JP2004357612A - Fgfシグナル伝達に関与する遺伝子 - Google Patents

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仁 岡本
Yoshikazu Hirate
良和 平手
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Abstract

【課題】中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム等の解析を可能とする、FGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子を提供する。
【解決手段】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする、FGFシグナル伝達に関与する遺伝子。(a)特定のアミノ酸配列を含むタンパク質(b)特定のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質。
【選択図】なし

Description

【0001】
【発明が属する技術分野】
本発明は、FGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子に関する。
【0002】
【従来の技術】
中枢神経系のうち中脳視蓋部と小脳は中脳後脳境界部の持つオーガナイザー活性によって誘導的に形成されると考えられている。中脳後脳境界部の形成にはいくつかのシグナル分子(Wnt1、FGF8)や転写因子(Islet3、Otx2、Gbx2、Pax2/5/8、Eng1/2/3)が関与していることが報告されている(非特許文献1〜11参照)。
しかしながら、これらの既知遺伝子の働きだけでは中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成を説明することはできない。
【0003】
【非特許文献1】
McMahon, A.P. and Bradley, A., 1990. The Wnt−1 (int−1) proto−oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell 62, 1073−1085.
【非特許文献2】
McMahon, A.P., Joyner, A.L., Bradley, A. and McMahon, J.A., 1992. The midbrain−hindbrain phenotype of Wnt−1−/Wnt−1− mice results from stepwise deletion of engrailed−expressing cells by 9.5 days postcoitum. Cell 69, 581−595.
【非特許文献3】
Crossley, P.H., Martinez, S. and Martin, G.R., 1996. Midbrain development induced by FGF8 in the chick embryo. Nature 380, 66−68.
【非特許文献4】
Kikuchi, Y., Segawa, H., Tokumoto, M., Tsubokawa, T., Hotta, Y., Uyemura, K. and Okamoto, H., 1997. Ocular and cerebellar defects in zebrafish induced by overexpression of the LIM domains of the islet−3 LIM/homeodomain protein. Neuron 18, 369−382.
【非特許文献5】
Broccoli, V., Boncinelli, E. and Wurst, W., 1999. The caudal limit of Otx2 expression positions the isthmic organizer. Nature 401, 164−168.
Millet, S., Campbell, K., Epstein, D.J., Losos, K., Harris, E. and Joyner, A.L., 1999. A role for Gbx2 in repression of Otx2 and positioning the mid/hindbrain organizer. Nature 401, 161−164.
【0004】
【非特許文献6】
Pfeffer, P.L., Gerster, T., Lun, K., Brand, M. and Busslinger, M., 1998. Characterization of three novel members of the zebrafish Pax2/5/8 family: dependency of Pax5 and Pax8 expression on the Pax2.1 (noi) function. Development 125, 3063−3074.
【非特許文献7】
Lun, K. and Brand, M., 1998. A series of no isthmus (noi) alleles of the zebrafish pax2.1 gene reveals multiple signaling events in development of the midbrain−hindbrain boundary. Development 125, 3049−3062.
【非特許文献8】
Fjose, A., Njolstad, P.R., Nornes, S., Molven, A. and Krauss, S., 1992. Structure and early embryonic expression of the zebrafish engrailed−2 gene. Mech. Dev. 39, 51−62.
【非特許文献9】
Ekker, M., Wegner, J., Akimenko, M.A. and Westerfield, M., 1992. Coodinate embryonic expression of three zebrafish engrailed genes. Development 116, 1001−1010.
【非特許文献10】
Wurst, W., Auerbach, A.B. and Joyner, A.L., 1994. Multiple developmental defects in Engrailed−1 mutant mice: an early mid−hindbrain deletion and patterning defects in forelimbs and sternum. Development 120, 2065−2075.
【非特許文献11】
Joyner, A.L., Skarnes, W.C. and Rossant, J., 1989. Production of a mutation in mouse En−2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature 338, 153−156.
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム等の解析を可能とする、FGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子を提供することを目的とする。
【0006】
【課題が解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明者らが鋭意検討し、FGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子ファミリーを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【0007】
本発明は以下を包含する。
(1) 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする、FGFシグナル伝達に関与する遺伝子。
(a)配列番号2、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20及び22に表すアミノ酸配列のうちいずれか1のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20及び22に表すアミノ酸配列のうちいずれか1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質。
【0008】
(2) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなるFGFシグナル伝達に関与する遺伝子。
(a)配列番号1、4、6、8、10、12、14、17、19及び21に表す塩基配列のうちいずれか1の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号1、4、6、8、10、12、14、17、19及び21に表す塩基配列のうちいずれか1の塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【0009】
(3) 上記(1)又は(2)記載のFGFシグナル伝達に関与する遺伝子を有するベクター。
(4) 上記(1)又は(2)記載のFGFシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させた遺伝子導入細胞。
【0010】
(5) 上記(1)又は(2)記載のFGFシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させたトランスジェニック動物。
(6) 上記(4)記載の遺伝子導入細胞又は上記(5)記載のトランスジェニック動物に対してリード化合物を作用させる工程と、
中脳・後脳境界部においてFGFシグナルと関連して働くリード化合物を同定する工程とを含むスクリーニング方法。
【0011】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者は、先ず、モデル動物としてゼブラフィッシュ(Danio rerio)Islet−3 (Kikuchi, Y., Segawa, H., Tokumoto, M., Tsubokawa, T., Hotta, Y., Uyemura, K. and Okamoto, H., 1997. Ocular and cerebellar defects in zebrafish induced by overexpression of the LIM domains of the islet−3 LIM/homeodomain protein. Neuron 18, 369−382.) によって発現制御を受ける新規遺伝子群の探索を行った。ここで、Islet−3は、中脳・後脳境界部(以下、MHBと呼ぶ)の発生を促進する中脳からのシグナルの発現を制御するLIM/ホメオドメイン型の転写因子である。
【0012】
そして、本発明者は、Islet−3による発現制御を受け、且つFGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子ファミリーを同定した。この新規な遺伝子ファミリーを、canopy遺伝子ファミリーと呼ぶこととし、当該ファミリーに属する各遺伝子を「cnpy」なる文言を付して命名する。
【0013】
ゼブラフィッシュ由来のcnpy遺伝子ファミリーは、cnpy1〜4遺伝子の4種類存在している。cnpy1遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号1に示し、cnpy1遺伝子がコードするcnpy1のアミノ酸配列を配列番号2に示す。cnpy2遺伝子がコードするcnpy2の部分アミノ酸配列を配列番号3に示す。cnpy3遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号4に示し、cnpy3遺伝子がコードするcnpy3のアミノ酸配列を配列番号5に示す。cnpy4遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号6に示し、cnpy4遺伝子がコードするcnpy4のアミノ酸配列を配列番号7に示す。
【0014】
また、cnpy1のアミノ酸配列(配列番号2)に基づいて、National Center for Biotechnology Information(NCBI)で公開されているヒトゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、ヒト由来のcnpy遺伝子ファミリーを同定した。ヒト由来のcnpy遺伝子ファミリーは、ヒトcnpy1〜4遺伝子の4種類存在している。ヒトcnpy1遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号8に示し、ヒトcnpy1遺伝子がコードするヒトcnpy1のアミノ酸配列を配列番号9に示す。ヒトcnpy2遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号10に示し、ヒトcnpy2遺伝子がコードするヒトcnpy2のアミノ酸配列を配列番号11に示す。ヒトcnpy3遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号12に示し、ヒトcnpy3遺伝子がコードするヒトcnpy3のアミノ酸配列を配列番号13に示す。ヒトcnpy4遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号14に示し、ヒトcnpy4遺伝子がコードするヒトcnpy4のアミノ酸配列を配列番号15に示す。
【0015】
ゼブラフィッシュ由来のcnpy1とヒト由来のcnpy1とについて相同性を測定した結果を図1に示す。このアライメントは、Genetyx−Mac, ver10 (ゼネティクス)のLipman−Pearson法 (デフォルトパラメータ設定)で作製した。同様に、ゼブラフィッシュ由来のcnpy2(部分アミノ酸配列)とヒト由来のcnpy2とについて相同性を測定した結果を図2に示す。ゼブラフィッシュ由来のcnpy3とヒト由来のcnpy3とについて相同性を測定した結果を図3に示す。ゼブラフィッシュ由来のcnpy4とヒト由来のcnpy4とについて相同性を測定した結果を図4に示す。
【0016】
図1乃至4に示すように、ゼブラフィッシュ由来のcnpy遺伝子ファミリーとヒト由来のcnpy遺伝子ファミリーとは、高い相同性を示すため、両ファミリーに属する遺伝子は同機能を有することが考えられる。
【0017】
また、cnpy1のアミノ酸配列(配列番号2)に基づいて、NCBIで公開されているマウスゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、マウス由来のcnpy遺伝子ファミリーを同定することもできる。また、ゼブラフィッシュ、ヒト、マウスに限定されず、例えば、ウシ、ブタ、ラット、ニワトリ、カエル、ホヤ、ウニ、ショウジョウバエ、線虫等のデータベースを検索することによって、各種後生動物におけるcnpy遺伝子ファミリーを同定することができる。
【0018】
マウス由来のマウスcnpy1遺伝子がコードするマウスcnpy1の部分アミノ酸配列を配列番号16に示す。マウスcnpy2遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号17に示し、マウスcnpy2遺伝子がコードするマウスcnpy2のアミノ酸配列を配列番号18に示す。マウスcnpy3遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号19に示し、マウスcnpy3遺伝子がコードするマウスcnpy3のアミノ酸配列を配列番号20に示す。マウスcnpy4遺伝子のコード領域を含む塩基配列を配列番号21に示し、マウスcnpy2遺伝子がコードするマウスcnpy4のアミノ酸配列を配列番号22に示す。
【0019】
本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子は、これら全てのcnpy遺伝子ファミリーに含まれるcnpy遺伝子を意味する。
また、本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子は、2、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20及び22に表すアミノ酸配列のうちいずれかのアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質(以下、「変異型タンパク質」と総称する)をコードする遺伝子を含んでいる。すなわち、本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子は、変異型タンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。
【0020】
変異型タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、配列番号1、4、6、8、10、12、14、17、19及び21に示す塩基配列における1以上の塩基を欠失、置換又は付加することによって作製することができる。1以上の塩基を欠失、置換又は付加する際には、従来公知の手法を特に限定することなく、適宜使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばT.クンケル(Kunkel)の部位特異的変異導入法(Kunkel, T. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488−492 (1985) )、 Gapped duplex法等が挙げられる。また、通常のクンケル法で使用する1〜2本の改変用オリゴヌクレオチドを、最高16本のオリゴヌクレオチドを同時に用いて多部位での効率よい置換を行う改良法なども採用することができる。本発明では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutan−K(宝酒造社製)やMutan−G(宝酒造社製))などを用いて、あるいは、宝酒造社製のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
【0021】
さらに、本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子は、配列番号1、4、6、8、10、12、14、17、19及び21に表すいずれかの塩基配列の相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、ストリンジェントな条件下において、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことを意味する。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち60%以上、好ましくは80%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い場合はハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が15〜900mMであり、温度が37〜70℃、好ましくは68℃での条件を意味する。
【0022】
ここで、「FGFシグナル伝達」とは、FGFが受容体に結合することにより進行するシグナルカスケードを意味する。「FGFシグナル伝達に関与する」とは、上記シグナルカスケードを構成する役割及び上記シグナルカスケードを活性化する機能を意味する。従って、「FGFシグナル伝達に関与する遺伝子」とは、当該シグナルカスケードの一部に含まれる遺伝子や、当該シグナルカスケードを活性化する機能を有する遺伝子を意味する。ある遺伝子がFGFシグナル伝達に関与するか否かは、当該遺伝子をノックアウトした細胞又はトランスジェニック動物において、上記シグナルカスケードの下流にある遺伝子の発現の有無や、上記シグナルカスケードの一部を構成するタンパク質を活性化するか否かにより確認できる。トランスジェニック動物としては、特に限定されないが、トランスジェニック・ゼブラフィッシュやトランスジェニック・マウス等を用いることができる。上記シグナルカスケードの下流にある遺伝子としては、engrailed遺伝子(Ekker, M., Wegner, J., Akimenko, M.A. and Westerfield, M., 1992. Coodinate embryonic expression of three zebrafish engrailed genes. Development 116, 1001−1010.)、sef遺伝子(Furthauer, M., Lin, W., Ang, S.L., Thisse, B. and Thisse, C., 2002. Sef is a feedback−induced antagonist of Ras/MAPK−mediated FGF signalling. Nat Cell Biol 4, 170−4.; Tsang, M., Friesel, R., Kudoh, T. and Dawid, I.B., 2002. Identification of Sef, a novel modulator of FGF signalling. Nat Cell Biol 4, 165−9.)、sprouty2遺伝子(Chambers, D., Medhurst, A.D., Walsh, F.S., Price, J. and Mason, I., 2000. Differential display of genes expressed at the midbrain − hindbrain junction identifies sprouty2: an FGF8−inducible member of a family of intracellular FGF antagonists. Mol. Cell. Neurosci. 15, 22−35.)を挙げることができる。また、シグナルカスケードの一部を構成して活性化されるタンパク質としては、ERK(Boulton, T.G., Nye, S.H., Robbins, D.J., Ip, N.Y., Radziejewska, E., Morgenbesser, S.D., DePinho, R.A., Panayotatos, N., Cobb, M.H. and Yancopoulos, G.D., 1991. ERKs: a family of protein−serine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF. Cell 65, 663−675.)を挙げることができる。
【0023】
上記シグナルカスケードの下流にある遺伝子の発現の有無は、定法に従って確認することができ、例えば、ノーザンハイブリダイゼイション、ウエスタンブロッティング、in situ ハイブリダイゼイション、RT−PCR等の手法で確認することができる。
【0024】
また、上記シグナルカスケードの一部を構成するタンパク質を活性化するか否かは、定法に従って確認することができ、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫組織化学法等の手法で確認することができる。
【0025】
本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子によれば、中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム等の解析が可能となる。特に、cnpy1遺伝子の転写産物からの翻訳を阻害したトランスジェニック動物においては、中脳視蓋部の低形成及び中脳後脳境界部の形成異常が観察されることから、cnpy1遺伝子は、中脳視蓋部及び中脳後脳境界部の形成に関与しているといえる。また、cnpy3遺伝子の転写産物からの翻訳を阻害したトランスジェニック動物においては、中脳視蓋部の低形成、中脳後脳境界部の形成異常、耳石の形成異常及び発生後期におけるレンズの変性が観察されることから、cnpy3遺伝子は、中脳視蓋部、中脳後脳境界部及び耳胞の形成に関与しているといえる。
【0026】
また、FGFシグナルは、中脳後脳境界部の形成以外にも、内耳、血管、肢芽、歯牙、等の様々な器官の形成や、細胞の癌化などに深く関わっている。このシグナルの活性を調節できる細胞外因子を発見できれば、器官形成や細胞の増殖の制御因子として広い応用の道が開けると期待される。したがって、本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させたトランスジェニック動物を用いれば、中脳・後脳境界部においてFGFシグナルと関連して働く分子を同定することが可能となり、器官形成や細胞の増殖制御に深く関わるFGFの働きの制御に繋がる新規分子を同定することができる。
【0027】
すなわち、本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子を導入した遺伝子導入細胞又は本発明に係るFGFシグナル伝達に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物に対してリード化合物を作用させる工程と、中脳・後脳境界部においてFGFシグナルと関連して働くリード化合物を同定する工程とを含むスクリーニング方法を提供することができる。
【0028】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0029】
〔実施例1〕cnpy遺伝子ファミリーの発現解析
本例では、先ず、ゼブラフィッシュ胚におけるcnpy遺伝子ファミリーの発現を観察した。
ゼブラフィッシュ胚を4%パラホルムアルデヒド/PBS (0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO, pH7.3)で4 ℃で一晩固定し、PBSTw (PBS+0.1% Tween−20)で5分間4回洗う。胚をメタノールに置換し−20Cで30分以上おいた後、75, 50, 25% メタノール/PBSTwで順次置換する。PBSTwで5分間2回リンスした後、受精後24時間以降の胚についてはProteinase K (10 mg/ml in PBSTw)で室温で3〜10分間消化。2 mg/ml グリシン/PBSTwでリンスした後、4% パラホルムアルデヒド/PBSTwで20分間固定する。PBSTwで5分間5回洗い、Hb4 (50% ホルムアミド、5x SSC (0.75 M 塩化ナトリウム, 75 mM クエン酸ナトリウム, pH7.0), 50 mg/ml ヘパリン, 0.1% Tween−20, 5 mg/ml torula RNA)を加え、65 ℃で1〜8時間プレハイブリダイゼイションを行う。80 ℃で10分間の熱変性を行ったディゴキシジェニンラベルされたcnpy1, cnpy3, cnpy4全長に対するアンチセンスリボプローブ/Hb4を加え、65 ℃で一晩ハイブリダイゼイションを行う。その後、胚を50% ホルムアミド/2xSSCTw (0.3 M 塩化ナトリウム, 30 mM クエン酸ナトリウム、0.1% Tween−20)で30分間2回、2xSSTwで15分間、0.2xSSCTwで30分間2回いずれも65 ℃で洗浄を行う。2% Blocking reagent (Roche)/MBT (0.1 Mマレイン酸、0.15 M塩化ナトリウム、0.1% Tween−20)を加え室温で1時間ブロッキングを行い、AP標識抗DIG抗体(Roche)をPBSTwで5000倍希釈し、室温で2時間あるいは4 ℃で一晩インキュベートする。PBSTwで20分間6回洗浄した後、SB (100 mM 塩化ナトリウム、50 mM 塩化マグネシウム、100 mM Tris−HCl, pH 9.5, 0.1% Tween20)で5分間2回置換し、SS (NBT/BCIP (Roche), SB)で発色を行う。その後、PBSTwで5分間2回洗浄し、100% エタノールで10分間脱色を行う。50% エタノール/PBSTwで5分間、PBSTwで5分間2回洗浄した後、25, 50, 75%グリセロール/PBSTwで各5分間置換し、75% グリセロール/PBSTwでマウントし検鏡する。
【0030】
cnpy1、cnpy3及びcnpy4遺伝子のゼブラフィッシュ胚における発現を観察した結果を図5及び図6に示す。なお、図5は、左から1列目がcnpy1遺伝子の発現、2列目がcnpy3遺伝子の発現、3列目がcnpy4遺伝子の発現を示しており、上から1行目が8細胞期にあるゼブラフィッシュ胚であり、2行目がドーム期(胞胚期)にあるゼブラフィッシュ胚であり、3行目が30% epiboly期(初期原腸胚期)にあるゼブラフィッシュ胚である。
【0031】
図6は、左から1列目がcnpy1遺伝子の発現、2列目がcnpy3遺伝子の発現、3列目がcnpy4遺伝子の発現を示しており、上から1行目が胚盾期(中期原腸胚期)にあるゼブラフィッシュ胚であり、2行目が尾芽胚期にあるゼブラフィッシュ胚であり、3行目が受精後18時間にあるゼブラフィッシュ胚であり、4行目が受精後25時間にあるゼブラフィッシュ胚である。
【0032】
図5及び図6から、cnpy1遺伝子は、マターナルな発現が弱く見られ、受精後12時間頃から孵化腺原基での発現が見られるようになり、受精後14時間以降はMHBにおいて特異的に発現が見られることが判った。また、図5及び図6から、cnpy3遺伝子及びcnpy4遺伝子は、マターナルな発現が強く見られ、胚性発現は胚全体に弱く見られることが判った。
【0033】
次に、本例では、マウス胚におけるcnpy遺伝子ファミリーの発現を観察した。
妊娠10.5日目のマウス(ICR)から胚を摘出し、PBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒド/PBSで一晩固定した。エタノールで脱水後、75, 50, 25%エタノール/PBSTwシリーズで再水和を行った。10 mg/ml Proteinase K/PBSTwで5〜15分間処理し、2 mg/mlグリシン/PBSTwで5分間、PBSTwで5分間2回洗浄し、0.2% グルタルアルデヒド/4% パラホルムアルデヒド/PBSTwで20分間固定した。PBSTwで5分間2回洗浄した後、70 ℃で1時間処理した後氷水中で完全に冷やし、6% H/PBSTwを加え室温で1時間置く。PBSTwで5分間3回洗浄した後、70 ℃で保温しておいたプレハイブリダイゼイション溶液(50% ホルムアミド、5x SSC, pH 4.5, 50 mg/ml torula RNA, 1% SDS, 50 mg/mlヘパリン)を加え、70 ℃で5分間置いた後、新しいプレハイブリダイゼイション溶液を加え、1時間以上インキュベートする。80℃で10分間の熱変性を行ったディゴキシジェニンラベルされたcnpy2, cnpy3, cnpy4全長に対するアンチセンスリボプローブ/プレハイブリダイゼイション溶液を加え、70 ℃で揺らしながら一晩ハイブリダイゼイションを行う。Solution1 (50%ホルムアミド、5xSSC, pH4.5, 1% SDS)を加え70 ℃で30分間3回洗浄を行う。Solution1 : Solution2 (5xSSC, pH4.5, 0.1% Tween−20)を加え70 ℃で10分間洗浄を行う。Solution2を加え室温で5分間3回洗浄する。Solution2を加え室温で30分間洗浄する。Solution3 (50% ホルムアミド, 2x SSC, pH4.5, 1% SDS)を加え70 ℃で5分間2回洗浄を行う。Solution3を加え70 ℃で30分間3回洗浄を行う。Solution3 : TBSTw (150 mM 塩化ナトリウム、100 mM Tris−HCl, pH7.5, 0.1% Tween−20) =1:1を加え70 ℃で10分間インキュベートする。TBSTwを加え、室温で5分間5回インキュベートする。2% Blocking reagent (Roche)/TBSTwで60分間ブロッキングを行う。AP標識抗DIG抗体(Roche)をTBSTwで5000倍希釈し、4 ℃で一晩インキュベートする。TBSTwを加え、室温で5分間4回インキュベートする。TBSTwを加え、室温で1時間6回インキュベートする。NTMT (0.1 M 塩化ナトリウム、0.1 M Tris−HCl, pH9.5, 50 mM塩化マグネシウム、1% Tween−20)を加え室温で5分間2回インキュベートする。発色液 (NBT/BCIP/NTMT)を加え室温で遮光して1〜5時間発色を行う。PBSTwを加え室温で5分間5回洗浄する。100% エタノールで10分間脱色を行う。50% エタノール/PBSTwで5分間、PBSTwで5分間2回洗浄した後、25, 50, 75%グリセロール/PBSTwで各5分間置換し、75% グリセロール/PBSTwでマウントし検鏡する。
【0034】
受精後10.5日目のマウス胚を観察した結果を図7に示す。なお、図7において、左から順にcnpy2遺伝子、cnpy3遺伝子及びcnpy4遺伝子の発現を観察した結果である。図7から、cnpy2遺伝子、cnpy3遺伝子及びcnpy4遺伝子ともにマウス胚全体に亘って発現が見られたが、特に肢芽及び尾部における強い発現を観察することができる。
【0035】
〔実施例2〕アンチセンスモルフォリノオリゴによるノックダウン実験
ゼブラフィッシュにおいて、転写産物からタンパク質への翻訳をアンチセンスモルフォリノオリゴ(MO)の顕微注入により効果的に阻害できる(ノックダウン)ことが知られている。そこで、本例では、cnpy1遺伝子を同手法でノックダウンした胚(cnpy1−MOノックダウン胚と呼ぶ。その他のcnpy遺伝子ファミリーのノックダウン胚も同様に称する。)、cnpy3−MOノックダウン胚、cnpy3/4−MOノックダウン胚及びcnpy4−MOノックダウン胚を作製し、形態異常を観察した。
【0036】
各アンチセンスモルフォリノオリゴの配列は以下の通りである。
cnpy1−MO;ATGGTGACATGCTGGTCTCCTGAG(配列番号23)
cnpy3−MO;TTACAACGAGCAATACTAAAACCCC(配列番号24)
cnpy4−MO;GTAAACATTTCCATACTGACTACAA(配列番号25)
【0037】
これらアンチセンスモルフォリノオリゴは、1x Danieau buffer (58 mM塩化ナトリウム、0.7 mM塩化カリウム、0.5 mM硫酸マグネシウム、0.6 mM硝酸カルシウム、5.0 mM HEPES, pH7.6)にそれぞれ溶解した。1〜2細胞期のゼブラフィッシュ胚にアンチセンスモルフォリノオリゴを顕微注入した。
【0038】
結果を図8及び図9に示す。図8において、(a)は正常なゼブラフィッシュ胚におけるMHB周辺を上方から撮影した写真であり、(b)は正常なゼブラフィッシュ胚におけるMHB周辺を側方から撮影した写真であり、(c)はcnpy1−MOノックダウン胚におけるMHB周辺を上方から撮影した写真であり、(d)はcnpy1−MOノックダウン胚におけるMHB周辺を側方から撮影した写真であり、(e)はcnpy3−MOノックダウン胚におけるMHB周辺を上方から撮影した写真であり、(f)はcnpy3−MOノックダウン胚におけるMHB周辺を側方から撮影した写真である。図9において、左から順に、正常なゼブラフィッシュ胚、cnpy3−MOノックダウン胚及びcnpy3/4−MOノックダウン胚における耳胞(矢印で示す)を撮影した写真である。
【0039】
図8及び図9の結果から、各ノックダウン胚において以下の形態異常が観察された。cnpy1−MOノックダウン胚では中脳視蓋部の低形成及びMHBの形成異常が観察された。cnpy3−MOノックダウン胚では軽度の耳胞及び耳石の形成異常が観察された。cnpy3/4−MOノックダウン胚においては重度の耳胞及び耳石の形成異常が見られた。また、cnpy4−MO単独では異常はほとんど見られない(図示せず)ので、cnpy4遺伝子は耳胞及び耳石の形成においてcnpy3遺伝子と協調的に働いていると考えられた。MHB形成及び耳胞の形成においてFGFシグナルが重要な役割を担っていることが知られているので、本例によってcnpy遺伝子ファミリーはFGFのシグナル伝達に関与していることが示唆された。
【0040】
〔実施例3〕繊維芽細胞増殖因子(FGF)シグナルへの関与
実施例2によりcnpy遺伝子ファミリーがFGFシグナル伝達に関与することが示唆されたため、本例では、cnpy遺伝子ファミリーとFGFシグナルとの関連について検討した。
【0041】
<FGFビーズ実験>
間脳及び中脳付近にFGF8bに浸したビーズを埋め込むことによって異所的にengrailed遺伝子の発現が誘導されることが知られている(Crossley, P.H., Martinez, S. and Martin, G.R., 1996. Midbrain development induced by FGF8 in the chick embryo. Nature 380, 66−68.)。そこで、正常なゼブラフィッシュ胚及びcnpy1−MOノックダウン胚にFGF8bビーズを埋め込み、engrailed遺伝子の発現誘導を確認した。
【0042】
Recombinant mouse FGF−8b (R&D systems)をPBSに溶解し、あらかじめPBSで洗浄しておいたheparin, insolubilized on acrylic beads (Sigma)を加え、0.5 mg/mlの濃度で4 ℃で一晩インキュベートする。受精後15時間の正常胚あるいはcnpy1−MOノックダウン胚にFGFを浸したビーズを埋め込み、1/3希釈Ringer液 (39 mM塩化ナトリウム、0.97 mM塩化カリウム、1.8 mM塩化カルシウム、1.7 mM Hepes, pH7.2)中で3時間インキュベート後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、in situハイブリダイゼイションによってengrailed遺伝子の発現を調べた。
【0043】
結果を図10に示す。図10から判るように、cnpy1−MOノックダウン胚においては、FGF8bビーズを埋め込んだところ、engrailed遺伝子の異所的な発現の程度が大幅に減少した。なお、正常なゼブラフィッシュ胚(正常胚)においては、FGF8bビーズを埋め込むことによって、engrailed遺伝子の異所的な発現が増加していることが判る。この結果から、cnpy1遺伝子は、FGFシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。
【0044】
<活性化ERKのウエスタンブロットによる検出>
FGFのシグナルはFGFが受容体に結合しその下流にあるシグナルカスケードを活性化することによって伝わる。ERKの活性化はFGFシグナルの指標となる(Gotoh, Y. and Nishida, E., 1996. Signals for mesoderm induction. Roles of fibroblast growth factor (FGF)/mitogen−activated protein kinase (MAPK) pathway. Biochim Biophys Acta 1288, F1−7.)。そこで、cnpy1−MOノックダウン胚及びcnpy3/4−MOノックダウン胚において活性化ERKをウエスタンブロットによって検出した。なお、正常なゼブラフィッシュ胚(正常胚)及びfgf3−MOノックダウン胚をコントロールとした。
【0045】
fgf3−MOの配列はCATTGTGGCATGGCGGGATGTCGGC(配列番号26)である。受精後18時間の正常胚、fgf3−MOノックダウン胚、cnpy3/4−MOノックダウン胚、及びcnpy1−MOノックダウン胚の卵膜と卵黄を取り除く。胚をSample buffer (125 mM Tris−HCl, pH6.8, 2% SDS, 10%グリセロール、50 mg/mlブロモフェノールブルー)で溶解し、95 ℃、5分間処理する。SDS−PAGEゲルに1レーンあたり3匹分のサンプルをアプライし、電気泳動を行う。泳動後、エレクトロブロッティングによりタンパク質をPVDFメンブレンに転写する。5%スキムミルク/TBSTw (TBS, 0.05% Tween−20)で一晩4 ℃でブロッキングを行う。活性化ERKを検出するためには1%スキムミルク/TBSTWで1:10000希釈したanti−diphosphorylated ERK (sigma)を加え、全ERKを検出するためには1%スキムミルク/TBSTWで1:10000希釈したanti−ERK1 (Santa Cruz)を加え、37 ℃で1時間インキュベートする。TBSTwで10分間3回洗浄する。活性化ERKを検出するためには1%スキムミルク/TBSTWで1:10000希釈したanti−mouse IgG, HRP conjugated (Santa Cruz)を加え、全ERKを検出するためには1%スキムミルク/TBSTWで1:20000希釈したanti−rabbit IgG, HRP conjugated (Santa Cruz)を加え、37 ℃で1時間インキュベートする。TBSTwで10分間3回洗浄する。Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer)を用いシグナルを検出する。
【0046】
結果を図11に示す。図11から判るように、cnpy1−MOノックダウン胚及びcnpy3/4−MOノックダウン胚においては、fgf3−MOノックダウン胚と同様に、活性化ERKがほぼ消失していることが分かった。この結果からも、cnpy1遺伝子はFGFシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。また、cnpy3遺伝子及びcnpy4遺伝子は、FGFシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。
【0047】
<免疫組織化学による活性化ERKの検出>
ウエスタンブロットにより活性化ERKの消失が確認されたので、免疫組織化学によって、ゼブラフィッシュ胚のどの部分で活性化ERKが消失したのかを調べた。
受精後18時間の正常胚あるいはfgf3−MO, cnpy1−MO, cnpy3−MO各ノックダウン胚を4%パラホルムアルデヒドで4 ℃で一晩固定する。PBSTwで5分間4回洗浄する。100%メタノールで脱水し、−20 ℃に30分以上おく。75, 50, 25%メタノール/PBSTwで各5分間おく。PBSTwで5分間2回洗浄する。2% Blocking reagent/MBTを加え、80 ℃、20分間及び、室温で1時間インキュベートする。PBSTwで1:10000希釈したanti−diphosphorylated ERKを加え、4 ℃で一晩インキュベートする。PBSTwで20分間6回洗浄を行う。PBSTwで1:1000希釈したanti−mouse IgG, Biotin−conjugated (sigma)を加え4 ℃で一晩インキュベートする。PBSTwで20分間6回洗浄を行う。ABC complex (Vector Laboratory)を加え室温で2時間インキュベートする。PBSTwで20分間6回洗浄を行う。0.1 M Tris−HCl, pH8.2で5分間2回置換する。DAB/0.1 M Tris−HCl, pH8.2を加え20分おき、1:1000希釈した過酸化水素水を適量加え発色を行う。PBSTwで5分間2回洗浄する。25, 50, 75%グリセロール/PBSTwで各5分間置換し、75% グリセロール/PBSTwでマウントし検鏡する。
【0048】
結果を図12に示す。図12から判るように、正常胚においては、活性化ERKは終脳及びMHBに多くみられたが、cnpy1−MOノックダウン胚あるいはcnpy3−MOノックダウン胚においてはこれらの領域での活性化ERKが消失していた。この結果からも、cnpy1遺伝子及びcnpy3遺伝子は、FGFシグナルの伝達に必須であることが明らかとなった。
【0049】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明により、FGFシグナル伝達に関与する新規な遺伝子を提供することができる。本発明に係る遺伝子を使用することによって、中脳後脳境界部による中脳視蓋部及び小脳の形成メカニズム並びに、内耳、血管、肢芽、歯牙、等の様々な器官の形成メカニズムや、細胞の癌化メカニズム等の解析が可能となる。
【0050】
【配列表】
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【0051】
【配列表フローテキスト】
配列番号23〜26は合成DNAである。
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒトcnpy1とゼブラフィッシュcnpy1との相同性を検討した結果を示す図である。
【図2】ヒトcnpy2とゼブラフィッシュcnpy2との相同性を検討した結果を示す図である。
【図3】ヒトcnpy3とゼブラフィッシュcnpy3との相同性を検討した結果を示す図である。
【図4】ヒトcnpy4とゼブラフィッシュcnpy4との相同性を検討した結果を示す図である。
【図5】cnpy1、cnpy3及びcnpy4遺伝子のゼブラフィッシュ胚における発現を観察した顕微鏡写真である。
【図6】cnpy1、cnpy3及びcnpy4遺伝子のゼブラフィッシュ胚における発現を観察した顕微鏡写真である。
【図7】cnpy2遺伝子、cnpy3遺伝子及びcnpy4遺伝子のマウス胚における発現を観察した顕微鏡写真である。
【図8】正常胚及びノックダウン胚におけるMHB周辺の形態異常を観察した顕微鏡写真である。
【図9】正常胚及びノックダウン胚における耳胞の形態異常を観察した顕微鏡写真である。
【図10】正常なゼブラフィッシュ胚及びcnpy1−MOノックダウン胚にFGF8bビーズを埋め込み、engrailed遺伝子の発現誘導を観察した顕微鏡写真である。
【図11】cnpy1−MOノックダウン胚及びcnpy3/4−MOノックダウン胚において活性化ERKをウエスタンブロットによって検出した電気泳動写真である。
【図12】免疫組織化学法によって、ゼブラフィッシュ胚のどの部分で活性化ERKが消失したのかを検出した顕微鏡写真である。

Claims (6)

  1. 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする、FGFシグナル伝達に関与する遺伝子。
    (a)配列番号2、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20及び22に表すアミノ酸配列のうちいずれか1のアミノ酸配列を含むタンパク質
    (b)配列番号2、3、5、7、9、11、13、15、16、18、20及び22に表すアミノ酸配列のうちいずれか1のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質。
  2. 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなるFGFシグナル伝達に関与する遺伝子。
    (a)配列番号1、4、6、8、10、12、14、17、19及び21に表す塩基配列のうちいずれか1の塩基配列を含むポリヌクレオチド
    (b)配列番号1、4、6、8、10、12、14、17、19及び21に表す塩基配列のうちいずれか1の塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、FGFシグナル伝達に関与する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  3. 請求項1又は2記載のFGFシグナル伝達に関与する遺伝子を有するベクター。
  4. 請求項1又は2記載のFGFシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させた遺伝子導入細胞。
  5. 請求項1又は2記載のFGFシグナル伝達に関与する遺伝子の機能を欠損させたトランスジェニック動物。
  6. 請求項4記載の遺伝子導入細胞又は請求項5記載のトランスジェニック動物に対してリード化合物を作用させる工程と、
    中脳・後脳境界部においてFGFシグナルと関連して働くリード化合物を同定する工程とを含むスクリーニング方法。
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