KR101126957B1 - 코지산 유도체를 함유하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코지산(kojic acid) 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코지산 유도체 화합물은 Src계 키나아제 활성을 억제함으로써 신경교종(glioma) 세포의 증식을 저해하고, 대식세포에서의 TLR4 매개 활성을 억제하는 효과가 우수하여 신경교종 유래의 종양에 대한 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

코지산 유도체, 신경교종, Src 키나아제, 대식세포, 세포증식, 종양

Description

코지산 유도체를 함유하는 항암용 조성물{Anti-cancer Composition containing Kojic acid Derivatives}

본 발명은 코지산 유도체(kojic acid derivatives)를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, Src계 키나아제 활성을 억제하여 신경교종 세포의 증식을 저해하고, 대식세포에서의 TLR4 매개 활성을 억제하는 특정 코지산 유도체 화합물의 용도에 관한 것이다.

신경교종(glioma)은 뇌와 척수의 내부에 있으면서 신경조직의 결합-지지-영양 등의 작용을 하는 신경아교세포에서 기원하는 종양으로서, 특히 뇌에 흔히 발생하며, 전체 뇌종양의 약 40%를 차지한다. 침윤성 성장을 하고 정상조직과의 경계가 분명하지 않아 외과적으로 이것을 완전히 제거하기 어려우며 완치가 곤란하다.

매년 만 명의 미국인이 신경교종으로 진단을 받는다. 신경교종의 신속한 진행을 방지할 수 있는 수단이 별로 없기 때문에, 신경교종은 암과 관련된 사망의 주요 원인이 된다. 지난 수십 년 동안 신경교종의 치료법은 거의 바뀌지 않았다.

신경교종은 원발성 뇌 종양의 가장 흔한 종류이고, 별아교세포종, 희돌기아교세포종, 뇌실막세포종으로 나뉘는데, 대개 심각한 예후와 연관된다. 교모세포종 (GBM) 및 역형성 별아교세포종(AA)을 포함하는 고등급(high-grade)의 별아교세포종은 성인에서 가장 흔한 내인성 뇌종양이다.

고등급 별아교세포종의 분자 유전학에 대한 이해 정도는 증가하였지만 (Kitange et al., Curr.Opin. Oncol. 15: 197-203 (2003)), 기원 세포 종류들은 여전히 불명확하고, 질병 공격성의 분자 결정자는 잘 이해되지 못하고 있다. 따라서 종양의 세포 기원 및 분자 발병기전에 대해 보다 구체적인 내용들이 파악될 경우, 거의 균일하게 치명적인 신생물 치료를 위한 새로운 표적을 확인할 수 있을 것으로 보인다. 예를 들면, 신경교종 세포의 병리 기작과 관련 있는 여러 가지 시그널 경로의 주 타겟을 찾아냄으로써, 이러한 신경교종 세포의 활성화 경로를 차단하거나 또는 신경교종 세포의 증식을 억제하는 등의 방안을 모색할 수 있고, 나아가 임상적으로 적용할 수 있는 신경교종의 예방 및 치료제의 개발이 가능할 것이다

이에 본 발명자들은 특정 코지산 유도체가 Src계 키나아제의 활성을 억제함으로써 C6 신경교종 세포의 증식을 저해한다는 사실을 확인하고, 나아가 대식세포에서 LPS 유도에 의해 일산화질소(NO)를 생성하고 인터루킨 6(IL-6)의 발현을 억제함을 확인함으로써 대식세포의 TLR4 매개 활성을 저해하는 코지산 유도체의 분자적 메카니즘을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 코지산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 코지산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하며,

[화학식 1]

상기 식에서, R₁은 수소, 할로겐, 히드록시, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시이고, R₂는 페닐, 페닐알킬, 히드록시페닐, 또는 디히드록시페닐일 수 있다;

[화학식 2]

상기 식에서, R1은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록시, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시이고, R2는 수소, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1에서 R1은 수소, 히드록시 또는 C₁-C₄ 알킬이고, 상기 R₂는 페닐 또는 히드록시페닐일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 R₁은 히드록시이고, 상기 R₂는 페닐일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식을 가지는 5-히드록시-2-((2-((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸티오)페닐티오)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-((2-((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methylthio) phenylthio)methyl)-4H-pyran-4-one)일 수 있다;

.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 2에서 R1은 수소, 히드록시, 또는 C₁-C₄ 알킬이고, 상기 R₂는 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알케닐일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 R₁은 히드록시이고, 상기 R₂는 C₁-C₄ 알킬일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 5-히드록시-2-(((2-(((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸)설파닐)에틸)설파닐)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-(((2-(((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methyl)sulfanyl)ethyl)sulfanyl)methyl)-4H-pyran-4-one) 또는 하기 화학식 4로 표시되는 5-히드록시-2-(((2-(((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸)설파닐)프로필)설파닐)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-(((2-(((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methyl)sulfanyl)propyl)sulfanyl)methyl)-4H-pyran-4-one)일 수 있다;

[화학식 3] [화학식 4]

또는

.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 신경교종 세포(glioma cell)로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종, 희소돌기아교세포종 및 시신경 교종으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 신경교종의 괴사(necrosis)를 유도하거나 세포증식(proliferation)을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 Src계 키나아제의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Src계 키나아제는 Src, Yes 또는 Fyn 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 대식세포의 TLR4 매개 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 대식세포에서의 LPS 유도 일산화질소(NO)의 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 대식세포에서 인터루킨 6의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 코지산 유도체들은 Src, Yes 또는 Fyn 등의 Src계 키나아제의 시그널 경로에 영향을 주어 이들의 활성을 억제함으로써 신경교종 세포들의 괴사를 유도하거나 증식을 억제하므로, 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종, 희소돌기아교세포종 및 시신경 교종 등의 신경교종 관련 종양을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 코지산 유도체의 신규 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 상기 코지산 유도체는 하기 화학식으로 표시되는 코지산으로부터 유래된 유도체 일 수 있다.

<화학식>

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 코지산(kojic acid)은 5-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4-pyrone 또는 2-Hydroxymethyl-5-hydroxy-γ-pyrone일 수 있다.

일반적으로 코지산은 전통적으로 술이나 된장 또는 간장과 같은 양조 식품을 만들 때 사용되는 누룩의 발효를 통하여 얻게 되는 물질로서, 멜라닌 색소 생성 효소인 타이로시네이즈(tyrosinase)의 활성을 억제하는 미백 성분 중의 하나로 알려져 있다. 또한, 지금까지 코지산 및 이의 유도체에 관한 연구들의 대부분은 티로시나제(Tyrosinase)의 활성을 억제하려는 방향에 대해서만 진행되어 왔을 뿐 아직까지 코지산 유도체의 항암 작용에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명에서는 이러한 코지산 유도체들이 항암 활성을 가지고 있다는 사실을 최초로 규명하였다.

본원에서 사용된 상기 "암" 및 "종양"의 용어는 숙주 기원의 비정상적으로 복제되는 세포가 대상체에서 검출 가능한 양으로 존재하는 질환을 지칭한다. 여기서 암은 악성 또는 비악성 암일 수 있으며, 암 또는 종양의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 담관암; 뇌암; 유방암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 상피내 신생물; 백혈병; 림프종; 간암; 폐암(예: 소세포 및 비-소세포); 흑색종; 신경교종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 신장암; 육종; 피부암; 고환암; 갑상선암; 및 기타 암종 및 육종이 포함될 수 있다. 또한 상기 암은 원발성 또는 전이성일 수 있으며, 그 중에서도, 상기 코지산 유도체는 신경교종의 예방 및 치료에 효과적이다.

본 발명에서는 보다 구체적으로 특정 코지산 유도체들이 Src, Yes 또는 Fyn 등을 포함하는 Src계 키나아제의 활성을 억제하고, 신경교종 세포의 괴사(necrosis)를 유도하며, 신경교종의 세포증식(proliferation)을 억제하고, 대식세포의 TLR4 매개 활성을 억제함과 동시에 LPS에 의해 유도된 일산화질소(NO)의 생성을 억제하고 나아가 인터루킨 6의 발현을 억제하는 활성이 있음을 규명하였다.

또한, 본 발명은 일 관점에서 하기 화학식 1로 나타내는 코지산 유도체에 관한 것으로서, 상기 코지산 유도체 화합물은 신경교종 세포의 증식을 억제시킴으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있는 의학적 용도에 효과적으로 적용될 수 있다.

상기 화학식에 있어서, R1은 수소, 할로겐, 히드록시, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시일 수 있고, R2는 페닐, 페닐알킬, 히드록시페닐, 또는 디히드록시페닐 등을 포함하는 아릴기일 수 있다.

바람직하게 상기 R1은 수소, 히드록시, 또는 알킬일 수 있고, 상기 R2는 페닐, 히드록시페닐일 수 있으며, 가장 바람직하게 상기 R1은 히드록시이고, R2는 페닐일 수 있다.

대표적인 화합물 1은 하기 화학식으로 표시되는 5-히드록시-2-((2-((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸티오)페닐티오)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-((2-((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methylthio)phenylthio)methyl)-4H-pyran-4-one)일 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 하기 화학식 2로 나타내는 코지산 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 하기 화학식으로 표시되는 화합물은 대식세포에서의 톨 유사 수용체(Toll-like receptor) 매개 활성을 억제하여 종양 또는 암 관련 미세 환 경을 조절함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있는 의학적 용도로서 적용될 수 있다.

상기 화학식에 있어서, R1은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록시, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시 일 수 있으며, R2는 수소, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐일 수 있다.

바람직하게 상기 R1은 수소, 히드록시, 또는 알킬일 수 있고, 상기 R2는 알킬, 알케닐일 수 있으며, 가장 바람직하게 상기 R1은 히드록시이고, R2는 알킬일 수 있다.

이러한 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 5-히드록시-2-(((2-(((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸)설파닐)에틸)설파닐)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-(((2-(((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methyl)sulfanyl)ethyl) sulfanyl)methyl)-4H-pyran-4-one) 또는 하기 화학식 4로 표시되는 5-히드록시-2-(((2-(((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸)설파닐)프로필)설파닐)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-(((2-(((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methyl) sulfanyl)propyl)sulfanyl)methyl)-4H-pyran-4-one)일 수 있다.

또한, 상기 화학식 1 및 화학식 2에 있어서,

본 발명에서 사용된 용어알킬은 임의의 탄소-탄소 단일 결합으로 이루어지는 치환 또는 비치환된 직쇄, 측쇄, 사이클릭 및/또는 복합 알킬을 의미하고, '알케닐'은 임의의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 치환 또는 비치환된 직쇄, 측쇄, 사이클릭 및/또는 복합 알케닐을 의미하며, '알키닐'은 임의의 탄소-탄소 삼중결합을 포함하는 치환 또는 비치환된 직쇄, 측쇄, 사이클릭 및/또는 복합 알키닐을 의미한다.

또한 본 발명에서 사용된 용어 '시클로알킬'은 고리를 형성하며, 고리 중 또 는 고리 상에 임의의 불포화 결합 및 임의의 헤테로원자(예를들어 O, N 또는 S)를 포함할 수 있는 치환 또는 비치환된 시클로알킬을 의미하고, '아릴'은 방향족 화합물로부터 유도되는 치환기로서, 치환 또는 비치환된 페닐, 비페닐, 나프틸 또는 안트라세닐 고리 시스템 등을 의미한다. 본 발명의 일례에서, R2는 치환되거나 치환되지 않은 페닐, 나프틸, 페난트릴, 스티릴, 아자비시클로옥탄 또는 아자비시클로헵탄기이다. 다른 일례에서는, R2는 알킬기, 알콕시기, 알콕시알킬기, 에스테르기, 알킬 아미노기, 디알킬아미노기, 사이클릭 아미노기, 할로겐 원자 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환된, 페닐, 나프틸, 페난트릴, 스티릴, 아자비시클로옥탄 또는 아자비시클로헵탄기이다. 또 다른 일례에서는 R2가 알킬아미노기, 디알킬아미노기 및 사이클릭 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환된, 페닐, 나프틸, 페난트릴, 스티릴, 아자비시클로옥탄 또는 아자비시클로헵탄기이다. 특히, 페닐(phenyl)은 탄소와 수소로 이루어진 작용기로 -C₆H₅ 의 화학식을 가지고, 6개의 탄소 원자는 순환 고리 구조를 이루며 배열되어 있는 라디칼을 의미한다. 페닐기에 히드록시기가 한 개 결합되어 있는 경우를 히드록시페닐이라 하고, 히드록시기가 두 개 결합되어 있는 경우를 히드록시페닐이라 한다.

'헤테로아릴'은 산소(O), 질소(N) 및 황(S)으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 5 내지 12원의 헤테로고리 또는 아릴 고리를 의미하고, 푸릴, 피롤릴, 피롤리디닐, 티에닐, 피리디닐, 피페리 딜, 인돌릴, 퀴놀릴, 티아졸, 벤즈티아졸 및 트리아졸 등을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화합물의 치환기의 정의에서 알킬은 바람직하게는 탄소수 1 내지 12의 알킬, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 8의 알킬, 가장 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬이고; 시클로알킬은 바람직하게는 탄소수 3 내지 12의 시클로알킬, 더욱 바람직하게는 탄소수 3 내지 8의 시클로알킬이며; 알콕시는 바람직하게는 탄소수 1 내지 12의 알콕시, 더욱 바람직하게는 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 가장 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이고; 알케닐은 바람직하게는 탄소수 2 내지 12의 알케닐, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 내지 8의 알케닐, 가장 바람직하게는 탄소수 2 내지 4의 알케닐이며; 알키닐은 바람직하게는 탄소수 2 내지 12의 알키닐, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 내지 8의 알키닐, 가장 바람직하게는 탄소수 2 내지 4의 알키닐이다.

본 발명에 따른 상기 코지산 유도체들은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

따라서 본 발명은 다른 관점에서 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 코지산 유도체의 제조방법을 제공할 수 있다. 또한, 하기 기술된 내용은 모두 R1이 히드록시기인 경우에 대한 제조방법의 일례를 기재하는 것으로서, 본 발명에 따른 제조방법은 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 하기 반응식에서 R2는 각각 앞서 기재한 바와 같다.

[반응식]

본 발명에 따른 코지산 유도체의 제조방법에 대한 일례를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 제1단계로서 염화물인 티오닐클로라이드를 유기용매 하에서 코지산과 반응하여 상기 화학식 (Ⅱ)으로 표시되는 코질클로라이드를 제조한다.

상기 단계에서 사용되는 코지산과 티오닐클로라이드는 1:1~1:1.3의 당량비로 반응시키는 것이 바람직하다. 이는 당량비가 1:1 미만이면 목적하는 생성물을 얻을 수 없고, 1:1.3 이상이면 목적하는 생성물 이외에 과량의 부산물이 생성되기 때문이다. 또한, 상기의 단계에서 사용되는 염화물로는 티오닐클로라이드, 옥살릴클로라이드, 포스포러스트리클로라이드,포스포러스옥시클로라이드 등을 사용할 수 있으며, 유기용매로는 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 테트라히드로 퓨란, 다이옥산, 아세톤, 톨루엔, 벤젠 등을 사용할 수 있다. 또한, 반응온도는 0~80℃, 바람직하게는 10~40℃일 수 있다.

이후, 제2단계로서 코질클로라이드의 제조가 완료되면 테레프탈릭산, 피리딘디카르복실산, 2,4-헥사디엔디오익산 등을 유기용매 하에서 수산화염과 반응시켜 상기 화학식 (Ⅲ)으로 표시되는 테레프탈릭산염, 피리딘디카르복실산염, 2,4-헥사디엔디오익산염 등을 제조한다.

이때, 상기 제2단계에서 사용되는 수산화염으로는 수산화나트륨, 수산화칼륨을 사용할 수 있으며, 유기용매로는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 이소프로필알콜 등을 사용할 수 있다.

이후, 제3단계로서 유기용매 하에서 상기 제2단계에서 생성된 테레프탈릭산염, 피리딘디카르복실산염, 2,4-헥사디엔디오익산염 등과 상기 제1단계에서 생성된 코질클로라이드를 반응시켜 코지산 이합체를 제조한다.

제3단계에서 사용되는 유기용매로는 디메틸포름아미드를 사용할 수 있다.

이상 상기와 같은 제조방법은 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 화합물의 분리 및 정제는 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해, 예를 들면, 간섭기를 적절히 보호하거나, 당분야에 공지된 다른 적당한 시약으로 교체하거나, 또는 반응 조건을 통상적으로 변화시킴으로써 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 화 합물 1의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 제조예들과 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

한편, 상기 방법에 의해 수득한 본 발명에 따른 상기 화학식 1 및 2의 코지산 유도체는 이하와 같은 활성을 가진다.

즉, 본 발명의 상기 화학식 1의 코지산 유도체는 신경교종(glioma)의 세포증식을 억제하는 활성을 가지며, 특히, 이는 Src family에 대한 활성을 억제하는 특징이 있다.

'신경교종'은 뇌속의 신경아교세포 또는 지지세포에서 시작하는 뇌 종양을 지칭한다. 이러한 신경교종으로는 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종, 희소돌기아교세포종 및 시신경 교종이 포함되며, "신경교모세포종", "다형성 신경교모세포종" 및 "IV급 성상세포종은 당업계에서 상호 교환적으로 사용되고 있으며 가장 넓은 의미에서 가장 흔한 형태의 뇌 종양인 악성 신경교종의 공격적인 형태뿐만 아니라 이러한 종양을 특징으로 하거나 이와 관련된 상태를 말한다. 따라서 세포 충만성 성상세포 종양(highly cellular astrocytic tumor)과 같은 신경교모세포종은 전형적으로 핵 및 세포 다형태성, 높은 혈관 증식, 임의에 의한 괴사를 동반한 높은 유사분열상, 현미경적 침윤성 병변, 높은 표지 지수 및 기타 이러한 진단적 척도를 특징으로 한다.

그러므로 본 발명에 따른 코지산 유도체에 의해 치료될 수 있는 신경교종으로는 성인 및 아동의 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종 및 혼합 신경교종이 포함될 수 있다.

한편, 상기 신경교종을 포함하는 종양에 있어서, 최근 몇 개의 종양유전자가 티로신 키나아제 효소를 암호화하고, 특정 성장 인자 수용체는 또한 티로신 키나아제 효소인 것으로 알려진 바 있다.

Src 부류의 비수용체 티로신 키나아제는 세포내에 위치하고, 종양 세포의 운동성, 전염, 침입 및 결과적인 전이 종양 성장에 영향을 주는 것을 포함하여 생화학적 신호 전달에 관여한다. Src 부류의 구성원으로는 c-Src, c-Yes, c-lck 및 c-Fyn을 들 수 있다.

또한, 세포외 자극이 없을 경우, 키나아제가 불활성 입체 형태로 유지되도록 Src 부류의 비수용체 티로신 키나아제가 정상 세포에서 매우 잘 조절된다는 사실 이 알려져 있다. 그러나 일부 Src 부류 구성원, 예컨대 c-Src 티로신 키나아제는 통상적인 인간의 암에서 정상 세포에 비해 종종 유의적으로 활성화 되는 것으로 밝혀졌다.

따라서 비수용체 티로신 키나아제의 억제제는 종양 세포의 운동성을 선택적 억제할 수 있는 억제제로서, 전이 종양 성장의 억제를 유도하는 포유동물의 암 세포의 전염 및 침입의 선택적 억제제로서 유효해야 하는 것으로 인지되고 있다. 따라서 c-Src 비수용체 티로신 키나아제의 주요한 역할은 혈류내로의 전염 단계, 기타 조직의 침입 단계 및 전이 종양 성장의 개시단계를 거쳐 진행하는 국소 종양에 필수적으로 요구되는 세포 운동성을 조절하는 것이다. 또한, c-Src 키나아제는 전이 중인 종양 세포의 침입 및 이동 성능을 부여하는 신호 전달 단계에 관여한다.

따라서 Src 키나아제의 억제제는 항종양제로서, 특히 전이 종양 성장 억제를 유도하고 암 세포의 운동성, 전염 및 침입을 선택적으로 억제하는데 유효하다.

특히, Src 키나아제 억제제로 기능하는 화합물은 전이 중인 종양 세포의 침입 및 이동 성능을 유도하는 신호 전달 단계에 관여하는 c-Src 키나아제와 같은 다수의 비수용체 티로신 키나아제 중 하나 이상의 억제에 민감한 종양을 예방 또는 치료하는데 유용할 수 있다. 또한, 이러한 화합물은 효소 c-Src의 억제에 의해 단독 또는 부분적으로 매개되는 종양의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 코지산 유도체는 농도 의존적으로 Src, Yes 또는 Fyn 키나아제 활성을 억제하는 특징이 있다. 이러한 결과는 본 발명의 일실시예에 있어서 Src 기능이 결실되어 있는 SYF 세포를 이용한 실험 및 Src 기능 저해제인 PP2를 처리한 실험을 통해서 확인할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 코지산 유도체는 Src 키나아제 신호 경로를 타겟팅 함으로써 Src 키나아제 매개의 하부(downstream) 신호 경로까지 영향을 주며, 결과적으로 신경교종 세포를 괴사(necrosis)에 이르게 할 수 있다. 그러므로 본 발명의 상기 화학식 1로 나타내는 코지산 유도체는 "Src-매개 경로"를 통해 신경교종 세포의 괴사를 유도함으로써 신경교종 세포의 증식을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1 및 화학식 2의 코지산 유도체는 대식세포(macrophage)의 TLR-매개 활성을 억제함으로써 종양 또는 암 관련 미세 환경을 조절할 수 있는 특징이 있다.

종양 관련 대식세포는 일반적으로 종양의 진행 및 전이와 관련되어 있으며, 최근 보고된 종양 억제 방법은 종양-관련 대식세포에 의해 과발현된 분자에 대하여 면역반응을 유도함으로써 대식세포를 공격하고 이들의 작용을 매개함으로 통해 종양의 미세 환경을 조절할 수 있다는 내용이 밝혀졌다(Oosterling et al. 2005 J. Pathol. 207:147-155; Emens et al. 2005 Endocr. Relat Cancer 12:1-17).

종양 관련 대식세포는 일산화질소(NO)의 생산 및 염증 촉진성 사이토카인으로 인해 종양 세포에 대해 세포독성이 거의 없는 분극화된 M2 대식세포 집단으로 이루어져 있다(Mills et al. 2000 J. Immunol.164:6166-6173).

특히, 일산화질소는 인터루킨(interleukin)과 같은 염증 촉진성 사이토카인, 프로스타글란딘(prostaglandin) 등과 함께 염증 유발 물질로 작용하여, 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래한다. 그러므로 대식세포의 일산화질소 생성을 저해하는 활성은 뇌 종양의 치료와 밀접한 관련이 있다고 할 수 있다.

한편, 본 발명의 코지산 유도체는 대식세포에 의해 유도된 iNOS에 의한 일산화질소의 생성을 저해하는 활성이 있다. 특히, 본 발명의 코지산 유도체는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 관련 활성, 그 중에서도 특히, TLR4를 매개로하는 활성을 조절하는 활성이 있다.

"톨-유사 수용체(Toll-like receptor:TLR)"는 병원체와 관련된 분자상 패턴(PAMP)을 인식하고 선천 면역에서 주요 신호전달 요소로서 작용하는 10개 이상의 고도로 보존된 포유류 패턴 인식 수용체 단백질(TLR1 - TLR10) 패밀리의 구성원을 지칭한다. TLR 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 서열을 갖는 세포외(세포질외) 도메인, 막관통 도메인 및 TLR 신호전달에 관여하는 세포내(세포질) 도메인을 포함하는 구조를 가지며, TLR에는 인간 TLR이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 코지산 유도체가 가장 효과적으로 영향을 끼치는 TLR은 TLR4인데, 인간 TLR4는 단핵구, 다형핵 식세포 및 수지상 세포에 존재하는 것으로 알려져 있다(Muzio M et al. 2000, J Leukoc Biol 67: 450-6).

현재 공지된 10가지의 인간 TLR 모두에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 유전자은행(GenBank) 등의 공개 데이터베이스로부터 입수가능하다. 유사하게, 수많은 비인간 종으로부터의 각종 TLR에 대한 핵산 및 아미노산 서열 역시, 유전자은행을 포함한 공개 데이터베이스로부터 입수가능하다.

"TLR 리간드" 및 "TLR에 대한 리간드" 는 TIR 도메인 이외의 TLR 도메인을 통하여 TLR과 직접 또는 간접적으로 상호작용하고 TLR 매개 신호전달을 유도하는 물질을 의미하는 것으로서, 수많은 TLR에 대한 리간드가 보고되었다. 그 중에서도 TLR4는 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 반응하여 신호를 보내는 것으로 보고된 바 있다(Hoshino K et al. 1999, J Immunol 162: 3749-52; Poltorak A et al. 1998, Science 282: 2085-8; Medzhitov R et al. 1997, Nature 388: 394-7).

TLR 매개 신호전달은 TLR의 TIR 도메인의 구조 및 기능과 관련하여 TLR과 적합한 TLR 리간드와의 상호작용과 관련된 세포내 신호 전달 경로의 일부를 지칭하는 것으로서, 본 발명의 코지산 유도체는 TLR4와 TLR 리간드인 LPS와의 상호작용과 관련되어 세포내 신호 전달 경로를 저해하는 기능을 가진다. 즉, TLR4 매개 활성을 조절함으로써 대식세포에서의 일산화질소 생성을 현저히 감소시킬 수 있는 것이다.

또한, 본 발명의 코지산 유도체는 지질다당류(LPS)에 의하여 자극된 대식세포에서 인터루킨 6(IL-6)의 발현을 저해함으로써 암을 억제하는 활성을 갖는다.

IL-6은 미토겐, 바이러스 감염 또는 IL-1에 의해 자극을 받았을 때 T 세포, 대식 세포, 섬유모세포, 근육 세포 등으로부터 생산되는 분자량이 21,000인 당단백질이다.

IL-6은 (i) 세포 증식 유도(하이브리도마, T 세포, 각질세포, 신장 혈관사이 세포), (ii) 세포 증식 저해(골수성 백혈병 세포주, 악성 흑색종 세포주) 및 (iii) 세포 분화 유도 및 세포의 특정 단백질 생산 유도(멜라닌 세포종 세포주의 신경 분화, 살해 T 세포의 분화, 거대핵세포 성숙, 골수성 백혈병 세포주의 대식 세포로의 분화, B 세포의 항체 생산, 간세포에서의 급성 병기단백질 생산)을 포함하는 다양한 생물학적 활성을 갖는다.

본 발명의 코지산 유도체는 이러한 IL-6의 발현을 억제함으로써 신경교종 세포 증식을 저해하고, T 세포 증식 유도 등과 관련된 종양 관련 메카니즘에 영향을 끼치게 된다. 특히, IL-6의 단백질 발현을 억제시킨다는 사실을 통해 상기 작용들이 전사 수준에서 일어남을 알 수 있다.

나아가 본 발명의 코지산 유도체는 농도 의존적으로 비례하는 항암 활성을 가지는 특징이 있다.

본 발명에서 신경교종의 억제에 효과적인 코지산 유도체의 용량은 3~200㎍/㎖으로서, 200㎍/㎖을 초과하면 세포독성을 일으킬 염려가 있고, 3㎍/㎖ 미만의 경우에는 유효한 효과를 발휘하기 어려운 점이 있다. 또한, 상기 범위 내에서 코지산 유도체는 용량에 따라 앞서 기재한 기능들은 다소 증가하는 경향이 있다.

본 발명의 코지산 유도체는 Src 키나아제 활성을 용량 의존적으로 현저하게 억제할 수 있으며, 대식세포에서의 TRL4 매개 활성을 저해함으로써 일산화질소의 생성을 감소시키고, IL-6와 같은 사이토카인의 생성 역시 억제함으로써 신경교종 세포 유래의 암 질환에 유효한 치료 및 예방효과를 갖는다.

그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 상기 코지산 유도체를 포함하는 항암용 조성물을 제공할 수 있으며, 바람직하게는 신경교종, 예를 들어, 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종, 희소돌기아교세포종 및 시신경 교종 등에 대하여 항암 활성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 '항암'이라는 용어는 암 질환의 치료 즉, 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽이는 것 뿐만 아니라, 암 질환의 예방, 즉 암 발병 이전에 암에 대한 저항력을 높이는 것도 함께 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 본 명세서에서 "암 예방 또는 치료"라는 용어와 '항암'이라는 용어는 혼재하여 사용되었다.

상기 '치료하는'이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 암의 "치료" 또는 "치료요법" 은 다음의 하나 이상을 포함할 수 있다. 즉, (1) 암의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴, (2) 암의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함, (3) 암을 경감시킴, 즉, 암의 퇴행을 야기시킴, (4) 암의 재발을 예방함, 및 (5) 암의 증상을 완화함(palliating) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

이하에서 별도의 설명이 없는 한, 용어 "본 발명에 따른 코지산 유도체" 또는 "화학식 1 또는 2의 화합물"은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭을 모두 포함하는 개념으로 사용된다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 용어 "수화물", "용매화물" 및 "이성질체" 역시 상기와 같은 의미를 가진다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 석신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모늄 염, 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.

따라서 본 발명은 환자에게 유효량의 화학식 1의 화합물을 투여하여 Src 키나아제 활성을 저해함으로써 종양세포 증식을 억제하여 암을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 환자에게 유효량의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 투여하여 대식세포에서의 TRL4 매개 활성을 저해함으로써 NO 생성을 감소시키고, IL-6와 같은 사이토카인의 생성 역시 억제함으로써, 종양 관련 미세환경을 조절함으로써 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 코지산 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하며, 상기 본 발명의 조성물은 암의 증상을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항암용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 코지산 유도체 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 코지산 유도체 화합물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또 한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 항암용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 항암용 조성물은 암의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 코지산 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 항암용 조성물은 암의 예방 또는 개선 효과를 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으며, 따라서 상기 본 발명의 조성물은 항암 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 항암 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물은 암 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 항암 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으 로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 암 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 항암 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 항암 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.01g 내지 20g, 바람직하게는 0.3g 내지 10g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

나아가 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 Src계 키나아제 활성에 의한 신호전달(signaling)을 억제하는 방법을 제공할 수 있으며, 구체적으로 Src 키나아제 활성 억제 방법을 살펴보면, (a) 상기 화학식 1의 코지산 유도체의 부재 하에 Src계 키나아제 활성에 의한 신호전달을 자극하기 위한 TLR 신호 효능제의 유효량; 및 (b) 상기 화학식 1의 코지산 유도체의 유효량을 접촉시킨 후, 화학식 1의 코지산 유도체의 부재 하에서 TLR 신호 효능제에 반응하는 TLR에 의한 신호전달과 비교함으로써 TLR 신호 효능제에 반응하는 TLR의 신호전달을 억제하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 신경교종 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 이용하여 대식세포(macrophage)의 TLR4 매개 활성을 억제 및 일산화질소(NO) 생성을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 이용하여 대식세포에서의 인터루킨-6(IL-6) 발현을 전사수준에서 억제하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 모든 방법에 있어서, 화학식 1 또는 화학식 2의 코지산 유도체는 수화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태일 수 있으며, 본 발명의 모든 측면에 의한 방법은 시험관 내에서 수행하거나 생체 내에서 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1>

<1-1> 실험 준비

코지산 유도체의 5종의 화합물, RHS-0107, 0108, 0110, 0111 및 0112는 (주)아모레 퍼시픽(한국) R&D 센터에서 입수하여, 95% 이상의 순도를 가지고 있음을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 또한, 쥐의 C6 글리오마(glioma) 세포 및 대식세포인 RAW264.7 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 구입하였고, SYF 세포를 과천 대학교 연구실로부터 입수하였다. 포스포티로신(phosphotyrosine, PY), Src(Y416), Akt(S473), Akt, Fyn, Yes 및 β-actin에 대한 phospho- 또는 전체 항체는 Cell Signaling(Beverly, MA) 및 Santa Cruz Biotechonlogy(Santa Cruz, CA)로부터 구입하여 준비하였다. 또한, 이하 실시예에서 수득한 값은 평균±S.M.E.로 표시하였고, 통계적 유의도(Statistical significance)는 t-test 및 one-way ANOVA에 따라 가변조건을 분석하여 결정하였다(*:p < 0.05; **:p < 0.01).

<1-2> 세포 배양

Rat C6 glioma 세포, RAW264.7 세포 및 SYF 세포를 10% FBS, 페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Essential Medium) 배지에서 37 ℃ 및 5% CO₂를 유지하는 습식 배양기에서 배양하였다.

<실시예 1>

코지산 유도체에 따른 세포 생존율 분석

상기 본 발명에 따른 코지산 유도체들에 의한 세포 생존율을 통상적인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolum bromide) 분석을 이용하여 측정하였다. 이를 위해 5x10⁴ cells/well의 C6 glioma 세포에 상기 준비한 5종의 코지산 유도체를 각각 농도별로 처리하여 배양한 후, MTT 용액 0.5mg/ml으로 37 ℃ 에서 4시간 동안 추가 배양하고, 490nm에서 마이크로 플레이트 리더기(Molecular Device corp.(Menlo Park, CA))로 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 또한 양성 대조군으로 상기 세포에 Src 키나아제 활성 억제제로서 알려져 있는 PP2를 처리한 것을 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, RHS-0110 화합물이 C6 glioma 세포의 생존율을 현저히 감소시키는 것으로 나타났으며, 특히, 대조군에 비해 약 3배 이상의 생존 저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 코지산 유도체 RHS-0110을 3 내지 200μM 농도로 처리한 경우, C6 glioma 세포의 생존 저해 활성은 매우 높은 것으로 나타났고, 특히 IC₅₀ 값이 4.7μM 일 때, 가장 우수한 저해 활성을 나타내었다. 또한, 코지산 유도체의 세포 생존 저해 활성은 농도-의존적으로 비례한다는 것을 알 수 있었다(도 3 참조). 또한, Src 키나아제 활성 억제제인 PP2를 처리한 경우도 C6 glioma 세포의 생존을 억제하는 것으로 나타났으나 본 발명에 따른 코지산 유도체인 RHS-0110을 처리한 경우가 더 우수한 결과를 보였다.

그러므로 상기 결과를 통해 본 발명의 코지산 유도체, 특히 RHS-0110는 Src 키나아제 활성 억제를 통해서 C6 glioma 세포의 증식을 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

<비교예 1>

SYF 세포의 세포 생존율 분석

SYF 세포 5x10⁶ cells/well에 대하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 코지산 유도체 RHS-0110을 3 내지 12μM 농도로 처리한 경우 SYF 세포의 생존능에는 거의 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났으며, 더욱이 56μM의 IC₅₀ 값을 가지는 경우에서는 도 2에서 나타난 C6 glioma 세포 생존능 저해 활성에 비하여 약 10배나 낮은 저해 활성을 나타내었다(도 3a). 또한, PP2를 처리한 경우도 SYF 세포의 생존능에는 영향을 끼치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 3b).

그러므로 Src 키나아제가 결실되어 있는 SYF 세포를 이용한 상기 결과를 통해 코지산 유도체 RHS-0110는 Src 키나아제 활성 억제를 통해서 C6 glioma 세포의 증식을 저해하는 사실을 명확히 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

코지산 유도체의 Src계 키나아제의 활성에 대한 영향

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 사용한 C6 glioma 세포와 SYF 세포 5x10⁶ cells/well를 차가운 PBS에서 1mM sodium orthovanadate로 3번 세척하고, 용해 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 7.4, 2mM EDTA, 2mM 에틸렌글리코테트라 아세트산(ethyleneglycotetraacetic acid), 50mMβ-glycerophosphate, 1mM sodium orthovanadate, 1mM dithiothreitol, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 10㎍/ml aprotinin, 10㎍/ml pepstatin, 1mM bensimide 및 2mM PMSF)에서 용해시킨 후, 30분 동안 4℃에서 교반시켰다. 이후 세포 용해물(lysates)을 10분 동안 4℃에서 16,000 g로 원심분리 한 후, 사용 전까지 20℃에 저장해 두었다. C6 glioma 세포 1x10⁷ cells/ml로부터 동일한 양의 단백질 500㎍을 함유하는 세포 용해물에 상기 5종의 코지산 유도체를 정해진 시간마다 각각 처리하고 1시간 동안 4℃에서 10μl의 protein A-coupled Sepharose Magnetic beads(50% v/v)(ELPIS BIOTECH, 대전, 한국)로 pre-clearing하였다. 이때 대조군으로는 상기 유도체를 처리하지 않은 것을 사용하였다. 이후 상기 단계를 거친 샘플들을 항-Src 항체 5μl로 처리하여 4℃에서 밤새 배양하고, 면역 복합체를 10μl의 protein A-coupled Sepharose Magnetic beads(50% v/v)와 혼합한 후 3시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 세포 용해물 전체를 면역블롯팅으로 분석하였다. 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리시키고 PVDF(polyvinylidenedifluoride) 막에 electroblotting에 의해 옮겼다. PVDF 막을, 실온에서 3% 우혈청 알부민, 20mM NaF, 2mM EDTA 및 0.2% Tween 20을 함유하고 있는 TBS (Tris-buffered saline)에서 60분 동안 blocking시켰다. 상기 막을 4℃에서 60분 동안 특정 1차 항체로 배양한 다음 동일한 버퍼로 3번 세척하고 다시 추가로 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 2차 항체로 추가 배양하였다. Ark, Src 및 β-actin의 전체 및 인산화 수준을 ECL 시스템(Amersham, Little Chalfont, Huckinghamshire, UK)을 이용하여 가시화하였다.

한편, C6 glioma 세포 5x10⁶ 를 24시간 동안 RHS-0110로 처리한 후 배양한s 다음, 전체 세포 용해물로부터 준비한, 면역 침강된 Yes와 Fyn에 대하여 티로신 인산화 수준을 인산화된 티로신 항체를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 코지산 유도체 RHS-0110를 24시간 또는 48시간 동안 처리한 C6 glioma 세포에서는 Src 발현이 현저히 억제된 것으로 나타났고(위의 결과), 면역 침강후 인산화 수준을 측정한 결과, RHS-0110는 Yes 및 Fyn 키나아제의 활성을 변화시키지 않았을 뿐만 아니라(아래 사진), 이들의 단백질 양도 변화가 없었다(도시 않음). 이러한 결과는 Src 키나아제가 코지산 유도체 RHS-0110의 주요한 타겟이 될 수 있음을 시사한다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, Src 활성에 의한 다운스트림 시그널링 역시 코지산 유도체 RHS-0110에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다. 특히, PI3K의 조절인 자 p85 및 다운스트림 키나아제 Akt의 대표적인 두 효소의 인산화는 Src 활성에 의해 시작되므로, 도 5의 도면을 통해 이들이 RHS-0110에 의해 명백히 억제되는 것을 알 수 있었다.

그러므로 상기 결과는 Src 및 이의 다운스트림 시그널링 경로가 코지산 유도체 RHS-0110의 항-증식성 타겟 경로를 매개하고 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

DNA laddering 패턴 및 핵 염색 분석

DNA laddering assay를 통하여 코지산 유도체 RHS-0110의 세포사멸(apoptosis) 및 세포괴사(necrosis)효과를 알아보았다. 이를 위하여, C6 glioma 세포와 SYF 세포 5x10⁶ cells/ml에 대하여, RHS-0110, 에탄올(10%), SNP(1mM)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 에탄올은 세포괴사 여부를 확인하기 위해 사용한 것이며, SNP는 세포사멸 여부를 알아보기 위해 사용한 것이다. 이후, 상기 배양물로부터 당업계에 공지된 방법을 통해 DNA 추출물을 수득한 다음 DNA laddering 패턴을 아가로스 겔 전기영동 방법에 의해 분석하였다.

또한, C6 glioma 세포 5x10⁵ cells/ml에 대하여 동일한 방법으로 HS-0110, EtOH(10%), SNP(1mM)를 처리하고 24시간 동안 배양한 후 핵 염색을 실시하였는데. 즉, 배양된 세포들을 PBS로 두 번 세척하고 10% 포르말린으로 5분 동안 고정시킨 후, PBS에서 5분 동안 0.1% Triton-X 100으로 투과시켰다. 이후 PBS로 두 번 더 세 척한 다음, 핵을 10㎍/ml Hoechat33342로 15분간 염색시켰다. 염색된 세포들을 IX51 형광 현미경을 사용하여 눈으로 확인한 다음, DP controller(Olympus Optical, 일본)로 이미지를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, RHS-0110를 처리한 경우는 에탄올을 처리한 경우와 유사한 패턴을 보였으나 SNP를 처리한 경우와는 상이한 패턴을 보였다. 이러한 결과는 RHS-0110이 C6 glioma 세포의 괴사를 유도한다는 사실을 시사한다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 사멸된 세포(apoptotic bodies)나 핵(nuclei)은 RHS-0110를 처리한 경우에는 관찰되지 않았으나, SNP를 처리한 경우에는 관찰되었다(도 7의 화살표).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 코지산 유도체 RHS-0110는 세포사멸 보다는 세포괴사를 유도하고 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4>

코지산 유도체의 일산화질소 생성에 대한 영향

5종의 코지산 유도체의 존재 또는 부재하에서 대식세포 RAW264.7 세포 2x10⁶ cells/ml에 LPS (1㎍/㎖)를 처리하여 24시간 자극하였다. 이후, 배양 상등액에서 일산화질소의 농도를 주요 일산화질소의 산화산물인 아질산염(nitrite)을 이용하여 Griess 시약으로 측정하였다. 각 세포의 배양배지 100㎕를 동일한 부피의(100㎕) Griess 시약(1% 설파닐아미드(sulfanilamide)/0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민디하 이드로클로라이드(naphthylethylenediaminedihydorchloride)/2.5% 인산)과 혼합하였다. 이후 아질산염의 수준을 ELIZA 플레이트 리더기를 이용하여 540㎚에서 착색미터법으로(colorimetrically) 측정하고, 공지의 아질산나트륨 농도로부터 제작된 아질산염 표준곡선을 참고하여 아질산염 농도를 산출하였다. 또한 상기 실시예 1에 기재된 MTT assay방법을 통해 세포생존율도 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 RHS-0107, 0108 및 0110의 존재하에서 대식세포 RAW264.7의 일산화질소 생성은 현저하게 감소된 것으로 나타났으며(더 8a), 일산화질소 검출 분석에 따르면, RHS-0107는 약 70%, RHS-0108는 약 80% 및 RHS-0110는 약 95% 까지 감소율을 보였다.

한편, RHS-0107 및 0108의 세포 독성 수준은 각각 50%, 60%로 대조군과 유사하게 나타났으며(도 8b), 따라서 세포독성 활성과는 크게 관련이 없음을 알 수 있었다. 다만, RHS-0110의 일산화질소 생성 억제 활성과 관련하여, 25 μM 이하 농도에서는 63%의 억제효율을 보였을 뿐만 아니라(도 8c) 세포독성에 있어서도 대조군과 비교하여 약 65%의 세포가 생존하고 있음을 확인할 수 있었다(도 8d).

그러므로 상기 결과를 통해, 특정 코지산 유도체들이 대식세포에서 일산화질소의 생성을 저해하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었고, 특히 RHS-0110 코지산 유도체가 세포 독성이 없으면서 대식세포에서 일산화질소의 생성을 현저하게 저해하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5>

코지산 유도체의 IL-6 발현에 대한 영향

RT-PCR에 의해 IL-6의 mRNA 발현 수준을 평가하기 위하여, LPS 처리된 RAW264.7 세포 5x10⁵ cells/ml로부터 TRIzol 시약(Gibco, BRL)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 이 때, RAW264.7 세포들을 코지산 유도체를 처리하여 6시간 동안 배양한 후, TRIzol(1ml/각 플레이트)를 처리하고 얼음 위에서 10분 동안 배양한 다음, TRIzol 세포 용해물을 DNA fragment 추출을 위해 사용하였다. 그리고 PCR에 사용된 프라이머(Bioneer, 서울, 한국)는 다음에 기재된 바와 같으며, 증폭 후, PCR 반응물을 RT 아가로스 겔에 전기영동 하였다.

PCR에 사용된 프라이머 서열

유전자	염기서열	서열번호
IL-6	5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3'	1
	5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3'	2
GAPDH	5'-CACTCACGGCAAATTCAACGGCAC-3'	3
	5'-GACTCCACGACATACTCAGCAC-3'	4

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, LPS 자극 하의 RAW264.7 세포에 특정 코지산 유도체를 처리하면 IL-6의 발현이 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 코지산 유도체는 LPS에 의해 자극된 IL-6의 유도를 전사단계에서 효과적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1은 코지산 및 5종의 코지산 유도체가 세포 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 2a 및 2b는 C6 glioma 세포에 RHS-0110 코지산 유도체를 농도별로 처리한 경우의 세포생존율 분석결과(2a) 및 Src 억제제인 PP2처리한 경우의 세포 생존율 분석결과(2b)이다.

도 3a 및 3b는 SYF 세포에 RHS-0110 코지산 유도체를 농도별로 처리한 경우의 세포생존율 분석결과(3a) 및 Src 억제제인 PP2처리한 경우의 세포 생존율 분석결과(3b)이다.

도 4 및 도 5는 코지산 유도체 RHS-0110를 처리한 Src계 키나아제 구성원들에 대하여 면역침강 및 면역블럿팅 분석 결과이다.

도 6 및 도 7은 코지산 유도체 RHS-0110를 처리한 경우 세포사멸 및 세포괴사 효과를 알아보기 위한 DNA ladderting 패턴 분석결과 및 형광 현미경 사진이다.

도 8은 LPS에 의해 자극된 대식세포 RAW264.7세포에 코지산 유도체 RHS-0110를 처리한 경우, Griess assay을 이용한 의 NO 생성율 분석결과 및 MTT assasy를 이용한 세포생존율 분석결과이다.

도 9는 LPS에 의해 자극된 대식세포 RAW264.7세포에 코지산 유도체 RHS-0110를 처리한 경우의 RT-PCR을 이용한 IL-6의 발현 분석결과이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Kangwon National University <120> Anti-cancer Composition containing Kojic acid Derivatives <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 F primer <400> 1 gtactccaga agaccagagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 R primer <400> 2 tgctggtgac aaccacggcc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 3 cactcacggc aaattcaacg gcac 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 4 gactccacga catactcagc ac 22

Claims (15)

1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 코지산 유도체를 유효성분으로 함유하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물:

   [화학식 1]

   

   상기 식에서, R₁은 수소, 할로겐, 히드록시, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시이고, R₂는 페닐, 페닐알킬, 히드록시페닐, 또는 디히드록시페닐이다;

   [화학식 2]

   

   상기 식에서, R₁은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록시, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시이고, R₂는 수소, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이다.
2. 제1항에 있어서,

   상기 화학식 1에서 R₁은 수소, 히드록시 또는 C₁-C₄ 알킬이고, 상기 R₂는 페닐 또는 히드록시페닐인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서,

   상기 R₁은 히드록시이고, 상기 R₂는 페닐인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
4. 제3항에 있어서,

   상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식을 가지는 5-히드록시-2-((2-((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸티오)페닐티오)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-((2-((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methylthio)phenylthio)methyl)-4H-pyran-4-one) 화합물인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물:

   

   .
5. 제1항에 있어서,

   상기 화학식 2에서 R₁은 수소, 히드록시, 또는 C₁-C₄ 알킬이고, 상기 R₂는 C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알케닐인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서,

   상기 R₁은 히드록시이고, 상기 R₂는 C₁-C₄ 알킬인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
7. 제6항에 있어서,

   상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 5-히드록시-2-(((2-(((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸)설파닐)에틸)설파닐)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-(((2-(((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methyl)sulfanyl)ethyl) sulfanyl)methyl)-4H-pyran-4-one) 또는 하기 화학식 4로 표시되는 5-히드록시-2-(((2-(((5-히드록시-4-옥소-4H-피란-2-일)메틸)설파닐)프로필)설파닐)메틸)-4H-피란-4-원(5-hydroxy-2-(((2-(((5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl)methyl)sulfanyl) propyl)sulfanyl)methyl)-4H-pyran-4-one) 화합물인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물:

   [화학식 3] [화학식 4]

   

   또는

   

   .
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,

   상기 암은 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종, 희소돌기아교세포종 및 시신경 교종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
10. 제1항에 있어서,

    상기 화학식 1의 화합물은 신경교종의 괴사(necrosis)를 유도하거나 세포증식(proliferation)을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
11. 제10항에 있어서,

    상기 화합물은 Src계 키나아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
12. 제11항에 있어서,

    상기 Src계 키나아제는 Src, Yes 또는 Fyn 인 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
13. 제1항에 있어서,

    상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 대식세포의 TLR4 매개 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
14. 제13항에 있어서,

    상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 대식세포에서의 LPS 유도 일산화질소(NO)의 생성을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.
15. 제1항에 있어서,

    상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 대식세포에서 인터루킨 6의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 신경교종(glioma cell) 세포로부터 유래된 암 예방 및 치료용 조성물.

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