 종을 사용하였다. 또, 양성 대조로서 야생형의 인간 IGF-I 수용체, 음성 대조로서 야생형의 래트 IGF-I 수용체를 pEF1 발현 벡터 (Thermofisher) 에 짜넣은 것을 사용하였다. 각종 IGF-I 수용체의 발현량은, IGF-I 수용체의 세포 내 도메인에 부가한 FLAG 태그 (AspTyrLysAspAspAspAspLys) 에 대한 FLAG M2 항체의 반응성을 지표로 하였다.
(CR 도메인의 치환체 1) 인간 IGF-I 수용체 (NP_000866, 서열 번호 2) 의 아미노산 서열, 245 번째 및 247 번째의 아스파르트산 및 알라닌을, 각각 아스파라긴 및 트레오닌으로 치환시켰다.
(CR 도메인의 치환체 2) 인간 IGF-I 수용체 (NP_000866, 서열 번호 2) 의 아미노산 서열, 294 번째의 글루타민산을, 아스파르트산으로 치환시켰다.
(CR 도메인의 치환체 3) 인간 IGF-I 수용체 (NP_000866, 서열 번호 2) 의 아미노산 서열, 315 번째 및 316 번째의 글리신 및 세린을, 각각 세린 및 트레오닌으로 치환시켰다.
HEK293T 세포를 9 × 106 세포/웰로 폴리-D-리신 코트된 10 ㎝ 디시에 파종하였다. 다음날에 각 플라스미드 DNA 를 리포펙션법에 의해 세포에 도입하였다. 그 다음날에 0.25 ％ 트립신/EDTA 를 사용하여 HEK293T 세포를 박리하고, 배양액으로 현탁하였다. HEK293T 세포를 0.8 × 105 세포/웰로 96 웰 플레이트 (폴리-D-리신 코트) 에 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 96 웰 플레이트로부터 배지를 제거하고, 10 ％ 완충 포르말린 (Mildform (등록상표) 10 NM, Wako) 을 사용하여 고정시키고, 블로킹 버퍼 (3 ％ BSA/PBS/아지화나트륨) 로 치환한 것을 ELISA 에 사용하였다.
ELISA 는, 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 1 nM 로 조제된 IGF11-16 항체 또는 FLAG M2 항체 용액을 각 웰에 50 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 0.1 ％ 스킴 밀크/3 ％ BSA/PBS 로 각 농도로 조제된 항마우스 IgG 항체 HRP 콘주게이트 용액을 각 웰에 50 μL 첨가하고 실온에서 약 1 시간 반응시켰다. 세정액으로 2 회 세정하였다. 각 웰에 기질 (TMB) 을 100 μL 첨가하고 반응을 개시시켰다. 약 30 분 후에 0.5 M 황산을 100 μL 첨가하고, 반응을 정지하고, 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 흡광도 450 ㎚ 의 값을 결합 활성으로서 평가하였다.
결과를 도 2 에 나타낸다. CR 도메인의 각 치환체를 발현시킨 세포에 대한 FLAG M2 항체의 반응성은 동등하고, CR 도메인의 각 치환체의 발현량은 거의 동일한 레벨인 것이 확인되었다. IGF11-16 은, CR 도메인에 변이를 도입하지 않은, 야생형의 인간 IGF-I 수용체에 대하여, 흡광도 450 ㎚ 의 값을 2 이상까지 상승시키고, 결합 활성의 항진을 나타냈다. CR 도메인의 치환체 1 및 2 에 대하여, IGF11-16 은, 흡광도 450 ㎚ 의 값을 2 이상까지 상승시키고, 결합 활성의 항진을 나타냈다. 한편, CR 도메인의 치환체 3 의 흡광도 450 ㎚ 의 값은 약 1 이고, 음성 대조인 래트 IGF-I 수용체의 흡광도와 동일한 정도이고, 결합성은 확인되지 않았다. 이러한 점들로부터, IGF11-16 의, IGF-I 수용체의 CR 도메인에 대한 결합 활성은, IGF-I 수용체의 315 번째 및 316 번째의 아미노산이 중요한 것이 밝혀졌다.
이상의 결과로부터, IGF11-16 의 인간 IGF-I 수용체에 대한 결합 부위는, 315 번째 및 316 번째의 Gly (글리신) 와 Ser (세린) 의 근방으로 추정되었다. 일반적으로 항체의 인식 서열은 아미노산 8 잔기 (6 내지 10 잔기의 평균치) 인 것, 및 IGF11-16 의 교차 반응성 (래트의 IGF-I 수용체에 대한 결합성 없음, 토끼 및 인간의 IGF-I 수용체에 대한 결합성을 가짐) 으로부터, IGF11-16 의 인간 IGF-I 수용체에 대한 결합 부위의 추정 서열은, ProSerGlyPheIleArgAsnGly*Ser*GlnSerMet 로 생각되었다 (Gly*Ser* 는, 315 번째 및 316 번째의 아미노산 서열을 나타낸다).
[실시예 8] 표면 플라즈몬 공명법에 의한 IGF-I 수용체에 대한 결합 친화성
약제의 IGF-I 수용체에 대한 결합 특성 (결합 속도 및 해리 속도) 을 검토하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 법에 의해 측정하였다.
센서 칩 CM3 (GE) 에, anti-His 모노클로날 항체 (monoclonal antibody) 를, Amine Coupling Kit (BR-1000-50, GE) 및 His Capture Kit (28-9950-56, GE) 를 사용하여 고정시켰다. 고정 조건은, NHS/EDC 7 분, 50 ㎍/㎖ anti-His 모노클로날 항체 3 분, 에탄올아민 (Ethanolamin) 7 분, 타겟 (Target) : ≥ 3000 RU 로 실시하였다. 애널라이트는, 각 농도의 약제를 사용하였다. 리간드는, 리콤비넌트 인간 IGF-I 수용체 히스티딘 태그 (305-GR-050, R＆D SYSTEMS, 이하 IGF-IR-His) 를 사용하였다. 음성 대조는, Purified Mouse IgG2a, κ, Isotype Ctrl, Clone : MG2a-53 (401502, BioLegend, 이하 ctrl IgG2a) 을 사용하였다.
Anti-His 모노클로날 항체의 고정화된 센서 칩 CM3 을, Biacore T200 에 설치하고, 반응 온도를 36 ℃ 로 설정하고, 러닝 버퍼 (HBS-EP＋, BR-1006-69, GE) 를 유속 30 μL/분으로 흘렸다. 리간드의 결합량을 약 100 RU 가 되도록 설정하고, IGF-IR-His 를 0.5 ∼ 2 × 10-8 mol/L 로 첨가하고, anti-His 모노클로날 항체에 보충시켰다. 10 nmol/L 의 Ctrl IgG2a 를 1 분간 반응시키고, HBS-EP＋ 를 유속 30 μL/분으로 10 분 이상 흘렸다. 애널라이트 및 HBS-EP＋ 를, 플로우 셀 (1 및 2) 및 플로우 셀 (3 및 4) 에 각각 첨가하여 반응시켰다.
반응 조건은, 결합 시간, 600 초 및 괴리 시간, 600 초로 설정하였다. 반응 종료 후, 재생용 버퍼 1 (0.2 ％ SDS), 재생용 버퍼 2 (100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5), 1 mol/L NaCl, 15 mmol/L MgCl2) 및 재생용 버퍼 3 (10 mmol/L 글리신-HCl (pH 1.5)) 으로, 각각 1 분간, 유속 30 μL/분으로 세정하였다. Biacore T200 Evaluation software (ver2.0) 를 사용하여, 1 : 1 결합 (Binding) 의 모델 (Model) 로 해석하고, 해리 속도 정수 (ka, 1/Ms), 결합 속도 정수 (kd, 1/s) 및 해리 정수 (KD, M) 를 산출하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
Figure pat00004
IGF11-16 의 인간 IGF-I 수용체에 대한 ka 는, IGF-I 의 약 1/5 이고, 결합 속도는 느렸다. 한편, IGF11-16 의 인간 IGF-I 수용체에 대한 kd 는, 측정 기기의 측정 하한보다 낮은 값이고, IGF-I 의 1/1000 보다 낮은 값인 점에서, 해리 속도는 매우 느리고, IGF11-16 은 IGF-I 수용체에 결합하면 해리하기 어려운 것이 밝혀졌다. IGF11-16 의 인간 IGF-I 수용체에 대한 KD 는, IGF-I 의 1/50 보다 낮은 값이고, 강한 결합 강도를 나타냈다. IGF11-16 은 IGF-I 과 비교하여 IGF-I 수용체에 대하여 강한 결합 활성을 갖는 것이 밝혀졌다.
[실시예 9] PathHunter (등록상표) 에 의한 IGF-I 수용체 혹은 인슐린 수용체의 활성화 작용
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 IGF-I 수용체에 대한 활성화 작용을 검출하기 위해, PathHunter (등록상표) IGF1R Functional Assay (DiscoverX) 를 사용하여 IGF-I 수용체의 하류 시그널의 활성화를 측정하였다.
IGF-I 수용체 및 IGF-I 수용체의 세포 내의 티로신키나아제와 결합하는 SH2 도메인을 갖는 어댑터 프로테인 SHC1-Enzyme Acceptor (EA) 융합 단백질을, 세포 내에 강제 발현시킨 세포주를 사용하였다. IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 인슐린 수용체에 대한 활성화 작용을 검출하기 위해, PathHunter (등록상표) INSR Functional Assay (DiscoverX) 를 사용하여 인슐린 수용체의 하류 시그널의 활성화를 측정하였다. 인슐린 수용체 및 인슐린 수용체의 세포 내의 티로신키나아제와 결합하는 SH2 도메인을 갖는 어댑터 프로테인 PLCG1-EA 융합 단백질을, 세포 내에 강제 발현시킨 세포주를 사용하였다. 이들 세포주는, IGF-I 수용체 혹은 인슐린 수용체에 대한 리간드 결합에 의해 수용체의 2 량체화가 일어나고, 계속해서 수용체가 인산화됨으로써, SH2 도메인을 갖는 어댑터 프로테인이 리크루트되고, 수용체 시그널 전달 복합체가 형성되고, 공간적으로 인접한 티로신키나아제와 EA 의 결합이 촉진되고, 활성형 β-갈락토시다아제가 재구성된다. 이 β-갈락토시다아제 활성에 의한 가수 분해된 기질의 화학 발광 시그널의 레벨을 측정함으로써, 수용체형 티로신키나아제에 대한 약제의 작용을 동정하는 것이 가능하다.
IGF-I 수용체 혹은 인슐린 수용체를 발현시킨 세포를, 폴리-D-리신 코트 혹은 콜라겐-I 코트된 96 웰 플레이트 (Black/clear 혹은 White/clear) 에, 90 μL/웰 (2 × 104 세포/웰 혹은 5 × 103 세포/웰) 로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 인큐베이트하였다. 다음날, 각 농도의 약제를 10 μL/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 인큐베이트하였다. 그 다음날, 배양 상청을 30 μL 로 취하고, 15 μL 의 기질 용액을 첨가하여, 60 분간 반응시키고, 루미노미터 (Tristar, 베르톨드) 로 발광 시그널을 측정하였다. IGF-I 수용체의 활성화는, 용매만을 처치한 군의 활성을 100 ％ 로서 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
Figure pat00005
인슐린 수용체의 활성화는, 용매만을 처치한 군의 활성을 100 ％ 로서 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
Figure pat00006
IGF-I 수용체를 발현시킨 세포주를 사용하여, 약제의 IGF-I 수용체의 활성화를 측정하였다. IGF-I 수용체를 발현시킨 세포주에서는, IGF-I 및 IGF11-16 은 컨트롤과 비교하여 IGF-I 수용체의 활성화 작용을 나타냈다.
인슐린 수용체를 발현시킨 세포주를 사용하여, 약제의 인슐린 수용체의 활성화를 측정하였다. 인슐린 수용체를 발현시킨 세포주에서는, 인슐린에 의한 인슐린 수용체의 활성화 작용을 나타냈다. 또, IGF-I 은, 인슐린 수용체를 농도 의존적으로 활성화하고, 50 nM 에서는 유의한 활성화 작용을 나타냈다. 한편, IGF11-16 은 인슐린 수용체를 활성화하지 않았다.
IGF-I 은, 인슐린 수용체에도 반응성을 나타내는 것이 알려져 있다. 또, 인슐린 수용체의 활성화는 혈당 저하 작용을 야기하는 것도 알려져 있다. IGF11-16 은, IGF-I 수용체에 특이적으로 작용하고, 인슐린 수용체를 개재하는 혈당 저하 작용을 갖지 않는 것이 밝혀졌다.
[실시예 10] 인간 근아세포에 있어서의 세포 증식 활성
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 인간 근아세포에 대한 증식 활성을 검토하기 위해, 인간 근아세포에 약제를 첨가하고, 4 일 후의 세포 내의 ATP 량을 측정하였다.
정상 인간 골격근 근아세포 (Human Skeletal Muscle Myoblast Cells, HSMM, Lonza) 를, SkBM-2 (Lonza, CC-3246) 에 1 ％ BSA 를 포함하는 배지를 사용하여, 96 웰 플레이트 (콜라겐 I 코팅된) 에, 0.1 ㎖/웰 (2 × 103 세포/웰) 로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 인큐베이트하였다. 세포 파종의 다음날에 각종 약제를 25 μL/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 4 일간 인큐베이트하였다. 세포 증식의 지표로서 세포 내의 ATP 량을, CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 사용하여 측정하였다. 4 일간 인큐베이트한 96 웰 플레이트를, 배양액이 50 μL/웰이 되도록 상청을 제거하고, 30 분 이상 실온에서 정치하였다. CellTiter-Glo (등록상표) 시약을 50 μL/웰로 첨가하고 10 분 이상 반응시킨 후에 루미노미터 (Tristar, 베르톨드) 로 발광 시그널을 측정하였다. 용매만을 첨가한 군의 활성을 100 ％ 로서 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
Figure pat00007
IGF-I 및 IGF11-16 은, 컨트롤 항체 (FLAG M2, 시그마 알드리치) 와 비교하여, 세포 증식 활성을 항진시켰다.
0.00005, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5, 5, 50 및 500 nM 의 IGF11-16 은, 인간 근아세포의 증식 활성을 농도 의존적으로 항진시켰다. IGF11-16 및 IGF-I 의 근아세포 증식 활성의 EC50 은, 각각 0.004 nM 및 0.61 nM 이고, IGF11-16 은 100 배 이상 강한 활성을 나타냈다.
비특허문헌 35 에 기재된 16-13 항체, 및 26-3 항체는, 용매 컨트롤 (아지화나트륨을 포함한다) 에 비하여, 현저한 세포 증식 활성은 확인되지 않고, IGF11-16 의 활성과 비교하여 약한 것이었다.
[실시예 11] 모르모트 근아세포에 있어서의 세포 증식 활성
모르모트 근아세포 (Cell Applications) 를, SkBM-2 (Lonza, CC-3246) 에 1 ％ BSA 를 포함하는 배지를 사용하여, 96 웰 플레이트 (Collagen type I coated) 에, 0.1 ㎖/웰 (4 × 103 세포/웰) 로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 인큐베이트하였다. 세포 파종의 다음날에 각종 약제를 25 μL/웰로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 4 일간 인큐베이트하였다. 세포 증식의 지표로서 세포 내의 ATP 량을, CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 사용하여 측정하였다. 4 일간 인큐베이트한 96 웰 플레이트를, 배양액이 50 μL/웰이 되도록 상청을 제거하고, 30 분 이상 실온에서 정치하였다. CellTiter-Glo (등록상표) 시약을 50 μL/웰로 첨가하고 10 분 이상 반응시킨 후에 루미노미터 (Tristar, 베르톨드) 로 발광 시그널을 측정하였다.
0.00005, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5, 5, 50 및 500 nM 의 IGF11-16 은, 모르모트 근아세포의 증식 활성을, 농도 의존적으로 항진시켰다. IGF11-16 및 IGF-I 의 EC50 은, 각각 0.004 nM 및 0.76 nM 이고, IGF11-16 은 100 배 이상 강한 활성을 나타냈다.
[실시예 12] IGF-I 과의 작용 지속성의 in vitro 비교
IGF11-16 과 IGF-I 의 작용 지속성을 비교하기 위해, IGF11-16 또는 IGF-I 을 첨가한 18 시간 후에 배지를 교환하고, IGF11-16 및 IGF-I 을 제거한 조건에서 인간 근아세포의 증식 활성을 측정하였다.
정상 인간 골격근 근아세포 (Human Skeletal Muscle Myoblast Cells, HSMM, Lonza) 를, SkBM-2 (Lonza, CC-3246) 에 1 ％ BSA 를 포함하는 배지를 사용하여, 96 웰 플레이트 (Collagen type I coated) 에, 0.1 ㎖/웰 (2 × 103 세포/웰) 로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 인큐베이트하였다. 세포 파종의 다음날에 IGF11-16 또는 IGF-I 을 25 μL/웰로 첨가하고, 첨가 18 시간 후에, IGF11-16 또는 IGF-I 이 들어가 있지 않은 배지 혹은 그것들을 함유하는 배지와 교환하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 4 일간 인큐베이트하였다. 세포 증식의 지표로서 세포 내의 ATP 량을, CellTiter-Glo (등록상표) Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 사용하여 측정하였다. 4 일간 인큐베이트한 96 웰 플레이트를, 배양액이 50 μL/웰이 되도록 상청을 제거하고, 30 분 이상 실온에서 정치하였다. CellTiter-Glo (등록상표) 시약을 50 μL/웰로 첨가하고 10 분 이상 반응시킨 후에 루미노미터 (Tristar, 베르톨드) 로 발광 시그널을 측정하였다. 용매만을 첨가한 컨트롤군에 대한 비율 (컨트롤군, 0 ％) 을 세포 증식 활성으로서 산출하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다.
IGF-I 의 1 nM 및 5 nM 을 4 일간 첨가한 군에서는, 세포 증식 활성을, 각각 39 ％ 및 75 ％ 로 상승시켰다. IGF-I 의 1 nM 및 5 nM 을 18 시간 첨가하고
워시아웃 (washout) 한 군의 세포 증식 활성은, 각각 8 ％ 및 10 ％ 이고, 4 일간 첨가한 군과 비교한 활성은, 1/5 보다 낮아져, 현저한 작용의 저하를 나타냈다.
IGF11-16 의 0.5 nM 을 4 일간 첨가한 군에서는, 세포 증식 활성을, 49 ％ 로 상승시켰다. IGF11-16 의 0.5 nM 을 18 시간 첨가하고 워시아웃한 군의 세포 증식 활성은 30 ％ 이고, 4 일간 첨가한 군과 비교한 활성은, 6 할 이상이 유지되어 있었다.
약제 첨가 후에 워시아웃한 IGF11-16 의 0.5 nM 처치군과 IGF-I 의 1 nM 및 5 nM 처치군의 세포 증식 활성을 비교하면, IGF11-16 쪽이 통계학적으로 유의하게 강한 활성을 나타냈다. 이러한 점들로부터, IGF11-16 은, 약제의 워시아웃 후에도 인간 근아세포의 증식 활성을 유지하고, IGF-I 과 비교하여, 강력한 작용을 갖는 것이 밝혀졌다. IGF11-16 은 워시아웃 후에도 세포 증식 활성을 유지한 점에서, IGF-I 의 작용과는 상이하고, IGF11-16 은 IGF-I 수용체와 강력하게 결합하고, IGF-I 수용체의 지속적인 활성화 작용을 갖는 것이 밝혀졌다.
[실시예 13] 인간 분화 근세포에 있어서의 글루코오스 흡수
IGF11-16 의 글루코오스 흡수 작용을 검토하기 위해, 인간 분화 근세포를 사용하여, 방사 표지된 3H-2-데옥시 글루코오스 (3H-2-Deoxy Glucose) 의 흡수량을 측정하고, IGF-I 의 작용과 비교하였다.
정상 인간 골격근 근아세포 (Human Skeletal Muscle Myoblast Cells, HSMM, Lonza) 를 24 웰 플레이트 (Costar, 3526) 에 0.5 ㎖/웰 (2 × 104 세포/웰) 로 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건에서 인큐베이트하였다. 세포가 컨플루언트의 상태가 될 때까지 배지 (SkBM-2 (Lonza, CC-3246) 에 FBS (Lonza, CC-4423W), L-글루타민 (L-Glutamine (Lonza, CC-4422W)), 덱사메타손 (Dexamethasone (Lonza, CC-4421W)), rhEGF (Lonza, CC-4420W) 및 GA-1000 (Lonza, CC-4419W) 을 첨가하였다) 를 교환하였다. 컨플루언트가 된 HSMM 세포를 0.5 ㎖/웰의 분화용의 배지 (DMEM/F12 (1 : 1) (Gibco, 11320) 에 2 ％ 말 혈청 (Horse Serum (Sigma, H1270)), 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Gibco, 15070-063) 을 포함한다) 로 교환하고 37 ℃, 5 ％ CO2 로 인큐베이트하고 근세포로의 분화를 개시하였다. 분화 개시부터 약 6 일 후의 세포를 인간 분화 근세포로서 글루코오스 흡수의 실험에 사용하였다.
인간 분화 근세포를 0.5 ㎖/웰의 기아 (Starvation) 용의 배지 (1 g/L 글루코오스 함유 DMEM (Gibco, 11885) 에 0.1 ％ BSA 지방산 무첨가 (Fatty Acid free (생화학 공업, 82-002-5)), 50 U/㎖ 페니실린, 50 ug/㎖ 스트렙토마이신 (Gibco, 15070-063) 을 포함한다) 로 교환하고 37 ℃, 5 ％ CO2 로 하룻밤 인큐베이트하였다. 다음날, 0.5 ㎖/웰의 기아 (Starvation) 용의 배지로 교환하고 37 ℃, 5 ％ CO2 로 2 시간 인큐베이트하였다. 웰을 1 ㎖/웰의 PBS 로 세정한 후, 0.5 ㎖/웰의 각종 약제를 포함하는 처치 배지를 첨가하고 37 ℃, 5 ％ CO2 로 2 시간 인큐베이트하였다. 처치 배지는, 글루코오스 흡수용의 버퍼 (20 mmol/L HEPES (DOJINDO, 342-01375), 150 mmol/L NaCl (SIGMA, S5150), 5 mmol/L KCl (Wako, 163-03545), 5 mmol/L MgSO4 (Wako, 131-00405), 1.2 mmol/L KH2PO4 (Wako, 169-04245), 25 mmol/L CaCl2 (Fluka, 21114) 및 2 mmol/L 피루빈산 (pyruvate (Wako, 190-14881)) 가 되도록 주사 용수로 용해시키고, NaOH 로 pH 를 7.4 로 조정) 를 사용하여, 최종 농도 0.1 mmol/L 글루코오스, 0.1 ％ BSA, 3H-2-데옥시 글루코오스 (1 uCi/㎖), 각 농도의 인간 재조합 IGF-I 또는 IGF-I 수용체 아고니스트 항체가 되도록 조제하였다. 웰에 1 ㎖/웰의 냉각한 PBS 를 첨가하고, 3 회 세정함으로써 글루코오스 흡수를 종료시켰다. 웰에 0.25 ㎖/웰의 1 N NaOH 를 첨가하고 세포를 용해시켰다. 세포 용해액을, 3 ㎖ 의 액체 신틸레이터 ULTIMA GOLD (PerkinElmer Japan) 를 미리 첨가한 바이알에 전체량 첨가하고 교반하였다. 액체 신틸레이션 카운터로 3H 의 방사 활성 (DPM) 을 3 분간 측정하였다. 무처치군 (컨트롤군) 의 글루코오스 흡수량 (DPM) 의 평균치를 100 ％ 로 하여 처치군의 글루코오스 흡수율을 산출하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다.
IGF-I 의 0.8, 4, 20 및 100 nM 은, 농도 의존적, 또한 유의하게 글루코오스 흡수를 항진시켰다. 한편, IGF11-16 은, 100 nM 까지 유의한 작용을 나타내지 않았다. 이러한 점들로부터 IGF11-16 은, 인간 분화 근세포에서의 글루코오스 흡수 작용은 매우 약하다고 생각되었다.
[실시예 14] in vivo 약효 (모르모트에 있어서의 근육량 증가 작용)
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 in vivo 에서의 약효를 확인하기 위해, 모르모트에 IGF11-16 을 단회 투여하고, 2 주일 후의 근육량을 측정하고, IGF-I 을 지속 투여했을 때의 작용과 비교하였다. 근육량 증가 작용이란, 모르모트의 근육 중량을 컨트롤군과 비교하여 5 ％ 이상 증가시키는 것으로 한다.
IGF11-16 (0.03, 0.1 또는 0.3 mg/㎏) 을, 정상 모르모트의 피하 혹은 정맥 내에 단회 투여하였다. 양성 대조로서 인간 재조합 IGF-I (메카세르민) 을, 삼투압 펌프 (알제트) 를 사용하여 피하에 매립하고, 1 mg/㎏/일이 되도록 지속 투여하였다. 약제 투여의 2 주일 후, 모르모트를 마취하에서 방혈 치사시키고, 장지신근의 중량을 측정하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.
IGF11-16 의 0.03, 0.1 및 0.3 mg/㎏ 을 정맥 내 투여한 군 (iv) 은, 용매만을 처치한 컨트롤군과 비교하여, 용량 의존적, 또한 유의하게 근육량을 증가시켰다. 또, IGF11-16 의 0.3 mg/㎏ 을 피하 투여한 군 (sc) 에서도, 컨트롤군과 비교하여, 유의한 근육량의 증가를 나타냈다.
IGF11-16 의 0.03 내지 0.3 mg/㎏ 의 단회 투여군의 근육 증가량은, 인간 재조합 IGF-I 을 1 mg/㎏/일로 지속 투여한 군 (infusion) 과 동일한 정도였다. 이러한 점에서, IGF11-16 은, 정맥 내 혹은 피하에 대한 단회 투여에 의해, in vivo 에서도 약효를 갖는 것이 밝혀졌다.
IGF11-16 은, 단회 투여에 의해, IGF-I 의 지속 투여와 동등한 약효를 갖는 것이 밝혀졌다. 임상에서의 IGF-I (메카세르민) 의 용법 용량은 1 일 1 회 내지 2 회이다. 한편, in vivo 에 있어서 IGF11-16 은 2 주에 1 회의 투여로 IGF-I 의 지속 투여와 동등한 유효성을 나타내는 점에서, IGF-I 과 비교하여 지속성이 우수한 것이 밝혀졌다.
[실시예 15] in vivo 혈당 저하 작용 (모르모트에 있어서의 혈당 저하 작용)
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 in vivo 에서의 혈당 저하 작용의 유무를 확인하기 위해, 모르모트에 IGF11-16 을 단회 투여하고, 계시적으로 혈당치를 측정하고, IGF-I 의 단회 투여시의 혈당 저하 작용과 비교하였다. 혈당 저하 작용이란, 혈당치를 50 mg/dL 이하로 저하시키거나, 또는 저혈당 증상을 일으키는 작용으로 한다.
IGF-I 을 모르모트에 단회 피하 투여하고, 혈당 저하 작용을 검토하였다. 모르모트를 12 시간 절식시키고, 인간 재조합 IGF-I (메카세르민) 을, 0.3, 1, 3 및 10 mg/㎏ 으로 단회 피하 투여하였다. 모르모트는, 투여 24 시간 후까지 절식시켰다. 각성 상태의 모르모트를, 투여 전 (0 시간), 투여 1, 2, 4, 8, 10 및 24 시간 후에 채혈하고, 글루테스트 센서 (산와 화학 연구소) 를 사용하여 혈당치를 측정하였다. 결과를 도 6 에 나타낸다.
IGF-I 은, 0.3 mg/㎏ 으로부터 유의한 혈당 저하 작용을 나타내고, 1 mg/㎏ 이상에서는 저혈당 증상이 확인되고, 3 mg/㎏ 이상에서는 사망 예가 확인되었다.
IGF11-16 을 모르모트에 단회 피하 투여하고, 혈당 저하 작용을 검토하였다. 모르모트를 12 시간 절식시키고, IGF11-16 을, 10, 30 및 100 mg/㎏ 으로 단회 피하 투여하였다. 모르모트는, 투여 24 시간 후까지 절식시켰다. 각성 상태의 모르모트를, 투여 전 (0 시간), 투여 2, 4, 8, 10 및 24 시간 후에 채혈하고, 글루테스트 센서 (산와 화학 연구소) 를 사용하여 혈당치를 측정하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다.
IGF11-16 은, 용매만을 투여한 컨트롤군과 비교하여, 100 mg/㎏ 투여군에서도, 혈당치에 유의한 차가 확인되지 않았다. 이러한 점에서, IGF11-16 의 피하 투여는, 혈당 저하 작용을 갖지 않고, 혈당치에 영향을 미치지 않는 것이 밝혀졌다.
IGF11-16 을 모르모트에 단회 정맥 내 투여하고, 혈당 저하 작용을 검토하였다. 모르모트를 12 시간 절식시키고, IGF11-16 을, 0.1, 1.5, 6 및 20 mg/㎏ 으로 정맥 내 투여하였다. 모르모트는, 투여 24 시간 후까지 절식시켰다. 각성 상태의 모르모트를, 투여 전 (0 시간), 투여 0.5, 1, 2, 4, 8 및 24 시간 후에 채혈하고, 글루테스트 센서 (산와 화학 연구소) 를 사용하여 혈당치를 측정하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다.
IGF11-16 은, 용매만을 투여한 컨트롤군과 비교하여, 20 mg/㎏ 투여군에서도, 혈당치에 유의한 차가 확인되지 않았다. 이러한 점에서, IGF11-16 은 정맥 내 투여에서도, 혈당 저하 작용을 갖지 않고, 혈당치에 영향을 미치지 않는 것이 밝혀졌다.
IGF11-16 은, 피하 및 정맥 내의 어느 투여법에서도, IGF-I 과 같은 현저한 혈당 저하 작용을 갖지 않고, 혈당치에 영향을 미치지 않는 점에서, IGF-I 의 부작용인 저혈당을 극복한, 약제로서의 가능성이 밝혀졌다.
[실시예 16] in vivo 약효 (모르모트에 있어서의 성장 촉진 효과)
IGF-I 수용체 아고니스트 항체의 in vivo 에서의 뼈에 대한 약효를 확인하기 위해, IGF-I 을 지속 투여, 및 성장 호르몬 (GH) 을 1 일 1 회 반복 투여했을 때의 작용과 비교하였다. 하수체가 적출된 모르모트에 IGF11-16 을 단회 투여하고, 2 주일 후의 경골의 길이, 및 성장판 연골의 두께를, 성장 촉진 효과의 지표로서 측정하였다. IGF11-16 (0.3 mg/㎏ 및 1 mg/㎏) 을, 하수체 적출 모르모트에 단회 피하 투여하였다. 비교 대조로서 인간 재조합 IGF-I (메카세르민) 을, 삼투압 펌프 (알제트) 를 사용하여 피하에 매립하고, 1 mg/㎏/일이 되도록 지속 투여하였다. 또, 다른 비교 대조로서 인간 재조합 GH (제노트로핀 (등록상표)) 를, 1 mg/㎏ 의 용량으로, 1 일 1 회, 반복 피하 투여하였다. 약제 투여의 2 주일 후, 모르모트를 마취하에서 방혈 치사시키고, 경골 근위부의 성장판 연골의 두께, 및 경골의 길이를 측정하였다. 결과를 도 9 및 도 10 에 나타낸다.
IGF11-16 의 0.3 mg/㎏ 및 1 mg/㎏ 을 피하 투여한 군 (IGF11-16) 은, 하수체 적출 모르모트에 용매만을 처치한 컨트롤군 (비히클) 과 비교하여, 용량 의존적, 또한 유의하게 성장판 연골의 두께, 및 경골의 길이를 신전시키고, 성장 촉진 효과가 확인되었다.
IGF11-16 의 0.3 mg/㎏ 의 단회 투여군의 성장 촉진 효과는, 인간 재조합 IGF-I 을 1 mg/㎏/일로 지속 투여한 군 (IGF-I) 과 동일한 정도였다. 또, IGF11-16 의 1 mg/㎏ 의 단회 투여군의 성장 촉진 효과는, 인간 재조합 GH 를 1 mg/㎏/일로 반복 투여한 군 (GH) 과 동일한 정도였다. 이러한 점에서, IGF11-16 은, 단회 투여에 의해, IGF-I 의 지속 투여, 및 GH 의 1 일 1 회의 반복 투여와 동등한 약효를 갖는 것이 밝혀졌다. 임상에서의 인간 재조합 IGF-I (메카세르민) 및 인간 재조합 GH (제노트로핀 (등록상표)) 의 용법 용량은, 각각 1 일 1 회 내지 2 회의 피하 주사, 및 주 6 회 내지 7 회의 피하 주사이다. 한편, in vivo 에 있어서 IGF11-16 은 2 주에 1 회의 투여로 IGF-I 의 지속 투여, 및 GH 의 1 일 1 회 반복 투여와 동등한 유효성을 나타내는 점에서, IGF-I 및 GH 와 비교하여 지속성이 우수한 것이 밝혀졌다.
[실시예 17] IGF-I 과 IGF11-16 의 혈중 동태
IGF-I 의 혈중 동태
모르모트를 12 시간 절식시키고, 인간 재조합 IGF-I 을, 0.3, 1, 3 및 10 mg/㎏ 으로 피하 투여하였다. 모르모트는, 투여 24 시간 후까지 절식시켰다. 각성 상태의 모르모트를, 투여 전 (0 시간), 투여 1, 2, 4, 8, 10 및 24 시간 후에 채혈하고, 혈장 중의 인간 IGF-I 농도를 ELISA (DG100, R＆D) 에 의해 측정하였다. 결과를 도 11 에 나타낸다.
혈장 중의 IGF-I 농도는 투여 용량에 의존하여 상승하고, 투여 24 시간 후의 혈장 중의 IGF-I 농도는 피크시의 약 50 ％ 이하로까지 저하되어 있었다. 0.3 mg/㎏ 투여군의 투여 24 시간 후의 IGF-I 농도는 측정 하한 이하였다. 또, 10 mg/㎏ 투여군은 투여 4 시간 이후에 저혈당으로 인해 사망하였기 때문에 혈장을 채취할 수 없었다.
IGF11-16 의 혈중 동태
모르모트를 12 시간 절식시키고, IGF-I 수용체 아고니스트 항체를, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100 mg/㎏ 으로 피하 투여하였다. 모르모트는, 투여 24 시간 후까지 절식시키고, 24 시간 후에 재급식하였다. 각성 상태의 모르모트를, 투여 전 (0 시간), 투여 2, 4, 8, 10, 24, 48 및 72 시간 후에 채혈하고, 혈장 중의 IGF11-16 농도를 ELISA 에 의해 측정하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다.
혈장 중의 IGF11-16 농도는 투여 용량에 의존하여 상승하고, 투여 48 시간 이후에도 혈장 중의 IGF11-16 농도는 투여 24 시간 후와 비교하여 약 50 ％ 이상을 유지하고 있었다. IGF11-16 의 혈중 동태는 IGF-I 과 비교하여 지속성이 우수한 것이 밝혀졌다.
본 발명은, 척추 동물의 IGF-I 수용체에 특이적으로 결합하고, IGF-I 수용체를 개재하여, 근육량 또는 성장판 연골의 두께를 증가시키고, 혈당치를 저하시키지 않는 항체를 제공할 수 있기 때문에, 항 IGF-I 수용체 항체에 관한 질환의 치료, 예방 또는 진단에 이용 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> Teijin Pharma Limited <120> ANTI-IGF-I RECEPTOR ANTIBODY <130> P46138 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60 Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <210> 2 <211> 1367 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 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