CN113514437A - 一种肾上腺素的高灵敏荧光检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，包括以下步骤：S1：将乙二胺添加至缓冲液中，获得第一混合液；S2：在所述第一混合液中，加入肾上腺素溶液得到第二混合液；S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；S4：通过光谱仪收集所述第三混合液在330nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算肾上腺素的浓度。另一方面，本发明还提出一种用于肾上腺素的高灵敏荧光检测的试剂盒：包括缓冲液、乙二胺，所述试剂盒通过所述肾上腺素的高灵敏荧光检测方法实现对肾上腺素的检测。

Description

一种肾上腺素的高灵敏荧光检测方法及试剂盒
技术领域
本申请涉及化学检测领域，尤其涉及一种肾上腺素的高灵敏荧光检测方法及试剂盒。
背景技术
肾上腺素(adrenaline,Ep)是由人体分泌出的一种激素和神经递质，由肾上腺释放，肾上腺素作为重要的神经递质和激素，由于其强大的生理特性和药理功能，已被研究多年。相关药物常用于高血压、器质性心脏病、支气管哮喘、心肌梗死和心脏手术。尿和血浆中Ep异常浓度水平已被用于诊断和评价神经、精神和心血管疾病的治疗和药理作用。当前，已经有许多检测生物样品中肾上腺素的方法被提出，例如毛细管电色谱、HPLC-MS、UPLC-MS/MS和亲水相互作用色谱与电化学检测。然而，这些方法需要昂贵的仪器、专业和费力的操作。因此，迫切需要开发能够同时检测肾上腺素的简单、选择性和灵敏的方法。
发明内容
基于以上问题，本发明提出了一种肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，包括以下步骤：
S1：将乙二胺添加至缓冲液中，获得第一混合液；
S2：在所述第一混合液中，加入肾上腺素溶液得到第二混合液；
S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
S4：通过光谱仪收集所述第三混合液在330nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算肾上腺素的浓度。
在其中一个实施例中，所述缓冲液选自伯瑞坦-罗宾森、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的任意一种，所述缓冲液的pH值为7.0～12.0。
在其中一个实施例中，所述第一混合液中乙二胺的浓度为1M-1.5M。
在其中一个实施例中，步骤S3的加热温度为30℃-60℃。
在其中一个实施例中，步骤S3的加热时间不小于8分钟。
在其中一个实施例中，形成所述第一混合液之前，还包括步骤S1a：向所述缓冲液中加入参比物。
在其中一个实施例中，所述参比物为荧光金纳米团簇、荧光碳点、荧光硅量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下显蓝色。
在其中一个实施例中，所述参比物在反应体系中的浓度为0.01mg/mL-0.4mg/mL。
这种检测方法简单高效，仅通过乙二胺在特定pH值缓冲液中形成的混合液即可实现对肾上腺素的快速、高灵敏检测，成本低，效率高，具有广阔的应用前景。
另一方面，本发明还提出一种用于肾上腺素的高灵敏荧光检测的试剂盒：包括：缓冲液、乙二胺，所述试剂盒通过权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法实现对肾上腺素的检测。
在其中一个实施例中，还包括参比物，所述参比物为荧光金纳米团簇、荧光碳点、荧光硅量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下显蓝色。
这种试剂盒仅通过乙二胺和缓冲液，再结合常用的光谱仪设备，即可实现对肾上腺素的快速、高灵敏检测，成本低，效率高，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明：
图1示出了对肾上腺素最佳检测条件(a)不同pH值，(b)EDA浓度，(c)温度和(d)反应时间；
图2单发射法检测不同浓度(a)肾上腺素的荧光光谱，(b)相应的荧光强度与肾上腺素浓度的变化曲线；
图3示出了检测肾上腺素过程中生成荧光材料的(a)紫外-可见吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱，(b)TEM图像及其尺寸分布；
图4示出了检测肾上腺素过程中生成荧光材料的(a)红外光谱，(b)核磁共振氢谱；
图5示出了检测肾上腺素过程中生成荧光材料的质谱；
图6示出了检测肾上腺素过程中生成荧光材料的(a)C 1s、(b)N 1s和(c)O 1s的高分辨率XPS；
图7示出了检测肾上腺素的特异性实验数据；
图8示出了双发射法检测不同浓度(a)肾上腺素的荧光光谱，(b)相应的荧光强度与肾上腺素浓度的变化曲线。
具体实施方式
为了更详细地阐明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明的技术方案做进一步阐述。
在本申请中，提出了一种高效的、低成本且高灵敏度的对肾上腺素的检测方法，首先通过以下的步骤确定对肾上腺素的检测限：
将乙二胺添加至缓冲液中，获得多组第一混合液；在多组所述第一混合液中，分别加入不同浓度肾上腺素溶液得到第二混合液；随后，加热使各组所述第二混合液反应后得到多组第三混合液；通过光谱仪收集各组所述第三混合液在330nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算肾上腺素的检测限。参见图1，通过调节这个过程中的乙二胺浓度、缓冲液pH值、加热反应温度或加热反应时间，确定了灵敏度最高的检测条件。在大量的探索实验中，参考图1a，当探究最佳缓冲液的pH条件时，乙二胺的浓度为1.5M，加热反应的温度为45℃，加热反应时间为10min；参考图1b，当探究最佳乙二胺浓度时，缓冲液的pH值为12.0，加热反应温度为45℃，加热反应时间为10min；参考图1c，当探究最佳加热反应温度时，缓冲液的pH值为12.0，乙二胺的浓度为1.5M，加热反应时间为10min；参考图1d，当探究最佳加热反应时间时，缓冲液的pH值为12.0，乙二胺的浓度为1.5M，加热反应温度为45℃。最终可以确定的是，在缓冲液的pH值为7.0-12.0、乙二胺的浓度为1M-1.5M、加热反应温度为30℃-60℃，检测时间不小于8分钟的条件下对肾上腺素的检测限最低，即检测灵敏度最高，其中，在缓冲液的pH值为12.0，乙二胺浓度为1.5M，加热反应温度为45℃，检测时间为10分钟时，检测灵敏度和检测效率最佳。
具体地，结合探究实验的最优结果，经过以下的实验确定肾上腺素的检测限：在400μL、pH值为12.0的伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson，BR)缓冲中加入50μL、浓度10M的EDA溶液，最后加入50μL不同浓度的肾上腺素溶液。将混合均匀后的样品置于45℃的气浴中反应10min，通过光谱仪收集各组反应后的物质在330nm激发光下的发射峰强度，计算对肾上腺素的检测限。结合图2可以看出，随着肾上腺素浓度的不断增加，生成的Y-PENPs也不断增加，引起了位于517nm处的荧光强度不断增强。图2a内插图是不同浓度样品在365nm的紫外灯下的图片。由图2b可知，当肾上腺素的浓度在0.1-10μM范围内，浓度和荧光响应具有一定的线性关系，线性方程回归是(F-F0)/F0＝562.92[DEp]-0.11(R2＝0.998)。利用检出限公式(LOD＝3N/S，N表示空白数据的标准偏差，S表示回归线的斜率)计算对肾上腺素的检测限低至115.8nM。
图3a为检测肾上腺素过程中生成的荧光物质的紫外-可见光吸收光谱(黑色实线)、荧光激发光谱(虚线)和荧光发射光谱(灰色实线)。参阅图3a可知，反应生成的肾上腺素聚合物荧光材料(Y-PENPs)在330nm的最佳激发下，在517nm处显示出最大发射波长。同时，图3b的TEM图也可以证明荧光纳米材料Y-PENPs(2.04nm)的成功制备。证明本发明中的检测方法能够用于检测肾上腺素。
结合图4，我们利用傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱对肾上腺素和最终产物进行了对比分析，从红外光谱(图4a)中可以明显看出，与肾上腺素相比，荧光产物的光谱在1040cm-1产生了一个新的特征峰，这归因于C-N的不对称拉伸振动，表明芳环和胺基之间可能发生迈克尔加成反应，而1640cm-1处新的特征峰则归属于C＝N键的拉伸振动，暗示席夫碱产物的形成。结合图4b相关的核磁共振氢谱展示了荧光物质产生新的特征峰，属于＝N-CH2和N-CH2-CH2-N质子，也进一步证明席夫碱产物的形成以及乙二胺与肾上腺素之间的相关反应。
为了进一步确定反应后生成荧光材料的化学结构，进行了质谱检测分析，参阅图5，可以看出200.03m/z的离子峰片段正好对应Y-PENPs可能的化学结构，说明推测的反应过程和反应产物的结构是正确的。同时，为了表征荧光产物的元素和化学成分，还进行了XPS检测表征，参阅图6，经过对XPS数据进行分峰拟合处理，发现Y-PENPs的结合能和我们推断的反应原理相符合。此外，Y-PENPs同时具有C＝N特殊峰，也进一步能够证明席夫碱反应的产生。
传感平台要真正实现真实样品的检测，不仅需要较高的灵敏度，更需要具有较高的选择性。为了评估开发的传感平台在实际应用中的可行性，我们对真实场景中可能存在的一些干扰分子(5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、抗坏血酸(AA)、葡萄糖及各种氨基酸)进行了研究。其中，干扰分子的浓度是所检测Ep浓度的5倍，其余实验条件均一致。图7显示的是不同物质516nm处的荧光强度的柱状图，明显观察到所构建的检测平台在对肾上腺素进行检测时不会受到相似干扰物微不足道的影响。
另外，为了提高检测的灵敏度并实现半定量的可视化检测，我们根据肾上腺素检测结果所呈现的特点，在检测过程中引入荧光金纳米团簇、荧光硅量子点，荧光碳量子点(均在365nm的紫光光照下显蓝色)作为内部参照构建了比率检测平台。如图8所示，引入碳量子点参比物后，正如所期望的那样，构建的比率荧光传感平台表现出多种变化趋势，实现了裸眼直接半定量检测目标分析物的目的。在蓝色荧光碳量子点的存在下，随着肾上腺素浓度的增加，碳量子点位于432nm处的荧光不断减弱，而Y-PENPs位于517nm处的荧光不断增加，最终反应的颜色由蓝色到黄色渐变。肾上腺素的浓度在0-10μM范围内，线性方程回归是F517/F432＝13.12[DEp]+0.17(R2＝0.992)，检出限是18.9nM(图8)。和前述单一荧光探针相比，检测灵敏度进一步显著的提高，并能够实现裸眼半定量检测的目的。
根据上述对肾上腺素的检测条件的探究，本发明提出一种对肾上腺素的高灵敏度检测方法，包括以下步骤：
S1：将乙二胺添加至缓冲液中，获得第一混合液；
S2：在所述第一混合液中，加入肾上腺素溶液得到第二混合液；
S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
S4：通过光谱仪收集所述第三混合液在330nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算肾上腺素的浓度。
这种方法仅通过乙二胺这种简单、廉价易得的物质即可对肾上腺素实现快速的高灵敏检测，检测限可以低至115.8nM。同时，根据上述探究实验可以知道，在对肾上腺素的检测过程中，缓冲液的pH值优选为7.0-12.0，进一步优选地，缓冲液选自伯瑞坦-罗宾森、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的任意一种均可；第一混合液中乙二胺的浓度优选为1M-1.5M；加热反应温度优选为30℃-60℃；加热反应时间优选为大于8分钟。
进一步地，本发明中提出的对肾上腺素的检测方法，还可以在步骤S1中包括S1a：向所述缓冲液中加入参比物。优选地，这些参比物为荧光金纳米团簇、荧光碳点、荧光硅量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下显蓝色。优选地，参比物在反应体系中的浓度为0.01mg/mL-0.4mg/mL。
引入参比物可以进一步提高对肾上腺素的检测灵敏度，并且可以实现对肾上腺素的可视化半定量检测。
在另一方面，本发明还根据上述对肾上腺素的检测方法提出一种试剂盒，用于执行上述检测步骤以实现对肾上腺素的检测，试剂盒包括乙二胺和缓冲液即可，再结合简单的光谱仪设备即可完成对肾上腺素的高效、高灵敏度检测。
相应的，为了提高检测的效果，试剂盒中还可以包括上述参比物，参比物可以是在紫外光照下显蓝色的任意荧光物质，优选地，可以是荧光金纳米团簇、荧光硅量子点，荧光碳量子点等。
以下结合实施例对本申请中提出的方案的检测效果进行描述：
实施例1：
对血清中和尿液中的肾上腺素分别进行检测：
向390μL、pH值为12.0的BR缓冲中依次加入50μL、浓度为10M的乙二胺溶液，随后加入10μL、浓度为50mg/mL的碳量子点(BCDs)溶液，最后加入用血清或尿液配置的50μL以及已知浓度的肾上腺素溶液。将混合均匀后的样品置于45℃的气浴中反应10min。收集330nm激发光下的发射峰强度。
表1血清及尿液样品中肾上腺素的检测
Figure BDA0003130293480000081
Figure BDA0003130293480000091
检测结果如表1中所示，肾上腺素在血清和尿液中该检测的回收率都在97.5-107.3％的范围内，且相对标准偏差都≤2.1。这一结果说明我们开发的比率荧光传感平台在真实样品的检测中具有较高的准确性。
最后，应当予以说明的是：以上所述实施例仅仅是本发明为清楚地说明本发明所作的较佳举例，但这并不是对本发明的实施方案的限制，所属领域的普通技术人员应当理解，以上方案中技术特征可以任意组合，在上述具体实施方式的基础上还可以做出其它不同形式的修改或对部分技术特征进行同等替换，这里无法对所有的实施方式予以穷举，因而，凡在本发明的精神和原则之内，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的所有的任何修改、改进、等同替换等等，都应处于本发明请求保护的技术范围之内。

Claims (10)

1.一种肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将乙二胺添加至缓冲液中，获得第一混合液；
S2：在所述第一混合液中，加入肾上腺素溶液得到第二混合液；
S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
S4：通过光谱仪收集所述第三混合液在330nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算肾上腺素的浓度。
2.根据权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，所述缓冲液选自伯瑞坦-罗宾森、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的任意一种，所述缓冲液的pH值为7.0～12.0。
3.根据权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，所述第一混合液中乙二胺的浓度为1M-1.5M。
4.根据权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，步骤S3的加热温度为30℃-60℃。
5.根据权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，步骤S3的加热时间不小于8分钟。
6.根据权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，形成所述第一混合液之前，还包括步骤S1a：向所述缓冲液中加入参比物。
7.根据权利要求6所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，所述参比物为荧光金纳米团簇、荧光碳点、荧光硅量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下显蓝色。
8.根据权利要求7所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法，其特征在于，所述参比物在反应体系中的的浓度为0.01mg/mL-0.4mg/mL。
9.一种用于肾上腺素的高灵敏荧光检测的试剂盒：其特征在于，包括：缓冲液、乙二胺，所述试剂盒通过权利要求1所述的肾上腺素的高灵敏荧光检测方法实现对肾上腺素的检测。
10.根据权利要求9所述的用于肾上腺素的高灵敏荧光检测的试剂盒，其特征在于，还包括参比物，所述参比物为荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下显蓝色。
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