KR102574891B1 - 싸리나무 추출물을 포함하는 임플란트 주위염 치료 및 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따른 싸리나무 추출물을 포함하는 임플란트 주위염 개선용 조성물에 의하면, 항염효과 및 구강 미생물에 대한 항균효과를 우수하게 하여, 임플란트 주위염의 증상을 치료 및 개선할 수 있다. 나아가, 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 임플란트 주위염 개선용 코팅 조성물을 제공할 수 있다.

Description

싸리나무 추출물을 포함하는 임플란트 주위염 치료 및 개선용 조성물{Composition for treating and improving peri-implantitis containing Lespedeza bicolor extract}
본 발명은 싸리나무 추출물을 포함하는 임플란트 주위염 치료 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 우수한 항염 및 항균효과를 나타내는 천연 추출물인 싸리나무 추출물을 이용하여 임플란트 주위염을 개선하고, 턱뼈와 임플란트 본체 표면 사이의 효과적인 골 유착(osseointegration)을 유도할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
임플란트(implant)란, 상실된 인체 조직을 회복시킬 수 있도록 체내에 이식되는 기구를 통틀어 일컫는 용어로서, 특히 치과용 임플란트는 치아의 결손이 있는 부위나 치아를 뽑은 자리의 턱뼈에 골 이식, 골 신장술 등의 부가적인 수술을 통하여 부피를 늘린 후, 생체 정합적인 임플란트 본체를 심어서 자연치의 기능을 회복시 켜주는 치과 치료 시술이다.
임플란트를 이용한 시술 또는 치료를 통하여 치아 본연의 기능 및 심미적 기능을 회복하기 위하여는 임플란트 본체 표면과 턱뼈 사이에 긴밀한 골 유착(osseointegration)이 요구된다.
임플란트의 기능 회복과 안정적인 골 유착(osseointegration)에 영향을 주는 요소로서, 임플란트의 재질, 디자인, 표면 특성, 골량 및 골질, 외과적 시술, 하중 조건과 환자의 구강 환경 등을 예시할 수 있다.
따라서, 임플란트는 구강 내 치조골에 이식되는 경우에 생체 조직에 대한 생체 친화성(biocompatibility)이 양호한 재료를 선택하여 생체조직과 생화학적으로 부작용이 없는 재료를 선택할 필요가 있으며, 구체적으로는 임플란트의 재질로서 티타늄(Ti) 또는 티타늄(Ti)합금, 코발트 합금, 스테인레스 스틸, 백금, 이리듐, 니오븀, 탄탈륨 등과 같은 금속 재료를 사용할 수 있다.
상기 예시된 금속 중 티타늄(Ti) 또는 티타늄(Ti) 합금은 생체친화성, 부식저항성, 강도(strength), 강인성(toughness) 및 내구성이 양호한 특성이 있으며, 특히 임플란트 재료로 사용될 경우, 용해 속도가 느리고 용해 산물은 화학적으로 불활성이기 때문에 골의 성장을 허용하여 골과의 계면에서 골 유착(osseointegration) 반응을 효과적으로 유도할 수 있다.
다만, 티타늄(Ti) 또는 티타늄(Ti) 합금은 세포 독성을 갖는 금속 이온이 방출되어 임플란트 본체 표면에서의 조골세포(osteoblasts)의 세포 증식을 억제하고, 이로 인한 성공적인 골 유착(osseointegration)을 형성할 수 없는 문제가 있다.
한편, 성공적인 치과 임플란트 시술을 위해 조골세포의 분화 및 광물화를 통해 임플란트 재질로 이용되는 티타늄(Ti) 또는 티타늄(Ti) 합금의 표면과 턱뼈 사이 골 유착을 증가시키고, 파골세포의 분화를 감소시키는 다양한 연구가 진행되어 왔다.
이러한 골 유착(osseointegration)의 부족은 생리 활성 코팅을 형성하여 임플란트 표면의 개질을 통해 해결되고 있다. 현재 임플란트 표면 개질에 관한 연구는 사실상 생체 불활성인 물질을 생체 활성인 물질로 만들거나, 오히려 이식 후에 쉽게 표면에 흡수되는 단백질의 유형에 영향을 미치는 것에 초점을 맞추고 있다. 표면 개질의 분류는 탄화물(cabide), 불소, 칼슘, 하이드록시 아파타이트 또는 인산 칼슘과 같은 비생물학적 코팅에서부터, 지질 단층 또는 지질 이중층, 성장인자, 단백질, 및/또는 펩티드를 사용하여 생물학적 환경을 모방하는 코팅까지 그 범위가 다양하다.
구체적으로, 인체 친화적인 생체 활성(bioactive)을 가지면서 충분한 강도를 갖는 수산화아파타이트(hydroxyapatite, HA)나 제3 인산칼슘(tricalciumphosphate, TCP) 등의 인산칼슘계 세라믹 재료로 금속 소재 표면을 코팅하여 생체 친화성을 향상시키고, 턱뼈와 임플란트 표면 사이의 골 유착(osseointegration)을 향상시키는 방법이 사용되고 있으며, 최근 연구에서는 양극 산화법에 의해 제조된 마그네슘 이온이 주입된 티타늄 산화막층을 지닌 임플란트가 기계절삭 또는 블라스팅 처리된 임플란트에 비해 골 유착(osseointegration)을 증진하는 것으로 알려졌다(한국공개특허 2004-0046248).
다만, 상기 코팅층을 구비한 임플란트라고 하더라도 임플란트 본체와 주변 조직과의 계면에 뼈를 형성시키는 골 유착(osseointegration)을 만족할 만한 수준으로 신속히 달성하지는 못하고 있으며, 양극 산화법에 의해 제조된 임플란트 표면은 마이크론 단위의 다공성 구조를 지니지만, 블라스팅 처리에 의해 형성된 마이크론 단위의 고유한 표면 구조를 유지하지 못하며, 0.5 내지 10㎛의 비교적 두꺼운 산화막층으로 인해 코팅층이 탈락될 수도 있다는 문제점이 있다.
한편, 임플란트 주위염, 치주염 등의 질환 또한 임플란트 본체 표면과 턱뼈 사이의 효과적인 골 유착(osseointegration)을 방해하는 요소 중 하나이다.
임플란트 주위염은 체내 면역 반응과 치주질환을 유발하는 병원성 박테리아 사이의 불균형에 의해 유발되는 염증성 질환으로, 임플란트 본체의 표면 및 식재된 임플란트의 주변 잇몸에서 자주 발생하며, 치주조직의 파괴와 치조골의 재흡수를 야기하는 것을 특징으로 한다. 더 나아가, 임플란트 주위염은 지지골의 연조직에 염증을 야기함으로써 종국적으로 임플란트의 소실을 초래하게 된다.
따라서, 성공적인 임플란트 본체 표면과 턱뼈 사이의 골 유착을 형성하기 위해서는 임플란트 주변의 염증 반응을 조절하고 완화하는 것은 물론 상기 염증을 유발하는 구강 미생물의 생장을 효과적으로 억제하는 것이 필요하다.
이에, 임플란트 본체 주변의 염증 반응을 조절하고 완화하기 위한 항염 의약품 등에 대해 연구가 진행되어 왔으나, 임플란트 주위염 등에 대한 항염 효과가 미미한 실정이다.
더 나아가, 상기 문제점들을 해결하기 위해 인체에 무해한 천연 추출물을 이용하는 방법에 대해서는 현재까지 많은 연구가 이루어지고 있지 않은 실정인 바, 본 출원인은 천연 추출물인 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하여 구강 미생물에 대한 항균 효과를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 임플란트 주위염에 대한 항염 효과를 나타내어 턱뼈와 임플란트 본체 사이의 성공적인 골 유착을 형성할 수 있는 조성물을 발명하기에 이르렀다.
KR 10-1676946 B1 KR 10-2016-0136667 A
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 임플란트 주위염 치료 및 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)의 생성을 억제함으로써 항염 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 구강 미생물에 대한 항균 효과가 우수한 임플란트 주위염 치료 및 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 임플란트 주위염 개선용 코팅 조성물 및 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 임플란트 주위염 치료 및 개선용 조성물은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하며, LPS(Lipopolysaccharides)로 처리된 MC3T3-E1 조골세포(osteoblasts)에 대한 항염 효과가 우수한 것이다.
상기 항염 효과는 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)의 생성을 억제함으로써 발현되는 것이다.
상기 조성물은 구강 미생물에 대한 항균효과가 우수한 것으로 상기 구강 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis), 대장균(E. coli) 및 트레포네마 덴티콜라(T. denticola) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 임플란트 주위염 개선용 코팅 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
또한, 본 발명의 조성물은 싸리나무 추출물의 효과를 강화시키기 위하여 화이트클로버 추출물, 자귀나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 당업계에서 조추출물 (crude extract)로 통용되는 의미가 있지만, 광의적으로는 추출물을 추가로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 식물 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한 외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가로 한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함"은 질병 또는 장애의 징후 또는 증상의 예방, 감소, 경감 또는 제거를 포함하나, 제한되지 않는 유익한 결과와 같은, 바람직한 생물학적 효과에 영향을 미치기에 충분한 양을 포함하는 것을 의미하고, 이 양을 “유효량”이라 한다. 따라서, 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량은 유의미한 개체의 이익을 나타내기에 충분하다. 따라서, 유효량은 투여되는 상황에 따라 달라질 것이다.
한편, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 '임플란트 본체'는 치아의 뿌리 역할을 하는 부위로 지르코늄, 이의 합금 및/또는 산화물, 탄탈룸, 이의 합금 및/또는 산화물, 하프늄, 이의 합금 및/또는 산화물, 니오븀, 이의 합금 및/또는 산화물, 크롬-바나듐 합금 및/또는 결합한 산화물, 및 스테인리스 강과 같이 다른 금속(들), 다른 금속 합금(들) 및/또는 금속 산화물(들)과 결합한, 예를 들어 티타늄, 티타늄 합금 및/또는 티타늄 산화물과 같은, 하나 이상의 금속, 금속 합금 및/또는 금속 산화물을 소재로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 임플란트 주위염 개선용 조성물은 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하며, LPS(Lipopolysaccharides)로 처리된 MC3T3-E1 조골세포(osteoblasts)에 대한 항염 효과가 우수한 것이다.
상기 싸리나무는 콩과에 속하는 낙엽 관목으로 학명은 Lespedeza bicolor TURCZ 로서 잎은 사료로 이용되고 경엽과 뿌리는 한약재로 사용되며, 약성은 평(平)하고 감(甘)하다. 해열·이수(利水)·윤폐(潤肺)의 효능이 있어 해소·백일해·임질·소변불리(小便不利)에 치료제로 이용한다.
본 발명에서는 상술한 싸리나무의 뿌리가 아닌 지상부인 줄기와 가지를 이용하여 추출물을 제조한다.
한편, 상기 LPS (Lipopolysaccharides)는 내독소 중 하나로서, 지질 및 다당류로 구성되는 커다란 분자이다. 특히 그람 음성균의 외막을 구성하고 있는 분자로서, 대식세포에서 종양괴사인자(tumor necrosis factor alpha(TNF-α)), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1β(IL-1β)와 같은 전염증성 사이토카인(Cytokine)을 증가시키며, 일산화질소(NO), 프로스타글란딘 E2(PGE2) 등의 전염증성 매개체를 분비하도록 유도한다. 염증상태에서 상기 물질들은 특히 과량으로 생성되며, 이로 인해 여러 가지 질병 및 암 발병 (carcinogenesis)이 촉진될 수 있다.
더 나아가, LPS(Lipopolysaccharides)는 치주조직의 파괴 및 골 흡수를 유도하는 특징이 있어, 구강 의약품에 대한 효과를 실험하는 과정에서 염증성 질환을 유도하기 위해 흔히 사용된다.
따라서 본 발명에서는 MC3T3-E1 조골세포에 LPS(Lipopolysaccharides)를 처리하여 염증반응을 유발하고, 상기 조성물이 염증반응이 유발된 상기 MC3T3-E1 조골세포에서 생성되는 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인 (cytokine)의 양을 효과적으로 감소시키는지를 실험함으로써, 그 항염 효과를 확인할 수 있다.
한편, 조골세포(osteoblasts)는 골 기질을 합성, 분비하고 기질에 칼슘 및 마그네슘이온 등의 무기염을 침착시킴으로써, 골 조직을 광물화(mineralization)시키는 능력을 갖추는 세포를 지칭하는 것으로, 골화 등에 의해 뼈의 신생이 이루어지는 부위에서 볼 수 있는 세포이다.
본 발명에서 상기 조골세포(osteoblasts)는 MC3T3-E1 조골세포(osteoblasts)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 골 유착 과정에 작용할 수 있는 조골세포의 종류에 해당하는 한 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 항염 효과는 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)의 생성을 억제함으로써 발현되는 것이다.
구체적으로 상기 전염증성 매개체는 NO(Nitric oxide) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)이며, 상기 전염증성 사이토카인(cytokine)은 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 IL-1β (interleukin-1β)인 것이나, 이에 제한되지 않는다.
염증반응(Inflammatory Response)이란 상처가 난 곳이 열나고 붉게 되고 부어오르며 통증을 느끼게 되는 반응이다. 염증반응은 상처부위의 비만세포로부터 나온 히스타민을 포함하여 상처를 통해 들어온 박테리아를 포식하면서 활성화된 대식세포가 분비한 사이토카인 등에 의해 시작된다.
보다 구체적으로, 염증반응과 관련된 전사인자인 NF-kB는 LPS와 같은 염증 자극에 의해 핵으로 전위되며, iNOS(inducible NO synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), IL-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 같은 전염증성 유전자의 발현을 유도한다.
상기 iNOS(inducible NO synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)는 각각 전염증성 매개체인 NO(Nitric oxide) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성과 관련되어 있다. 즉, LPS에 의해 염증반응이 유도된 세포는 iNOS(inducible NO synthase) 유전자 및 COX-2(cyclooxygenase-2)유전자의 발현을 촉진하고, 상기 유전자는 각각 NO(Nitric oxide) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 촉진함으로써 염증반응을 야기한다.
상기 NO(Nitric oxide)는 조골세포의 성장을 억제하고, 세포 사멸을 증가시킬 뿐만 아니라, 파골 세포의 분화를 유도한다. 한편, 염증 반응 동안 생성되는 상기 프로스타글란딘 E2(PGE2) 또한, 파골세포의 분화를 유도한다.
또한, TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 IL-1(interleukin-1)은 파골 세포의 생성을 촉진해, 골 재흡수(bone resorption)를 유도하는 인자이다. 보다 구체적으로 NF-kB 신호전달로부터 생성된 상기 TNF- α 및 IL1β 은 조골세포로부터의 골 형성을 억제할 뿐만 아니라, NF-kB 리간드(RANKL)의 수용체 활성화제의 발현 증가를 야기하며, 이에 따라 분비된 NF-kB 리간드(RANKL)는 파골 세포의 형성을 유도하고, 치조골의 재흡수 및 치주질환을 가속화하는 역할을 한다.
결과적으로, 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)을 적절히 조절함으로써, 파골 세포 형성 및 골재흡수를 조절할 수 있으며, 상기 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 LPS(Lipopolysaccharides)로 처리하여 염증상태를 유도한 MC3T3-E1 조골세포에서 상기 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)의 생성을 억제함으로써, 임플란트 주위염에 대한 항염 효과를 향상시키고, 임플란트 표면의 성공적인 골 유착을 유도할 수 있다.
상기 조성물은 구강 미생물에 대한 항균효과가 우수한 것이다.
치태에는 다양한 구강 미생물이 서식하고 있으며, 충치와 다양한 치주질환을 야기하는 원인이 된다. 구체적으로 성공적으로 식재된 임플란트 본체의 주변에도 군집화된 다양한 구강 미생물들이 존재하고 있으며, 이들 또한, 체내 면역력이 떨어짐에 따라 임플란트 주위염 등을 야기하는 원인이 되고 있다.
따라서 성공적인 임플란트 시술을 위해서는 임플란트 본체 주변의 염증 반응을 조절하고 완화하는 것뿐만 아니라, 염증을 유발하는 원인이 되는 구강 미생물 자체를 조절하는 것 또한 필요하다.
보다 구체적으로, 상기 구강 미생물은 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis), 대장균(E. coli) 및 트레포네마 덴티콜라(T. denticola) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)는 그람 양성구균, 조건부 혐기성균으로 사람의 구강(oral cavity)에서 흔하게 발견되며, 충치의 주요 원인균으로 알려졌으며, 18 내지 40℃에서 생장하는 중온성(mesophilic) 세균이다. 구강뿐만 아니라, 인두(pharynx), 장에도 서식한다. 에나멜에 부착하거나 산성의 부산물을 생성하는 능력 때문에 충치 형성에 중요한 역할을 한다. 구체적으로 구강 내의 치면 세균막에 상주하여 섭취한 음식물에 포함된 탄수화물, 특히 포도당, 과당 등을 분해하고 그 대사 과정에서 발생하는 부산물인 유기산, 특히 젖산을 세포 외로 방출함으로써 치아 법랑질을 탈회시킨다.
상기 과정에서 주된 역할을 하는 물질은 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)가 생산하는 GTFase(glucosyltransferases)이다. 상기 GTFase는 자당을 기질로 하여 점착성의 비수용성 글루칸(glucan)을 합성하는 반응을 촉매하며, 상기 글루칸(glucan)은 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)를 치면에 부착시켜 기타 미생물을 유인하고, 증식을 유도하여, 다양한 치주질환을 야기하는 원인이 된다.
상기 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis)는 그람 음성균으로 절대 혐기성이다. 비운동성으로, 포자를 형성하지 않는 특징이 있다. 균종 별로 화학 조성과 두께가 다양한 캡슐을 갖는다. 이 캡슐의 기능은 두 가지로, 생체막에서 다른 세포에 부착되는 데 필수적인 역할을 할 뿐만 아니라, 백혈구에 의한 식균작용으로부터 세균을 보호하는 역할을 한다. 한편, 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis)는 사람의 주요한 구강 미생물(microbiota) 중 하나로, 치주 포켓이나 이와 잇몸 사이의 홈에 서식하는데, 초기에 생체막을 형성하기 위해서는‘1차 이주종(primary colonizer)’이 존재해야만 한다.
이러한 1차 이주종은 그람 양성 연쇄상구균(streptococci)인 경우가 많다. 이러한 1차 개척종 이후에 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis)와 같은 2차 이주종이 정착하게 된다. 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis)는 구강의 치근단(subgingiva)과 가장 관련이 있는데, 치태(dental plaque)가 되는 생체막(biofim)의 일부를 형성한다. 이는 치주질환에서 고통스러운 염증을 유발하는 것과 관련되어 있다.
상기 대장균(E. coli)은 사람이나 동물의 장내에 기생하는 세균으로 대장에 많기 때문에 대장균으로 부른다. 대장균(E. coli)은 양쪽 끝이 둥글고 길이가 약 2 내지 4μm 정도가 된다. 편모가 있어 운동성이 있으며, 그람 음성균이다. 대장균은 인간 또는 동물의 배설물에 함유되어 있는 총 대장균군의 90% 이상으로 매우 많은 양을 차지하기 때문에 사람 및 동물의 배설물에 의한 오염을 표지하는 가장 정확하고 효과적인 세균이라 할 수 있다. 한편, 창자에서는 물과 함께 비타민이 흡수되는데, 비타민 K, 비타민 B5, 바이오틴 등의 비타민은 주로 큰창자에 사는 대장균 대장균(E. coli)에 의해 합성된다. 따라서 이들 비타민은 음식으로 섭취되지 않더라도 결핍증이 생기지 않는 특징을 가지고 있다. 또한, 대장균 대장균(E. coli)이 큰창자에 있음으로 인해 다른 병원성 세균이 큰창자에 들어오는 것을 막아주는 효과도 있다.
다만, 상기 대장균(E. coli)은 상기 서술한 인체에 유익한 작용을 하는 미생물이면서, 장 이외의 부위에서는 방광염, 복막염, 패혈증 등의 병을 일으키고, 어린 아기나 어른에 이르기까지 전염성 설사를 유발하기도 하는 병원균이다. 한편, 상기 대장균(E. coli)은 구강 내에도 존재하는 미생물로, 임플란트 주위염 등 치주질환을 야기하는 원인균이 되기도 한다.
한편, 상기 트레포네마 덴티콜라(T. denticola) 또한, 구강 내 대표적 세균으로, 코일처럼 휘어진 구조 안에 필라멘트를 형성하여 전체적으로 코일처럼 휘어진 모양을 갖는다. 덴틸라이신(dentillisin)이라는 효소를 갖고 있어, 이를 통해 세포 속에 침투하여 작용하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 구강 점막 세포에 침투하여, 치아를 받치고 있는 치조골을 흡수함으로써 치주질환을 야기하는 원인이 된다. 구강 내에서 상기 트레포네마 덴티콜라(T. denticola)는 다른 세균들과 함께 바이오필름을 형성한다. 보다 구체적으로 상기 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis)가 구강 내에서 대사 산물을 배출하면, 그 대사 산물을 트레포네마 덴티콜라(T. denticola)가 흡수하는 관계를 통해 구강 내에서 서로 공생하는 특징이 있다.
이에 상기 조성물은 LPS(Lipopolysaccharides)로 처리하여 염증상태를 유도한 MC3T3-E1 조골세포에 대한 항염효과뿐만 아니라, 구강 내 미생물에 대한 항균효과를 향상시킴으로써, 임플란트 주위염 등 다양한 치주질환을 예방 및 개선할 수 있는 효과가 있다.
바람직하게는 상기 조성물은 상기 싸리나무 추출물에 화이트클로버 추출물, 자귀나무 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 추출물을 더 포함할 수 있다.
상기 화이트클로버는 콩과에 속하는 다년생으로서 줄기는 포복형이고 꼭지 끝에 흰 무늬가 있는 3개의 소엽이 붙어 있는 목초로서 본 발명은 뿌리를 제외한 지상부를 이용한다.
상기 자귀나무는 콩과에 속하는 낙엽활엽소교목으로 학명은 Albizzia julibrissin DURAZZ로서 한방에서는 수피를 약재로 사용하며. 약성은 평(平)하고 감(甘)하며, 활혈(活血)·진정(鎭靜)·소종·구충의 효능이 있는 것으로 알려졌으며, 본 발명에서는 뿌리가 아닌 지상부의 줄기와 가지를 사용한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 싸리나무 추출물 100 중량부에 대하여, 화이트클로버 추출물 10 내지 20 중량부 및 자귀나무 추출물 10 내지 20 중량부를 포함할 수 있으며, 화이트클로버 추출물과 자귀나무 추출물을 모두 포함하는 경우에는 화이트클로버 추출물 5 내지 10 중량부와 자귀나무 추출물 5 내지 10 중량부 포함한다.
상기 중량부 범위에 의하는 경우, LPS(Lipopolysaccharides)로 처리하여 염증상태를 유도한 MC3T3-E1 조골세포에서 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)의 생성을 효과적으로 억제함으로써, 항염효과를 더욱 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 구강 내 미생물에 대한 항균효과 또한 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 추출 용매로 에탄올을 이용하여 추출한 추출물일 수 있으며, 이 때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃ 추출한 추출물일 수 있다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72시간 동안 방치될 수 있으며, 상세하게는 1 내지 24시간 동안 방치될 수 있다.
여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 임플란트 주위염 등에 대한 항염효과 및 구강 내 미생물에 대한 항균 효과를 나타낼 수 있는 싸리나무 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 임플란트 주위염 개선용 코팅 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
상기 코팅 조성물은 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 성형되어 사용될 수 있고, 화학적 첨가물을 이용하여 겔, 분말, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 사용될 수도 있으나, 수용액의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.
수용액의 형태로 사용될 경우에는, 임플란트 표면에 코팅되는 코팅 조성물의 농도는 0.05 내지 200M이고, pH는 4 내지 10일 수 있으나, 특별히 이를 한정하는 것은 아니다.
또한, 이러한 수용액의 형태로 임플란트 표면 코팅에 사용될 경우에는 생물학적 활성물질을 추가로 첨가하여 사용할 수 있는데, 상기 생물학적 활성물질로 골 성장을 촉진하는 성장인자, 골 조직 형성 증진을 유도하는 펩타이드와 단백질, 피브린, 골 형태 형성인자, 골 성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨염 등이 사용될 수 있다.
상기 골 성장을 촉진하는 성장인자로는 BMP(bone morphogenic protein), PDGF(Platelet-derived growthfactor), TGF-beta(Transgenic growth factor), IGF-I(Insulin-like growth factor), IGF-II, FGF(Fibroblast growth factor) 및 BGDF-II(beta-2 microglobulin) 등이 있으며, 상기 골 조직 형성 증진 펩타이드와 단백질로는 RGD 시퀀스를 포함하는 각종 펩타이드와 콜라겐 및 피브로노젠과 같은 각종 단백질 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 골 형태 형성인자로는 오스테오칼신(osteocalcin), 본사이알로프로테인(bonesialo protein), 오스테오제닌(osteogenin), BMP(bone morphogenic protein) 등이 사용될 수 있는데, 상기 골 성장제는 인체에 무해하고 골성장을 촉진하는 물질이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 골 형성을 증진시키는 핵산, 골 형성을 억제하는 물질의 길항제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 임플란트 주위염 개선용 약학 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 추출물은 상세하게는 체중 1kg당 10 내지 1000mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 상세하게는 체중 1kg당 50 내지 500mg 정도 투여할 수 있다.
본 발명의 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 싸리나무 추출물을 포함하는 임플란트 주위염 개선용 조성물에 의하면, 항염효과 및 구강 미생물에 대한 항균효과를 우수하게 하여, 임플란트 주위염의 증상을 치료 및 개선할 수 있다. 나아가, 싸리나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 임플란트 주위염 개선용 코팅 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 ; 본 발명에 따른 추출물 제조
실시예 1: 싸리나무 추출물 제조
건조한 싸리나무 줄기와 가지를 믹서기로 분쇄한 다음 분말 30g을 추출 용매인 50% 에탄올을 1;10(w;v)의 비율로 가한 다음 완전히 침지 시킨 후, 80℃에서 환류시키면서 3시간씩 3회 반복 추출하였다.
추출액은 Whatman No.2 여과지로 여과한 다음 60℃에서 감압 농축하여 싸리나무 추출물 약 3.4g을 제조하였다.
실시예 2: 싸리나무 및 화이트클로버 혼합 추출물 제조
건조한 화이트클로버의 지상부를 이용하여 상술한 싸리나무 추출물 제조와 동일한 방법으로 화이트클로버 추출물 약 3.1g을 제조하였다.
이어서 싸리나무 추출물 100중량부에 대하여 화이트클로버 10중량부를 혼합하여 싸리나무 및 화이트클로버 혼합 추출물을 제조하였다.
실시예 3: 싸리나무 및 자귀나무 혼합 추출물 제조
화이트클로버 대신에 건조한 자귀나무 가지와 줄기를 이용한 것을 제외하고는 실시예 2 동일한 방법으로 싸리나무 및 자귀나무 혼합 추출물을 제조하였다.
이때 자귀나무 추출물은 약 3.3g 제조되었다.
실시예 4: 싸리나무, 화이트클로버 및 자귀나무 혼합 추출물 제조
본 실시예는 상술한 바와 같은 방법으로 3가지 추출물을 제조한 다음에 싸리나무 추출물 100중량부에 대하여 화이트클로버 추출물 5중량부 및 자귀나무 추출물 5중량부를 혼합하여 싸리나무, 화이트클로버 및 자귀나무 혼합 추출물을 제조하였다.
시험예 1. 구강 내 미생물에 대한 항균효과
상기 실시예에서 제조한 추출물의 구강 미생물에 대한 항균 활성을 실험하기 위한 미생물 균주는 한국 미생물 보존 센터(KCCM)와 유전자 은행(KCTC)에서 구입하여 사용하였다. 이용된 균주는 표 1과 같다.
구체적으로, 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)는 MBcell사의 Brain Heart Infusion한천 및 액체 배지에서 배양하였으며, 액티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans)는 MBcell사의 MRS 한천 및 액체 배지에서 배양하였으며, 대장균(E. coli)은 MBcell사의 Luria Bertani 한천 및 액체 배지에서 배양하였고, 칸디다 알비칸스(C. albicans)는 MBcell사의 Potato Dextrose 한천 및 액체 배지에서 배양하여 액체 배지 희석법(broth microdilution)으로 항균활성을 측정하였다.
대수기 중기까지 배양한 시험 균액을 같은 배지에 105/㎖이 되도록 균주를 맞춘 다음, 96 웰 플레이트에 웰 당 0.2㎖씩 균주한 다음, 상기 실시예에서 제조한 추출물 2배수씩 희석하여 처리하였다.
30℃에서 18시간 배양하여 세균의 생육을 650㎚에서 측정하였다. 세균의 생육을 완전히 저해하는 화합물의 최소농도를 MIC로 정의하였으며 양성 대조군으로 겐타마이신을 사용하여 그 결과를 표 2에 나타냈다.
균주 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 양성 대조군
스트렙토코커스 뮤탄스
(S. mutans)		 1.7 0.5 0.5 0.3 0.1
액티노마이세템코미탄스
(A. actinomycetemcomitans)		 1.5 0.5 0.5 0.5 0.3
대장균(E. coli) 1.5 0.5 0.5 0.5 0.3
칸디다 알비칸스
(C. albicans)		 1.2 0.5 0.5 0.5 0.3
상기 표 2의 결과 실시예 추출물 모두 양조 대조군과 거의 유사한 수준의 뛰어난 항균 활성을 보여 구강 내 미생물들에 의해 야기될 수 있는 임플란트 주위염에 대한 개선효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
시험예 2. VEGF 억제 효과 확인
96well plate (Corning, USA)에 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)를 3X104 cells/well로 접종하였으며 이때 배지는 EBM-2 + 2% FBS배지를 사용하였다.
24시간 후에 serum free media에 VEGF 20ng/mL 또는 VEGF 20ng/mL + 실시예 추출물 100㎍/ml을 처리하여 48시간 배양 후 Well 당 XTT 시약을 50ul 처리하여 4시간 반응시킨 후 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) reader (Molecular Devices, USA)로 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타냈다.
Absorbance
VEGF 1.31
실시예 1 0.18
실시예 2 0.14
실시예 3 0.14
실시예 4 0.12
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 본원발명에 따른 추출물을 처리한 군은 HUVEC의 증식이 처리하지 않은 군과 비교하여 현저히 억제된 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명의 추출물은 VEGF를 효과적으로 억제하여 임플란트 주위염을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.
시험예 3. 염증 반응 억제 효과 확인
염증 반응에서의 대식세포(macrophage)는 TNF-α, 인터루킨-6 (IL-6), IL-1β와 같은 염증매개물질과 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 생성하고, 유도형 NO 생성효소 (inducible nitric oxide synthase; iNOS)와 사이클로옥시게네이즈-2(cyclooxygenase-2; COX-2)를 합성하여 NO 및 프로스타글란딘(prostaglandin E2; PGE2)를 생성한다. 상기와 같은 전염증성 사이토카인은 염증 반응을 유도하며, 숙주의 면역 반응이 적절하지 못하는 경우, 염증성 질환을 유발할 수 있다.
따라서, 염증반응으로부터 생성되는 NO, 전염증성 사이토카인의 생성 억제를 확인하여 항염증 효과를 확인할 수 있다.
시험예 3-1. NO 생성 억제
그리스(Griess) 반응을 이용하여 배양액 내의 NO(Nitric Oxide)의 농도를 측정하였다. RAW 264.7 세포를 1X106 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 2시간 전 배양하였다.
그 후 실시예에서 수득된 추출물을 100㎍/mL 처리하고 1시간 후에 1㎍/mL의 LPS로 자극하여 24시간 본 배양하였다. 이렇게 얻어진 상층액과 Griess 시약 (1% 술파닐아미드(sulfanilamide) + 0.1% 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드(naphthylendiamine dihydrochloride), 1:1)을 1:1로 실온에서 10분간 반응시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 540nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다. 하기 표 4에서는 LPS만을 처리한 군의 흡광도를 기준(100%)으로 아무것도 처리하지 않은 군(Control) 및 LPS와 칠엽수 추출물을 모두 처리한 군이 나타내는 흡광도를 %를 표시하였다.
Absorbance(%)
control 25
LPS 1㎍/mL 100
실시예 1 39
실시예 2 31
실시예 3 31
실시예 4 29
상기 표 4의 결과로 본 발명 추출물의 NO 생성 억제 효과를 확인할 수 있었다.
시험예 3-2. 세포독성시험( Cytotoxicity assay)
Murine macrophage cell line RAW264.7 세포를 96-well plate (Corning, USA)에 세포수가 1 X 104 cells/well이 되게 분주하고 2시간 CO2 incubator 에서 배양하였다(37℃ 5% CO2). 배양 후 본 발명의 추출물을 100㎍/mL로 각각 처리하여 37℃에서 1시간 배양하였다.
배양 후 LPS(Lipopolysaccharides)를 1ug/mL 농도로 처리하여 37℃에서 24시간 배양하였다. Well 당 XTT 시약을 50 ul 처리하여 4시간 반응시킨 후 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) reader (Molecular Devices, USA)로 490nm에서 흡광도 변화를 측정하여 세포의 생존율을 백분율로 나타내어 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
Cell viability(%)
control 100
LPS 1㎍/mL 98
실시예 1 99
실시예 2 99
실시예 3 99
실시예 4 99
상기 표 5의 결과로 본 발명의 추출물은 세포 독성이 없는 것을 알 수 있었으며, 실시예 3-1의 NO 생성 억제효과는 세포 독성에 의한 것이 아니었다.
시험예 3-3. 인터루킨-6의 발현 억제
RAW 264.7 세포의 세포배양액 내의 인터루킨-6(IL-6)의 분비량은 ELISA kit (Mouse ELISA set, R&D Systems Inc.)를 이용하여 측정하였다. 세포배양액을 얻기 위해 RAW 264.7 세포를 5 X 106 cells/mL로 조절하여 24 well plate에 접종하고 2시간의 전 배양 후 100㎍/mL 농도로 본 발명의 추출물과 1㎍/mL의 LPS를 처리하였다.
그 후 24시간의 본 배양을 거쳐 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. ELISA는 마이크로플래이트(microplate)에 포획 항체(capture antibody)로 anti-mouse IL-6를 분주하여 실온에서 하룻밤 동안 코팅(coating) 시켰다. 이후 워시 버퍼(Wash Buffer) (#WA126, R&D Systems Inc.)로 세척하고 Reagent Diluent(#DY995, R&D Systems Inc.)로 블로킹(blocking)하였고 워시 버퍼(Wash Buffer)로 세척한 뒤 각 microplate well에 세포 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다.
반응 후 워시 버퍼(Wash Buffer)로 세척하고 희석한 biotinylated anti-mouse IL-6 detection antibody와 스트렙타비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트(streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)를 분주하여 실온에서 20분 반응시켰다.
그 후 다시 워시 버퍼(Wash Buffer)로 세척하고 기질 용액(Substrate Solution) (#DY999, R&D Systems Inc.)을 첨가하여 실온에서 20분 동안 암반응시켰다.
정지액 (Stop Solution) (#DY994, R&D Systems Inc.)으로 반응을 종료시킨 후 마이크로플래이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
iL-6(%)
control 0.00
LPS 1㎍/mL 100.00
실시예 1 2.91
실시예 2 1.45
실시예 3 1.39
실시예 4 1.08
상기 표 6의 결과로 보아, 본 발명의 추출물은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 인터루킨-6의 발현량을 감소시키는 것을 확인하였다.
상기의 모든 실험 결과를 종합적으로 고려하여 보았을 때, 본 발명의 추출물은 NO 생성을 억제하고, 세포 독성이 없으며, 전염증성 사이토카인인 인터루킨-6의 발현량을 감소시키는 것을 알 수 있었다.
상기의 결과로 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)에 의하여 염증이 유도된 대식세포의 Raw264.7에 대한 NO생성과 세포내 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 Interleukin-6의 발현량을 감소시킴으로써 항염증 작용을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3-4. 사이클로옥시게네이즈(COX-2)의 발현 억제
MG63 세포의 세포배양액 내의 사이클로옥시게네이즈(COX-2)의 분비량은 ELISA kit (R&D Systems Inc.)를 이용하여 측정하였다. 세포배양액을 얻기 위해 MG63 세포를 1 X 106 cells/mL로 조절하여 60mm culture plates에 접종하고 2시간의 전 배양 후 100㎍/mL 농도로 본 발명의 추출물과 10㎍/mL의 LPS를 처리하였다.
그 후 48시간의 본 배양을 거쳐 배지는 버리고 세포는 PBS로 두 번 워시하고 lysis buffer를 이용하여 단백질을 분리하여 ELISA에 사용하였다. ELISA는 마이크로플래이트(microplate)에 포획 항체(capture antibody)로 anti-human/mouse COX-2를 분주하여 실온에서 하룻밤 동안 코팅(coating) 시켰다.
이후 워시 버퍼(Wash Buffer) 로 세척하고 Block buffer로 블로킹(blocking)하였고, 이를 다시 워시 버퍼(Wash Buffer)로 세척한 뒤 각 microplate well에 분리된 세포 단백질을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다.
반응 후 워시 버퍼(Wash Buffer)로 세척하고 희석한 biotinylated anti-human/mouse COX-2 detection antibody와 스트렙타비딘홀스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트(streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)를 분주하여 실온에서 20분 반응시켰다.
그 후 다시 워시 버퍼(Wash Buffer)로 세척하고 기질 용액(Substrate Solution)을 첨가하여 실온에서 20분 동안 암반응시켰다. 정지액 (Stop Solution)으로 반응을 종료시킨 후 마이크로플래이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 7에 나타냈다.
Relative COX-2 EXPRESSION(%)
control 0.00
LPS 1㎍/mL 100.00
실시예 1 34.21
실시예 2 25.14
실시예 3 24.35
실시예 4 19.98
상기 표 7의 결과는 임플란트 주위염의 in vitro model인 MG63을 이용한 세포실험에서 본 발명의 추출물이 사이클로옥시게네이즈(COX-2)의 발현량을 감소하는 것을 보여준다.
상기의 결과로 본 발명의 추출물이 지질다당(Lipopolysaccharide; LPS)에 의하여 염증이 유도된 MG63에 대한 사이클로옥시게네이즈(COX-2)의 발현량을 감소시킴으로써 항염증 작용을 나타내어 임플란트 주위염에 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3-5. 프로스타글란딘( PGE2 )의 발현 억제
MG63 세포의 세포배양액 내의 프로스타글란딘(PGE2)의 분비량은 ELISA kit (R&D Systems Inc.)를 이용하여 측정하였다. 세포배양액을 얻기 위해 MG63 세포를 1 X 106 cells/mL로 조절하여 60mm culture plates에 접종하고 2시간의 전 배양 후 100㎍/mL 농도로 본 발명의 추출물과 10㎍/mL의 LPS를 처리하였다.
LISA는 마이크로플래이트(microplate)에 세포배양액과 primary antibody solution(anti-PGE2 mouse monoclonal antibody)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 여기에 PGE2 conjugate를 첨가하고 추가로 2시간 동안 반응시켰다(competitive ELISA). 이후 워시 버퍼(Wash Buffer)로 총 4번을 세척하고 기질 용액(Substrate Solution)을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응시켰다. 정지액 (Stop Solution)으로 반응을 종료시킨 후 마이크로플래이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 8에 나타내었다.
Relative PEG2 EXPRESSION(%)
control 0.00
LPS 1㎍/mL 100.00
실시예 1 15.27
실시예 2 13.28
실시예 3 13.28
실시예 4 9.87
상기 표 8의 결과는 임플란트 주위염의 in vitro model인 MG63을 이용한 세포실험에서 본 발명의 추출물이 염증 매개 물질인 프로스타글란딘(PGE2) 의 생성을 억제하는 것을 보여준다.
상기의 결과로 본 발명의 추출물이 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 프로스타글란딘(PGE2)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타내어 임플란트주위염에 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

Claims (7)

  1. 싸리나무 에탄올 추출물; 및
    상기 싸리나무 에탄올 추출물 100 중량부에 대하여 화이트클로버 에탄올 추출물, 자귀나무 에탄올 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 10 내지 20 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 효과가 우수한 임플란트 주위염 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항염 효과는 전염증성 매개체 및 전염증성 사이토카인(cytokine)의 생성을 억제함으로써 발현되는 것인 임플란트 주위염 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 포피로모나스 진지발리스(P. gingivalis), 대장균(E. coli) 및 트레포네마 덴티콜라(T. denticola)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 구강 미생물에 대하여 항균효과를 보이는 임플란트 주위염 치료용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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