KR101121805B1 - 항염증 활성을 갖는 헤테로 고리 치환 신규 플라보노이드 유도체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 일반식 (I) 로 표기되는 신규한 플라보노이드 유도체, 약학적으로 허용 가능한 그의 염 및 이들을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 일반식 (Ⅰ)로 표기되는 플라보노이드 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 염증유도성 효소인 시클로옥시게나아제-2 (cyclooxygenase-2, 이하 "COX-2"라고 약칭함) 및 유도성 나이트릭 옥사이드 신타아제 (inducible nitric oxide synthase, 이하 "iNOS"이라고 약칭함)의 발현 또는 활성을 저해함으로써 염증질환치료, 면역계 이상 질환 또는 암질환 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
플라보노이드, 유도체, 염증질환, 면역계 이상, 암질환
Description
본 발명은 염증 유발성 효소들의 발현 또는 활성 억제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 플라본 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 시클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, 이하 "COX-2"라고 약칭함) 및 유도성 나이트릭 옥사이드 신타아제(inducible nitric oxide synthase, 이하 "iNOS"이라고 약칭함)의 발현 또는 활성억제제에 관한 것이다.
[문헌 1] Cell, 83, 345, 1995
[문헌 2] J. Biol. Chem., 271, 33157, 1996
[문헌 3] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3228 (1994)
[문헌 4] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12013(1994)
[문헌 5] WO 9606840
[문헌 6] Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 2337, 1995
[문헌 7] Ann. Report. Med. Chem., 211, 1997
[문헌 8] Furchgott RF and Zawadzki JV, 1980
[문헌 9] Hibba, 1987
[문헌 10] Nathan and Xie, 1994
[문헌 11] Havsteen, Biochemical Pharmacology32, 1114, 1983
[문헌 12] Kim et al., J. Pharmacol. Sci. 96, 229-245, 2004
[문헌 13] Bauman et al., Prostaglandins 20, 627, 1980
[문헌 14] Ferrandiz et al., Pharmazie 45, 206, 1990
[문헌 15] Laughton et al., Biochemical Pharmacology42, 1673, 1991
[문헌 16] Liang et al., Carcinogenesis 20, 1945, 1999
[문헌 17] Kim et al., Biochemical Pharmacology 58, 759, 1999
[문헌 18] Chi et al., Biochemical Pharmacology 61, 1195, 2001
[문헌 19] Cho et al., J. Ethnopharmacology 70, 127, 2000
[문헌 20] Krakauer et al., FEBS Letter 500, 52, 2001
[문헌 21] de Rossi, R. H., Veglia, A. V. On the product distribution in the iodination of phenol. Tetrahedron Lett. 27, 5963-5966, 1986
[문헌 22] Jinhee Jang, Kwan-Seog Sin, Hyun Pyo Kim, Haeil Park. "Inhibitory activity of 8-aminowogonin analogues against prostaglandin E2 production" Yakhak Hoeji 2008, 52(1), 85-91
[문헌 23] Biochemical Pharmacology 61, 1195, 2001
[문헌 24] Chi et al., Biochem. Pharmacol. 61, 1195-1203, 2001
[문헌 25] J. Immumological Methods 65, 55, 1983
[문헌 26] 김 등, Arch. Pharm. Res. 16, 18-24, 1993
시클로옥시게나아제(cyclooxygenase, 이하 "COX"라고 약칭함)는 아라키돈산(arachidonic acid, 이하 “AA"라고 약칭함)으로부터 프로스타글란딘(prostaglandins, 이하 ”PGs" 이라고 약칭함)의 생합성에 관여하는 효소로, 생체 내에서 COX-1과 COX-2의 두 가지 이성효소로 존재하는 것으로 밝혀져 있다(Cell, 83, 345, 1995). COX-1은 구조성 효소(constitutive enzyme)로, 정상상태에서 발현하여 위장관보호, 신장기능조절과 같은 신체의 항상성의 유지에 관여하는 반면, COX-2는 유도성 효소(inducible enzyme)로, 염증이나 기타 면역 반응시 세포분열인자(mitogen)나 사이토카인류(cytokines)에 의해 세포내 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다(J. Biol. Chem., 271, 33157, 1996). 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal antiinflammatory drug, 이하 “NSAIDs"라고 약칭함)들은 COX-2 효소를 억제함으로써 소염진통효과를 나타내지만, COX-1 효소 또한 불필요하게 억제하기 때문에 위장관 출혈이나 신장 독성과 같은 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3228 (1994); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12013(1994)).
따라서 COX-2를 선택적으로 저해할 수 있는 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있고(WO 9606840; Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 2337, 1995; Ann. Report. Med. Chem., 211, 1997), 셀레브렉스(celebrex)가 COX-2를 선택적으로 억제하면서 위장관 출혈의 부작용을 완화시킨 약물로 개발되어 시판되고 있다.
그리고 선종성 폴립은 대장점막에서 PGE2를 증가시키는데, 상기 PGE2는 AA대사과정에서 COX에 의해 초래되는 것이기 때문에 COX를 억제시키는 COX-2 억제제에 의해 대장암 등의 발암과정을 억제시킬 수 있고, 따라서 COX-2 억제제는 대장암을 위시한 암의 예방요법제로도 사용할 수 있다.
나이트릭 옥사이드(nitric oxide, 이하 "NO"라고 약칭함)는 나이트릭 옥사이드 신타아제(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 L-아르기닌으로부터 생성된다. NO는 처음에 아세틸콜린(acetylcholine) 및 브라드키닌(bradykinin)과 같은 물질의 작용을 매개하여 혈관을 확장시키는 인자로 알려졌고(Furchgott RF and Zawadzki JV, 1980) 그 후, NO가 대식세포(macrophage)의 항종양 및 항균작용에 반응하는 것으로 밝혀져 있다(Hibba, 1987). Inducible NOS (iNOS)는 건강한 조직에서는 거의 발현되지 않고, 면역적인 공격이나 상처를 받았을 때 나타나며, 염증유발 상태에서 iNOS는 신경세포, 성상세포(astrocytes) 및 내피세포를 포함하는 대부분의 조직에서 나타날 수 있고 염증의 매개물질로 작용한다(Nathan and Xie, 1994). NO의 형성은 또한, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 궤양성 대장염 등과 같은 자가면역 질환과 홍반, 혈관 확장 등과 같은 전형적인 염증증상에서 증가되고, 이러한 증상은 iNOS 저해제에 의해 호전되는 것으로 알려져 있다.
한편, 현재까지 4000여종 이상으로 알려져 있는 식물 플라보노이드 유도체들은 항염증, 항알러지, 항암활성 등 많은 생물학적 활성이 알려져 있다(Havsteen, Biochemical Pharmacology32, 1114, 1983). 이들이 나타내는 생물활성 중 항염증 또는 항알러지 작용은 여러 연구자들에 의해 1960년대부터 동물모델에서 증명되어 왔다(Kim et al., J. Pharmacol. Sci. 96, 229-245, 2004). 수종의 플라보노이드 유도체들의 항염증 작용기전에 대한 연구결과도 많이 발표되어 왔으나, 1980년 수종의 플라보노이드 유도체들이 에이코사노이드(eicosanoid) 생성효소인 COX 및 리폭시게나아제(lipoxygenase, 이하 “LOX"라고 약칭함)를 저해한다는 것이 발표된 이후(Bauman et al., Prostaglandins 20, 627, 1980), 많은 연구자들은 이들 유도체들의 아라키돈산(arachidonic acid, 이하 ”AA"라고 약칭함) 대사효소에 대한 작용 및 in vivo 항염증 또는 항알러지 작용에 대한 연구를 계속 진행하여 왔다. 실제로 플라보노이드들은 화학구조에 따라 COX 또는 LOX를 저해한다는 많은 논문이 발표되었으며(Ferrandiz et al., Pharmazie 45, 206, 1990; Laughton et al., Biochemical Pharmacology42, 1673, 1991) 현재도 계속적으로 연구가 진행중이고, 최근 수종의 플라보노이드 유도체들이 다른 염증유도성 효소인 iNOS의 발현을 억제한다는 것이 확인되었다(Liang et al., Carcinogenesis 20, 1945, 1999; Kim et al., Biochemical Pharmacology 58, 759, 1999; Chi et al., Biochemical Pharmacology 61, 1195, 2001). 또 다른 특정구조의 플라본 유도체들이 염증유발과 관련이 있는 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, 이하 “TNF-α"라고 약칭함) 또는 인터루킨-1(interleukin-1, 이하 ”IL-1“이라고 약칭함) 등의 염증유발 사이토카인(cytokine)들의 생성을 억제한다는 것이 알려져 있다(Cho et al., J. Ethnopharmacology 70, 127, 2000; Krakauer et al., FEBS Letter 500, 52, 2001). 그러나 지금까지 발견된 이들 유도체들은 COX-2 및 iNOS의 발현 또는 활성 억제능 력이 부족하므로 염증질환 치료, 면역조절 또는 암질환 예방 효과가 제한적이므로 COX-2 및 iNOS의 발현 또는 활성 억제능력이 우수한 새로운 구조의 염증유발성 효소 억제제의 개발이 요구되어 왔다.
본 발명의 목적은 COX-2 및 iNOS 유도 염증 매개체들의 합성에 대한 강력한 억제 활성을 나타내는 플라보노이드계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 염증질환치료, 면역계 이상 질환 또는 암질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자는 본 발명자들에 의하여 새롭게 제조된 헤테로 고리 치환 신규 플라보노이드계 화합물 유도체들이 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체들의 합성을 강력하게 저해함을 확인하여 염증 질환의 치료 및 예방 약제로서 개발가능성이 높음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 COX-2 및 iNOS 유도 염증 매개체들의 합성에 대한 강력한 억제 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
상기 식에서,
X는 O 또는 N이며;
R1 내지 R9 는 각각 독립적으로 수소원자, C1 내지 C3 저급알킬기, 히드록시기, C1 내지 C3 저급알콕시기 및 P치환기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며,
여기에서 P 치환기는 R'로 치환되거나 비치환된 하나 이상의 N, O, S 또는 기타 이종원자로 치환된 3원 내지 7원 헤테로 복소환기이며;
R'기는 페닐기, 가지상, 또는 직쇄형의 C1 내지 C10 알킬기, C1 내지 C5 알킬기로 치환된 옥시케토기 또는 Q 치환기이며, 여기에서 Q 치환기는
이며, R'' 및 R"'치환기는 각각 독립적으로 수소원자 또는 C1 내지 C3 저급 알킬기이며;
(-----)표시는 단일결합 또는 이중결합을 의미한다.
상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 바람직하기로는 X는 O 원자인 군; R1 내지 R9 는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, 메톡시기 및 P치환기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며, 여기에서 P 치환기는 R'로 치환되거나 비치환된 하나 이상의 N, O 또는 S로 치환된 4원 내지 6원 헤테로 복소환기이며, R'기는 페닐기, 가지상 C1 내지 C5 알킬기, C1 내지 C3 알킬기로 치환된 옥시케토기 또는 Q 치환기이며, 여기에서 Q 치환기는 C1 내지 C3 저급알킬기로 치환된 아미노알킬기인 화합물 군이다.
상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 보다 바람직하기로는 X는 O 원자이고; R1 내지 R9 는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, 메톡시기 또는 페닐기, 부틸기, 옥시아세틸기 또는 디메틸아미노메틸기로 치환된 퓨란기, 티오펜기, 피리딘기, 또는 트리아졸기인 화합물 군이다.
상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 보다 더 바람직하기로는 X는 O 원자이고; R1 는 페닐기, 부틸기, 옥시아세틸기 또는 디메틸아미노메틸기로 치환된 퓨란기, 티오펜기, 피리딘기, 또는 트리아졸기이며; R2 내지 R9 는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, 또는 메톡시기인 화합물 군이다.
상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 가장 바람직한 화합물로서,
8-(푸란-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-1)
8-(티오펜-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-2);
8-(피리딘-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-3);
8-(피리딘-4-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-4);
8-(푸란-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-1);
8-(티오펜-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-2);
8-(피리딘-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-3);
8-(피리딘-4-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-4);
8-(4-부틸-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-1);
8-(4-페닐-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-2);
8-(4-옥시아세틸-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-3);
8-(4-N,N-디메칠아미노메칠-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-4)을 들 수 있다.
상기 구조식 (Ⅰ)로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기의 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히 드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
또한, 상기의 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
하기의 반응식들은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 본 발명의 여러 화합물들은 반응식 1 내지 2의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다. 본 발명의 몇몇 화합물들은 반응식 1 내지 2의 범주에 포함되지 않는 과정에 따라 합성되었으며, 이러한 화합물들에 대한 상세한 합성 과정은 이들 각각의 실시예에 설명되어 있다.
상기 반응식 1은 8-헤테로아릴-5,7-디하이드록시플라본 화합물(4)을 제조하는 방법을 도시한 것으로서,
이미 기존 문헌(de Rossi, R. H., Veglia, A. V. On the product distribution in the iodination of phenol. Tetrahedron Lett. 27, 5963-5966, 1986)에 알려진 제조과정을 통하여 얻어진 약 13당량의 8-요드-5,7-디메톡시 플라본 (2), 13당량의 헤테로아릴 보론산, 0.011당량의 팔라듐 촉매 [Pd(PPh3)4]을 질소 가스 충전 하에서 무수 디메칠 포름아마이드 등의 유기용매에 녹인 후 실온에서 30분 내지 3시간 동안 교반하고, 상기 반응액에 포화 탄산칼륨 수용액을 가한 후에 약 80120℃에서 1 내지 6시간동안 추가로 교반 반응을 수행한 후에 헤테로아릴 보 론산 (R-B(OH)2)을 1 내지 3 당량 추가로 가하고, 약 80120℃에서 6 내지 24시간동안 반응을 진행한다. 상기 반응액을 냉각시키고 디클로로 메탄으로 희석시킨 후에 셀라이트를 통과시키고 1% 내지 10%의 염산수용액으로 세척한다. 수득된 유기층을 무수 황산나트륨 등의 건조제를 이용하여 건조, 여과, 감압농축 후 얻어지는 고형의 잔류물을 메탄올 등의 재결정 용매로 재결정하여 8-헤테로아릴-5,7-디메톡시플라본 화합물(3)를 수득 가능하다.
또한 상기에서 수득된 고체를 무수 클로로포름 등의 유기용매에 용해시킨 후 약 약 010℃에서의 온도로 냉각시키고. 약 110 당량의 보론 트리브로마이드을 가하여 약 10분 내지 6시간동안 교반 후에 환류 조건하에서 6 내지 24시간 동안 추가로 반응시킨다. 상기 반응액을 실온까지 냉각시킨 후에 메탄올 등의 유기용매를 가하여 생성되는 고체를 여과하고 고체를 포화 탄산나트륨 수용액으로 잘 세척한 후에 메탄올 등의 재경정 용매를 사용하여 재결정하면 8-헤테로아릴-5,7-디하이드록시플라본 화합물(4)을 고체로 수득가능하다.
상기 반응식 2은 5,7-디하이드록시-8-트리아졸계 플라본을 제조하는 방법을 도시한 것으로서,
이미 기존 문헌 (Jinhee Jang, Kwan-Seog Sin, Hyun Pyo Kim, Haeil Park. "Inhibitory activity of 8-aminowogonin analogues against prostaglandin E2 production" Yakhak Hoeji 2008, 52(1), 85-91)에 알려진 제조과정을 통하여 얻어진 약 13당량의 8-아미노-5,7-디메톡시플라본을 약 1 내지 10% 염산수용액에 현탁 시킨 후에 약 13당량의 아질산나트륨을 반응액에 서서히 가하고 약 30분 내지 3시 간 동안 실온에서 교반한다. 상기 반응액에 용해시킨 아지도나트륨 수용액을 서서히 가한 후에 실온 내지 30℃에서 약 30분 내지 3시간 교반 후에 디클로로메탄으로 추출, 분리, 건조, 여과, 감압에서 농축하여 생성되는 고형물질을 메탄올로 재결정하여 고체의 물질을 얻고, 이 고체물질을 무수 클로로포름에 용해시키고 3당량의 보론 트리브로마이드 용액을 약 1 내지 10℃에서 서서히 적하시킨 후에 약 10분 내지 1시간 동안 교반을 수행한 후에 상온에서 약 6시간 내지 24시간 동안 교반한다. 생성된 반응액을 실온까지 냉각시킨 후에 메탄올을 가하여 생성되는 고체를 여과하고 고체를 포화 탄산나트륨 수용액으로 잘 세척한 후에 메탄올 등의 재결정 용매로 재결정하여 핵심중간체인 8-아지도-5,7-디하이드록시플라본을 제조한다.
상기 8-아지도-5,7-디메톡시플라본을 아세토니트릴 등의 불활성 용매에 용해시킨 후에 약 1 내지 3당량의 알킨화합물 및 약 0.01 내지 0.5 당량의 이초산구리를 가한 후에 실온에서 약 6시간 내지 24시간 동안 교반한다. 반응을 마친 반응액을 여과, 농축하여 얻어지는 잔사를 컬럼 분리하여 정제한 후에 상기 반응식 1의 제조과정 중에 표시한 방법으로 탈메틸화를 수행하여 목적하는 5,7-디하이드록시-8-트리아졸계 플라본을 제조가능하다.
이와 같이 플라보노이드 환(flavonoid ring)의 다른 위치에도 위와 유사한 방법으로 헤테로아릴 치환기 (heteroaryl group)를 치환한 치환체를 합성할 수 있다.
따라서 본 발명에서는 상기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법으로 얻어진 본 발명의 일반식 (I) 화합물들은 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체들의 합성을 강력하게 저해함을 확인하여 염증질환, 면역계 이상 질환 또는 암질환의 치료 및 예방에 효과적임을 확인하였다.
따라서 본 발명에서는 상기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 단체를 함유하는 염증질환, 면역계 이상 질환 또는 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
본원에서 정의되는 “염증 질환”은 예를 들어, 급성 또는 만성 염증질환, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 아토피성피부염, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알츠하이머 병, 결장암 등을 비롯한 질환, 바람직하게는, 급성 또는 만성 염증질환, 관절염 또는 염증성 장 질환 등 구체적으로는, 폐렴, 관절염, 아토피성피부염, 또는 폐쇄성 기도 질환(COPD)을 포함한다.
따라서, 본 발명은 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체의 과다 합성에 대한 저해제를 제공한다.
본원에서 정의되는 “면역계 이상 질환”은 류마티스성 관절염, 전신성 홍반 성 낭창, 궤양성 대장염 등과 같은 자가 면역 질환을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 플라보노이드계 화합물을 포함하는, 염증질환, 면역계 이상 질환 또는 암질환을 예방, 치료하기 위한 약제학적 조성물과 플라보노이드계 화합물을 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체의 합성의 증가로 인한 모든 질병의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 약제학적 조성물의 투여로 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체의 과다 합성의 증가로 인한 모든 질병을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체의 과다 합성에 기인한 질환은 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체가 과발현되는 등 그 활성이 증가되어 초래되는 모든 질병을 포함하나, 구체적으로는 염증질환, 면역계 이상 질환 또는 암질환을 포함한다.
본원에서 정의되는 “암질환”의 구체적 암은 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 담낭암 등을 포함하고, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부 형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁 제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.
또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물에서, 본 발명에 따른 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염의 유효용량은 0.1 내지 200 mg/kg 또는 피부적용시 0.1 내지 200 mg/cm2이고, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg 또는 피부적용시 1 내지 10 mg/cm2이며, 하루 1-6회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명에 따른 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 마우스에 경구 투여, 복강내 투여 및 피하주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 500 mg/kg 이상인 것으로 확인되었고 따라서, 본 발명에 따른 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 비교적 안전한 물질로 판명되었다.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 일반식 (Ⅰ)로 표기되는 플라보노이드 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 염증유도성 효소인 시클로옥시게나아제-2 및 유도성 나이트릭 옥사이드 신타아제 (inducible nitric oxide synthase, 이하 "iNOS"이라고 약칭함)의 발현 또는 활성을 저해함으로써 염증질환치료, 면역계 이상 질환 또는 암질환 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 실험 준비 및 기기
1-1. 분석기기
본 실험에서 얻은 생성물의 구조 확인을 위해 사용된 기기는 하기와 같다. 핵자기 공명 스펙트럼 (1H NMR, 13C NMR) 은 300 MHz 또는 400MHz 를, 용매는 CDCl3, DMSO-d6를 사용하였다. 짝지음(Coupling) 상수 ( J )는 Hz 로 표시하였다. 질량(Mass) 스펙트럼을 사용하였으며 m/z 형태로 표시하였다.
1-2. TLC 및 관 크로마토그래피
TLC (Thin layer chromatography)는 E. Merck 사 제품인 실리카겔(Merck F254)을 사용하였으며 관 크로마토그래피(Column chromatography)를 위해서는 실리카(Merck EM9385, 230-400 mesh)를 사용하였다. 또한, TLC 상에서 분리된 물질을 확인하기 위해서 UV 램프(= 254 nm)를 이용하거나 아니스알데히드(Anisaldehyde), 과망간산칼륨(KMnO4) 발색 시약에 담근 후, 플레이트를 가열하여 확인하였다.
1-3. 사용 시약
본 실험에서 사용된 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 란캐스터(Lancaster), 플루카(Fluka) 제품을 구입하여 사용하였으며, 반응에 사용된 용매 는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 머크(Merck), 준세이 화학(Junsei Chemical Co.) 제품의 1급 시약을 정제 없이 사용하였다. 용매에 사용한 THF 는 아르곤 기류에서 Na 금속과 벤조페논(Benzophenone)을 넣고 가열환류하여 청색으로 되었을 때 사용하였다. 또한, 디클로로메탄(CH2Cl2) 은 아르곤 기류에서 CaH2 를 넣고 가열환류하여 사용하였다. 에틸아세테이트와 헥산은 아르곤 기류에서 가열환류하여 정제하여 사용하였다.
실시예 1. 헤테로고리 치환체를 갖고 있는 알콕시 플라본 유도체 (Ia)들의 합성
이미 알려진 제조과정을 (de Rossi, R. H., Veglia, A. V. On the product distribution in the iodination of phenol. Tetrahedron Lett. 27, 5963-5966, 1986) 통하여 얻어진 8-요드-5,7-디메톡시 플라본 (1 당량), 헤테로아릴 보론산 (2 당량), 팔라듐 촉매 [Pd(PPh3)4, 0.05 당량]을 질소 가스 충전 하에서 무수 디메칠 포름아마이드에 녹인 후 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산칼륨 수용액을 가한 후에 100℃에서 2시간 교반 후 헤테로아릴 보론산을 1 당량 추가로 가하고 100℃에서 12시간 반응을 진행하였다. 반응액을 냉각 후 디클로로메탄으로 희석 시킨 후 셀라이트를 통과 시키고 3% 염산수용액으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨을 사용하여 건조, 여과, 감압농축 후 얻어지는 고형의 잔류물을 메탄올로 재결정하여 고체형태로서 하기와 같은 8-헤테로아릴-5,7-디메톡시플라본 화합물들 (3-1) 내지 (3-4)을 얻었다.
1-1. 8-(푸란-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (
3-1
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(푸란-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-1)을 수득하였다.
- 수득율: 76%,
- 황색고체,
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.761~7.793 (m, 3H, H4-furan, H2', H6'), 7.584~7.595 (t, 1H, J=1.7Hz, H5-furan), 7.423~7.495 (m, 3H, H3', H4', H5'), 6.773~6.778 (d, 1H, J=1.3Hz, H2-furan), 6.712 (s, 1H, H3), 6.517 (s, 1H, H6), 4.057 (s, 3H, OMe), 3.977 (s, 3H, OMe).
1-2. 8-(티오펜-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (
3-2
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(티오펜-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-2)을 수득하였다.
- 수득율: 50%,
- 백색고체,
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.630~7.662 (m, 2H, H2', H6'), 7.369~7.466 (m, 5H, H3', H4', H5', H2-thiophen, H4-thiophen), 7.273~7.294 (dd, 1H, J=3.7Hz, 2.6Hz, H5-thiophen), 6.715 (s, 1H, H3), 6.521 (s, 1H, H6), 4.067 (s, 3H, OMe), 3.939 (s, 3H, OMe).
1-3. 8-(피리딘-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (
3-3
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(피리딘-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-3)을 수득하였다.
- 수득율: 54%,
- 백색고체,
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.706~8.711 (d, 1H, J=1.5Hz, H2-pyridine), 8.656~8.678 (dd, 1H, J=4.9Hz, 1.7Hz, H4-pyridine), 7.766~7.805(ddd, 1H, J=7.8Hz, 2.0Hz, H6-pyridine), 7.486~7.518 (m, 2H, H2', H6'), 7.325~7.455 (m, 4H, H3', H4', H5', H5-pyridine), 6.692(s, 1H, H3), 6.546 (s, 1H, H6), 4.083 (s, 3H, OMe), 3.917 (s, 3H, OMe).
1-4. 8-(피리딘-4-일)-5,7-디메톡시플라본 (
3-4
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(피리딘-4-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-4)을 수득하였다.
- 수득율: 79%,
- 백색고체,
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.729~8.747 (d, 2H, J=5.6Hz, H3-pyridine, H5-pyridine), 7.493~7.534 (m, 2H, H2', H6'), 7.336~7.462 (m, 5H, H3', H4', H5', H2-pyridine, H6-pyridine), 6.703 (s, 1H, H3), 6.533 (s, 1H, H6), 4.081 (s, 3H, OMe), 3.924 (s, 3H, OMe).
실시예 2. 헤테로 고리 치환체를 갖고 있는 히드록시 플라본 유도체 (Ib)들의 합성
상기 실시예 1에 개시된 제조공정에서 생성된 고체들을 무수 클로로포름에 용해시킨 후 약 5℃의 온도로 냉각시키고 보론 트리브로마이드 (5 당량)를 가하여 약 30분간 교반 후에 환류 조건에서 12 시간 추가로 반응시켰다. 반응액을 실온까지 냉각 시킨 후 메탄올을 가하여 생성되는 고체를 여과하고 고체를 포화 탄산나트륨 수용액으로 잘 세척한 후 메탄올을 사용하여 재결정하여 하기와 같은 8-헤테로아릴-5,7-디하이드록시플라본 화합물들 (4-1) 내지 (4-4)들을 고체로 수득하였다.
2-1. 8-(푸란-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (
4-1
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(푸란-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-1)을 수득하였다.
- 수득율: 44%,
- 황색고체,
- mp=140~141oC,
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 13.048 (s, 1H, 5-OH), 11.148 (s, 1H, 7-OH), 7.946~7.966 (m, 2H, H2', H6'), 7.919~7.924 (d, 1H, J=1.4Hz, H4-furan), 7.790~7.800 (t, 1H, J=1.6Hz, H5-furan), 7.494~7.623 (m, 3H, H3', H4', H5'), 6.982 (s, 1H, H3), 6.865~6.869 (d, 1H, J=1.1Hz, H2-furan), 6.416 (s, 1H, H6).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): d 182.74 (C-4), 163.88 (C-7), 161.67 (C-2), 159.58 (C-5), 154.65 (C-9), 144.32 (C-4-furan), 141.78 (C-2-furan), 131.90 (C-1-furan), 131.11 (C-1'), 129.16 (C-3', C-5'), 129.01 (C-4'), 126.24 (C-2', C-6'), 114.19 (C-10), 112.16 (C-3), 105.88 (C-5-furan), 105.65 (C-8), 99.22 (C-6).
2-2. 8-(티오펜-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (
4-2
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(티오펜-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-2)을 수득하였다.
- 수득율: 48%,
- 황색고체,
mp: 215~216oC,
1H-NMR (400 MHz, CDCl3+MeOD): δ 7.717~7.738 (m, 2H, J=8.3Hz, 1.6Hz, H2', H6'), 7.431~7.529 (m, 5H, H3', H4', H5', H2-thiophen, H4-thiophen), 7.431~7.363 (d, 1H, J=5.0Hz H5-thiophen), 6.720 (s, 1H, H3), 6.443 (s, 1H, H6).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3+MeOD): δ 183.31 (C-4), 164.42 (C-7), 161.86 (C-2), 160.76 (C-5), 155.11 (C-9), 132.22(C-1-thiophen), 131.36 (C-5-thiophen), 131.12 (C-1'), 130.25 (C-4'), 129.41 (C-3', C-5'), 126.65 (C-2', C-6'), 125.56 (C-4-thiophen), 124.99 (C-2-thiophen), 105.27 (C-3, C-8), 104.50 (C-10), 99.55 (C-6).
2-3. 8-(피리딘-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (
4-3
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(피리딘-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-3)을 수득하였다.
- 수득율: 80%,
- 황색고체,
- mp>300oC,
1H-NMR (600 MHz, DMSO): δ 13.170 (s, 1H, OH), 11.573 (s, 1H, OH), 9.208 (s, 1H, H2-pyridine), 8.950~8.959 (d, 1H, J=5.5Hz, H4-pyridine), 8.778~8.791 (d, 1H, J=8.0Hz, H6-pyridine), 8.181~8.204 (dd, J=7.9Hz, 5.7Hz, H5-pyridine), 7.739~7.751 (d, 2H, J=7.5Hz, H2', H6'), 7.558~7.582 (t, 1H, J=7.5Hz, H4'), 7.475~7.500 (t, 2H, J=7.6Hz, H3', H5'), 7.067 (s, 1H, H3), 6.520 (s, 1H, H6).
13C-NMR (150 MHz, CDCl3+MeOD): δ 181.97 (C-4), 163.40 (C-7), 161.81 (C-2), 161.40 (C-5), 154.34 (C-9), 147.20 (C-2-pyridine), 144.00 (C-4-pyridine), 141.19 (C-6-pyridine), 131.98 (C-1-pyridine), 131.11 (C-1'), 130.48 (C-5-pyridine), 129.06 (C-3', C-5'), 126.27 (C-2', C-4', C-6'), 105.41 (C-3), 103.96 (C-10), 101.59 (C-8), 98.63 (C-6).
2-4. 8-(피리딘-4-일)-5,7,디하이드록시플라본 (
4-4
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(피리딘-4-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-4)을 수득하였다.
- 수득율: 53%,
- 황색고체,
- mp>300oC,
1H-NMR (300 MHz, CDCl3+MeOD): δ 8.65~8.67 (d, 2H, J=5.9Hz, H3-pyridine, H5-pyridine), 7.41~7.65 (m, 7H, H2-pyridine, H6-pyridine, Ph), 6.73 (s, 1H, H3), 6.44 (s, 1H, H6).
13C-NMR (150 MHz, CDCl3+MeOD): δ 182.84 (C-4), 164.17 (C-7), 161.80 (C- 2), 161.40 (C-5), 154.34 (C-9), 148.85 (C-3-pyridine, C-5-pyridine), 148.29 (C-1-pyridine), 132.21 (C-1'), 131.02 (C-4'), 129.31 (C-3', C-5'), 126.85 (C-2', C-6'), 126.31 (C-2-pyridine, C-6-pyridine), 106.01 (C-8), 105.35 (C-3, C-10), 99.74 (C-6).
실시예 3. 헤테로고리 치환체를 갖고 있는 플라본 유도체(II)의 합성
이미 기존 문헌에 개시된 제조과정을 (Jinhee Jang, Kwan-Seog Sin, Hyun Pyo Kim, Haeil Park. "Inhibitory activity of 8-aminowogonin analogues against prostaglandin E2 production" Yakhak Hoeji 2008, 52(1), 85-91) 통하여 얻어진 8-아미노-5,7-디메톡시플라본 (1 당량)을 5% 염산수용액에 현탁 시킨 후 1 당량의 아질산나트륨을 반응액에 서서히 가하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응액에 용해시킨 아지도나트륨 수용액을 서서히 가한 후 실온에서 1시간 교반 후 디클로로메탄으로 추출, 분리, 건조, 여과, 감압에서 농축하여 생성되는 고형물질을 메탄올로 재결정하여 고체의 물질을 얻었다. 고체물질을 무수 클로로포름에 용해시키고 3당량의 보론 트리브로마이드 용액을 5℃에서 서서히 적하한 후 30분간 교반 후 상온에서 12시간 교반하였다. 반응액을 실온까지 냉각 시킨 후 메탄올을 가하여 생성되는 고체를 여과하고 고체를 포화 탄산나트륨 수용액으로 잘 세척한 후 메탄올로 재결정하여 핵심중간체인 하기와 같은 물성치를 갖는 8-아지도-5,7-디하이드록시플라본을 제조하였다.
3-1. 8-아지도-5,7-디하이드록시플라본의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-아지도-5,7-디하이드록시플라본을 수득하였다.
- mp: 252-254℃.
1H NMR (300MHz, DMSO): δ 8.264~8.296 (dd, 2H, J=8.3Hz, 1.2Hz, H2', H6'), 7.581~7.691 (m, 3H, H3', H4', H5'), 7.122 (s, 1H, H3), 6.477 (d, 1H, H6).
상기에서 생성된 8-아지도-5,7-디메톡시플라본을 아세토니트릴에 용해한 후 1.2당량의 알킨화합물 및 0.1당량의 이초산구리를 가한 후 실온에서 12시간 교반하였다. 반응액을 여과, 농축하여 얻어지는 잔사를 컬럼 분리하여 정제한 후 실시예 1의 제조과정 중에 표시한 방법으로 탈메틸화하여 목적하는 하기와 같은 5,7-디하이드록시-8-트리아졸계 플라본(5-1) 내지 (5-2)을 수득하였다.
3-2. 8-(4-부틸-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (
5-1
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(4-부틸-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-1)을 수득하였다.
- 수득율: 62%,
- 황색고체,
-mp: 202℃.
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 7.657 (s, 1H, H1''), 7.559~7.588 (dd, 2H, J=7.1Hz, 1.5Hz, H2', H6'), 7.478~7.530 (m, 1H, H4'), 7.389~7.443 (m, 2H, H3', H5'), 6.708 (s, 1H, H3), 6.506 (d, 1H, H6), 2.841~2.891 (t, 2H, J=7.5Hz, CH2), 1.713~1.814 (m, 2H, CH2), 1.392~1.516 (m, 2H, CH2), 0.946~0.995 (t, 2H, J=7.3Hz, CH3).
3-2. 8-(4-페닐-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (
5-2
)의 제조
상기와 같은 제조방법을 수행하여 하기 물성치를 갖는 8-(4-페닐-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-2)을 수득하였다.
- 수득율: 47%,
- 황색고체,
-mp: 230℃.
1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 7.981~8.003 (m, 3H, H2', H6', H1''), 7.298~7.535 (m, 8H, H3', H4', H5', Ph), 6.695 (s, 1H, H3), 6.501 (d, 1H, H6).
실험예 1. COX-2 및 iNOS에 대한 영향
실시예에서 합성된 유도체들의 COX-2 및 iNOS에 대한 영향을 검정하기 위하여 Chi등의 방법(Biochemical Pharmacology 61, 1195, 2001)에 따라 하기와 같이 실험하였다.
즉, RAW 264.7 세포주(ATCC)를 1 μg/ml 농도의 리포폴리사카로이 드(lipopolysaccharide, 이하 “LPS"라고 약칭함; Sigma Chem. Co.)로 처리하여 COX-2와 iNOS를 발현시키고, 생성된 PGE2의 양을 ELISA법으로 검정하였고, NO의 양은 Griess 법(Chi et al., Biochem. Pharmacol. 61, 1195-1203, 2001)으로 측정하였다. 이때 각 유도체 10μM의 농도를 동시에 처리하고 24시간 상기 세포주에 배양하였다.
또한 본 발명에서 COX-2 및 iNOS의 저해제로는 일반적으로 알려져 있는 NS-398(Biomol 사) 및 AMT(Tocris Cookson사)를 양성 대조물질로 이용하였다.
본 실험 결과는 하기의 표 1과 같은데, 이와 같이 헤테로고리 치환체를 함유한 신규한 후라보노이드 유도체들이 COX-2 및 iNOS 유도 염증매개체들의 합성을 저해함을 확인하였으며, 이들 물질들의 항염증제로의 가능성을 나타내었다. 특히 화합물 (compound) 4-2, 4-3, 4-4, 5-2 등의 유도체들의 경우는 치환체가 없는 chrysin (5,7-디히드록시후라본(dihydroxyflavone)(Sigma Chem. Co. 10 uM) 보다 월등한 저해능을 보이는 것을 알 수 있어, 헤테리 고리 치환체의 새로운 항염증제로서의 유용성을 증명할 수 있었다.
| Compound | COX-2에 의한 PGE2 생성 저해능 (%) | iNOS에 의한 NO 생성 저해능 (%) |
| 4-1 | 26.7 | 8.3 |
| 4-2 | 31.4 | 7.6 |
| 4-3 | 48.1 | 16.7 |
| 4-4 | 92.4 | 29.1 |
| 5-1 | 8.9 | 14.1 |
| 5-2 | 48.0 | 7.3 |
| chrysin | 11.0 | 6.2 |
| NS-398 (0.1 uM) | 99.4 | - |
| AMT (1.0 uM) | - | 97.6 |
실험예 2. MTT 어세이 시험
또한 상기 실시예에서 합성된 유도체들의 세포독성은 Mossman의 방법(J. Immumological Methods 65, 55, 1983)을 이용하여 MTT법으로 검정하였다.
본 실험에 의한 세포독성 검정결과, 시험에 사용한 모든 유도체들은 검정농도인 10μM에서 어떠한 세포독성도 나타나지 않았다.
실험예 3. COX-2 및 iNOS에 대한 농도의존성 저해효능실험
상기 실험예 1에서 가장 강력한 저해능을 보이는 화합물 (compound) 4-4 물질의 농도-의존적 저해능을 확인하기 위하여 실시예 1의 방법으로 서로 다른 농도에서 저해능을 비교하였고 그 결과는 아래의 표 2와 같다.
| Compound(4-4) | COX-2에 의한 PGE2 생성저해능 (%) | iNOS에 의한 NO 생성저해능 (%) |
| 2 uM | 24.3 | |
| 5 uM | 42.7 | |
| 10 uM | 73.8 | 37.8 |
| 25 uM | 52.6 | |
| 50 uM | 76.1 |
본 실험 결과, 이와 같이 화합물 (compound) 4-4 물질은 COX-2에 의한 PGE2 생성저해능 실험 및 iNOS에 의한 NO 생성저해능 실험에서 농도-의존적으로 저해능을 나타냄을 확인하였다
실험예 4. 웨스턴 블롯(Western blot) 검정실험
상기 실험예 3에서 강력한 PGE2 및 iNOS 저해 활성을 나타낸 유도체 중에서 화합물(compound) 4-4의 COX-2 및 iNOS에 대한 직접적인 발현 억제력을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법 (Chi et al., Biochem. Pharmacol. 61, 1195-1203, 2001)으로 웨스턴 블롯(Western blot)법으로 검정하였다.
그 실험 결과는 도 1과 같으며, 화합물(compound) 4-4는 COX-2에는 영향을 주지 않고 iNOS의 발현을 억제하여 NO의 생성을 억제하는 독특한 세포기전을 보유한다는 것을 보여주었다.
실험예 5. TPA-유도 마우스 귀부종 억제 실험
상기 실험예에서 강한 PGE2 및 iNOS 저해 활성을 나타낸 compound 4-3, 4-4, 5-2를 대상으로 하여 동물실험을 통한 염증억제력을 검정하기 위하여 TPA-유도 마우스 귀부종법 (김 등, Arch. Pharm. Res. 16, 18-24, 1993)을 시험과정을 응용하여 하기와 같이 시험 하였다.
또한 본 발명에 따른 유도체의 항염증작용과 비교하기 위해 항염증제로 널리 사용되고 있는 프레드니솔론(prednisolone, Upjohn Co.)을 양성 대조물질로 이용하였다.
즉, TPA (3 μg/ear, Sigma Chem. Co.)를 ICR 마우스(male, 4 weeks, Orient Bio사에서 구입) 도포하였고, 본 발명에 따른 유도체들 및 양성 대조물질은 마우스의 귀에 TPA 처리 30분전에 각각 발랐고, TPA 처리 5시간 후에 귀의 부종을 측정기기(Mitutyo ear gauge, Japan)를 이용하여 부종 억제 정도를 측정하였다(귀 두께로 부종의 양을 계산).
본 실험 결과는 하기 표 3과 같고, 따라서, 본 발명의 유도체들은 in vivo시험에서도 항염증활성을 나타냄을 확인하였다.
| compound | mg/ear | % inhibition of ear edema |
| prednisolone | 0.5 | 52.3* |
| compound 4-3 | 0.5 | 29.9* |
| compound 4-4 | 0.5 | 40.3* |
| compound 5-2 | 0.5 | 38.7* |
| n = 5, *: P < 0.05, Significantly different from TPA-treated control group by unpaired Student's-t-test |
||
도 1은 COX-2 및 iNOS에 대한 직접적인 발현 억제력을 확인한 웨스턴 블롯(Western blot)법 실험 결과를 나타낸 도이다.
Claims (7)
- COX-2 및 iNOS 유도 염증 매개체들의 합성에 대한 강력한 억제 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용 가능한 염:(Ⅰ)
상기 식에서,X는 O 이며;R1는 각각 독립적으로 페닐기, 부틸기, 옥시아세틸기 또는 디메틸아미노메틸기로 치환된 퓨란기, 티오펜기, 피리딘기 또는 트리아졸기이며;R2 내지 R9 는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기 또는 메톡시기이며;(-----)표시는 단일결합 또는 이중결합을 의미한다. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,8-(푸란-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-1); 8-(티오펜-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-2); 8-(피리딘-3-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-3); 8-(피리딘-4-일)-5,7-디메톡시플라본 (3-4); 8-(푸란-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-1); 8-(티오펜-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-2); 8-(피리딘-3-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-3); 8-(피리딘-4-일)-5,7,디하이드록시플라본 (4-4); 8-(4-부틸-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-1); 8-(4-페닐-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-2); 8-(4-옥시아세틸-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-3); 또는 8-(4-N,N-디메칠아미노메칠-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-5,7-디하이드록시플라본 (5-4)인 화합물군.
- 제 1항의 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 단체를 함유하는 염증질환, 면역계 이상 질환 또는 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물.
- 삭제
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