KR101127600B1

KR101127600B1 - 신규 나린제닌 유도체, 7-트리메틸 아세토-나린제닌 및 그 화합물의 항암제로서의 용도

Info

Publication number: KR101127600B1
Application number: KR1020090103475A
Authority: KR
Inventors: 정유훈; 임융호; 이영한; 용연중; 현지예; 정강연; 우윤경; 신순영
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2012-03-23
Also published as: KR20110046807A

Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물 및 그 화합물 및 그 화합물을 제조하는 방법 그리고 그 화합물을 유효성분으로 하는 약학 조성물에 관한 것으로, 암세포의 자기사멸 유도 효과를 보이는 화학식 1의 화합물은 항암제로 사용할 수 있다.

세포자기사멸, 7-트리메틸 아세토-나린제닌, 항암제

Description

신규 나린제닌 유도체, 7-트리메틸 아세토-나린제닌 및 그 화합물의 항암제로서의 용도{A Novel Naringenin Derivative, 7-Trimethyl Aceto-naringenin and A Use as a Anti-cancer Drug thereof}

본 발명은 신규 나린제닌 유도체, 7-트리메틸 아세토-나린제닌 및 그 화합물의 제조방법 그리고 그 화합물의 항암제로서의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 세포자기사멸 (Apoptosis)는 필요 이상으로 생성된 세포, 기능을 상실한 세포, 수선이 불가능한 DNA의 손상을 받은 세포 등에서 유도되는 세포의 죽음으로서 세포의 항상성을 유지하는 중요한 생체 기작중 하나이다. 세포자기사멸이 유도된 세포는 세포막 손상, 염색체 응축등과 같은 형태적 특징이 나타나며 endogenous endonuclease 활성으로 인해 핵내 크로마틴(chromatin)이 oligonucleosome 길이인 200 bp (base pair) 간격으로 잘려진 DNA 절편(Fragment)이 생성된다, Cisplatin, Vincristine, Doxoruvicin등과 같은 각종 항암제나 방사선조사에 의한 암치료 기전은 대부분 암세포의 세포자기사멸 과정을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

세포자기 사멸 과정 중 단백질의 분해는 매우 중요한 과정으로서, Caspase 등과 같은 단백질 분해효소가 관여하고 있다 (Tanabe et al., J Biol Chem 274: 15725-15731, 1999.). Caspase는 포유류에서 10종류 이상이 알려져 있다 (Thornberry et al., Science 281: 1312-1316, 1998). TNF 등과 같은 외인성 세포사멸 신호가 수용체와 결합하면 Caspase-8이 활성되고, 활성 Caspase-8은 Caspase-3, -6, -7 등의 effector caspase 효소를 절단하여 활성화시켜 궁극적으로 세포자기사멸이 유도된다 (Muzio et al., J Biol Chem 273: 2926-2930, 1998; Yang et al., Mol Cell 1: 319-325, 1998). 또 항암제나 방사선 조사 등은 미토콘드리아에 있는 싸이토크롬-C (cytochrome C)를 세포질 내로 방출시켜 Apaf-1과 복합체를 이루고 있는 Caspase-9을 통해 Caspase-3를 활성화시켜 세포질 내의 세포 기능에 중요한 많은 기질 단백질들을 절단시켜 세포 죽음을 유도시킨다 (Green, Cell 94, 695-698, 1999).

세포자기사멸 유도 과정에서 Caspase-3의 주요 기질 중의 하나가 핵내 존재하는 PARP (poly(ADP-ribose)polymerase) 단백질이다. PARP 효소는 구조적으로 N-말단 쪽에 2개의 zinc-finger와 helix-turn-helix motif의 DNA 결합 부위, Nuclear localization signal을 가지고 있으며 C-말단 쪽에는 효소 촉매 부위가 위치하고 있다. 세포 사멸을 유도하는 신호에 의해 Caspase-3가 활성되면 113 kDa의 PARP는 24 kDa과 89 kDa으로 절단됨으로서 PARP 효소는 활성화된다. 활성화 된 C-말단 PARP 단편은 H1 histone을 poly(ADP-ribosyl)lation 시켜 internucleosomal DNA 부위가 endonuclease와 쉽게 결합하도록 도와주어 DNA 절편화를 촉진시키며(Yoon et al., J. Biol. Chem. 271, 9129-9134,1996), N-말단 단편은 손상 받은 DNA와 결합 하여 endonuclease에 의한 DNA fragmentation을 촉진시킨다 (Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 89, 7703-7707, 1993). 또한 PARP에 의한 ADP-ribosylation 과정은 많은 양의 NAD+를 소모하고 ATP를 과다하게 에너지로 사용하기 때문에 세포의 죽음을 더욱 촉진시키게 한다(Soldani C와 Scovassi AI, Apoptosis. 7, 321-8, 2002). 따라서 PARP는 세포 사멸 초기 과정에 절단이 일어나서 세포 사멸 진행을 촉진시키는 역할을 함으로, PARP 절단은 세포 사멸의 진행을 파악하는데 중요한 인자로 여겨지고 있다. 따라서 PARP 단백질의 절단을 유도시키는 물질의 개발은 암예방 및 치료제 개발에 중요하다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항암 활성을 가지는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항암 활성을 가지는 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물((이하 'KN4'라 함)을 제공한다.

[화학식 1]

또한 본 발명은 상기의 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사 용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 암세포에서 자기 세포 사멸 유도 효과를 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 암 세포는 자궁암 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 약학 조성물은 안정하고 효과적인 조성물을 만들기 위해 당업자에 의해 사용되는 통상적인 절차에 따라 제조된다. 그러한 방법은, 혼합, 교반, 현탁, 분산, 유화, 용해 등에 의한, 약학 보조제, 예컨대 담체, 희석제, 용매 또는 부형제가 있거나 내에 있는 활성 화합물 및 비경구, 경구, 비내, 협측 또는 직장 투여 등을 위해 약학적으로 적당한 형태로 성분을 처리하는 단계를 포함한다. 고체, 액체, 비경구 제형에 있어서, 활성 화합물 또는 활성 성분의 유효량은 목적하는 결과를 도출하는 임의의 양이다.

제형은 당 업계에 인식된 임의의 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 화합물과 나머지 성분들을 혼합하여 조제될 것이다. 고체 경구용 제형을 제조하는데 사용되는 나머지 성분들은 통상적으로 불활성인 성분들, 예컨대 미정질 셀룰로스, 메틸 셀룰로스 등, 필요하다면 이의 적당한 감미료, 착색제 및/또는 착향료, 및 보존제를 포함할 것이다. 현탁액의 제조에 적당한 상기 고체 경구용 제형 또는 건식 조제물은 이들이 본 발명의 화합물의 효과적인 투여량을 함유하도록 조제될 것이다. 통상적으로는, 본 발명의 화합물 100 mg ～ 1500 mg을 함유하는 고체 제형을 고려한다. 경구 현탁액에 적당한 제제는 유사한 투여량을 함유해야한다.

본 발명의 약학 조성물은, 예를 들어 정제 바인더, 충진제, 보존제, 정제 붕해제, 유동성 조절제, 가소제, 습윤제, 분산제, 유화제, 용매, pH 변화 첨가제, 착향제 등과 같은 약학에 통상 사용되는 보조제 및 첨가제와 함께 조제될 수 있다.

두번째로 바람직한 방법은 비경구적인 근육 내, 정맥 내 또는 피하 투여이다.

본 발명의 약학 조성물이 주사가능한 제제로 조제되는 경우, 용액 또는 현탁액의 형태로 약학 조성물을 조제할 때, 시중에 사용되는 모든 희석제를 사용할 수 있다. 적당한 희석제의 예로는 물, 에틸 알콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에톡시화 이 소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르가 있다. 염화나트륨, 포도당 또는 글리세롤은 치료제로 혼입될 수 있다. 주사가능한 제제 중 활성 성분의 농도는 0.1 mg/㎖～100 mg/㎖의 범위인 것이 바람직하다.

상기 제시된 일반적인 제형 이외에도, 본 발명의 화합물은 또한 제어된 방출 수단 및/또는 전달 장치 등은 미국 특허 번호 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123 및 4,008,719에 기술된 것에 의해 투여될 수 있다.

총 1일 투여량의 범위는 통상 약 10 mg～약 5000 mg의 본 발명의 화합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 약 100 mg～ 약 3000 mg(총 1일 투여량 범위)이다. 하지만, 투여량은 환자의 요구 및 병태에 따라 많아지거나 적어질 수 있다.

또한 본 발명은 나리제닌에 트리메틸 아세틸 클로라이드를 가하여 본 발명의 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기의 반응은 상온에서 나리제닌을 CH₂Cl₂에 녹인 후에 미리 증류한 Et₃N을 넣어 준 후 트리메틸 아세틸 클로라이드를 가하여 주는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 상기 화학식 1의 나린제닌 유도체, 7-트리메틸 아세토-나린제닌을 이용하여 세포자기사멸을 유도시킴으로써 항암제로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 기술할 것이나, 이러한 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니며, 특허청구범위에 기재된 발명의 정신 및 보호범위 내에서 다양한 보완 및 변형이 가능하다는 것은 자명할 것이다.

실시예 1: 화학식 1을 갖는 화합물의 합성방법

화학식 1의 화합물인 7-트리메틸 아세토-나린제닌 (7-trimethyl aceto-naringenin, KN4)을 합성하기 위여 다음과 같은 방법을 사용하였다.

Argon gas하에 불꽃 건조된 100 mL 둥근 바닥 플라스크에, 상온에서 naringenin (100 mg, 0.37 mmol)을 5 mL의 CH₂Cl₂에 녹인 후에 미리 증류한 Et₃N (0.2 ml, 1.46 mmol)를 넣어주었다. 출발물질이 모두 녹은 후 Trimethyl acetyl chloride (0.05 mL, 0.37 mmol)을 천천히 넣고 상온에서 10분 동안 교반시켜 주었다. 반응의 종결점은 얇은막 크로마토그라피 (TLC 조건: 10% Acetone/CHCl₃ , R _f = 0.5)로 결정하였고, 반응이 끝나면 용매를 진공증발기로 완전히 제거한 뒤 얻어진 반응물을 flash column chromatography (gradient solvent system: 1% → 3% Acetone/CHCl₃)로 정제하여 흰색의 고체 형태인 화합물 KN4 (84 mg, 0.24 mmol, 62.64 % yield)을 얻었다. 이와 같은 합성 방법은 도 1의 모식도로 요약할 수 있다.

(1) 수소핵자기공명 실험 결과

KN4의 양성자 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 2에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다.

¹H-NMR(400MHz) d: 2.80(dd, 17.2, 2.92), 3.41(dd, 17.2, 12.98), 5.56(dd, 12.98, 2.92), 6.31(s), 6.81(dd, 6.64, 1.97), 7.33(dd, 6.64, 1.97), 1.27(s), 12.0(s), 9.63(s). 여기서 s, d는 커플링상태를 각각 singlet, doublet으로 나타내며 ( ) 내의 숫자는 커플링상수를 나타낸다.

(2) 탄소핵자기공명 실험 결과

KN4의 탄소 핵자기공명 스펙트럼의 결과는 도 3에 나타내었으며, 이를 정리하면 다음과 같다.

¹³C-NMR(100MHz) d: 42.2(t), 78.8(d), 198.5(s), 158.4(s), 102.5(d), 162.3(s), 101.6(d), 157.9(s), 105.8(s), 128.42(s), 128.37(d), 115.2(d), 150.8(s), 175.5(s), 38.7(s), 26.6(q). 여기서 s, d, t는 탄소의 다중도를 나타내며 각각 siglet, doublet, triplet을 표시한다. 115.2ppm과 128.37ppm의 두 첨두는 다른 첨두들보다 약 2배의 세기를 보인다.

(3) 화학식 1을 갖는 화합물의 전체적 구조

모든 핵자기공명분광법(NMR) 실험은 Bruker Avance 400 spectrometer (Karlsruhe, Germany) 시스템을 사용하였고 298K의 온도로 실험하였다. 화학식 1의 구조는 화학식 2의 나린제닌에 대한 탄소핵자기공명 스펙트럼의 데이터와 비교하여 결정하였다(도 4 참조). KN4는 나린제닌의 수산기에 트리메틸 아세토기가 붙은 것이기 때문에 기존의 나린제닌과는 트리메틸 아세토기 부분에서만 다를 것으로 예측되어서 기존의 나린제닌에 대한 수소 및 탄소핵자기공명 스펙트럼들을 비교하여 결정하였다. 나린제닌의 탄소핵자기공명 스펙트럼에서는 13개의 탄소 첨두가 관찰된다: 42.0(t), 78.4(d), 95.0(d), 95.8(d), 101.8(s), 115.2(d), 128.3(d), 128.9(s), 157.7(s), 162.9(s), 163.5(s), 166.6(s), 196.4(s). 여기서 115.2와 128.3ppm의 첨두는 두 개의 탄소를 나타내는 두 배의 세기를 가진 첨두들이다.

KN4의 탄소 첨두들과 나린제닌의 탄소 첨두들을 비교하면 26.6, 38.7, 175.5ppm의 세 첨두들에서 차이를 보이는데, 26.6ppm의 첨두는 세 개의 메틸기가 존재함을 보여주는 첨두이고 175.5ppm의 첨두는 트리메틸 아세토기의 케톤기를 나타내며, 38.7ppm의 첨두는 트리메틸기 (trimethyl group)의 탄소를 나타내기 때문에 KN4은 나린제닌에 트리메틸 아세토기가 붙어 있는 것으로 확인 되었다. 그런데 트리메틸 아세토기의 케톤 탄소(175.5ppm)와 나린제닌의 6번 위치의 수소(6.31ppm) 사이에 원거리 커플링(long-ranged coupling)이 에이치엠비씨 실험에서 관찰되었기 때문에 트리메틸 아세토기은 나린제닌의 7번 위치에 결합된 것으로 결정되었다(도 5 참조). 최종적인 구조 및 명명은 도 6과 같고 화학식 1의 나린제닌 유도체는 5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxochroman-7-yl pivalate이다.

실시예 2: 화학식 1의 세포자기사멸 유도 효과

본 발명에서는 KN4의 세포자기사멸 유도 효과를 확인하기 위하여, HeLa 세포 (인간 자궁 암세포)를 ATCC (American Type Culture Collection, 미국)에서 분양받아 KN4에 의한 PARP의 조각단편 (cleaved PARP)을 조사하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

1.5 X 10⁶개의 HeLa 세포를 10% 우태아 혈청 (Fetal bovine serum)이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후 20 ㎍/㎖ 농도의 나린제닌과 KN4를 세포에 처리하였다. 24시간 경과후 세포를 수확하여 RIPA (50 mM Tris-HCl (ph 7.4), 1% NP-40, 0.25% Na-Deoxycholate, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF) 세포 용해액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 고속원심분리기를 이용하여 세포 조각들을 분리시킨 후 상등액을 수확하여 단백질을 분리하였다. 전체 단백질 중 15㎍을 8% SDS-폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide gel) 겔에 전기영동한 후 분리된 단백질 밴드를 셀룰로스막으로 이동시키고 상온에서 30분 동안 5% 스킴밀크 (skim milk) 블록킹 용액을 처리하였다. 상기 셀루로스막에 PARP 단백질의 일차항체 (primary antibody)를 첨가하고 상온에서 4시간 반응시킨 후 TBST (50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) 용액으로 3차례 막을 세척하였다. 상기 1차 항체가 결합된 셀루로스막을 2차항체 (Secondary antibody)를 첨가하고 상온에서 90분 동안 반응시킨 후 TBST 용액으로 5 차례 세척하였다. 상기 막을 화학형광 검출 키트 (chemiluminescence detection kit, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 이용하여 셀루로스막상에 존재하는 PARP 단백질의 조각 생성 여부를 분석하였다.

도 7에서 나타난 바와 같이, 나린제닌은 세포사멸의 주요 현상인 PARP 단백질의 절단에 아무런 효과가 없었지만, KN4는 PARP 단백질의 조각단편을 유도시켰다. 이때 대조 단백질로 사용한 GAPDH 단백질 발현양은 변화되지 않았다.

상기 결과는 KN4가 나린제닌에 비해 더 효과적으로 HeLa 자궁경부암 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 의미한다.

도 1은 화학식 1의 합성을 위한 방법에 대한 모식도;

도 2는 화학식 1의 수소핵자기공명 스펙트럼을 나타내는 그림;

도 3은 화학식 1의 탄소핵자기공명 스펙트럼을 나타내는 그림;

도 4는 화학식 2 (나린제닌)의 탄소핵자기공명 스펙트럼을 나타내는 그림;

도 5는 화학식 1의 이차원 에이치엠비씨 스펙트럼을 나타내는 그림;

도 6은 화학식 1의 구조 및 명명법을 나타내는 그림;

도 7은 화학식 1의 PARP 단백질의 절단 상태를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물.

[화학식 1]
삭제
제 1항의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 암세포에서 자기 세포 사멸 유도 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 암세포에서 폴리 ADP-리보스 폴리머레이즈(poly(ADP-ribose)polymerase;PARP) 단백질 조각 단편을 유도하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 암 세포는 자궁암 세포인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
나리제닌에 트리메틸 아세틸 클로라이드를 가하여 제 1항의 화합물을 제조하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기의 제조방법은 상온에서 나리제닌을 CH₂Cl₂에 녹인 후에 Et₃N를 넣어 준 후 트리메틸 아세틸 클로라이드를 가하여 주는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물을 제조하는 방법.