KR101138032B1 - 은행나무 플라바노이드에 의한 발모 자극 조성물 - Google Patents

Abstract

은행나무의 플라바노이드 성분은 발모 자극에 유용하며, 따라서 탈모증 또는 대머리의 치료에 유용하다.

플라바노이드, 이소진게틴, 은행나무, 발모 촉진

Description

은행나무 플라바노이드에 의한 발모 자극 조성물 {STIMULATION OF HAIR GROWTH BY GINKGO BILOBA FLAVANOIDS}

본 발명은 제약학 및 화장품학의 양자에 관한 것이다. 더 상세히 말하자면, 본 발명은 플라바노이드가 농축된 은행나무 추출물을 도포 또는 투여하여 발모를 자극하는 것에 관한 것이다.

여러 가지 생리학적 효과를 발휘하는 은행나무 (Ginko biloba)의 잎 및 은행나무 종자 추출물은 원래는 중국에서, 그리고 지금은 전세계에 걸쳐 다년간 사용되어 왔다. 중국인들은 은행나무 종자를 암, 호흡기 및 순환계 질환 및 손상된 청각을 치료하는 데 사용하여 왔다. 종자 추출물은 성욕을 증진시키고 수명을 연장시키는 데 사용하여 왔다. 은행나뭇잎 추출물은 서양 문화에서 여러 가지 치료 목적으로 사용되어 왔다.

은행나뭇잎으로부터 얻는 특정 추출물인 EGb761 (테보포르탄)은 임상 시험에서 사용된 바 있다. 중량/중량 기준으로, 이 추출물에는 플라본 글리코사이드 24% 및 테르페노이드 6%가 함유되어 있다. 상기 추출물 및 기타 은행나무 추출물에 의하여 치료되는 질환 중에는 뇌기능 부전, 부적절한 혈액 순환 및 각종 심장 질환이 있다. 상기 추출물은 자유 라디칼 제거제로서도 역시 사용되어 왔다.

은행나무 추출물을 이용하기 위한 생리학적 근거는 모델계에 대한 다수의 연구에서 조사되어 왔다. 그러나, 본 발명과 가장 관련 있는 것은 문헌 [Yakugaku Zassli (1993) 113: 718-724]에 발표된 고바야시 (Gobayashi, N.) 등이 수행한 연구로서, 여기에는 전술한 추출물인 EGb761 (70% 에탄올 중에서의 은행잎의 추출에 의하여 조제됨)을 CH3계 마우스의 제모된 등에 국부 도포시 발모를 자극하는 것으로 나타났다. 이들 연구자들은 상기 추출물의 혈류 증진능에 대한 자극 영향에 기한 것으로 여겼다. 이 연구에 있어서, 은행나무 추출물은 불량한 혈액 순환에 의하여 악화된 동창(凍瘡)에 효과적이라고 알려져 있다는 가설에 기초하여 사용되었다.

가장 현저하게는 플라본 글리코사이드 및 테르페노이드를 비롯한 다수의 활성 분자는 은행나뭇잎 중에서 확인되었다. 확인된 플라본 글리코사이드 중에는 카엠페롤, 퀴에르세틴, 이소르함네틴, 시아도피티신, 진게틴, 아멘토플라본, 비보베텐, 세콰이아플라본 및 이소진게틴이 있다. 상기 플라본 핵은 글루코스 또는 람노스를 비롯한 당과 결합하는 수가 있다. 특히, 이소진게틴의 구조가 결정되어 발표되기에 이르렀다. 이는 도 1에 나타나 있다. 상기 테르페노이드로서는 징콜라이드 (ginkgolide) A, B 및 C와, 빌로발라이드를 들 수 있다. 징콜라이드는 혈소판 활성 인자를 억제하는 것으로 알려져 있으므로, 징콜라이드는 면역계가 스트레스를 받는 경우, 천식, 죽상 동맥 경화 및 뇌졸중의 치료에 유용하며, 운동 신경의 회복에 도움이 될 수 있고, 특정 기생충 감염에 사용될 수도 있다.

은행나무에서 유래된 개개의 플라바노이드의 효능도 역시 연구된 바 있다. 문헌 [Saponara, R.,et al., J. Nat. Prod. (1998) 11:1368-1369]에서는 개개의 은행나무 플라본이 레트의 지방 조직 내의 cAMP 포스포디에스테라아제의 활성을 억제한다는 사실을 보여주었다. 이들은 피부 미세 순환을 자극하기도 하였다. 문헌 [Dell'Agli, M., et al., Planta Med. (2002) 68 : 76-79]에서는 각종 은행나무 플라본은 복용량 의존 방식에 있어서 지방 조직 세포 중의 지방 분해를 자극한다는 사실을 보여주었다. 은행나무로부터 유래된 개개의 플라본은 문헌 [Kim, S. J., et al., Skin Pharmacol, (1997) 10:200-205]에 설명되어 있는 바와 같이, 인간 피부 섬유 모세포도 역시 자극하였으며, 콜라겐 및 세포외 피브로넥틴의 생성을 증가시켰다. 상기 플라본의 일부는 문헌 [Lee, S. J., et.al., Life Sci. (1995) 6:551-558]에 설명되어 있는 바와 같이, 림프구 증식을 억제하기도 하였다.

출원인이 아는 바로는, 고바야시 (전술한 내용 참조)가 설명하는 발모 자극이 은행나무의 플라바노이드 성분에 기인한다는 사실은 제안된 적이 없었다.

미국 특허 제6,410,512호는 발모에 있어서 프로테아좀 억제제의 효과를 설명하고 있다. 이는 프로테아좀 활성 및/또는 NF-κB 활성을 억제하면, 그 결과 발모가 강화되는 것으로 여겨지고 있다. 본 출원인이 아는 한, 은행나무 플라바노이드의 프로테아좀 억제에 관한 이 기술 분야에서의 간행물이나 설명서는 전혀 없다.

은행나뭇잎 추출물의 플라바노이드 분획과, 특히 개개의 플라바노이드 성분은 체모가 있는 동물의 발모를 자극하는 효과가 있다는 사실이 밝혀지기에 이르렀다. 개개의 플라바노이드는 발모에 영향을 주기 위하여 국부 또는 전신에 사용될 수도 있으며, 또는 플라바노이드 성분이 농축된 추출물이 사용될 수도 있다. 개개의 플라바노이드 또는 이들의 혼합물은 활용 가능한 방법에 의하여 합성하여 조제할 수 있다. 플라바노이드 또는 이들의 혼합물은 탈모증이 화학 요법 또는 방사선 치료에 의하여 야기되는 약학적 상황과, 자극이 남성형 대머리, 체모선 후퇴 등을 치유하거나, 또는 더욱 풍성한 발모를 제공하기 위한 화장품학적 상황에 유용하다.

따라서, 한 가지 관점에 있어서, 본 발명은 대상의 체표상(體表上)의 특정 부위에서의 발모를 자극하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 은행나무로부터 유래된 1종 이상의 단리된 플라바노이드 또는 상기 플라바노이드가 농축된 은행나무 추출물을 상기 부위에 제공하는 것을 포함한다.

또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 활성 성분으로서 1종 이상의 단리된 플라바노이드 또는 플라바노이드가 농축된 은행나뭇잎 추출물을 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 적어도 1종 이상의 단리된 플라바노이드 또는 플라바노이드가 농축된 은행나무 추출물을 함유하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 플라바노이드 조성물을 사용하여 남성형 대머리 치료, 안면 또는 두부 관련 풍성한 발모를 촉진하거나 또는 체모선의 후퇴를 치유하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 이들 플라바노이드계 물질을 이용하여 약물 또는 방사선 치료의 부작용인 탈모증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 이소진게틴의 구조를 나타낸 것이다.

도 2A 및 2B는 이소진게틴 및 OSA의 존재하에 프로테아좀 억제 시험의 결과를 도식적으로 나타낸 것이다. 도 2A는 20S 프로테아좀을 직접 처리하였을 경우의 결과를 나타낸 것이며, 도 2B는 이들 화합물로 적혈구를 처리하였을 경우의 결과를 나타낸 것이다.

도 3A 및 3B는 각각 17일 및 26일 후의 발모에 대한 1% OSA 및 10% 이소진게틴의 비교 효과를 나타낸 것이다.

발명의 실시 방식

발모 자극의 중요성은 여러 가지 상황에서 일어날 수 있다. 아마도 가장 시급한 중요성은 암환자의 화학 요법 및/또는 방사선을 이용한 치료에 의한 부작용으로 발생하는 탈모증을 치료하고자 하는 소망일 것이다. 효능에 관련된 불확실성과 결부된, 그러한 치료의 극심한 불편 이외에, 환자는 체모 손실이라는 추가된 외상 및 자신의 이미지에 대한 부수적 영향을 받게 된다. 이들 영향은 치료의 성공 또는 결핍에 대하여 생리학적으로 피이드백 (feedback)할 수 있고, 따라서 이 상태를 치료하는 것은 의료적 및 인도 주의적인 의미가 있다. 본 발명에 의하여 제공되는 물질은 치료에 있어서 적어도 부정적 측면을 완화시킬 수 있다.

그보다 덜 시급하기는 하지만, 관련 대상에게 성가신 문제는 노화 또는 선천적 기형에 의한 체모 손실이다. 남성형 대머리에 관한 불안은 잘 알려져 있다. 체모선 후퇴 등의 체모 손실의 대안적 패턴은 관련된 개인에게 마찬가지로 성가신 문제이다. 그 밖에, 남성 및 여성의 양쪽에 있어서 두발의 질은 노화에 따라 종종 저하되고 결국 가늘어져 매력적인 발모를 조절하는 것이 불가능해진다. 본 발명은 풍성한 두발을 회복함으로써 개인의 삶의 질에 보탬이 되는 수단을 제공한다.

본 발명의 물질 및 조성물을 전신에 도포하는 것이 가능할 수 있으나, 이들을 영향이 있는 부위에 직접 국부 도포하는 것이 분명히 좋다.

따라서, 제약 및 화장품의 양쪽 용도에 모두 양호한 조성물들은 국소 도포에 적합한 부형제를 함유하게 된다. 목적하는 표면에서 소정량의 활성 성분을 방출하는 조절된 제제가 역시 바람직하지만, 전형적인 국소용 제제는 겔제, 연고제, 분말제 또는 용액제이다. 상기 제제는 활성 부분의 진피 침투성을 증대시키는 물질을 함유할 수 있다. 그러한 침투제로서는, 예컨대 DMSO, 각종 담즙산염 및 무독성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

화장품/제약 조성물의 표준 성분은 이 기술 분야에 잘 알려져 있는데, 국소 도포용 의약 제제는 본 명세서에 참고로 포함시킨 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PA]에서 발견된다. 화장품 제제는 광범위하며 실무자들에게 잘 알려져 있다.

특히 유리한 제제는 그의 성분을 특히 모낭에 직접 전달하는 리포좀의 사용을 수반한다. 그러한 조성물은, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함시킨 미국 특허 제5,965,157호 및 제6,261,596호에 설명되어 있다.

따라서, 본 발명은 제한된 화장품용이거나 또는 제약용/화장품용에 관계 없이 활성 성분의 국소 용도 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 물질을 이용할 수 있는 대상으로서는 방사선 및/또는 화학 요법 치료를 받고 있는 환자, 체모선이 후퇴하거나 남성형 대머리인 남성, 턱수염 생장이 기호에 맞지 않는 남성, 체모가 가늘어지는 여성, 즉 피부 표면의 특정 지역에 발모를 소망하는 모든 남녀를 들 수 있다. 본 발명 물질의 1차적 용도는 인간용이지만, 애완용 동물 또는 가축 또는 실험용 동물의 발모를 목적으로 하는 경우도 있을 수 있다.

삭제

사실상, 본 발명의 한 가지 관점은 본 발명의 조성물의 안전성 및 효능을 확인하기 위하여 실험 동물을 활용하는 것이다. 따라서, 인간에 사용하기 위한 제품은, 발모를 자극하기 위한 개별 조제품의 효능을 확인하고, 개별 조제품이 무독성인지 확인하기 위하여, 예컨대 레트, 마우스 또는 토끼 등의 실험 동물에 도포될 수 있다. 품질 관리의 맥락에서 본 발명의 물질을 사용하는 것은, 전술한 바와 같이, 본 발명의 일부이다.

본 발명 조성물의 활성 성분은 은행나무로부터 유래될 수 있는 단리된 플라바노이드일 수 있다. 단리된 플라바노이드 분자는 본질적으로 순수한 것, 예컨대 순도가 90 내지 100% 또는 90 내지 99% 또는 약 95%일 수 있으며, 실제로 은행나뭇잎으로부터 단리시키거나, 표준화된 유기 화학 기법을 사용하여 합성할 수도 있다. 은행나뭇잎에 함유되어 있는 플라바노이드의 구조는 전술한 바와 같이 밝혀져 있다. 이소진게틴의 구조는 예시로서 도 1에 나타나 있다. 이러한 구조는 1종 이상의 당과 더 결합될 수 있다.

따라서, 상기 "단리된 플라바노이드"란 본질적으로 순수하고, 은행나뭇잎에서 발견되는 화합물과 대응하지만 조제된 것인 개개의 화합물이다.

지적한 바와 같이, 개개의 단리된 플라바노이드는 본 발명의 조성물 중의 단독 활성 성분일 수도 있고, 또는 이 단리된 플라바노이드는 추가의 플라바노이드 화합물들을 비롯한 기타 활성 성분과 혼합될 수도 있는데, 상기 추가의 플라바노이드 화합물들의 일부는 은행나뭇잎에 존재하는 플라바노이드에 대응하는 것들일 수 있다.

본 명세서에 정의된 바와 같이, "은행나무에서 유래된" 플라바노이드는 상기식물의 잎 중에서 글리코실화형 또는 비글리코실화형으로 발견되는 플라바노이드를 말하는 것이다. 따라서, "유래된"이라는 용어는 상기 잎으로부터 실제로 조제되거나 합성 조제된 화합물을 말한다.

별법으로서, 상기 활성 성분은 플라바노이드 성분이 농축된 은행나뭇잎 추출물을 구성할 수도 있다. 전술한 바와 같이, 통상 70% 에탄올 중에서 추출하여 조제한 일반적으로 사용되는 추출물은 EGb761로 표시하며, 중량/중량을 기초로 하여 플라본 글리코사이드 24%를 함유한다. 농축 추출물은 고함량 (중량/중량), 좋기로는 플라바노이드를 30% 이상, 더 좋기로는 플라바노이드를 40% 이상, 더 더욱 좋기로는 플라바노이드를 50% 이상, 가장 좋기로는 플라바노이드를 60% 또는 70% 이상의 플라바노이드를 함유하게 된다.

후술하는 바와 같이, 은행나뭇잎의 플라바노이드 분획의 발모 자극능은 직접적으로, 그리고 이들 화합물의 프로테아좀 활성 억제능에 의하여 나타낸다. 프로테아좀 억제 및 발모 자극간의 관계는 본 명세서에 참고로 포함시킨 전술한 미국 특허 제6,410,512호에서 이미 정립되어 있다. 따라서, 다음의 실시예들은 은행나무 플라바노이드 이소진게틴 모델이 발모 자극에 효과적이라는 사실을 나타내고 있다.

다음의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

이소진게틴에 의한 프로테아좀 억제

백혈구 세포 (WBC), 적혈구 세포 (RBC) 또는 농축 전혈 (PWB)로부터 프로테아좀을 조제한다. 백혈구 세포를 조제하기 위하여, 헤파린 첨가 마이크로테이너 튜브 중에서 혈액 1 ㎖를 염수로 1:1 (v/v) 희석하고, 1 ㎖의 NycoPrep™ 분리 매질상에서 층분리를 행한다. 이 조제액을 500xg (Sorvall RT 6000D, rotor H-1000B, 1500 rpm)으로 30분간 실온에서 원심 분리한다. WBC는 상징액(上澄液)으로서 회수하고, PBS 3 ㎖로 세척하여, 500xg (Sorvall RT 6000D, rotor H-1000B, 1500 rpm)으로 5분간 실온에서 원심 분리한다. 상징액을 제거한 후, WBC 펠릿을 PBS 1 ㎖ 중에 재현탁시키고, 6600xg (Eppendorf 5415C, 7000 rpm)으로 10분간 실온에서 미세 원심 분리한다. 이어서, 상징액을 제거하고, 프로테아좀 분석 전에 WBC 펠릿을 -70℃로 냉동시킨다.

RBC를 사용하는 경우, 전술한 WBC 조제 과정에서 얻은 RBC 펠릿을 회수하여 PBS 3 ㎖로 세척한 다음, 500xg (Sorvall RT 6000D, rotor H-1000B, 1500 rpm)으로 5분간 실온에서 원심 분리한다. 상징액을 제거하여 RBC 펠릿을 PBS 1 ㎖ 중에 재현탁시키고, 6600xg (Eppendorf 5415C, 7000 rpm)으로 10분간 실온에서 미세 원심 분리한다. 상징액을 다시 제거한 그 다음, 프로테아좀 분석 전에 RBC 펠릿을 -70℃로 냉동시킨다.

프로테아좀의 공급원으로서 농축 전혈을 사용하는 경우, 헤파린 첨가 마이크로테이너 튜브 중에서 채혈된 혈액 1 ㎖ 염수로 1:1 (v/v) 희석시키고 500xg (Sorvall RT 6000D, rotor H-1000B, 1500 rpm)으로 5분간 실온에서 원심 분리한다. 상징액을 제거하고, PWB 펠릿을 PBS 중에서 재현탁시켜 6600xg (Eppendorf 5415C, 7000 rpm)로 10분간 실온에서 미세 원심 분리한다. 상징액을 제거하고, 프로테아좀 분석 전에 PWB 펠릿을 -70℃로 냉동시킨다.

프로테아좀을 조제하기 위하여, WBC 또는 RBC 또는 PWB 1:1 (v/v)을 pH 8.0의 5 mM EDTA를 사용하여 30분간 용해하고, 15,000xg (Eppendorf 5415C, 14,000 rpm)으로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 프로테아좀을 함유하는 상징액을 얼음 위에 올려놓고 단백질 농도를 측정한다.

대조구로서, 기지의 프로테아좀 억제제, 이 경우에는 프로테아좀 억제제 I (PSI 또는 OSA) 또는 락타시스틴 계대 희석액을 조제한다. 피검 화합물의 계대 희석액들도 역시 조제한다. 이어서, 이들 반응액을, 후술하는 바와 같이, 희석 시료 50 ㎕ 및 0.5 ㎍/ml 20S 프로테아좀 2.0 ㎕가 첨가된 0.65 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 투입한다. 상기 튜브를 37℃에서 1 시간 배양하고, 6 시간 이내의 분석용으로 얼음 위에 올려놓는다.

분석용으로 시료, 즉 20S 프로테아좀 50 ㎕ 또는 표준품 또는 WBC 시료 ~50 ㎍/㎕ 또는 RBC 시료 ~500 ㎍/㎕ 또는 PWB 시료 ~1000 ㎍/㎕ 등의 피검 화합물을 96-웰 블랙 형광판 내의 기질 완충액 (20 mM HEPES, 0.5 mM EDTA, 0.05% SDS, and 120 μM LLVY-AMC; pH 8.0) 50 ㎕에 첨가한다. 반응액을 형광 분광 광도계 (최대 여기: 380 nm; 최대 방출: 440 nm)로 측정하고, 반응 속도를 측정한다. 나타낸 바와 같이, 기질은 Leu-Leu-Val-Tyr-AMC이다. AMC는 아미도-4-메틸쿠마린이다.

결과는 도 2A 및 2B에 나타나 있다. 도 2A의 결과는 OSA 및 이소진게틴이 직접 첨가된 마우스의 농축 전혈로부터 조제한 20S 프로테아좀 제제를 사용하여 얻었다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, OSA 및 이소진게틴 양자는 LLVY-AMC 기질의 단백질 분해의 Vmax를 유사하게 억제하고 있다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, OSA의 세포 침투능이 더 크다는 관점에서, 적혈구 세포를 이들 화합물로 처리하는 경우, OSA에 의한 억제는 더 효과적이었다. 이들 분석법에 있어서, 먼저 적혈구를 이들 화합물로 처리한 다음, 프로테아제 활성 평가를 위하여 프로테아좀을 단리한다는 것을 상기하게 될 것이다.

실시예 2

발모 자극

8주령 C57 수컷 검은색 마우스를 7일간 개별 우리에 적응시키고, 표준식과 물을 자유롭게 공급하였다. 마우스는 처리 전에 마취시켰다.

각 마우스의 등을 제모하고, 이어서 다음 날부터 5일간 매일 1.0% OSA 용액 (100 ㎕)을 국소 도포하였다. 동일한 방법을 사용하여 각각 1, 5 및 10 중량%의 이소진게틴 용액 50 ㎕를 도포하였다. 발모 진행 과정을 육안으로 관찰하고 사진으로 기록한다.

도 3A 및 3B는 각각 17일 및 26일 후의 1% OSA 또는 10% 이소진게틴의 처리 결과를 나타내고 있다. 도시된 바와 같이, OSA와 이소진게틴 양자 모두 대조구에 비하여 등의 발모를 자극한다.

Claims (15)

1. 적어도 이소진게틴을 함유하는, 체모가 있는 대상의 체표 부위에서의 발모를 자극하기 위한 조성물.
2. 적어도 이소진게틴을 함유하는, 남성형 대머리를 치료하기 위한 조성물.
3. 적어도 이소진게틴을 함유하는, 안면 또는 두부의 풍성한 발모를 촉진하기 위한 조성물.
4. 적어도 이소진게틴을 함유하는, 방사선 또는 화학 요법에 의한 탈모증을 치료하기 위한 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 국소 도포용으로 제제된 것인 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제

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