KR101178099B1 - 고추냉이무로부터 증류추출법으로 추출한 천연 항균성 성분인 이소티오시아네이트류를 포함하는 마이크로캡슐을 함유하는 천연 항균 치약 - Google Patents

고추냉이무로부터 증류추출법으로 추출한 천연 항균성 성분인 이소티오시아네이트류를 포함하는 마이크로캡슐을 함유하는 천연 항균 치약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추냉이무(Horseradish)에서 추출한 천연 항균성분인 이소티오시아네이트류(Isothiocyanates, 이하 ITCs라고 함)를 첨가한 항균 치약에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고추냉이에서 추출한 천연 항균성분인 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액을 마이크로캡슐에 넣어 항균성분의 활성을 안정화시킴과 동시에 그 작용기간을 장기화하여 통상의 치약 원료와 혼합하여 제조한 치약으로 구강내의 미생물에 대해서 살균작용 또는 항균 활성을 가지며, 천연 항균성분을 첨가함으로써 부작용도 없는 천연 항균 치약에 관한 것이다.
고추냉이, 이소티오시아네이트류(ITCs), 마이크로캡슐, 천연 항균 치약

Description

고추냉이무로부터 증류추출법으로 추출한 천연 항균성 성분인 이소티오시아네이트류를 포함하는 마이크로캡슐을 함유하는 천연 항균 치약 {NATURAL ANTIMICROBIAL TOOTHPASTE CONTAINING MICROCAPSULE IN ISOTHIOCYANATES EXTRACTED FROM HORSERADISH BY DISTILLED EXTRACTION PROCESS}
본 발명은 고추냉이무(Horseradish, Armoracia rusticana)로부터 증류추출법으로 추출한 이소티오시아네이트류(ITCs)가 치아 우식증(dental caries), 치주 질환(peridontal disease) 및 치근단 염증(root apex inflammation)을 유발시키는 구강내 미생물에 대하여 강력한 살균작용을 나타낸다는 점에 착안하여 이소티오시아네이트류(ITCs) 마이크로캡슐에 담아 치약에 첨가하여 고추냉이 특유의 향취 뿐만 아니라 구강내의 미생물에 대해서 살균작용 또는 항균 활성을 나타내는 천연 항균 치약의 발명에 관한 것이다.
일반적으로 사용되는 항균제는 독성, 안정성 및 미각 면에서 문제점을 지니고 있다. 치약 조성물 중에 함유되는 항균제는 계면활성제나 연마제에 의해서 불활성화되어 항균 활성이 저하되는 경우가 허다하였을 뿐만 아니라 항균 활성의 저하 또는 불활성화를 방지하기 위하여 항균제를 과다하게 첨가함으로 인하여 구강 점막을 자극하여 부풀음, 물집 또는 홍반 등을 야기하거나 중추신경장애 등을 일으킬 수도 있으며, 불소 화합물의 경우에는 치아에 반점을 유발시키기도 하는 단점들이 있었다.
1980년대 중반까지, 캄포르화 파라모노클로로페놀[camphorated paramonochlorophenol(CMPC)], 포르모크레졸(formocresol) 등의 강력한 구강내 소독제가 널리 사용되었으나, 이들은 결합 조직에 해로운 효과를 나타내었고[참고: Chang YC, Tai KW, Chou LS. Effect of camphorated paramonochlorphenol via the root canal. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 51:637-642, 1981], 수산화칼슘은 훌륭한 생물학적 항균작용을 나타내어, 감염 구강 내 약제로는 최근까지 수산화칼슘이 선택되고 있다[참고: Holland R, Souza V, Nery MJ. Reaction of rat connective tissue to implanted dentin tubes filled with mineral trioxide aggregate or calcium hydroxide. J Endod, 254:161-166, 1999]. 그러나 항균력에 관한 연구에서 수산화칼슘은 일부 세균에서는 그 효과가 감소되는 것으로 밝혀졌으며, 단기간 적용시에는 효과가 없는 것으로 밝혀졌다[참고: Stevens RH, Grossman LI. Evaluation of the antimicrobial potential of calcium hydroxide as an intracanal medicament. J Endod, 9:372-374, 1983; Sjogren U, Figdor D, Spangberg L. The antimicrobial effect of calcium hydroxide as a short-term intracanal dressing. Int Endod J, 24:119-125, 1991].
가장 널리 쓰이는 구강 살균제로는 차아염소산나트륨(NaOCl)이 알려져 있다. NaOCl은 수십 년간 근관치료에서 사용되어 왔으며, 근관 내에서 박멸하기 어려운 엔테로코커스 종(Enterococcus sp.), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 칸디다 종(Candida sp.) 등에 대해서도 효과적이다[참고: Haapasalo M, Udnaes T, Endal U. Persistent, recurrent, and acquired infection of the root canal system post-treatment. Endodon Topics, 6:29, 2004]. NaOCl은 0.5 내지 5.25%의 다양한 농도로 사용되고 있는데, 고농도로 사용시, 조직 용해 능력은 높아지지만, 괴사된 조직과 생활 조직 모두를 용해시키므로, 항상 바람직한 것은 아니다[참고: Yesilsoy C, Whitaker E, Cleveland D. Antimicrobial and toxic effects of established and potential root canal irrigants. J Endodon, 21:513-515, 1995]. 또한, NaOCl은 치주와 치근단 조직에 자극을 주어 근관치료에서 높은 농도의 NaOCl이 치근단 밖으로 빠져나간 경우, 염증 반응으로 심각한 조직 괴사나 동통, 부종, 감각 이상 등이 올 수 있다[참고: Omid M, Donald J, Robert E. Anatomy of sodium hypochlorite accidents. Clinical techniques in endodontics, October:1-6:2007].
클로르헥시딘 디글루타메이트(Chlorhexidine digluconate, CHX)도 치과영역에서 널리 쓰이는 화학적 항균제이다[참고: Cervone F, Tronstad L, Hammond B. Antimicrobial effect of chlorhexidine in a controlled release delivery system. Endod Dent Traumatol, 1:33-36, 1990]. 이 약제는 그람 음성균과 그람 양성균에 대해 효과적인 넓은 항균 범위를 가지며, 항균 효과가 오래 동안 지속되기 때문에, 근관치료 분야에서 사용되게 되었다[참고: Souza-Filho FJ, Soares Ade J, Vianna ME. Antimicrobial effect and pH of chlorhexidine gel and calcium hydroxide alone and associated with other materials. Braz Dent J, 19:28-33, 2008]. 특히, 수산화칼슘과 함께 사용하는 경우, 편성 혐기성 세균에 대한 항균효과가 우수한 것으로 밝혀졌다[참고: Podbielski A, Spahr A, Haller B. Additive antimicrobial activity of calcium hydroxide and chlorhexidine on common endodontic bacterial pathogens. J Endodon, 29:340-345, 2003; Siren EK, Haapasalo MP, Waltimo TM. In vitro antibacterial effect of calcium hydroxide combined with chlorhexidine or iodine potassium iodide in Enterococus faecalis. Eur J Oral Sci, 112:326-331, 2004]. 그러나 장기간 사용시 미각 이상이나 작열감이 나타날 수 있으며, 구강내 항균제로서 NaOCl에 비해 임상적인 장점이 아직까지 밝혀지지 않았다[참고: Stephen Cohen, Kenneth M. Hargreaves. Pathways of the Pulp, 신흥 인터내셔널, 서울, 319, 2007].
따라서 본 발명은 고추냉이무로부터 증류추출한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성 저하 또는 불활성화를 방지하기 위하여 이소티오시아네이트류(ITCs)를 마이크로캡슐 속에 포집하여 치약에 첨가함으로써 고체 지질 마이크로캡슐을 함유하는 항균 치약을 개발하는 것을 기술적 과제로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명자들이 예의연구하여, 고추냉이무로부터 증류추출한 이소티오시아네이트류(ITCs)를 마이크로캡슐화하여 치약에 첨가한 결과, 첫째, 마이크로캡슐화 하지 않은 이소티오시아네이트류(ITCs)는 약 12주 후에 이의 농도가 60% 이하로 저하되었으나, 마이크로캡슐화 하였을 때는 이의 농도가 거의 변화되지 않고 그대로 유지되어, 마이크로캡슐화 함으로써 항균 활성의 저하 및 불활성화를 방지할 수 있었으며, 둘째, 마이크로캡슐화 한 이소티오시아네이트류(ITCs)가 미생물 특히, 충치의 원인균으로 알려진 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 비롯하여 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 파에칼리스( Enterococcus faecalis), 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등과 치근관내 감염시 자주 발견되는 세균들 중 편성혐기성 세균인 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescence) 등의 구강 미생물에 대해서 강한 항균 활성이 있었으며, 마이크로캡슐화 함으로써 항균 활성의 저하 및 불활성화를 방지할 수 있었으며, 셋째, 이소티오시아네이트류(ITCs)를 포집한 고체 지질 마이크로캡슐을 함유하는 치약이 임상실험에서 기존의 치약 제조시에 사용되는 항균제의 과다 투여로 인하여 발생하는 구강 점막 및 인체에 대한 부작용 등을 최소한도로 할 수 있다는 사실을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.
그러므로, 본 발명에 의하면 분말 형태의 고추냉이무로부터 증류 추출법을 이용하여 항균성 물질(이소티오시아네이트류, ITCs)을 추출하고, 이를 마이크로캡슐화한 다음, 통상적인 치약 제조방법에 따라 치약에 첨가하는 방법이 제공된다.
본 방법은 고추냉이 분말 시료 200g을 550mL의 증류수와 혼합하고, 이소티오시아네이트류(ITCs) 성분의 보다 많은 생성을 위하여 37℃에서 80 내지 100분 동안 반응시킨 다음, 120℃의 오일 욕에서 가열, 증류하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 방법은 추출한 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액을 마이크로캡슐화하여 항균 활성의 저하 및 불활성화를 방지하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 방법은 마찰력에 의해 마이크로캡슐이 파괴되어 항균 성분이 용출 항균효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
고추냉이무의 천연 항균 성분은 증류수를 이용하여 추출하였다. 고추냉이무 분말 200g을 증류수 550mL와 혼합하고, 로타리 증발기[모델명 NE-1, 도쿄리카키카이가부시키가이샤(Tokyo Rikakikai Co., Ltd.) 제품]에서 이소티오시아네이트류(ITCs)의 생산을 최대화하기 위하여 40℃에서 120분 동안 유지시켰다. 혼합물을 120℃의 오일 욕(모델명 C-WHT, 창신과학 제품)에서 120분 동안 증류시키고, 추출액 150㎖을 분획한 후, 원심분리하여 수득한 오일상 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도를 측정하였다.
추출물의 이소티오시아네이트류(ITCs) 농도는 이소티오시아네이트류(ITCs) 중 약 62%를 차지하는 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도를 측정함으로써 결정하였다. 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도는 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector, FID)이 부착된 기체 크로마토그래피(모델명 HP 6890 series, 미국 캘리포니아주 소재 휴렛 팩커드 디벨롭먼트 캄파니 제품)로 측정하였으며 컬럼은 5% 페닐 실록산 모세관 컬럼(HP-5, 0.32mm i.d. × 30m)을 사용하였다. 주입구의 온도는 220℃로 유지하였으며, 캐리어 가스는 헬륨을 사용하였고, 스플릿 비율(split ratio)은 1:21.5이었다. 표준품은 99.8%의 AIT[스위스 북스에 소재하는 풀카 헤미 아게(Fluka Chemie AG) 제품]를 사용하였다.
그 결과, AIT가 600,000ppm 함유된 이소티오시아네이트류(ITCs)를 추출할 수 있었다(참고: 도 1).
이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성 저하 및 불활성화 방지를 위한 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액의 마이크로캡슐화는 다음의 방법으로 실시하였다.
먼저, 추출물을 적정 농도로 고체 지질에 분산시키고, 알릴 이소티오시아네이트의 함량이 2.5%로 되도록 조절하여 밀봉된 용기에서 60℃에서 추출물을 분산시켰다. 고체 지질과 물과의 비율을 1:9로 하여 적정량의 비이온성 계면활성제(Tween 80)와 함께 혼합하고, 균질기(homogenizer)를 사용하여 당해 혼합물을 30초 동안 분산시켜 에멀션을 형성한 다음, 이를 0℃에서 냉각시켜 마이크로캡슐을 제조하고, 이어서 상등액을 폐기하고 마이크로캡슐을 회수하였다. 제조된 마이크로캡슐의 크기는 분산력에 따라 10 내지 300μm의 범위에서 입도 분석기[모델명: Malvern Mastersizer 2000, 맬버른 인스트루먼츠 리미티드(Malvern Instruments Ltd.) 제품]를 사용하여 다양하게 측정하였다.
마이크로캡슐화에서 사용할 수 있는 고체 지질은 융점이 40℃ 이상인 모든 지질 및 유사 지질로, 단독으로 사용하거나 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 천연 또는 합성 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 및 이들의 혼합물(경화 지방 포함), 천연 및 합성 왁스, 지방 알콜, 지질 펩타이드 등을 예로 들 수 있으며, 본 발명에서는 경화 팜유를 고체 지질로서 사용하였다(참고: 도 2).
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르는 항균 치약은 고추냉이무로부터 추출한 천연 항균성분인 이소티오시아네이트류(ITCs)를 고체 지질 마이크로캡슐에 넣어 항균 성분의 항균 활성을 안정화시키는 동시에, 활성 성분의 작용기간을 장기화하여 통상의 치약 원료와 혼합하여 제조한 치약으로 구강 내의 미생물에 대해서 살균 활성 또는 항균 활성을 가지며, 천연 항균 성분을 첨가함으로써 부작용을 감소시킨 천연 항균 치약치약으로 국민의 치아 건강을 효율적으로 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다.
알릴 이소티오시아네이트는 수용액 상태에서 하이드록실 그룹과 물의 친핵성 공격(neucleophilic attack)에 의해 분해되며, 이는 pH가 높을수록(강염기성) 심하게 진행됩니다. 또한 알릴 이소티오시아네이트는 수용해도가 낮으며 휘발성이므로 자극적인 냄새가 강하게 납니다. 따라서, 이러한 단점을 보완하기 위해서 캡슐화하는 것인데, 알릴 이소티오시아네이트는 소수성이고 오일에 안정하므로, 고체 지질을 이용한 캡슐화는 매우 이상적인 방법이라 할 수 있다.
따라서 알릴 이소티오시아네이트를 그 자체로 치약에 혼합하였을 경우, 시간이 지남에 따라 활성 성분이 분해되어 항균 활성이 저하되며, 알릴 이소티오시아네 이트의 소수성으로 인하여 상 분리(phase separation)가 발생하여 제품에 심각한 영향을 주는 것이 자명합니다. 그 이유는, 치약을 사용하기 위해 치약 튜브를 개방하는 순간, 치약 튜브 속에 모여있던 성분들이 급격히 방출될 가능이 있고, 활성 성분의 불균질한 분포로 인하여 사용시 항균효과가 일정하지 않게 되며, 결과적으로 이로 인한 치약의 항균 활성 지속성이 저하되기 때문이다. 이러한 단점은 고체 지질을 사용한 마이크로캡슐을 이용함으로써 해결될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 구강내 미생물에 대한 항균 활성, 이소티오시아네이트류(ITCs)를 마이크로캡슐화하여 통상적인 치약 제조법으로 제조한 치약에 첨가한 후에 임상실험을 통하여 구강내 미생물에 대한 항균 활성을 구체적으로 설명하고자 하나, 다음의 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
이소티오시아네이트류(ITCs) 중의 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도 변화를 측정함으로써, 마이크로캡슐화된 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성 변화를 판정하였다. 마이크로캡슐화 하지 않은 알릴 이소티오시아네이트(AIT) 농도 10,000ppm의 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액과 위와 같은 방법으로 제조한 이소티오시아네이트류(ITCs) 함유 마이크로캡슐을 증류수에 현탁시킨 후, 4℃에서 4주 동안 보관하면서 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도를 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.
두 시료 모두 저장한 지 6주째까지는 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도에 있어서 변화를 거의 나타내지 않았으나, 마이크로캡슐화 하지 않은 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액의 알릴 이소티오시아네이트(AIT)는 저장한 지 7주째부터 농도가 서서히 감소하기 시작하여 저장한 지 12주째에는 최초 농도(10,000ppm)의 약 60%인 5,918ppm까지 감소하였다. 그러나 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액의 경우에는 저장한 지 12주째가 경과하여도 농도에 있어서 변화가 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실로부터, 본 발명의 고체 지질 마이크로캡슐화가 이소티오시아네이트류(ITCs)의 활성 저하 억제에 효과적인 것을 알 수 있었다.
실시예 2
고추냉이무로부터 추출한 이소티오시아네이트류(ITCs)를 마이크로캡슐화하고 구강내 미생물에 대한 항균 활성을 측정하기 위하여 사용하는 균주는 한국생명공학연구원 유전자 은행(KCTC, Daejeon, Korea)에서 분양받은 치아 우식증 유발 균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 치주 질환 균주인 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 치수 및 근단 병소와 관련균주인 스타필로코커스 아우레우스(lococcus aureus), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)였으며(참고: 표 1), 실험 전에 각 미생물을 표 1에 기재한 바와 같은 배양 배지에 접종한 후, 세균은 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간, 효모는 25℃, 호기성 환경하에서 48시간 동안 전배양하여 사용하였다.
시험에 제공된 균주와 배양 배지
시험에 제공된 균주 산소 요구성 사용 배지
그람 양성균
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC 25175 통성혐기성
(通性嫌氣性)		 BHI 브로스1
스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)(d) ATCC 27607
통성혐기성		 BHI 브로스
락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)
ATCC 393
통성혐기성		 MRS 브로스2
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 25923
통성혐기성
BHI 브로스
엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) ATCC 29212
통성혐기성		 트립티카제 소이 브로스
(Trypticase soy broth)3
그람 음성균
아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) ATCC 29522
통성혐기성
트립티카제 소이 브로스
효모
칸디다 알비칸스(Candida albicans) ATCC 10231 호기성
(好氣性)		 YM 브로스4
1 Brain heart infusion (Difco, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA)
2 Lactobacilli MRS(Difco, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA)
3 Trypticase soy broth(Difco, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA)
4 Yeast Malt broth (Difco, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA)
마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성은 디스크 페이퍼법(Disk paper method)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같다.
각 균주를 전배양하여 640nm의 파장[모델명: V530, UV/VIS 분광 광도계, 닛폰분코가부시키가이샤(Jasco Corporation) 제품]에 대한 흡광도(A660)가 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(S. sobrinus), 락토바실러스 카세이(L. casei) 및 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus)는 0.700 내지 0.750, 엔테로코커스 파에칼리스(E. faecalis), 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans)는 0.750 내지 0.800, 칸디다 알비칸스(C. albicans)는 0.350 내지 0.400으로 되도록 일정하게 현탁된 배양액 100㎕를 멸균된 스프레더(spreader)를 사용하여 각 배양액과 동일한 평판 배지에 도말하였다. 이후 실험군으로서, 멸균된 직경 10mm의 필터 페이퍼 디스크(filter paper disk)(Whatman No.2)에 AIT 농도 10,000ppm의 이소티오시아네이트(ITCs)를 30㎕씩 흡수시키고, 세균 및 효모가 도말된 각각의 배지에 밀착시켜, 세균은 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하는 한편, 효모는 25℃ 호기성 환경하에서 48시간 동안 배양하였고, 대조군은 아무 처리도 시행하지 않은 페이퍼 디스크를 도말된 평판 배지에 밀착시킨 후 동일한 방법으로 배양하였다. 배양 후, 실험군의 디스크 주변 투명 환(clear zone)과 콜로니(또는 군집)의 양상을 대조군과 비교하여 항균효과의 여부를 확인하였다.
이소티오시아네이트류(ITCs)와 AIT 표준용액은 실험에 사용된 모든 균주에서 페이퍼 디스크 주위로 대조군에 비하여 적은 군집(colony)을 보였으며(참고: 도 4 및 도 5), 이로써 고추냉이무로부터 추출한 천연 항균성분인 이소티오시아네이트류(ITCs)는 구강내 세균에 대하여 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3
구강내 미생물에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration, 이하, MIC라고 함)를 측정하기 위하여 각 균주 배양액을 96웰 평저 마이크로플레이트(flat bottom microplate)[독일 프릭켄하우스에 소재하는 그라이너 비오-오네 게엠베하(Greiner bio-one GmbH) 제품]의 각 웰에 5㎕씩 분주한 후, 세균과 효모는 전배양 배지와 동일한 멸균 배지를 50㎕씩 분주하였다. 여기에 650,000ppm의 이소티오시아네이트류(ITCs)를 이중 희석법(double dilution method)으로 일정 농도로 희석(20000ppm, 10000ppm, 5000ppm, 2500ppm, 1250ppm, 625ppm, 313ppm, 156ppm, 78ppm, 39ppm, 19.5ppm)하여 50㎕씩 분주하고, 세균은 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안, 효모는 25℃, 호기성 환경하에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 균주의 증식 유무를 마이크로 플레이트 리더(micro plate reader)(OD; 660nm, 모델명: EL800, 바이오-텍 인스트루먼트 인코포레이티드(Bio-Tek Instrument Inc.) 제품]로 측정하였으며, 그 결과는 표 2에 요악한 바와 같다.
구강내 미생물에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 억제 농도(MIC)
사용 균주 최소 억제 농도(ppm, 평균±표준편차)
이소티오시아네이트류(ITCs) 표준 AIT
S. mutans 500.2±170.89 1375±684.65
S. sobrinus 312.6±191.47 1125±279.51
L. casei 1750±684.65 3000±1118.03
S. aureus 132.8±109.33 390.8±234.33
E. faecalis 937.6±441.77 2000±684.65
A. actinomycetemcomitans 652.2±382.53 1375±684.65
C. albicans 117±55.15 344±171.16
일곱 종류의 구강내 미생물 중 칸디다 알비칸스(C. albicans)에 대한 MIC가 117±55.15ppm으로 가장 낮았으며, 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스 소브리누스(S. sobrinus), 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans), 엔테로코커스 파에칼리스(E. faecalis)의 순서로 MIC가 높았고, 락토바실러스 카시(L. casei)의 MIC가 1750±684.65ppm으로 가장 높았다.
구강내 미생물에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 살균 농도(minimum bactericidal concentration, 이하, MBC라고 함)는 MIC 측정 후에 증식이 관찰되지 않은 배양액을 한 백금이 취하여 각 세균과 효모에 맞는 배양액과 동일한 평판 배지에 스트리킹(streaking)한 후, 세균은 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안, 효모는 25℃, 호기성 환경하에서 48시간 동안 배양하여 증식 유무를 확인한 후에 증식이 되지 않은 농도를 MBC로 하였으며, 그 결과는 표 3에 요약한 바와 같다.
구강내 미생물에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 살균 농도(MBC)
사용 균주 최소 살균 농도(ppm, 평균±표준편차)
이소티오시아네이트류(ITCs) 표준 AIT
S. mutans 2,000±684.65 4000±1369.31
S. sobrinus 1,750±1843.49 4500±3259.60
L. casei 6000±2236.07 7000±2738.61
S. aureus 875±342.33 1750±684.65
E. faecalis 3500±1369.31 6000±2236.07
A. actinomycetemcomitans 3500±1369.31 6000±2236.07
C. albicans 625.2±382.53 1750±684.65
일곱 종류의 구강내 미생물 중 칸디다 알비칸스(C. albicans)에 대한 MBC가 625.2±382.53ppm으로 가장 낮았으며, 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스 소브리누스(S. sobrinus)는 각각 875±342.33ppm 및 1750±1843.485ppm을 나타내었고(참고: 도 6), 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)는 2000±684.65ppm을 나타내었다. 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans)와 엔테로코커스 파에칼리스(E. faecalis)는 3,500±1,369.31ppm으로 같은 값을 보였으며, 락토바실러스 카시(L. casei)의 MBC는 6,000±2,236.07ppm으로 가장 높았다.
실시예 4
치근관내 감염시 빈번하게 검출되는 편성혐기성 세균(偏性嫌氣性細菌)에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성을 측정하기 위하여 사용된 균주는 한국생명공학연구원 유전자 은행(KCTC, Daejeon, Korea)으로부터 분양받은 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens) KCTC 5407와 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum) KCTC 5103, 항균성 실험에서 대조균으로 널리 사용되는 클로스트리듐 페르프린게스(Clostridium perfringens) KCTC 3269이었다. 배지는 RCM(reinforced clostridial medium, Difco 제품)과 RCM 한천(reinforced clostridial medium agar, Oxoid Ltd. 제품)에 5% sheep blood(RCM blood agar)를 섞어 사용하였다.
순수한 균주를 얻기 위해 분양받은 균을 멸균된 RCM 10㎖가 들어 있는 스크류 캡 튜브(screw capped tube, 16×160mm)에 넣고, AnaeroGen™[옥소이드 리미티드(Oxoid Ltd.) 제품]으로 혐기성 상태를 만든 플라스틱 상자(AnaeroPack Rectangular Jar™, 미쓰비시가스카가쿠가부시키가이샤(Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.) 제품] 안에 균이 들어 있는 튜브를 넣어 CO2 배양기에서 37℃, 48시간 동안 배양하였다. 이때, 상자 속의 혐기성 상태를 확인하기 위한 지시약으로 BBL™[Dry Anaerobic Indicator Strips, 벡톤, 딕킨슨 앤드 캄파니(Becton, Dickinson and Company) 제품]을 사용하여 파란색에서 하얀색으로 변하는 것을 확인하였다.
배양된 용액을 한 백금이 취하여 RCM 혈액 배지(blood agar)에 스트리킹한 후, 다시 혐기성 상자에 넣어 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 평판 배지에서 배양된 세균 중 독립 콜로니를 취하여 RCM 혈액 배지에 스트리킹하여 다시 배양하였다. 배양된 세균을 RCM 10㎖가 들어 있는 스크류 캡 튜브에 넣어 혐기성 상자에서 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 당해 세균 배양액 500㎕와 글리세롤 500㎕을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 담아 혼합하여 이후의 실험에 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다.
마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성은 디스크 페이퍼법(disk paper method)을 이용하였다. 각 균주를 전배양하여 640nm의 파장(V530, UV/VIS 분광 광도계, 닛폰분코가부시키가이샤 제품)에 대한 흡광도(A640)가 0.700 내지 0.800으로 일정하게 현탁된 배양액 100㎕를 RCM 혈액 평판 배지에 분주한 후, 멸균된 스프레더를 사용하여 균일하게 도말하였다. 멸균된 직경 10mm의 필터 페이퍼 디스크(Whatman No.2)에 AIT 농도 10,000ppm의 이소티오시아네이트류(ITCs)를 30㎕씩 흡수시키고, 각 균주가 도말된 배지에 밀착시킨 다음, 혐기성 상자에 넣고, 37℃, 5% CO2 세균 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 디스크 주변에 형성된 투명 환의 유무로 항균효과의 여부를 확인하였으며, 그 결과는 도 7에 도시되어 있는 바와 같다.
마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)와 클로르헥시딘은 모든 표준균주에서 페이퍼 디스크 주위로 투명 환을 형성하였으며, 이로써 고추냉이무로부터 추출한 천연 항균성분인 이소티오시아네이트류(ITCs)는 혐기성 세균에 대하여 항균 활성이 있는 것으로 확인되었다.
치근관내 감염시 빈번하게 검출되는 편성혐기성 세균에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 억제 농도(MIC)는 멸균된 96웰 평저 마이크로플레이트[독일 프릭켄하우스에 소재하는 그라이너 비오-오네 게엠베하 제품]의 각 웰에 600,000ppm의 서양산 고추냉이 뿌리 추출물을 RCM 멸균 배지로 단계 희석(5,000ppm, 2,500ppm, 1,250ppm, 625ppm, 312ppm, 156ppm, 78ppm, 39ppm, 19ppm, 9.5ppm)하여 100㎕씩 분주하고, 각각의 균주를 5㎕씩 분주한 다음, 혐기성 상자에 넣고, 37℃, 5% CO2 세균 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 균주의 증식 유무를 마이크로 플레이트 리더(OD; 660nm, EL800, 바이오-텍 인스트루먼트 인코포레이티드 제품)로 측정하였다. 위와 동일한 방법으로 각 균주에 대한 클로르헥시딘(양성 대조구)의 최소 억제 농도도 측정하였다. 클로르헥시딘은 1,000ppm을 원액으로 멸균 배지에 단계 희석(400ppm, 200ppm, 100ppm, 50ppm, 25ppm, 12.5ppm, 6.25ppm, 3.125ppm, 1.56ppm, 0.78ppm)하여 사용하였다. 그 결과는 표 4에 기재되어 있는 바와 같다.
치근관내 편성혐기성 세균에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 억제 농도(MIC)
사용균주 최소 억제 농도 (ppm, 평균±표준편차)
이소티오시아네이트류(ITCs) 클로르헥시딘
C. perfringens 468.0±180.7 6.25±0.00
P. nigrescens 136.5±39.0 5.47±1.56
F. nucleatum 87.8±49.0 3.12±0.00
세균마다 MIC에 차이는 있었지만, 총 4회의 실험을 통해 78 내지 625ppm의 범위에서 MIC를 나타내었으며, 클로스트리듐 페르프린게스(C. perfringens)는 468.5ppm, 프레보텔라 니그레센스(P. nigrescense)는 136.5ppm, 푸소박테리움 누클레아툼(F. nucleatum)은 87.75ppm의 평균 MIC 값을 나타내었다.
최소 살균 농도(MBC)는 MIC 측정 후에 증식이 관찰되지 않은 배양액을 한 백금이 취하여 RCM 혈액 평판 배지에 스트리킹한 다음, 혐기성 상자에 넣고, 37℃에서 48시간 동안 배양하여 증식 유무를 확인하였다. 위와 동일한 방법으로 각 균주에 대한 클로르헥시딘의 최소 살균 농도도 측정하였으며, 그 결과는 표 5에 기재되어 있는 바와 같다.
치근관내 편성혐기성 세균에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 살균 농도(MBC)
사용 균주 최소 억제 농도(ppm, 평균±표준편차)
이소티오시아네이트류(ITCs) 클로르헥시딘
(Chlorhexidine)
C. perfringens 625±0.00 10.94±3.12
P. nigrescens 390±156 10.94±9.37
F. nucleatum 156±0.00 10.94±9.37
각 세균마다 MBC에 차이는 있었지만, 총 4회의 실험에서 156 내지 625ppm의 MBC 값을 나타내었다. 각 세균에 대한 평균 MBC 값은 클로스트리듐 페르프린게스(C. perfringens)는 625ppm, 프레보텔라 니그레센스(P. nigrescense)는 390.25ppm, 푸소박테리움 누클레아툼(F. nucleatum)은 156ppm으로 나타났다.
실시예 5
조성이 다음에 기재한 바와 같은 본 발명의 마이크로캡슐화 된 항균성 고추냉이 추출물을 함유하는 치약(이하, 치마제라고도 함)을 제조하였다. 함량은 중량%이다.
인산일수소칼슘 40중량%,
소르비톨 30중량%,
알킬황산나트륨 1.50중량%,
아스파탐 0.10중량%,
파라옥시안식향산 에스테르 0.20중량%,
카라기난 1.00중량%,
향료 1.0중량%,
실시예 1에 따르는 마이크로캡슐화 된 항균성 고추냉이 추출물 1.0중량% 및
치약이 100중량%가 되도록 하는 양의 정제수 .
당해 치약에 있어서, 고추냉이 추출물의 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 최종 농도는 750ppm이 되도록 하였다.
실시예 6
임상실험 결과
실험 참가에 자발적으로 동의한 지원자를 대상으로 피검 후보자의 문진과 예비구강 검사 결과, 특별한 구강 질환 증세, 전신 질환, 약물 알러지, 특이 체질, 최근 항생제나 기타 약물 복용 등의 사실이 없는 자를 확인하여 우선 대상 피검자군으로 선정하였다. 실험 중 자발적 탈퇴 가능함이 설명되어 있고 실험 기간 동안의 피검자 준수사항이 기재된 실험동의서에 자필 서명을 받아 최종 피검자 군을 확정하였다. 대조군으로는 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)가 함유되지 않은 치약을 사용하였고, 실험군으로는 in vitro 실험 결과를 고려하여 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)가 750ppm 첨가된 세치제(洗齒劑)를 사용하였다. 본 연구는 이중 맹검법(double blind method) 및 교차 실험을 적용하였다. 실험 전 1주 동안의 1차 잔류효과 제거기간(wash-out period)을 가졌다. 잔류효과 제거기간 첫날에 구강검사 후 피검자 전원에게 모두 동일한 규격의 중강도 잇솔과 약제 성분이 없는 세치제를 사용하면서 하루에 3회 회전법에 의한 잇솔질을 하도록 교육하였다. 잔류효과 제거기간 1주(週)가 경과한 후에, 이미 배부하였던 세치제와 잇솔을 모두 회수하고, 실험 개시에 앞서 구강검사를 통해 확인한 치면세균막 지수와 치은염 지수(gingivitis index), 치석 지수(dental calculus index) 및 우식 활성도(caries activity)에 따라 피검자들의 초기값(base line)을 구하였고, 이 값을 기준으로 군(群) 사이에 평균값이 차이가 나지 않도록 대조군과 실험군으로 구분하였다. 대조군에는 기본 성분으로 구성된 세치제를 배부하였고 실험군에는 실험군 세치제를 배부하였다. 이들 피실험자 모두는 4주 동안 하루에 3회 3분 동안 잇솔질을 실시하도록 하였고 1주 단위로 실험을 진행하였다. 4주 경과 후 1차 연구기간 마지막 날에 치면세균막 지수(Dental Plaque Index)와 치은염 지수, 치석 지수, 우식 활성도 측정 후 실험군 세치제의 잔류효과 억제를 위해 다시 1주간 2차 잔류효과 제거기간을 가짐으로써 모든 대상자들의 치은 상태가 원래대로 회복되게 하였다. 2차 잔류효과 제거기간 후 동일한 방법으로 교차실험을 하여 세치제 효과를 평가하였다. 치면세균막 지수의 부착 정도는 Turesky 등이 변형한 Quigley와 Hein의 치면세균막 평점 기준[참고: Turesky S, Gilmore N, Glickman I. Reduced plaque formation by the chloromethyl analogue of vitamin C. J. Periodontol 41: 41-43. 1970]을 적용하였고, 피검 치아의 치은(gingiva)을 협면 변연부(buccal face edge), 근심 협면(mesial buccal face), 원심 협면(distal buccal face), 설면(buccal face)으로 나누어 측정하고, 개인의 치면세균막 지수는 각 부위별 측정치의 합계를 검사대상 치아수로 나누어 산출하였다. 이때, 제3대구치(third molar teeth)는 맹출(萌出) 여부에 상관없이 검사에서 제외하였다. 연구 대상자의 치은염 정도는 Loe와 Silness의 치은염 평점 기준[참고: Loe H, Silness J. Periodontal disease in pregnancy. I. Prevalence and severity. Acta. Odont. Scand., 21533-51, 1963]에 따라서 치아를 둘러싸고 있는 치은연(gingival margin)을 각각 협면 변연부, 근심 협면, 원심 협면, 설면으로 구분하여 측정하고, 산술평균으로 치아별 치은염 지수를 구하고, 치아별 치은염 지수의 산술평균으로 개인의 치은염 지수를 산출하였다. 치석 지수는 각 연구 대상자의 치아를 협설측 치면으로 구분하여 여섯 개(1번, 16번, 26번, 31번, 36번, 46번 치아)를 측정하고 개인의 치석 지수는 각 부위별 측정치의 합계를 검사대상 치아수로 나누어 구하였다. 세치제 사용으로 인한 항우식 효과를 평가하기 위하여 우식 활성도 평가 방법 중 딥 슬라이드법(dip slide method)을 이용하여 타액 속의 스트렙토코커스 뮤탄트(S. mutans)를 검출하는 Dentocult?-SM[핀란드 에스푸에 소재하는 오리온 디아그노스티카(Orion Diagnostica) 제품]을 사용하였다. 표본 추출 15분 전에 바시트라신 디스크(bacitracin disc)를 선택적 배양액이 담겨 있는 시험관에 넣어 미리 활성화시켜 두었다. 피검자에게 파라핀 소구(小球)를 1분 정도 씹게 하여 타액 분비를 자극하고 뮤탄스 스트렙토코씨(mutans streptococci)가 치면에서 타액으로 이동하도록 하였다. 피검자에게 스크리닝 스트립(screening strip)의 거친 면을 구강 속의 혀 위에 올려놓도록 하여 타액을 채취하였다. 타액에 충분히 적셔진 스트립을 선택적 배양액이 담겨 있는 시험관에 옮기고, 뚜껑을 느슨하게 잠근 다음, 시험관을 37℃의 항온 배양기에서 최소 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 표본들의 스트립에 형성된 군집을 제조사에서 제공하는 판정표를 이용하여 0, 1, 2, 3단계로 나누어 판정하였다.
연구 시작과 더불어 조사된 초기값과 시간의 경과에 따라 얻은 치면세균막 지수는 표 6에 기재되어 있는 바와 같다.
치면세균막 지수에 미치는 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 치약의 영향
그룹 0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
대조군 1.87±0.76 1.70±0.56 1.54±0.55 1.48±0.52 1.35±0.48
실험군 1.84±0.84 1.20±0.78* 0.92±0.62* 0.86±0.66*
0.77±0.49*
초기값에 비해 대조군은 28%, 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 세치군은 58%의 치면세균막 억제효과를 나타내었으며, 시간 경과에 따른 두 군 사이의 차이는 통계적 유의성을 나타내었다.
경과시간에 따른 각 군의 치은염 지수의 변화는 표 7에 기재되어 있는 바와같다.
치은염 지수에 미치는 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 치약의 영향
그룹 0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
대조군 0.34±0.15 0.31±0.10 0.29±0.09 0.28±0.09 0.25±0.12
실험군 0.32±0.11 0.26±0.11 0.21±0.14 0.20±0.15 0.19±0.16
두 군 모두 시간이 경과함에 따라 치은염 지수가 감소함을 보였으나, 전체적으로 실험군이 대조군에 비해 더 많은 양의 치은염 지수 감소를 나타내었고 통계적으로도 유의한 차이를 보였다. 초기값에 비해 대조군은 26%, 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 세치군은 40%의 억제효과를 나타내었다. 경과시간에 따른 각 군의 치석 지수의 변화는 표 8 및 도 8과 같다.
치석 지수에 미치는 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 치약의 영향
그룹 0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
대조군 0.29±0.29 0.22±0.21 0.22±0.22 0.21±0.19 0.18±0.16
실험군 0.28±0.25 0.15±0.17 0.13±0.15 0.11±0.15 0.10±0.13
초기값에 비해 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 세치군은 64%의 억제효과를 보여 대조군보다 26% 많은 치석 지수 억제효과를 나타내었으며, 시간의 경과에 따른 두 군 사이의 차이는 통계적 유의성을 나타내었다. 경과시간에 따른 Dentocult-SM 결과 값의 변화는 표 9에 기재되어 있는 바와 같다.
항우식 효과에 미치는 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 치약의 영향
그룹 0일 7일 후 14일 후 21일 후 28일 후
대조군 1.19±0.82 1.32±1.03 1.35±0.91 1.32±0.80 1.14±0.84
실험군 1.21±0.85 0.69±0.83 0.56±0.71 0.42±0.55 0.38±0.62
마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 세치군은 처음부터 첫 7일 동안 급격히 감소하였고 이후에도 꾸준히 감소하는 양상을 보여 대조군과 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 초기값에 비해 대조군은 4%, 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 세치군은 69%의 억제효과를 나타내어 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 첨가 세치군이 대조군보다 65% 많은 스타필로코커스 뮤탄스 억제효과를 보였다.
도 1은 고추냉이무로부터 추출한 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액에 함유되어 있는 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 가스 크로마토그램이다.
도 2는 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액이 함유된 마이크로캡슐을 나타내는 사진이다.
도 3은 마이크로캡슐화 하였을 때의 이소티오시아네이트류(ITCs) 중 알릴 이소티오시아네이트(AIT)의 농도 변화를 나타내는 그라프이다.
도 4는 A. actinomycetemcomitans에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성을 나타낸다.
도 5는 C. albicans에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 항균 활성을 나타낸다.
도 6은 S. sobrinus에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs)의 최소 살균 농도를 나타낸다.
도 7은 F. nucleatum에 대한 마이크로캡슐화한 이소티오시아네이트류(ITCs) 용액의 항균 활성을 나타낸다.

Claims (3)

  1. 고추냉이무에서 추출되는 이소티오시아네이트류를 밀봉된 용기에서 60℃로 경화 팜유로 이루어진 고체 지질에 분산시켜 알릴 이소티오시아네이트의 함량이 2.5중량%가 되도록 조절하고, 고체 지질과 물과의 비율을 1:9로 하여 비이온성 계면활성제(Tween 80)와 혼합하고, 이어서 균질기(homogenizer)를 사용하여 당해 혼합물을 30초 동안 분산시켜 에멀션을 형성시킨 다음, 당해 에멀션을 0℃에서 냉각시킴을 특징으로 하는, 이소티오시아네이트류 함유 고체 지질 마이크로캡슐의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 고추냉이무에서 추출되는 이소티오시아네이트류를 밀봉된 용기에서 60℃로 경화 팜유로 이루어진 고체 지질에 분산시킨 2.5중량% 함량의 알릴 이소티오시아네이트,
    1:9의 비율로 혼합되는 고체지질과 물에 투입되어 혼합되는 비이온성 계면활성제(Tween 80)의 혼합물로서 이루어지고,
    상기 혼합물을 균질기(homogenizer)를 사용하여 30초 동안 분산시켜 에멀션을 형성시킨 다음, 에멀션을 0℃에서 냉각시킨 이소티오시아네이트류 함유 고체 지질 마이크로캡슐이 포함되는 항균성 치약.
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