KR101175379B1 - 란타나이드 킬레이트 및 생물 분석에서의 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물 분자를 정성 및 정량적으로 측정하기 위해 형광 분석법에서 이용될 수 있는 신규 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 상기 화합물을 식별하고 그 화합물의 적합성을 검증하는데 있다. 상기 목적은 하기 화학식의 화합물을 통해 달성된다.
Figure 112010028056118-pct00058
식 중, R1은 안테나 작용기이며, R2는 배위된 란타나이드(Ⅲ) 이온을 함유하는 킬레이트 형성제이며, X는 -OH이거나, 또는 아미드 결합을 통해 킬레이트 형성제의 카르복실레이트 잔기에 결합되는, 생물 분자에의 결합기이며, Y는 -H이거나, 또는 안테나 작용기에 결합되는, 생물 분자에의 결합기이다.
란타나이드 킬레이트, 생물 분석, 안테나 작용기, 형광 분석법

Description

란타나이드 킬레이트 및 생물 분석에서의 그의 용도 {LANTHANIDE CHELATES AND USE THEREOF IN BIOANALYSIS}
본 발명은 란타나이드 킬레이트, 이 란타나이드 킬레이트의 제조 및 특성화, 및 생물 분석, 바람직하게는 형광 분광법에서 란타나이드 킬레이트의 용도에 관한 것이다.
형광 분광법에서 란타나이드 착물을 사용하는 점은 이미 공지되었다. US 4,374,120으로부터는 50 내지 1000 마이크로초의 상대적으로 긴 형광 시간을 갖는 형광 마커로서 Eu-킬레이트와 Tb-킬레이트가 소개되었으며, 이와 관련한 리간드는 특히 아미노폴리카르본산이다. 또한, 몇몇 란타나이드-형광-킬레이트 착물이 시간 분해 형광 측정법에 대해 특히 적합하다는 점도 공지되었다. 이와 관련하여 Tb(Ⅲ)-BPTA-NHS 및 Eu(Ⅲ)-에스트로겐이 바람직하며, Tb(Ⅲ)-BPTA-NHS는 DNA 혼성화 분석에서 이용된다 (문헌 [Matsumoto, K. et al., RIKEN Review 35, May, 2001] 참조). 란타나이드 킬레이트는 WO 00/01663에 따라 HTRF (균일한 시간 분해 형광)-분석에서 이용된다. 공지된 점에 따르면 시아닌 염료 및 인도시아닌 염료는 생물 임상 의학에서 이용된다 (US 6,217,848, 추가의 검증 자료를 구비한 US 6,190,641). DE 42 22 255는 유전자 탐침 진단법에서의 이용을 위해 란타나이드 이온 킬레이트화 구조를 갖는 표지 시약을 기술하고 있다. 란타나이드 이온 킬레이트화 구조로서는 피리딘 유도체가 선호되며, 스페이서로서는 폴리알킬아민, 폴리에틸렌글리콜이 선호되며, 감광성 성분으로는 푸로쿠마린 유도체가 선호된다. 타칼로, 에이치 (Takalo, H.) 등의 문헌 [Journal of Alloys and Compounds 1995, 225, 511-14]의 112쪽에는 Tb(Ⅲ) 및 Eu(Ⅲ) 킬레이트와 이 킬레이트의 발광 수율에 대해 기술되어 있다. 인산화 활성을 측정하기 위해 DE 698 13 850에 따라서는 크립테이트가 이용된다. 이 크립테이트는 Tb, Eu, Sm, Dy, Nd와 같은 희토류 분자와 비스피리딘과 같은 착물 형성제를 함유한다. 또한, 상기 크립테이트는 형광성 공여체 화합물로서 이용된다. 헤밀라, 아이 (Hemmilaa, I) 및 웹, 에스 (Webb, S.)는 문헌 [DDT, 1997, 2, 373-381]에서 약물 선별을 위해 란타나이드 킬레이트를 이용한 시간 분해 형광 측정법 (TRF)의 원리를 기술하였다. DE 102 59 677에서는 핵산을 검출하기 위한 프로브가 소개되었다. 이러한 프로브는 바람직한 실시예에 따라 형광단으로서 희토류 염료를 이용한다.
공여체로부터 수용체 상으로 이루어지는 에너지 전이를 측정함으로써 생물 분석 시에 이용하기 위해, 상기한 에너지 전이를 실행할 수 있는 화합물을 사용하여야 한다. 이를 위해, 공간상 상호 간에 분리된 2개의 쌍극자의 상호 작용을 바탕으로 하는 에너지 전이의 특별한 형태로서 형광 공명 에너지 전이 (FRET)가 적용될 수 있다. 이와 관련하여 상기 쌍극자들에 의해 (공여체)가 전자 여기된다. 만일 두 쌍극자가 상호 간에 공명 상태에 존재한다면, 형광성 공여체의 여기 에너지는 방사선 없이 수용체 상으로 전이될 수 있다. FRET는, 높은 민감성과, 공여체와 수용체 사이의 이격 거리에 대한 강력한 종속성을 바탕으로, 생물학적으로 관련된 기질을 식별하고 특성화하는데 다방면으로 적용되었다. 실질적인 개발은 균일한 형광 분석 [서열 및 접힘 마킹 (단백질), DNS]에서 FRET 시스템을 적용하는 것에 있다. 이와 관련하여, 반응에 참여하게 된 항원 및 항체는 형광단 그룹으로 표시되며, 이러한 그룹의 경우 하나의 형광단은 에너지 공여체로서, 다른 형광단은 대응하는 에너지 수용체로서 기능한다.
임상 실험 진단학뿐 아니라 조합 약품 제조학에서 분자 대 분자의 상호 작용을 직접적으로 검증하기 위한 FRET-원리의 포괄적 적용은 상기한 공여체 및 수용체의 이용 가능성을 전제로 하며, 공여체 및 수용체는 장파의 스펙트럼 영역에서 효율적인 분광학상 흡수 및 방출 거동을 특징으로 한다. 이와 관련하여, 생물학적 기질의 여기를 회피하기 위해, 공여체의 여기 파장은 350 nm 초과가 되어야 한다. 이때 생물학적 시험 방법에서 상기한 공여체 및 수용체를 적용하기 위한 추가의 본질적인 기준은, 표지된 분자의 안정성 및 그 생물학적 활성이 저하되지 않으면서, 생물고분자-형광단의 안정적인 공유 결합이 형성되는 것에 있다.
이러한 영역에 대한 인식의 관점에서, 정밀성 및 단기간 데이터 이용 가능성에 대한 요건에 상응하는 적합한 공여체-수용체 시스템이 요청된다. 왜냐하면 공지된 공여체-수용체 시스템은 몇 가지 단점이 있기 때문이다. 따라서, 공여체로부터 수용체 상으로 이루어지는 에너지 전이가 종종 만족스럽지 못하다. 특히 분석 방법의 민감도가 전체적으로 만족스럽지 못하다. 또한, 공여체의 착물 안전성은 종종 충분하지 못하며, 그리고 공여체의 수용성 역시 불충분하다.
전술한 단점들의 원인은 우선적으로 구조, 다시 말해 공여체 화합물의 구조에 있다. 지금까지 흡수 및 방출의 요구되는 분광 특성을 갖는 공여체 화합물들 중에서 높은 안정성의 화합물을 제공하지 못하고 있다. 또한, 지금까지 이용되던 수용체 염료는 선택의 화합물이 아니다. 왜냐하면 이용되어 오던 수용체 염료의 경우 공여체의 방출 스펙트럼과 관련하여 수용체 염료 자신의 흡수 최대값이 조정되지 못했으며, 그리고 지금까지 수용체 염료의 충분한 용해도를 보장할 수 없었기 때문이다.
형광단을 목적에 따라 적용하기 위해, 새로운 화합물의 합성시 일차적으로는, 공여체로부터 대응하는 수용체로 이루어지는 에너지 전이의 효율 증대와 그에 따른 분석 방법의 민감도의 증대가 개발되어야 한다. 이러한 요구는 에너지 공여체로서 란타나이드 착물을 이용함으로써 고려될 수 있었다. 이때 폴리아미노 폴리카르본산은 적용에 관련한 특별한 발색단 잔기를 이용하여 란타나이드(Ⅲ) 이온을 킬레이트화한다. 폴리아미노 폴리카르본산을 통해 실질적인 형광단, 즉 란타나이드(Ⅲ) 이온을 착물화함에 따라, 이용되는 공여체의 높은 착물 안정성과 수성 매질에서의 우수한 용해성이 보장되었다. 이와 같이 최초로 이용되는 란타나이드(Ⅲ) 착물의 특징은, 사전 지정된 파장 영역에서 흡수하고 그에 따라 여기 파장에 맞게 조정될 수 있는 치환체 (이하, 안테나로 지칭됨)를 통해 리간드 시스템을 개질하는 것에 있다.
형광 분석 시 에너지 공여체로서 란타나이드(Ⅲ)-화합물의 이용은, 유기 공여체와 비교하여, 민감성 및 신호 대 잡음 비와 관련하여 분광학상 장점을 제공하였으며, 그에 따라 특히 조합 약품 제조학에서도 다양한 새로운 적용 양태가 제공되었다. 이에 대한 근거는, 큰 스토크스 이동 (Stokes shift), 즉 여기된 상태의 높은 세기 및 긴 수명과 결부되는 선 모양의 방출과 같이, 란타나이드(Ⅲ) 착물을 특징짓는 분광 특성이다. 또한, 란타나이드(Ⅲ) 화합물의 주요 장점은 시간 분해식 스펙트럼 기록과 더불어 공여체와 수용체가 바람직한 이격 거리를 갖는다는 점에 있다. 이와 관련하여 공여체와 수용체 간의 바람직한 이격 거리는 불완전하게 표지된 기질에 대해 더욱 양호한 신호 분리 및 신호 증대를 가능케 하고, 일반적으로 큰 표지를 허용한다.
본 발명의 목적은 공여체로서 에너지 전이가 가능한 란타나이드(Ⅲ) 킬레이트 착물에 있어서, 가시 스펙트럼 영역에서 흡수 및 방출의 높은 안정성뿐 아니라 바람직한 분광 특성을 특징으로 하는 상기 란타나이드(Ⅲ) 킬레이트 착물을 제공하는 것에 있다.
란타나이드(Ⅲ) 착물의 공여체 특성을 고려하는 란타나이드(Ⅲ) 착물의 시험과 관련하여, 본 발명의 추가의 목적은 공여체로서 분광학상 적합한 수용체 염료를 선택 및 합성 개질하고 그에 이어 균질 용액에서 공여체-수용체 쌍을 형광 분석하는 것에 있다. 수용체 염료로서는, 공여체의 방출 스펙트럼, 수용체 염료 자체의 방출 세기 및 용해도와 관련하여 수용체 염료 자체의 흡수 최대값의 위치에 맞춰 조정되는 새로운 수용체 염료뿐 아니라 예컨대 로다민 폴리메틴 염료와 같은 공지된 수용체 염료가 이용된다.
공여체 및 수용체의 성공적인 표지를 위한 전제 조건은, 기질 분자에 대한 공유 결합을 가능케 하기 위해, 각각의 형광단에 대한 적합한 결합기가 존재하는 것이다. 그러므로 계속해서 공여체 및 수용체 각각의 대응하는 작용기화(functionalization)가 요구된다.
본 발명의 최종의 목적은, 작용기화된 공여체-수용체 쌍을 이용하여 배향되는, 실질적이고 연구에 관련한 생물화학적 문제에 대한 균일한 생물 분석을 구성하고, 생물학적인 분자 대 분자 상호 작용의 식별에 대한 공여체-수용체 쌍의 원리상 적합성을 검증하는 것에 있다.
그에 따라, 상기 목적은 안테나로부터 란타나이드(Ⅲ) 이온 킬레이트 형성제로 에너지 전이를 가능케 하는 시스템을 제공하는 것이다. 실제로는, 안테나 또는 킬레이트 형성제에 결합된 결합기가 각각 생물 분자에 결합되고, 이러한 공여체-수용체 시스템에서 에너지 전이가 측정될 수 있음으로써 이용된다. 그런 다음 상기 생물 분자들의 특성 및 그 거동에 대한 추론이 가능하다. 상기 측정 데이터는 무엇보다 FRET 시스템을 이용하여 검출할 수 있다.
본원에 따른 분야에 대한 집중적인 전세계적 연구와 개별적인 연구 주제를 담은 유력한 논문들에도 불구하고, 안테나로부터 방출체 (emitter)로 이루어지는 에너지 전이를 설명하고 연구 가설을 세울 수 있도록 허용하는 확정된 이론은 존재하지 않는다. 어떠한 안테나가 특히 적합할 수 있는지도 예측할 수 없다. 만일, 보조적으로, 에너지와 관련하여 소정의 영역에 위치하는 안테나 발색단의 삼중항 상태에 주목하면서, 대응하는 안테나 착물을 생성한다면, 그 결과는 실망스럽게 된다. 왜냐하면 삼중항(triplet) 준위가 희토류의 착물화로 인해 극적으로 변화하기 때문이다. 또한, 본원에서 사용된 치환되거나 치환되지 않은 발색단 1,10-페난트롤린이 수신된 에너지를 SE(Ⅲ)-중심으로 전이시키는지 여부도 마찬가지로 거의 예측할 수 없다.
상기 목적은 본 발명에 따라 제1 단계에서 유로퓸(Ⅲ) 및 테르븀(Ⅲ)의 안테나 착물이 생성됨으로써 달성된다. 이와 같은 목적을 위해 우선적으로 안테나 리간드가 생성된다.
목표하는 안테나 리간드의 골격은 실제의 킬레이트 리간드로 구성된다. 이러한 킬레이트 리간드는 금속 이온을 배위하고, 동시에 란타나이드(Ⅲ) 화합물을 공여체로서 적용하기 위해 필요한 높은 안정성을 보장한다. 다른 한편으로, 킬레이트 리간드는 가시 스펙트럼 영역에서 공여체의 흡수를 가능케 하는 발색단 그룹인 안테나를 제공해야 한다.
이미, 화합물의 안정성으로 인해 O-작용기화된 리간드 시스템에 의한 착물이 형성되는 형광성 란타나이드(Ⅲ) 화합물은 공지되었다. 목표하는 적용예를 위해 본 발명에 따라, 폴리아미노 폴리카르본산이, 특히 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (LH5)이 선택된다. 폴리아미노 폴리카르본산의 란타나이드 킬레이트는 높은 착물 안정성 이외에도 수성 매질에서의 매우 우수한 용해성을 나타낸다. 여러자리로 인해, 발색단 그룹의 도입에도 불구하고 유로퓸(Ⅲ) 이온 또는 테르븀(Ⅲ) 이온의 배위 포화가 달성될 수 있다. 또한, 추가의 작용기는 생물학적 분석물의 고착을 가능케 하는 결합기로서 도입될 수 있다.
4-에티닐아닐린과 발색단 그룹으로 이루어진 안테나는, 자신의 광물리학적 특성을 이용하여, 관련 스펙트럼 영역에서 착물화되지 않은 형태로뿐만 아니라 LH5와 착물화된 형태로도 흡수하지 않는 란타나이드(Ⅲ) 이온으로의 에너지 전이의 효율과 여기 파장을 결정한다. 이때, 생물학적 시스템에서 발광 표지자로서 란타나이드(Ⅲ)-화합물을 적용할 경우, 특히 바람직하게는 가시 스펙트럼 영역에서 발광 표지자의 여기가 가능하며, 그럼으로써 부분적으로 자체 형광 능력이 있는 생물학적 기질의 직접 여기가 배제될 수 있다. 그러므로 본 발명에 따라 상기한 발색단은 예컨대 350 nm 초과의 스펙트럼 영역에서 흡수하는 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 내로 도입된다.
아세틸렌기로 치환된 공액 (conjugated) 1,10-페난트롤린은 효과적이면서도 가시 스펙트럼 영역에서 형광성을 갖는 새로운 종류의 발색단을 나타낸다. 지금까지 이러한 화합물들에 대해서는, 오로지 분자 전자학의 분야에서 형광성 센서 및 스위치를 구성하기 위한 개질 가능한 형광단으로서 상기 화합물을 적용하는 것에만 관심이 모아졌다. 이러한 발색단의 흡수 및 방출 파장은 치환체의 종류에 의해 결정된다.
1,10-페난트롤린 유도체들은 그 공액 π-시스템을 바탕으로 강하게 흡수하는 발색단이며, 그로 인해 본 발명의 특별한 적용을 위해 원칙적으로 적합하다. 그리고 페난트롤린 골격에서의 각각의 치환과 대응하는 치환체의 각각의 작용성에 따라, 흡수 특성은, 흡수 최대값의 위치와 이 흡수 최대값의 세기와 관련하여 영향을 받게 된다. 킬레이트 리간드 내로 목표하는 발색단을 도입할 수 있도록 하기 위해, 치환체에서는 일급 아미노 작용기가 요구된다. 3,8-위치에서 1,10-페난트롤린의 대칭 치환 이외에도, 특히 비대칭 치환을 이용하여, 발색단의 분광 특성을 추가로 변화시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 2-클로로-1,10-페난트롤린을 제조하였다. 안테나-발색단 (P*B)의 합성은 에티닐아닐린(B)과 2-클로로-1,10-페난트롤린 (P*)의 가교 결합을 통해 이루어졌다.
P*B는 가시 스펙트럼 영역 내로 도달할 때까지 집중적으로 흡수하는 화합물이다. P*B의 흡수 스펙트럼은 도 1에 도시되어 있으며, 측정된 흡수값은 표 1에 요약되어 있다. 맨 처음에 제시된 안테나-발색단(P*B)의 1,10-페난트롤린 (phen)과의 비교를 통해, 알킨(B)을 함유한 페난트롤린 골격의 치환으로 최장파장 흡수의 장파색단 이동과 증대(n → π*-전이)가 야기되는 것이 확인된다.
Figure 112010028056118-pct00001
P*B에 대한 B의 결합은 흡수의 적색 이동을 강화시키며, 그리고 동시에 흡수를 증대시킨다. 그 외에도 흡수띠들의 상호 간 세기 비율이 변화한다.
강력한 흡수 이외에도, 안테나 P*B는 동시에 가시 스펙트럼 영역에서 매우 집중적인 방출을 나타낸다. 그러나 P*B의 방출 특성은 안테나의 향후 적용과 표면상 관련성이 없다. 1,10-페난트롤린 유도체 (P*B)와 디에틸렌트리아민 펜타아세트산의 이무수물 (LH-A)을 반응시킴으로써 아미드 결합이 형성되면서 킬레이트 리간드 내에 안테나가 도입되었다. 일급 아민에 대한 카르본산의 상대적으로 낮은 반응성은 카르보닐 성분의 활성화를 필요로 한다. 그러므로 일반적으로 대응하는 산 염화물, 산 무수물, 또는 카르본산의 에스테르의 가아민 분해 반응 (aminolyse)이 실행된다. 킬레이트 리간드를 이용하는 경우, 폴리아미노 폴리카르본산은 우선 이무수물 (LH-A)로 변환되었다. 이무수물 (LH-A)은 유리 산과 비교하여 더욱 반응성이 클 뿐 아니라 동시에 생성물 선택성을 증대시키는데, 왜냐하면 5개의 카르복실기 중 오로지 2개만이 방향족 아민과 반응할 수 있기 때문이다. 그에 반해, 대응하는 산 염화물 또는 에스테르의 반응은 비선택적일 수도 있다.
본 발명의 목적과 관련하여 상기한 합성 전략의 추가의 장점은, 이무수물의 선택으로 안테나뿐 아니라 추가의 아미노 작용기화된 기가 킬레이트 리간드에 결합될 수 있다는 점에 있다.
LH -A의 합성: 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 - 이무수물
Figure 112006090491092-pct00002
반응은 보호 가스 하에서 실행된다.
아세트산 무수물 12.9 ml와 피리딘 12.3 ml에 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 13.4 g을 첨가한다. 현탁액은 70℃에서 24시간 동안 교반한다. 이때 반응 혼합물은 암갈색으로 변화한다. 냉각 후에 여과하면 아세트산 무수물을 함유한 침전 생성물이 생성되며, 이어서 수차례 헥산으로 세척하고 진공 상태에서 건조한다.
수율: 약 90％.
안테나 리간드 (P* BLH 4 )의 합성
Figure 112006090491092-pct00003
오로지 각각 하나의 안테나 발색단을 킬레이트 리간드에 도입할 목적으로, 이무수물 (LH-A)와 안테나 (P*B)를 1:1의 비율로 반응시켜, P*BLH4를 형성하였다. 상기 반응은 수용액에서 실시하였고, 이때 제2 무수물 작용기는 개방된다.
킬레이트 리간드 (LH5) 내에 안테나 (P*B)를 도입한다고 하여, 그 자체로 상기한 안테나의 분광 특성은 본질적으로 변화하지 않으며, 그에 반해 본래의 킬레이트 리간드, 즉 디에틸렌트리아민 펜타아세트산은 안테나 리간드의 모든 목표되는 분광 특성을 포함한다. 도 2에는 퍼킨엘머 (PERKINELMER (LS50B)) 사의 형광 분광기에 기록된 여기 스펙트럼의 실례에서 획득한 결과가 도시되어 있다.
P*B의 흡수 최대값은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산과의 연결을 통해 극미하게 단파장쪽 (hypsochrome)으로 이동되며, 흡수띠들의 세기 비율이 변화하고, 흡수띠들의 띠 구조는 부분적으로 변화한다. 그러나 모든 경우에 디에틸렌트리아민 펜타아세트산에 안테나 (P*B)를 도입하면, 유리 안테나와 비교하여 최장파장 흡수가 증대되며, 그에 반해 방출의 스펙트럼 위치는 영향을 받지 않는다.
표 2에는 P*B와 비교하여 안테나 리간드 (P*BLH4 )의 분광 특성들이 비교되어 있다. 특히 바람직하게는 리간드의 여기는 안테나 기의 흡수 최대값에서 이루어질 필요가 없는데, 왜냐하면 방출 띠들의 위치는 여기 파장과 무관하기 때문이다. 이는 흡수 영역에서 란타나이드(Ⅲ)-착물의 임의의 장파장 여기를 가능케 하며, 흡수 영역은 또 다른 발색단을 이용함으로써 추가적으로 팽창될 수 있다.
Figure 112006090491092-pct00004
* P* BLH 4 의 여기는 λexc = 360 nm에서 이루어진다.
본 발명에 따른 용액의 처리를 위해, 안테나 리간드 (P*BLH4)가 추가로 이용된다.
약알칼리성 수용액에서 유리산으로서 안테나 리간드 (P*BLH4 )와 금속 염화물 (EuCl3 및 TbCl3)을 화학량론적으로 반응시킴으로써, 안테나 착물 ([EuP*BL]- 및 [TbP*BL]- )이 생성된다. 이러한 착물들은 반응 용액을 농축시킨 후에 적합한 상대이온 (예컨대, 테트라부틸암모늄-이온 nBu4N+)을 첨가함으로써 분리될 수 있다. 그러나 FRET 분석의 경우, 오로지 금속염 용액들만이 각각 안테나 리간드 용액에 적정되며, 그리고 착물 형성은 UV/Vis-분광법 및 형광 분광법을 이용하여 조절된다. 결합기를 함유하는 안테나 리간드는 원리상 일무수물 또는 [P*BLH4]의 분리 없이 "단일 반응기 합성"에서도 제조될 수 있다.
[ EuP * BL ] - 및 [ TbP * BL ] - 의 합성
이용되는 안테나 착물의 제조는 안테나 리간드 용액으로 금속염 용액을 적정함으로써 이루어진다:
EuCl3 및 TbCl3은 pH 6 내지 7의 수용액 내, 또는 pH 10의 알칼리 용액 (NH3/H2O) 내 BLH4 (농도 > 0.1 mM)에 1:1 비율로 첨가된다.
안테나 착물 ([ EuP * BL ] - 및 [ TbP * BL ] - )의 분광 특성화
수용액 내 안테나 착물 ([ EuP * BL ] - 및 [ TbP * BL ] - )의 흡수 및 방출 스펙트럼을 기록하였다. 두 공여체의 획득한 흡수 스펙트럼은 도 3에 도시되어 있다.
안테나 착물 (EuP*BL]- 및 [TbP*BL]- )의 광에 의한 여기는 임의적으로 안테나 발색단 (P*B)의 흡수 영역에서 이루어질 수 있다. 특히 이와 관련하여 가급적 장파장 여기가 이루어지는데, 다시 말해 P*B의 n→π*-전이의 흡수 최대값에서, 또는 상기한 흡수 (이미 언급했듯이, λexc = 360 nm일 시에)의 장파장 꼬리에서 가급적 장파장 여기가 이루어진다. 안테나 착물 ([EuP*BL]- )의 경우, P*B의 최장파장 흡수로의 여기로 인해 Eu(Ⅲ) 이온을 특징 짓는 적색 방출이 이루어진다. 이는 도 4에 도시되어 있는 바와 같다.
[EuP*BL]- 의 방출 스펙트럼에서 첨예한 방출선은 4f-준위 내부에서의 전이에 상응한다. 가장 집중적인 전이는 595 nm 및 617 nm에서 관찰된다. 그와 반대로 테르븀(Ⅲ) 이온의 방출은 녹색 스펙트럼 영역에서 이루어지며, 이러한 녹색 스펙트럼 영역은 492 nm 및 547 nm에서 가장 집중적인 두 방출선을 갖는다. 안테나 착물 ([TbP*BL]- )에 대해 도 5에 도시한 방출 스펙트럼은, [EuP*BL]- 와 유사하게, λexc = 360 nm에서 P*B의 최장파장 흡수쪽으로 안테나 리간드가 여기하는 것에 기인한다.
두 란타나이드(Ⅲ) 이온은 안테나 착물들 ([EuP*BL]- 및 [TbP*BL]- )에서 매우 집중적인 방출을 나타낸다. 이러한 집중적인 방출은 이용되는 안테나 발색단(P*B)의 강력한 흡수에 기인한다. 비치환된 디에틸렌트리아민 펜타아세트산의 각각의 란타나이드(Ⅲ) 착물의 방출 스펙트럼을 비교해보면, 안테나 리간드(P*BLH4)를 이용한 착물화가 [TbP*BL]- 에 대해서는 5배만큼, 그리고 [EuP*BL]- 에 대해서는 30배만큼 금속 이온 방출의 집중화를 초래하는 것을 알 수 있으며, 여기된 상태의 상대적으로 긴 수명이 유지된다 (표 3).
Figure 112006090491092-pct00005
도시한 안테나 착물들 ([ EuP * BL ] - 및 [ TbP * BL ] - )의 장점은 그들의 전자 여기된 상태의 비교적 긴 수명에 있다. 표 3에서 알 수 있듯이, [ EuP * BL ] - 의 경우 0.59 ms의 방출 수명이 관찰되며, 그리고 [ TbP * BL ] - 의 경우 1.61 ms의 방출 수명이 관찰된다. 그에 비해 유기 형광단의 수명은 나노초 영역으로 존재한다.
공여체로서 란타나이드(Ⅲ) 화합물을 이용함으로써, 이는 시간 지연 측정 상황에서 형광 스펙트럼의 기록을 가능케 하는데, 다시 말해 스펙트럼의 기록은 공여체의 여기 직후에 이루어지는 것이 아니라, 소정의 지연 후에 비로소 이루어진다. 그에 따라, 공여체 [본원의 경우 안테나 착물들 ([EuP*BL]- 및 [TbP*BL]- )]와 비교하여 짧은 수명을 갖는 분자들과 관련하여 발생하여 간섭하는 그들의 기타 모든 배경 형광은 제거될 수 있으며, 그리고 본질적인 측정 신호의 세기 왜곡을 배제하는데 기여한다.
공여체 ([ EuP * BL ] - 및 [ TbP * BL ] - )의 모든 형광 측정은 설정된 시간 지연에 따라 실시하였다. 표준 설정은 하기와 같이 하였다:
[ EuP * BL ] - 의 경우: 여기 파장: λexc = 360 nm
여기 간격: 15 nm 방출 간격: 5 nm
방출 필터: 515 nm
시간 창문(time window)(gt): 4.50 ms
시간 지연(dt): 0.07 ms
[ TbP * BL ] - 의 경우: 여기 파장: λexc = 400 nm
여기 간격: 15 nm 방출 간격: 10 nm
방출 필터: 430 nm
시간 창문 (gt): 4.60 ms
시간 지연 (dt): 0.08 ms
란타나이드(Ⅲ)-착물들의 형광 감쇠 곡선을 측정하는 경우, FRET 분석에서와 같이, 형광 분광기 LS50B에서 동일한 표준 설정이 선택되었다. 방출은 [EuP*BL]- 의 경우 λem = 617.5 nm의 파장에서 관찰하였고, [TbP*BL]- 의 경우는 λem = 547 nm의 파장에서 관찰하였다.
다음에서, 설정된 목적의 본 발명에 따른 해결 방법과 관련한 공여체 착물들의 적합성이 검증된다. 이를 위해, 다음에서 기술되는 바와 같이 진행된다.
FRET 실험에서, ST936 및 로다민 B의 각각의 수용체 농도를 다양하게 한 상태에서 전자 여기된 안테나 착물([EuP*BL]- 또는 [TbP*BL]- )의 수명 및 방출 세기의 변화를 분석하였다. 에너지 전이의 효율은 수용체가 존재하는 경우 관찰될 공여체의 형광 소멸의 정도를 제공한다.
공여체-수용체 쌍들은 대응하는 공여체 용액과 수용체 용액을 혼합함으로써 수득된다. 유로퓸(Ⅲ) 착물 ([EuP*BL]- )의 FRET 분석은 본 발명에 따라 대응하는 수용체로서 센시엔트 게엠베하 볼펜 (SENSIENT GmbH Wolfen) 사의 폴리메틴 염료 (ST936)를 이용하여 실행하였다. 공여체 착물 ([TbP*BL]- )에 대한 수용체 염료로서는 본 발명에 따라 로다민 B 염료를 이용하였다. 모델 시스템에서, 공여체 및 수용체의 선택은 그들의 분광 특성을 바탕으로 결정된다. 이때 생물학적 기질로의 공유 결합 체결을 위해 공여체 또는 수용체에 대한 대응하는 작용기화는 중요하지 않다.
FRET 실험에서 선택된 공여체에 대한 수용체의 분광학상 전제 조건은 공여체의 방출과 수용체의 흡수가 겹치는 것이다. 도 6은 대응하는 수용체로서 센시엔트 게엠베하 볼펜 사의 선택된 폴리메틴 염료 (ST936)의 분광 특성과 관련하여 안테나 착물 ([EuP*BL]- )의 분광 특성을 도시하고 있다. 도면으로부터, [EuP*BL]- 의 방출 스펙트럼과 수용체의 흡수 스펙트럼이 강하게 겹치며, 그에 따라 본 발명의 목적에 대한 요건을 충족하고 있음을 알 수 있다. 또한, ST936의 방출 최대값은, λem = 660에서 안테나 착물의 가장 집중적인 방출선쪽으로 장파장 이동되어 있다.
폴리메틴 염료 (ST936)가 존재하는 상태에서 [ EuP * BL ] - 을 여기할 시에, 이는 안테나 착물의 방출 세기를 소멸시키며, 그리고 666 nm에서 수용체 방출을 증가시킨다. 그에 따라 이용되는 안테나 착물 ([ EuP * BL ] - )로부터 형광 염료 (ST936) 상으로 이루어지는 방사선 없는 에너지 전이가 검증된다. FRET 실험에서 공여체의 농도가 일정할 시에, 수용체 농도가 상승함에 따라 [ EuP * BL ] - 의 방출 세기는 감소하고, ST936의 방출이 증가하는 점을 관찰하였다. 방출 스펙트럼의 요구되는 수정으로, 각각의 공여체 대 수용체 비율에 대한 공여체 방출 및 민감해진 수용체의 방출을 산출할 수 있다.
만일 안테나 착물 ([TbP*BL]- )과 이러한 공여체를 위해 선택한 수용체 염료 (로다민 B)가 한 용액 내에 있다면, 이와 같은 공여체-수용체 쌍의 경우에서도, [TbP*BL]- 의 여기 이후 안테나 발색단 (P*B)의 최장파장 흡수 영역에서, 수용체 상으로의 방사선 없는 에너지 전이의 결과로 [TbP*BL]- 의 방출 세기가 소멸하며, 그리고 로다민 B의 새로운 방출이 초래된다. 그에 따라 상기한 안테나 착물의 적합성이 검증된다.
공여체를 위한 제조 및 적합성 시험 후에, 수용체 염료를 합성한다.
공여체 착물 ([EuP*BL]- )에 대해서, 대응하는 FRET 분석에서 유로퓸(Ⅲ) 착물과 관련한 이 유로퓸(Ⅲ) 착물의 에너지 공여체 특성을 시험하기 위해, 아크마리 케미 게엠베하 (AcMaRi Chemie GmbH) 사의 폴리메틴 염료(ST936)을 이용하여, 상기한 공여체 착물의 분광 특성을 바탕으로 적합한 수용체를 찾아냈다. 이러한 폴리메틴 염료는, 공여체의 방출 영역에서 강한 흡수를 나타내며, 그리고 [EuP*BL]- 을 방출하기 위해 장파장쪽 이동되면서 집중적인 방출을 나타내는 것을 특징으로 한다.
그러나, 수용액에서의 폴리메틴 염료의 불충분한 용해성과 표지할 단백질 분석물의 공유 결합을 위한 부족한 작용성은 적용하는 데 있어서 단점으로 작용한다. 그러므로, 예컨대 단백질에 대한 결합 가능성을 허용하면서, 동시에 물에서의 용해성을 개선하는 그러한 기로써 폴리메틴 염료 (ST936)를 치환하여야 한다.
본 발명의 범주에서, 목적은 ST936의 Cy5-기본 몸체와 그에 따라 최대값의 위치와 관련하는 ST936의 흡수 및 방출 특성을 유지하면서 표지하기에 적합한 새로운 폴리메틴 염료를 형성하기 위해 인돌레닌 잔기를 유도체화하는 것에 있다.
인돌레닌 유도체 TIPBr-, TIEOBr-, TIPEBr-, TIPNBr- 및 TIBEl- 로부터 출발하여, 이미 공지된 폴리메틴 염료 (ST936) 이외에도 추가의 염료 (Cy5BE, Cy5'BE 및 Cy5PE)를 제조하였다. 디아닐리드와 인돌레닌 유도체 (TIEOBr- )를 반응시킴으로써, 대응하는 폴리메틴 염료로서 Cy5EE를 획득하였다. 이때 히드록시 작용기는 반응 용액 내에 존재하는 아세트산 무수물에 의해 에스테르화되었다.
이에 따라, 안테나 리간드는, 이후의 공여체에 대한 측정할 분석물 (면역 분석 성분)의 공유 결합을 허용하는 작용성을 구비하고 있어야 하는 사실을 식별하였다. 이때 상기한 작용 잔기를 통한 분석물의 결합은 안테나 리간드에서, 란타나이드(Ⅲ) 이온을 착물화하는 유리 카르복실기의 수를 감소시키며, 그에 따라 형성되는 안테나 착물의 총 전하를 변화시킨다. FRET를 바탕으로 하는 FIA 시스템의 경우, 오로지 음전하 착물 또는 중성 착물만이 바람직하다. 왜냐하면, 상기한 FIA 시스템은 대개 마찬가지로 음전하를 띠는 생물학적 기질과의 비특정 결합을 일으킬 수 없기 때문이다. 우선적으로 분광 특성화를 위해 란타나이드(Ⅲ) 안테나 착물 ([LnPBL]- )을 제조하였다.
또한, 안테나 리간드 (P* BLH 4 )는 링커 기를 도입함으로써 본 발명에 따라 작용기화된다. 이미 확인했던 바와 같이, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (LH-A)의 이무수물은 2-위치에서 치환된 1,10-페난트롤린 유도체(P*B)와 오로지 일측에서만 반응할 수 있으며, 그럼으로써 계속해서 제2 무수물 작용기도 마찬가지로 아미노 작용기화된 기와 반응할 수 있게 된다.
이와 같은 방법으로, 2가지 상이한 링커 기, 즉 상이한 사슬 길이의 디아민을 안테나 리간드 (P*BLH4 )에 결합하였다. 그리고 P*BLH3-EDA (EDA: 에틸렌디아민)과 P*BLH3-SP1 (SP1: 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄)을 합성하였다.
Figure 112006090491092-pct00006
반응은 보호 가스 하에서 실시된다.
LH-A 1.5 mmol을 DMF 24 ml 및 Et3N 2.1 ml에 용해하고, 그런 다음 DMF 5 ml에 용해된 2-(4-아미노페닐에티닐)-1,10-페난트롤린 (P*B) 1.5 mmol과 한 방울씩 떨어뜨려 교반하면서 혼합한다. 반응 용액은 실온에서 약 2시간 동안 교반한 후에 DMF 3 ml에 용해된 디아민 2 mmol에 한 방울씩 떨어뜨리면, 황색의 박편 침전물이 생성된다. 이 침전물을 추가로 1시간 내지 2시간 동안 교반하고, 진공 상태에서 다소 농축시키고 밤새도록 냉장고에 두면, 생성물이 완전하게 침전된다. 생성 침전물은 프릿을 통해 반응 용액으로부터 분리하고, 다소 건조된 메탄올 및 에테르를 이용하여 세척하고, 이어서 진공 상태에서 건조한다. 생성물은 황색의 염료로서 획득된다. 만일 생성물을 공기 중에 분리하면, 황색의 침전물은 끈적거리게 되고, 색상은 오렌지 적색으로 변한다. 생성물을 공기 중에 건조시키고, 분쇄기로 분쇄할 수 있다.
수율: 약 60％.
폴리메틴 염료를 마찬가지로 작용기화하였다. 왜냐하면, 본 발명의 목적은 한편으로는 유리 카르복실기를 이용하여 폴리메틴 염료를 제조하는 것에 있기 때문이다. 상기한 유리 카르복실기를 통해서는 염료가 직접적으로 단백질에 결합될 수 있으며, 카르본산 잔기는 또한 단백질에 대한 또 다른 반응성의 기 (예: 디아민)를 이용한 유도체화를 허용한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은 폴리메틴 염료를 합성하는 것이며, 단백질 분석물에 대한 상기한 폴리메틴 염료의 화학적 결합은 아미드 결합의 형성을 통해 이루어지지 않는다.
이러한 이유에서, 목적의 제1 관점을 위해, 2개의 대칭 염료 (Cy5BE 및 Cy5PE)뿐 아니라 비대칭 염료 Cy5'BE를 제조하였다. 이어서, 목표하는 카르본산 작용기는 에스테르 염료의 가수분해로부터 직접 획득하였으며, 염료는 퍼클로레이트로서 분리할 수 있었다.
생물 분석을 모델화하기 위한 목적으로, 공여체-수용체간 간격을 차별화하여 FRET 분석을 실행한다.
스페이서는 모델 시스템에서 공여체 및 수용체를 공간상 이격시키면서, 링커의 생물 분자들 (예: 항원 및 항체)의 결합식 상호 작용을 시뮬레이션화한다.
이때, 링커의 사슬 길이에 의해 공여체-수용체간 간격은 FRET가 더 이상 관찰 불가능할 정도로 크지 않게 하여야 하는데, 다시 말하면, 공여체-수용체간 간격은 소위 푀르스터 (Foerster) 간격의 내부에서 이동되어야만 한다.
이러한 모델 시스템에서, 공여체 및 수용체는, 아미드 결합 (공여체-링커-결합) 내지 티오카르바메이트 결합의 형태로, 링커의 사슬 길이를 변화시키면서, 개질된 염료의 이소티오시아네이트 작용기를 통해 견고하게 연결된다. 개질된 공여체 및 수용체를 이용한 목표하는 모델 시스템은 도 11에 도시되어 있다. 디아민, 즉 에틸렌디아민 (EDA) 내지 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄 (SP1)을 이용하여 안테나 리간드를 치환하는 조건에서, 공여체로서 안테나 착물 ([EuP*BL]- )을 이용하였다. 대응하는 수용체는 FRET 실험에서 폴리메틴 염료 (Cy5ENCS)이다.
Figure 112006090491092-pct00007
공여체 (안테나 착물 ([EuP*BL]- )) 및 수용체 (폴리메틴 염료 (Cy5ENCS))는 링커를 통해 상호 간에 연결된다. 링커로서는 에틸렌디아민 (EDA) 및 1,8-디아미노-3,6-디옥사옥탄(SP1)을 이용하였다.
공여체의 제조는 수성 EuCl3-용액 (≥ 1?10-3 M)을 안테나 리간드 (P*BLH3-EDA 내지 P*BLH3-SP1)의 등몰 수용액에 적정함으로써 이루어졌다. 안테나 착물 ([EuP*BL-EDA] 또는 [EuP*BL-SP1])의 형성은 형광 분광법으로 추적하였다. λexc = 360 nm의 조건에서 수용액을 여기한 후에, 유로퓸(Ⅲ) 이온의 집중적인 적색 방출을 관찰함으로써 [EuP*BL-EDA] 또는 [EuP*BL-SP1]의 착물 형성을 증명하였다.
FRET 실험에서, 말단 아미노 작용기를 이용하여 치환된 일정한 농도의 안테나 착물 ([EuP*BL-EDA] 또는 [EuP*BL-SP1])을 용해하기 위해, 수용체 염료 (Cy5ENCS)를 단계별로 폴리메틴 염료의 양이 과잉 상태가 될 때까지 첨가하였다. 이때 공여체 ([EuP*BL-EDA])([EuP*BL-SP1]에 대해서도 동일하게 적용됨)의 방출은 수용체 농도가 상승함에 따라 소멸되고, 수용체의 방출의 증가가 관찰된다. 도 7에는 FRET 실험으로 획득한 방출 스펙트럼이 공여체-수용체 쌍 ({[EuP*BL]-EDA-Cy5ENCS})에 대해 수정된 후 상태로 그래프로 도시되어 있다. 수정이란, 모든 방출 스펙트럼을, 수용체가 존재하지 않을 시 안테나 착물의 최고에너지 전이 (highest energy transition)의 최대값으로 규격화하는 것에 상응한다.
동일한 측정 조건에서, 개질된 안테나 착물의 FRET 분석은 {[EuP*BLH4]-SP1-Cy5ENCS}를 이용하여 링커 (SP1)가 존재하는 조건에서 실행하였다. 도 13에서 알 수 있듯이, 여기서도 또한 폴리메틴 염료의 방출을 동시에 민감화할 시에 공여체 방출의 소멸이 관찰된다. 그에 따라 이와 같은 모델 분석을 통해 대응하는 면역 분석에 대한 새로운 FRET 시스템의 원리상 적용 가능성이 검증된다.
개질된 공여체-수용체 쌍을 이용한 FRET 생물 분석
FRET 생물 분석을 이용하여 생물학적 활성 분자들을 검증하고/하거나 정량화하기 위해, 전술한 공여체/수용체 쌍들 중 어느 하나를 이용하는 측정 시스템을 가능한 한 범용적으로 이용할 수 있어야 한다. 그러므로 면역 글로불린 G (IgG)에 대한 단백질 A의 결합이, 공여체로서 안테나 리간드 (P*BLH3-SP1)과 수용체로서 염료 (Cy5BA)를 이용하여 두 상대자의 표지 후에, FRET 측정을 통해 검증되는지 여부를 분석하였다.
이용한 시스템 (단백질 A - IgG)은, IgG에 대한 단백질 A의 결합이 Fc-단편에서 이루어짐으로써, Fab-단편에 결합하는 대응하는 항원과 IgG의 상호 작용은 영향을 받지 않게 되는 장점을 갖는다.
이용되는 두 단백질을 공여체 내지 수용체로 리간드화하기 위해, 두 반응물을, 20℃의 온도 조건에서, 과량의 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)를 함유한 약산 영역에서 처리하였다. 그리고 단백질을 함유하는 안테나 리간드 내지 염료의 형성된 산아미드는, 겔 여과를 통해, 반응하지 않은 리간드 및 반응 제형의 여타의 저분자 성분들로부터 분리하였다.
IgG 에 대한 P* BLH 3 - SP1 의 결합
IgG 0.066 μM을, pH 5.0의 이미다졸/HCl-완충액 100 mM에서 안테나 리간드(P*BLH3-SP1) 3.3 μM 및 EDC 330 μM와 혼합하고, 실온에서 밤새도록 배양하였다. 1시간의 배양 후에, 1 N NaOH를 사용하여 pH 값을 다시 pH 4.5 내지 5.0으로 만들었다. 다음날 아침에, 본질적으로 변성된 단백질을 나타내는 생성된 물질을 5000 x g에서 원심 분리를 통해 제거하고, IgG-안테나 리간드-콘쥬게이트를, NAP-5-칼럼(아머샴 바이오텍 (Amersham Biotech))을 통해 겔 여과함으로써 반응하지 않은 안테나 리간드 및 기타 저분자 물질로부터 분리하였다.
수율은 사용한 IgG와 관련하여 약 60％였다. IgG-분자는 약 30개의 결합된 안테나 리간드 분자를 함유하였다. 이와 같은 치환도는 단백질 대 안테나 리간드의 몰 비를 변화시킴으로써 임의로 설정된다.
단백질 A 및 염료 Cy5BA로 이루어진 첨가 화합물의 합성은 유사한 방법으로 실시했지만, 그러나 염료는 염료의 불충분한 용해도로 인해 알코올 용액으로서 사용하였다. 처리는 앞서 기술한 바와 같이 반응하지 않은 염료로부터 원심 분리 및 겔크로마토그래피 분리를 통해 생성된 단백질을 분리함으로써 실행하였다.
수율은 (단백질 A와 관련하여) 약 10％였으며, 치환도는 단백질 A의 1 M당 염료가 약 8 M이었다. 불충분한 수율은 염료에 대한 용매로서 이용한 알코올에 의해 단백질이 강하게 변성됨으로써 야기된다.
결합된 공여체 및 수용체의 FRET를 위한 성능은, 단백질 A (PA) 및 면역 글로불린 G (IgG)의 표지된 성분들을 2가지 상이한 농도로 하여 실행하는 수명 시험에 따라 PA:IgG의 비율을 1:1의 조건으로 하여 시험하였다. 이와 관련하여 수명 측정으로부터 검출된 에너지 전이 효율 (E)은 성분들의 농도와는 무관하도록 하여야 한다. 획득한 표지된 물질로부터 8.5×10-7M 및 2.5×10-7M의 이미다졸/HCl-완충액 용액을 제조하였다. 공여체 착물은, 표지 비율에 상응하는 양의 EuCl3-용액을 리간드에 첨가함으로써 제조하였다.
도 8과 도 9는 지시된 농도를 이용하여 대응하는 여기 조건 하에서 획득한 스펙트럼을 도시하고 있다. 각각은 최초에 순수 공여체 용액을 분석하였고, τ0을 산출했으며, 그리고 τ를 측정하기 위해 표지된 단백질 A를 첨가한 후 재차 분석하였다. 수명은 4회 측정하였으며, 그 평균치를 이용하였다. 전이 효율(％)은 하기와 같이 계산된다.
Figure 112006090491092-pct00008
측정값들은 표 4에 요약되어 있다. 그에 따라 전이 효율은 방법 조건에 따른 측정 오류의 범주에서 무관하며, 그리고 본 시스템의 작용기 효율이 입증된다. 상대적으로 작은 효율 값은 수용체와 비교하여 공여체의 보다 높은 표지도(marking degree)에 그 원인이 있다. 본 실시예에서는 1:1 또는 1:2 (IgG:PA)의 비율이 보다 효율적일 수도 있다.
Figure 112006090491092-pct00009
FRET 면역 분석을 위한 키트 시스템의 조합을 위한 제안
생물학적 및 의학적 분석 실험에서 FRET 면역분석을 활용하기 위해 키트 시스템을 개발하여야 한다. 이러한 키트 시스템은 사용자로 하여금 분석 시스템을 가능한 간단하게 취급하게 하며, 그리고 이용하는 일차 항체와 그에 따른 조사 분석물의 선택과 관련하여 높은 유연성을 가능케 한다.
도 7에는 FRET 면역 분석의 측정 원리가 개략적으로 도시되어 있다. 제1 반응에서, 공여체에 결합되는 항체 (일차 항체)를 갖는 분석물을 함유한 분석 물질이 배양된다. 제2 반응에서, 수용체 염료로써 표지된 이차 항체와, 또는 특별하게 면역 글로불린을 결합시키는 기타 단백질 (예: 단백질 A 또는 단백질 G)과 결합된 일체 항체의 검출이 이루어진다. 그에 따라 이러한 단백질 대 단백질의 상호 작용에 의해 야기되는 FRET 반응은 분석의 측정 변수이다. 상기한 FRET 면역분석은 전형적인 ELISA 반응과 같이 고체상에서 이루어져야 하는데, 왜냐하면, 그렇지 않았을 경우, 반응하지 않는 일차 항체와 함께 이차 항체가 FRET 반응을 야기하는 위험이 존재하기 때문이다.
Figure 112010028056118-pct00010
FRET -면역 분석의 개략도
FRET 면역 분석을 위한 키트는, 안테나 리간드 및 실험자가 설정할 일차 항체에 대해 안테나 리간드를 결합시키기 위한 시약 (EDC, 완충액, 겔 여과 칼럼) 뿐 아니라 수용체 염료로써 표지된 이차 항체 (또는 특별하게 면역 글로불린을 결합시키는 기타 표지된 단백질)로 구성된다. 만일 키트에, 수용체 염료들로써 표지되는 다수의 이차 항체가 첨가된다면, 상기한 측정 시스템을 이용하여 상이한 분석물들의 동시적인 검출이 가능하다 (다중화). 이와 관련하여 상기 수용체 염료들은, 상이한 파장의 조건에서 FRET 반응의 검출을 실행할 수 있는 방식으로, 자신들의 스펙트럼 특성으로 구분된다.
공여체의 경우에, 아미노 작용기화된 안테나 (P*B), 산 무수물 (LH-A) 및 스페이서인 에틸렌디아민 (EDA)으로 구성된 시스템이 효과적인 것으로서 입증되었다. 3가지 성분은 DMF/TEA 내에서 안테나 리간드에 연결된다. 스페이서의 변이는 원칙적으로 가능하다. 획득한 생성물은 크로마토그래피 세척 후에 적용할 수 있으며, 그리고 사용자가 염료로서 사용할 수 있다. 항체 및 안테나 리간드는, 통상적인 방법에 따라, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노-프로필)-카르보디이미드(EDC) 또는 N, N'-카르보닐디이미드-아졸 (CDI)을 이용하여 카르보닐 성분을 활성화하면서, 아미드 결합의 형성을 통해, 상호 간에 연결된다. 적용 범위를 확장하기 위해, 스페이서를 함유한 안테나 리간드의 말단 아민 질소에서 이소티오시아네이토 작용기로의 변환 역시 가능하다.
본질적인 에너지 공여체, 즉 란타나이드(Ⅲ) 착물들은 분석 시에 현장에서 대응하는 양의 금속 염화물 용액을 첨가함으로써 제조된다. 란타나이드(Ⅲ) 이온의 선택은 그 란타나이드(Ⅲ) 이온의 특정한 방출에 의해 수용체 염료의 선택을 결정한다. 실례로서 이용하는 유로퓸(Ⅲ) 이온의 경우에는, 폴리메틴 염료 (Cy5R)가 선택되었다. 이 폴리메틴 염료의 흡수는 공여체(유로퓸(Ⅲ)-착물)의 방출 영역에 위치한다. 히드록시 염료와 산 기로서 작용기화 된 Cy5 염료는 높은 수율로 접근할 수 있다. 산 작용기는 이미 공여체의 경우에서 언급한 방법에 따라 아미드 결합을 통해 이차 항체에 대한 직접적인 결합을 허용한다. 단백질의 카르복실기를 이용하여, 히드록시 작용기화된 염료는 또한 에스테르 결합을 통해 연결될 수 있다. 작용기 실례로서, 폴리메틴 염료의 부류로 이루어진 화합물이 지시될 뿐 아니라, 본 발명에 따라 제조되어 이용되는 폴리메틴과 유사한 염료가 지시된다.
가장 간단한 경우, 시판중인 키트 시스템은 본 발명에 따라 최소한 하기의 성분들을 함유한다 (표 5):
● 염료로서 스페이서 (EDA)를 함유하는 안테나 리간드 (성분 1).
● 표지를 위한 CDI 또는 EDC 및 트리에틸아민 아세테이트 완충액.
● 10-3 mol/l의 수용액으로서 유로퓸(Ⅲ) 염화물 (성분 2).
● Cy5-염료로써 표지된 이차 항체 (성분 3).
Figure 112006090491092-pct00011
위에 기술한 FRET 면역 분석은 바람직하게는, 분석물에 결합되어 뒤이은 FRET 반응 시에 잘못된 긍정 신호를 제공할 수도 있는 일차 항체가 FRET 반응 전에 세척 단계를 통해 제거될 수 있도록 하기 위해, 고체 표면 (예: 미량 역가 플레이트, 조직 화학적 적용 시 슬라이드)에서 실행된다.
2~3가지 적용에서, 균일한 FRET 면역 분석을 생각해볼 수 있다. 이에 대한 실례로 예컨대 항체 생성에 의한 융합 세포 클론 (hybridomcell clone)의 스크리닝을 들 수 있다. 이와 같은 시스템은 단일 클론 항체를 식별하는 일차 항체 이외에도 (예: 항-마우스-IgG), 제2 성분으로서 예컨대 성분 인자 C1q와 같은 단백질을 함유하며, 그럼으로써 유리 면역 글로불린으로부터 항원-항체 착물의 구분이 가능하게 된다.
균일한 적용의 주요 문제점은, 단백질-단백질 간의 상호 작용이 존재함에도 불구하고 공여체와 수용체 사이의 간격이, FRET을 관찰할 수 없어서 이로 인해 잘못된 결과가 획득될 정도로 클 수 있다는 것이다. 이와 같은 잘못된 해석의 위험은, 실험을 통상적인 경합 분석의 형태로 실행하면 회피할 수 있다. 이를 위해, 매우 약한 상호 작용을 갖는 AK/AG 쌍으로부터 개시되어 FRET에서 검증이 가능해야 한다. 표지되지 않은 항체를 첨가한 후에, 이러한 항체의 농도에 따라서 수용체의 방출 세기가 감소함으로 인해, 효과적인 착물의 형성이 식별될 수 있다.
합성된 물질의 목록
3,8- 디브롬 페난트롤린 (P)
1- 메틸 -1,10-페난트롤린-1- 이움요오다이드 (P*(a))
Figure 112006090491092-pct00013
1- 메틸 -1,10- 페난트롤 -2-온 (P*(b))
Figure 112006090491092-pct00014
2- 클로로페난트롤린 (P*)
Figure 112006090491092-pct00015
3-(2-히드록시-2-메틸부트-3-이닐)아닐린 (A(a2))
Figure 112006090491092-pct00016
3- 에티닐아닐린 (A)
Figure 112006090491092-pct00017
4-(2-히드록시-2-메틸부트-3-이닐)아닐린 (B(a2))
Figure 112006090491092-pct00018
4- 니트로페닐아세틸렌 (B( b3 ))
Figure 112006090491092-pct00019
4- 에티닐아닐린 (A)
Figure 112006090491092-pct00020
3,8- 비스 (3'- 아미노페닐에티닐 )-1,10-페난트롤린 ( PA 2 )
Figure 112006090491092-pct00021
3,8- 비스 (4'- 아미노페닐에티닐 )-1,10-페난트롤린 ( PB 2 )
Figure 112006090491092-pct00022
2-(4'- 아미노페닐에티닐 )-1,10-페난트롤린 (P*B)
Figure 112006090491092-pct00023
디에틸렌트리아민 펜타아세트산-이무수물 ( LH -A)
Figure 112006090491092-pct00024
안테나 리간드 PA 2 LH 3
Figure 112006090491092-pct00025
안테나 리간드 ( PB 2 ) 2 L 2 H 6
Figure 112006090491092-pct00026
안테나 리간드 P* BLH 4
Figure 112006090491092-pct00027
안테나 리간드 P* BLH 3 - EDA
Figure 112006090491092-pct00028
안테나 리간드 P* BLH 3 - SP1
Figure 112006090491092-pct00029
인돌레닌 유도체 TIPBr -
Figure 112006090491092-pct00030
인돌레닌 유도체 TIEOBr -
Figure 112006090491092-pct00031
인돌레닌 유도체 TIPEBr -
Figure 112006090491092-pct00032
인돌레닌 유도체 TIBEI -
Figure 112006090491092-pct00033
폴리메틴 염료 ST936
Figure 112006090491092-pct00034
폴리메틴 염료 Cy5EE
Figure 112006090491092-pct00035
폴리메틴 염료 Cy5BE
Figure 112006090491092-pct00036
폴리메틴 염료 Cy5'BE
Figure 112006090491092-pct00037
1H-NMR(ppm, MeOH-d4):
신호의 할당이 이루어지지 않았다.
UV/Vis-스펙트럼(MeOH):
nm 단위의 λabs(M-1cm-1단위의 ε): 643(7.1?104) nm 단위의 λem: 664
폴리메틴 염료 Cy5BA
Figure 112006090491092-pct00038
1H-NMR(ppm, MeOH-d4):
신호의 할당이 이루어지지 않았다.
UV/Vis-스펙트럼(MeOH): 내부 염(internal salt)으로서.
nm 단위의 λabs(M-1cm-1단위의 ε): 642(7.9?104)
폴리메틴 염료 Cy5'BA
Figure 112006090491092-pct00039
1H-NMR(ppm, DMSO-d6):
신호의 할당이 이루어지지 않았다.
UV/Vis-스펙트럼(MeOH):
nm 단위의 λabs(M-1cm-1단위의 ε): 643(1.42?105) nm 단위의 λem: 668
폴리메틴 염료 Cy5E
Figure 112006090491092-pct00040
폴리메틴 염료 Cy5R 의 합성
Figure 112006090491092-pct00041
아세트산 무수물 50 ml에 용해된 알킬화된 인돌레닌 20 mmol 및 디아닐리드 10 mmol의 용액을 70℃로 가열하고, 천천히 트리에탄올아민을 한 방울씩 떨어뜨려 첨가한다. 염료는 과염소산을 이용하여 분리하고 흡인 여과한다. 재결정화를 위해, 소량의 메탄올에서 용해하고, 그 용액을 10배 용적의 디에틸에테르 내에 첨가하고 -40℃에서 결정화한다 (수율: 약 80％).
인돌레닌 유도체 TIPBr -
Figure 112006090491092-pct00042
도면
Figure 112006090491092-pct00043
도 1: MeOH에서 발색단 PA 2 (---), PB 2 (──) 및 P*B(…)의 흡수 스펙트럼
Figure 112006090491092-pct00044
도 2: pH = 10의 조건으로 NH3/H2O에서 안테나 리간드 PA 2 LH 4 (---), (PB 2 ) 2 L 2 H 6 (──) 및 P* BLH 4 (…)의 여기 스펙트럼
Figure 112006090491092-pct00045
도 3: H2O에서 [ EuP * BL ] - (──) 및 [ TbP * BL ] - (…)의 UV/Vis-스펙트럼
Figure 112006090491092-pct00046
도 4: H2O에서 [ EuP * BL ] - 의 규격화된 방출 스펙트럼
(여기 조건: λexc = 360 nm, 간격: 10/2.5 nm, dt = 0.07 ms, gt = 4.5 ms).
Figure 112006090491092-pct00047
도 5: H2O에서 [ TbP * BL ] - 의 규격화된 방출 스펙트럼
(여기 조건: λexc = 360 nm, 간격: 10/5 nm, dt = 0.08 ms, gt = 4.6 ms).
공여체들 [ EuP * BL ] - 및 [ TbP * BL ] - 의 모든 형광 측정은 설정된 시간 지연에 따라 실행하였다. 표준 설정은 아래와 같이 하였다.
[ EuP * BL ] - 의 경우: 여기 파장: λexc = 360 nm
여기 간격: 15 nm 방출 간격: 5 nm
방출 필터: 515 nm
시간 창문(gt): 4.50 ms
시간 지연(dt): 0.07 ms
[ TbP * BL ] - 의 경우: 여기 파장: λexc = 400 nm
여기 간격: 15 nm 방출 간격: 10 nm
방출 필터: 430 nm
시간 창문(gt): 4.60 ms
시간 지연(dt): 0.08 ms
Figure 112006090491092-pct00048
도 6: 수용체 (…)의 흡수, 내지 공여체 방출(-──) 및 수용체 방출(---)에 따라, pH = 10의 조건으로 NH3/H2O에서 이루어지는 [ EuP * BL ] - 및 ST936의 분광 특성
Figure 112006090491092-pct00049
도 7p: H2O 내에서 [ EuP * BLH 3 ]- EDACy5ENCS의 FRET 실험; 상승하는 수용체 농도에 따라 수정된 방출 스펙트럼
(C공여체 = 5?10-6M, C수용체 = 1.6?10-7M 내지 5.6?10-6M)
Figure 112006090491092-pct00050
도 8: C(IgG)=C(PA)=2.5×10-7M에 따른 형광 스펙트럼 (점선 = IgG, 실선 = IgG+PA)
Figure 112006090491092-pct00051
도 9: C(IgG)=C(PA)=8.2×10-7M에 따른 형광 스펙트럼 (점선 = IgG, 실선 = IgG+PA)
축약 명칭
Figure 112006090491092-pct00052
CDI: N,N'-카르보닐디이미다졸
CDD: N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드
EDA: 에틸렌디아민
FIA: 형광 면역 분석
phen: 페난트롤린
DMF-TEA: 디메틸포름아미드-트리에탄올아민

Claims (14)

  1. 하기 화학식의 에티닐아닐린.
    Figure 112011098432844-pct00053
    식 중,
    R1은 안테나 작용기이며, 상기 안테나 작용기는 하기 1,10-페난트롤린 (1), 플루오렌 (2), 아세토페논 (3), 벤조페논 (4), 플루오레논 (5), 크산톤 (6), 아자크산톤 (7), 안트라퀴논 (8), 아크리돈 (9), 퀴놀린 (10) 및 쿠마린 (11) 중 하나이고
    Figure 112011098432844-pct00059
    ;
    R2는 배위된 란타나이드(Ⅲ) 이온을 함유하는 킬레이트 형성제이며, 상기 킬레이트 형성제는 하기 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA) (하기 화학식에서 n=1인 경우), 트리에틸렌테트라아민 헥사아세트산 (TTHA) (하기 화학식에서 n=2인 경우)
    Figure 112011098432844-pct00060
    이거나, 또는
    하기 TTHA-이성질체 [니트릴로트리스(에틸렌니트릴로)] 헥사아세트산 (NTTHA)
    Figure 112011098432844-pct00061
    이되,
    TTHA-유도체는 3개의 카르복실레이트 기가 착물의 형성에 이용될 수 있도록, 안테나 작용기를 갖는 제2 에티닐아닐린을 함유할 수 있고;
    X는 -OH이거나, 또는 아미드 결합을 통해 킬레이트 형성제의 카르복실레이트 기에 결합하는 -NH(CH2)2NH2, -NH(CH2)2PhNH2, -NH(CH2)2PhNCS, -NH(CH2)nNH(C3N3Cl2) (여기서, n은 2 내지 6임) 및 -NH(CH2)2O(CH2)2NH2 중 하나이고;
    Y는 -H이거나, 또는 안테나 작용기에 결합하는 생물 분자에의 결합기이며, 이 결합기는 하기 중 하나이고
    Figure 112011098432844-pct00057
    ;
    상기 란타나이드(Ⅲ) 이온은 Eu3+, Tb3+, Dy3+ 및 Sm3+ 중 하나이다.
  2. 삭제
  3. 하기 화학식의 2-(4'-아미노페닐에티닐)-1,10-페난트롤린 (P*B).
    Figure 112011098432844-pct00062
  4. 2-클로로-1,10-페난트롤린을 p-에티닐아닐린과 가교 결합시켜 하기 화학식의 2-(4'-아미노페닐에티닐)-1,10-페난트롤린 (P*B)을 제조하는 방법.
    Figure 112011098432844-pct00063
  5. 하기 화학식의 2-(4'-아미노페닐에티닐)-1,10-페난트롤린 (P*B)을 포함하는 안테나 발색단.
    Figure 112011098432844-pct00064
  6. LH4가 디에틸렌트리아민 펜타아세트산을 나타내며, LH3, LH2, LH, L이 디에틸렌트리아민 펜타아세트산의 또다른 해리 형태를 나타내는 것인, 하기 화학식의 킬레이트 리간드 P*BLH4.
    Figure 112011098432844-pct00065
  7. 하기 화학식의 킬레이트 리간드 P*BLH4를 포함하는 안테나 리간드.
    Figure 112011098432844-pct00066
  8. 착물 [EuP*BL]-
    Figure 112011098432844-pct00067
    또는 착물 n-Bu4N[EuP*BL]
    Figure 112011098432844-pct00068
    .
  9. 착물 [TbP*BL]-
    Figure 112011098432844-pct00069
    또는 착물 n-Bu4N[TbP*BL]
    Figure 112011098432844-pct00070
    .
  10. P*BLH3-EDA
    Figure 112011098432844-pct00071
    또는 P*BLH3SP1
    Figure 112011098432844-pct00072
    .
  11. 안테나 착물 EuP*BL-EDA
    Figure 112011098432844-pct00073
    또는 안테나 착물 EuP*BL-SP1
    Figure 112011098432844-pct00074
    .
  12. 삭제
  13. 제1항에 따른 화합물을 링커 반응을 통해 생물 분자에 공유 결합시키고, 표지될 생물 분자로서 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, DNA 및 RNA와 같은 핵산, 올리고당류, 다당류, 당단백질, 인지질, 효소의 저분자 기질 및 단백질의 저분자 리간드의 물질 군으로부터 선택된 화합물을 사용하며, 분석물의 검출을
    a. 시간 분해 형광분석 (TRF) 방법에 따라 란타나이드(Ⅲ) 이온의 형광을 직접 측정하는 방법, 또는
    b. 측정 반응을 위해, 상기 생물 분자에 결합하는 폴리메틴 염료의 군으로부터 선택된 유기 염료를 첨가한 후에, 공여체 분자에 의해 유기 염료, 즉 수용체 분자 상으로 전이되는 에너지를, 수용체 분자의 형광 방출을 측정함으로써 결정하는 방법
    중 하나에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는, 생물 분자들을 정성 검출 및 정량 측정하기 위한 시간 분해 형광분석 (TRF) 또는 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 기재의 형광분석법.
  14. - 링커 에틸렌디아민 (EDA)을 고체로서 함유하는 안테나 리간드;
    - 표지를 위한 N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI) 또는 N-에틸-N'-(3-디아미노프로필)-카르보디이미드 (CDD) 및 트리에탄올아민/HCl 완충액;
    - 10-3 mol/l의 수용액으로서 Eu(Ⅲ) 클로라이드;
    - 필요에 따라 이차 항체, 또는 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하는, 고체로서 산 작용기를 갖는 Cy5 염료로 구성되며, 이때
    - 안테나 리간드로서, LH4가 디에틸렌트리아민 펜타아세트산을 나타내며, LH3, LH2, LH 및 L이 디에틸렌트리아민 펜타아세트산의 또다른 해리 형태를 나타내는 것인 하기 화학식의 P*BLH4
    Figure 112011098432844-pct00075
    를 사용하며,
    - 산 작용기를 갖는 Cy5 염료가
    Cy5P
    Figure 112011098432844-pct00076
    ,
    Cy5BA
    Figure 112011098432844-pct00077
    ,
    Cy5E
    Figure 112011098432844-pct00078
    , 또는
    Cy5eNCS
    Figure 112011098432844-pct00079
    이며,
    - 여기 파장(λexc)이 360 nm이고 검출 파장(λem)이 665 nm인,
    제1항에 따른 에티닐아닐린을 사용하는 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 생물분석법.
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