KR101161346B1

KR101161346B1 - 항산화, 항염증 및 미백에 유효한 싸리나무 성분의 추출방법

Info

Publication number: KR101161346B1
Application number: KR1020100008582A
Authority: KR
Inventors: 박승춘; 장승희; 최명진; 이중수; 이삼빈
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2012-07-02
Also published as: KR20110088868A

Abstract

본 발명은 항산화, 항염증 및 미백 효과를 갖는 싸리나무 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 다단계 추출법을 이용하여 항산화 및 항염증 효과가 가장 좋은 추출물을 고농도로 획득하는 방법 및 그 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 추출방법은 70% 메탄올(methanol), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등을 순차적으로 이용하여 목적하는 싸리나무의 추출물을 얻는 것을 특징으로 한다.

Description

항산화, 항염증 및 미백에 유효한 싸리나무 성분의 추출방법{The extracting method of compositions having anti-oxidant effect, anti-inflammatory effect and whitening effect from Lespedeza bicolor}

본 발명은 항산화, 항염증 및 미백 효과를 갖는 싸리나무 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 다단계 추출법을 이용하여 항산화 및 항염증 효과가 가장 좋은 추출물을 고농도로 획득하는 방법 및 그 추출물에 관한 것이다.

발명자들은 본 발명에서 다단계 추출법을 이용해 여러 가지 추출물을 획득한 다음 그 효과와 그 추출물의 구성성분을 분석하였다.

본 발명에 따라 얻어지는, 위의 효과를 갖는 싸리나무 추출물은 기능성 생산품의 조성물로서 다양하게 이용할 수 있다.

싸리나무(Lespedeza bicolor)는 콩과에 속하는 다년생 낙엽관목으로서, 그 높이가 1.2~3m에 달한다. 본래 일본에서 자랐으나 현재 북미와 동아시아에서도 서식한다. 기원적 형태학적 특성으로 볼 때, 싸리나무는 19개의 표현형으로 분류되며 7개의 생장특성을 가지고 있다.

싸리나무는 주로 조류의 사료로 이용되었으며, 토양을 비옥하게 하는 데에도 사용되었다. 또한 이것의 잎을 차로 만들어 마시거나 음료의 재료로 사용하였고, 전통 중국 약재로서도 사용되었다. 그중 싸리나무의 잎과 씨앗과 열매는 급ㅇ만성 신장염, 고질소혈증, 이뇨작용에 사용되기도 하였다.

근래 들어 싸리나무의 형태학적 기원의 분류와, 알루미늄(aluminium) 독성과 생장관계의 연구 등을 통해 생물학적 기원과 싸리나무 각각의 종과 토양과의 관계가 밝혀져 왔으며, 최근에는 이보다 싸리나무가 미치는 생리학적 기능에 더 많은 연구관심이 모여지고 있다.

그 일례로서, 싸리꽃 에탄올 추출물이 멜라닌 합성 억제를 하여 미백 효과를 가진다는 결과가 있고, 싸리나무의 꽃과 잎, 그리고 뿌리의 에스트로겐 생성능력에 관한 연구를 통해 뿌리부분의 추출물이 에스트로겐 생성활성을 가진다는 점이 보고되었다. 또한 싸리나무가 녹차와 같이 항알러지 효과와 항산화 효과를 가진다는 점에 대한 보고가 있는데, 싸리나무의 항산화 효과에 대한 연구는 열수추출법, HPLC 분석을 이용한 분자구조에 따른 분획 또는 분획추출법을 통해 이루어졌다. 그 외 싸리나무는 항산화 효과와 더불어 항균작용을 가지고 있음이 밝혀지고 있으며 항염증 작용을 하는 것으로 알려지고 있다.

싸리나무에 관한 성분 분석에 대해서도 연구가 이루어져, 싸리나무의 줄기의 일반성분으로는 탄수화물이 가장 높으며, 그 외 수분, 조단백질, 조회분, 조지방으로 이루어져 있음이 밝혀졌다. 싸리나무 줄기껍질의 성분을 보면, 7,4-dihydroxy-2-methoxy-6-geranylisoflavanone 0.053%로 이루어져 있으며, 적목질은 daidzein 과 isoliquirigenin으로 이루어져 있다는 연구결과가 있다.

이러한 연구를 바탕으로, 싸리나무는 한방고추장의 재료로서 사용되거나(공개특허 10-2008-0009798), 약초 간장과 된장에도 사용되고 있다(공개특허 특2003-0044158). 또한 싸리나무를 주재료로 하는 음료가 생산되고 있으며(등록특허 10-2009-0083032), 구운 싸리나무를 이용한 삼계탕이 한방보양식으로 특허 등록되었다(등록특허 10-0499927). 또한 싸리나무 추출물을 이용한 미백 효과와 항염증 피부자극 완화효과를 가지는 화장료 조성물(등록특허 10-0563547)과 아토피 피부용 화장료 조성물(공개특허 10-2008-0079740) 등이 있다.

그러나 위와 같은 상황에도 불구하고 싸리나무에 관한 연구는 주로 외국에서 이루어져 우리나라에서는 싸리나무 관련 정보가 아직 미흡한 실정이며, 싸리나무의 사용 또한 즙을 내거나 열수추출을 하는 단계에 머물고 있다.

따라서 본 발명에서는 다단계 추출법을 이용한 특정 분획 추출물을 사용하여, 항산화, 항염증 및 미백 효과가 탁월한 추출물의 제조공법을 완성하고, 생리적 활성효과를 갖는 물질을 분석하여 정의하였다. 특히, 본 발명자들이 안출한 ethyl acetate 추출물(EE)은 열수추출물(WE)에 비해 항산화, 항염증 및 미백 효과 등이 탁월한바, 본 발명은 기존의 열수 추출물과 차별화된 추출법으로서 발명자들이 실험해본 결과, 기존에 항산화와 항염증 효과가 알려진 vitexin과 미백 효과를 가진 Haginin을 동시에 고농도로 다량 추출할 수 있는 이점을 갖는 것으로 확인되었다.

위에서 설명한 바에 의해 어느 정도 드러났지만, 본 발명의 목적은 싸리나무로부터 항산화 및 항염증 효과, 나아가 미백 효과를 갖는 성분을 고농도로 추출하는 방법을 제공하는 데 있다.

이들 위해 발명자들은 싸리나무로부터 다단계 추출법을 이용하여 분획 추출물을 획득하고 이를 이용하여 탁월한 생리활성 효과를 기대하는 기능성 제품의 생산을 도모하고자 하였다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은,

그늘에서 말린 싸리나무 200g에 70% 메탄올(methanol)을 1500ml의 비율로 혼합한 다음, 이를 농축하여(메탄올 제거) 메탄올 추출물(ME)을 얻는 단계;

상기 메탄올 추출물(ME)에 같은 부피의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 분획에 의해 클로로포름 추출물(CE)을 얻는 단계;

상기 분획물 중 클로로포름 추출물(CE) 이외의 나머지 분획물 부분에 그 분획물과 같은 부피의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 분획에 의해 에틸아세테이트 추출물(EE)을 얻는 단계;로 이루어지는,

항산화, 항염증에 유효한 싸리나무 성분의 추출방법인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 추출방법에 의하여 획득되는 항산화, 항염증에 유효한 싸리나무 성분의 추출물임을 특징으로 한다.

본 발명은 기존의 싸리나무 성분 추출법과 전혀 차별화된 방법으로, 항산화 및 항염증 효과, 그리고 나아가 미백 효과 등 우수한 생리활성을 갖는 추출방법을 제시함과 아울러 그 추출물의 구성성분을 정의한 것으로, 이를 이용하여 생리활성 효과를 기대하는 기능성 제품의 생산을 도모할 수 있다.

제1도는 본 발명에 따른 다단계 추출법을 이용한 싸리나무 분획별 추출 방법에 관한 도표이다.

본 발명은 항산화, 항염증 및 미백 효과 등 우수한 생리활성을 갖는 싸리나무의 추출물의 획득과 함께 그 추출물의 구성성분을 정의한 것인바, 본 발명을 실시예와 함께 더욱 상세히 설명한다.

[싸리나무의 획득] 그늘에서 일주일간 말린 싸리나무 200g에, 70% 메탄올(methanol)을 1500ml 혼합한 다음, 이를 농축하여(메탄올 제거) 메탄올 추출물(ME)을 얻었다.

그다음 이 메탄올 추출물(ME)에 도 1과 같이 동량(같은 부피)의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 24시간 동안 정치시켜 분획에 의해 클로로포름 추출물(CE)을 얻었다. 그리고 분획물 중 클로로포름 추출물(CE) 이외의 나머지 부분에 동량(같은 부피)의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 마찬가지로 24시간 동안 정치시켜 분획에 의해 에틸아세테이트 추출물(EE)을 얻었다. 그리고 역시 에틸아세테이트 추출물(EE) 이외의 나머지 부분에 동량(같은 부피)의 n-부탄올(n-butanol)을 첨가하여 24시간 동안 정치시켜 분획에 의해 n-부탄올 추출물(BE)과 그 나머지 부분인 물 추출물(WE)을 얻었다. 이후 건조시켜 DMSO로 녹여 시험을 실시하였다.

[세포 배양] 마우스 대식세포인 RAW264. 7 세포는 한국세포주 은행에서 구했으며, 10% FBS와 2mM L-glutamine, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin 이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 계대하였다. 세포 배양은 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양되었다.

[실시예 1] 세포독성시험과 NO assay는 적정 싸리나무 분획 추출물의 농도에서 항염증 효과를 측정하기 위해 시행되었다. 세포독성시험은 MTT assay로 시행되었으며, RAW264. 7 세포(5×10⁴cells/ml)에 시료를 24시간 처리한 후, 배양 배지를 새 배지로 바꾸고 2mg/ml MTT 시약을 10ul 첨가하였다. 4시간 후에, 배지를 제거한 후 200μl DMSO를 첨가하여 formazan 생산물을 녹이고, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

NO assay는 RAW264. 7 세포(2×10⁵cells/ml)에 여러 가지 농도의 시료를 30분간 전처리한 후, Lipopolysaccharide (LPS) 0.5μg/ml을 24시간 처리하였다. 그후 세포 배양 배지 100μl를 96well plate에 옮기고, Griess reagent A와 B를 빛을 차단하여 각각 50μl씩 10분 간격으로 첨가하였다. 흡광도는 540nm에서 측정하였으며, sodium nitrite로 표준곡선을 산출하였다.

세포독성시험과 NO assay의 결과판정은 흡광도 값에 의해 확인되었다. 이는 다음 그래프(Fig. 1)와 같다.

세포독성시험에서 싸리나무 메탄올 추출물(ME) 전처리 후 LPS 처리한 군은 LPS만 처리한 군에 비해 세포 생존률이 높았지만, 대조군보다는 낮았다(Fig. 1A). 또한 NO assay에서 RAW264. 7 세포에서 LPS (0.5μg/ml)를 24시간 동안 처리하였을 때, NO 발생이 유의적으로 증가되었으며, ME 전처리 후 LPS 처리군의 NO 발생이 농도-의존적으로 감소됨을 알 수 있었다(Fig. 1B). 이것은 ME의 NO 발생 억제 효과가 그것의 세포독성에 의한 것이 아님을 알려 주며, 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포의 NO 발생의 감소가 염증의 억제 지표임을 볼 때, ME는 염증억제 작용을 하는 것으로 볼 수 있다.

Fig. 1A 및 1B. 싸리나무의 추출물 중 메탄올 추출물이 RAW264. 7세포에서 세포독성과 NO 생산에 미치는 영향[basal은 대조군으로서 샘플 미처리 군이며, 0, 25, 50, 100, 200은 메탄올 추출물(ME)의 농도가 각각 0μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml, 200μg/ml인 경우에 대해 LPS를 처리한 실험군이다.]

여러 가지 분획 추출물인 클로로포름 추출물(CE), 에틸 아세테이트 추출물 (EE), n-부탄올 추출물(BE), 물 추출물(WE)을 이용하여 세포독성시험을 실시한 결과(Fig. 2A), CE가 50μg/ml 농도에서 유의적인 세포독성작용을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 또한, NO assay에서(Fig. 2B), CE와 EE가 50μg/ml 농도에서 NO 발생을 억제하였다. 따라서 발명자들은 세포독성이 없고 NO 발생을 억제시켜 항염증 작용을 가지는 EE를 중점적으로 효과 검정하기로 하였다. 그리고 Fig. 3B와 같이 EE가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 발생을 농도의존적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 2A 및 2B. 여러 가지 싸리나무 다단계 추출물이 RAW264. 7세포에서 세포독성과 NO 생산에 미치는 영향

Fig. 3A 및 3B. 싸리나무의 추출물 중 에틸 아세테이트 추출물이 RAW264. 7세포에서 세포독성과 NO 생산에 미치는 영향

[실시예 2] Transient transfection과 luciferase reporter assay : 위의 NO assay에서 EE가 NO 생성을 억제하여 염증을 억제한다는 사실을 토대로, 이것의 메카니즘을 알아보기 위해 iNOS, COX-2, TNF-α와 같은 염증 관련 사이토카인을 전사시키는 요인인 NF-κB의 활성 정도를 측정하기 위해 Transient transfection 과 luciferase reporter assay를 시행하였다. 그 방법은 다음과 같다.

RAW264. 7세포(4×10⁵cells/ml)가 세포 계대 플레이트에 80% 정도 자랄 때까지 배양한 후, 대조군과 벡터를 FuGENE

HD를 이용하여 주입하였다. 세포는 pTK-RL로 감염시킨 후, 감염된 세포를 24well plate에 2×10⁵cells/ml로 계대하였다. LPS 0.1μg/ml로 24시간 처리 후, PBS로 세척하고 lysis buffer로 추출하여 Dual Luciferase assay system (Promega, Madison, WI)로 luciferase 활성을 측정하였다.

pTAL-Luc 벡터 처리군은 음성대조군으로 사용되었으며, EE의 전처리 유무에 따른 pTAL-Luc 벡터 처리군의 NF-κB promoter 활성 수준은 차이가 없었다. NFκB 처리한 군 중 LPS 처리군의 NF-κB promoter 활성 수준을 100%로 볼 때, 대조군의 NF-κB promoter 활성 수준값은 7.37±2.99%로 환산되었다. 또한, EE의 전처리군에 NFκB를 첨가하였을 때, 농도-의존적으로 NF-κB promoter 활성 수준값이 감소함을 알 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4. 싸리나무의 에틸 아세테이트 추출물이 NFκB promoter에 미치는 영향

[실시예 3] 싸리나무의 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH 법에 의한 free radical 소거능을 측정하였다. 그 방법은 다음과 같다.

96well plate에 10μl 시료를 분주하고, 200μl DPPH를 첨가하여 37℃에서 30분동안 방치한 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. free radical 소거능 산출식은 다음과 같다.

Free radical 소거능 (%) = (1-((Sd-Se) / C)) × 100

Sd는 시료와 DPPH가 반응한 흡광도 값이며, Se는 에탄올과 시료가 반응한 흡광도 값이다. C는 DPPH와 에탄올과의 반응 흡광도 값으로, IC₅₀값은 50% free radical 소거능을 의미한다.

싸리나무에서 얻어진 모든 분획을 여러 가지 농도로 free radical 소거능을 측정한 결과, Fig. 5와 같은 농도-의존적인 곡선을 얻을 수 있었으며, EE, BE, ME, CE, WE의 IC₅₀값은 112.45, 141.01, 209,65, 340.97, 689.31 μg/ml으로 양성대조군인 ascorbic acid 의 IC₅₀값인 31.77μg/ml 보다 높았다.

Fig. 5. DPPH 법에 의한 여러 가지 싸리나무 추출물의 free radical 소거능

[실시예 4] 싸리나무의 미백 활성을 알아보기 위해 tyrosinase 활성 억제를 측정하였다. 그 방법은 다음과 같다.

0.1M phosphate buffer (pH 6.5)150, 1.5mM L-tyrosine 38μl에 2,100 unit/ml mushroom tyrosinase(0.05M, pH 6.0)을 10μl를 섞은 후 sample 3μl를 첨가하여 반응 전과 1시간 동안 25℃에서 1시간 반응시킨 후 470nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해율 산출식은 다음과 같다.

저해율 (%) = [(D-C)-(B-A)] / D-C × 100

A : 저해제를 넣은 것의 반응 전 흡광도

B : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도

C : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 전 흡광도

D : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도

싸리나무 다단계 추출물의 tyrosinase 활성 억제 정도는 Fig. 6에 나타내었다. 모든 싸리나무 다단계 추출물은 농도-의존적으로 tyrosinase 활성을 억제하였으며, 특히 EE는 확연하게 tyrosinase 활성을 억제하여, 억제율은 1000μg/ml에서 94.12±0.87%, 100μg/ml에서 76.99±1.29%이었다.

Fig. 6. 여러 가지 싸리나무 분획 추출물의 tyrosinase 억제 정도

Tyrosinase의 동역학 연구에서(kinetic study) EE는 버섯유래 tyrosinase 활성의 K_m값을 증가시켰으며, V_max값(△A₄₉₂/min)은 변화시키지 못했다(Fig. 7). 이것은 EE가 버섯유래 tyrosinase의 경쟁적 억제제라는 것을 의미한다.

Fig. 7. 싸리나무의 에틸 아세테이트 추출물 (0, 10, 30㎍/ml)과 tyrosinase의 Lineweaver-Burk plot.

[실시예 5] 싸리나무 추출물중의 하나인 EE가 위와 같은 여러 가지 생리활성 기능을 가지고 있다는 결과를 토대로, 이러한 기능을 하는 성분을 분석하고자 LC-MS assay를 수행하였다. 그 방법은 다음과 같다.

LC/MS 분석은 Varian 500MS (ESI-ion trap mode) mass spectrometer와 Agilent 1100 series liquid chromatograph system (Agilent, USA)로 실시하였다. Varian, chromsep 150×2.0mm Pursuit XR-3μm-C₁₈column를 이용하여 0.2ml/min 이동상에서 40℃를 유지하여 mobile phase A(0.1% formic acid가 포함된 물)와 B(0.1% formic acid가 포함된 acetonitrile)을 사용하였다. 처음 2분간은 95% A와 5% B로 mobile phase를 설정한 뒤, 점차 A의 함량을 0%까지 감소시킨 후, 다시 A의 함량을 95%로 증가시켰다.

싸리나무의 구성성분은 254nm 흡광도와 ESI-MS에서 측정되었다. Fig. 8에서 EE의 주로 구성성분은 Vitexin 과 Haginin A, B 와 C인 것을 알 수 있었다.

Peaks: 1, not identified; 2, not identified; 3, Vitexin; 4, Haginin A; 5, Haginin C; 6, Haginin B; 7, not identified;

Fig. 8. 싸리나무의 에틸 아세테이트 추출물의 LC/MS 분석

Claims

그늘에서 말린 싸리나무 200g에 70% 메탄올(methanol)을 1500ml의 비율로 혼합한 다음, 이를 농축하여(메탄올 제거) 메탄올 추출물(ME)을 얻는 단계;와,
상기 메탄올 추출물(ME)에 같은 부피의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 분획에 의해 클로로포름 추출물(CE)을 얻는 단계;를 시행한 후,
상기 분획물 중 클로로포름 추출물(CE) 이외의 나머지 분획물 부분에 그 분획물과 같은 부피의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 분획에 의해 본 공정의 최종 목적물인 에틸아세테이트 추출물(EE)을 얻는 단계;로 이루어지는,
항산화, 항염증 및 미백에 유효한 싸리나무 성분의 추출방법.
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