KR101089517B1

KR101089517B1 - 암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법 및 그 키트

Info

Publication number: KR101089517B1
Application number: KR1020110087747A
Authority: KR
Inventors: 유문간; 홍승진; 김영호; 김상년; 장재진; 최숙종
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 주식회사 오리엔트바이오
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2011-12-07
Also published as: EP2035576A1; JP2009542201A; CN101490274A; KR20110101124A; WO2008004719A1; EP2035576A4; US20100028875A1; KR20080004408A

Abstract

본 발명은 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하여 암의 예측, 암의 유무, 암 전이 정도 또는 예후를 확인하는 방법 및 메틸화 확인용 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 암 진단에 중요한 신규한 메틸 가변 부위를 규명하고 이 부위의 메틸화를 측정할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 메틸 가변 부위의 메틸화 정도와 염색체 소실 정도를 동시에 분석하여 암 예측 정확성을 획기적으로 상승시킬 수 있다.

Description

암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법 및 그 키트 {The data collecting method required for diagnosing cancer and the kit}

본 발명은 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하여 암의 예측, 암의 유무, 암 전이 정도 또는 예후를 확인하는 방법, 메틸화 확인용 올리고뉴클레오티드 및 염색체 소실과 염색체 불안정성 정도를 측정할 수 있는 단순 반복염기서열 올리고뉴클레오티드군에 관한 것이다.

암은 유전자 변화에 의해 발생하는 유전질환으로 인식되고 있다. DNA는 염기서열에 따라 아미노산의 서열 및 단백질의 기능을 결정하지만 단백질 발현 여부는 DNA 메틸화의 영향을 받는다. 즉 특정 유전자의 기능과 발현은 염기서열과 DNA 메틸화에 의해서 좌우된다고 볼 수 있으며 종양조직에서는 이 두 가지, 즉 유전학적, 후성학적 (epigenetic) 형태의 변화를 모두 관찰할 수 있다. 따라서 동일 암조직에서 유전학적이고 후성학적인 변화를 모두 확인한다면 암 발생 원인을 보다 정교하게 이해하게 되고 이를 바탕으로 암 예방과 치료에 활용할 수 있을 것이다.

지금까지 알려진 종양조직에서의 DNA메틸 변화를 살펴보면,

1) 종양조직은 DNA 메틸화와 탈메틸화를 모두 보이고,

2) DNA 메틸화는 유전자와 인접한 CpG섬에서 일어나는 반면 탈메틸화는 주로 반복 염기서열에서 일어나고,

3) 종양 DNA의 메틸화와 탈메틸화는 종양의 발생과 진행에 있어서 상호 독립된 역할을 한다는 것이다.

이처럼 종양 DNA 메틸 변화가 암 발생과 진행에 있어서 기여하는 구체적인 역할이 아직 이해되고 있지 못하고 있다. 그러나 세포의 성장과 분화, 노화 과정에서의 다양한 DNA 메틸 변화가 알려지면서 유전자 불안정성으로 대단히 이질적인 악성 표현형을 이해하는데 DNA의 메틸화는 새로운 관심분야로 대두되고 있다.

사람 유전체는 발생초기에 후성 유전자의 재프로그래밍(epigenetic reprogramming) 과정을 통해 사람 각 조직으로의 분화가 진행되며, 후성 유전자 구조는 배아발생 초기에 대부분 정립되어 일생동안 유지되는 영역과 세포분화와 반복염기서열 RNA의 핵 내 밀도에 따라 영향을 받는 가변적인 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)로 나눌 수 있다.

인간유전체의 40% 이상을 차지하고 있는 역전위체는 내인성 레트로바이러스-유사 유전인자(endogenous retrovirus-like genetic element)에서 유래하는 반복염기 서열로서 스스로는 메틸화를 유도하는 동시에 주위 DNA에 메틸화를 전파하여 다양한 DNA 메틸화를 유전체 전반에 형성시키는 핵심적 역할을 할 수 있다.

한편, 단순반복열 염기서열 올리고뉴클레오티드로 검출되는 염색체 소실(chromosomal loss)은 유전체의 양적 감소를 동반하며 유전체의 양적 감소(dosage reduction)가 미치는 영향은 각 개체의 유전체양을 엄격하게 유지하려는 유전체 보상기전(dosage compensation)을 작동시킬 것으로 예상된다. 따라서 염색체 소실은 양적감소를 보상하기 위하여 핵산 탈메틸화 변화를 유도하므로, 염색체 소실이 핵산 메틸화 변화를 통해 다양한 암 진행을 주도한다고 보여 진다. 또한 이러한 탈메틸화 과정은 임신 초기에 태반형성을 유도하기 위하여 세포의 침습과 전이를 위한 후성 유전자가 활성화되었다가 분만과 더불어 퇴화 소실되는 내인성 프로그램과 유사한 유전자 발현 양상을 보이게 된다.

이에, 본 발명에서는 기존에 많이 연구 되어 왔던 CpG 섬(island)의 메틸화 변화 보다 CpG 섬과 인접 역전위체(retroelement) 사이에 형성되는 가변부위인 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 유전자형에 따른 메틸화 변화 정도가 더 크며 이 부위 메틸화 측정이 암 소인, 진행, 진단, 예후 측정 등에 매우 중요한 방법임을 제시하였다. 또한 종양조직에서의 염색체 소실의 정도에 대한 유전자형에 따른 메틸 이행 부위의 메틸화의 변이 정도를 확인하여 암 진단에 중요한 역할을 확인하였다.

<종래기술의 문헌 정보>

1. Balmain A, Gray J, Ponder B. The genetics and genomics of cancer. Nat Genet 2003; 33 S:238-24

2. Hong SJ, Choi SW, Lee KH, Lee S, Min KO, Rhyu MG. Preoperative genetic diagnosis of gastric carcinoma based on chromosomal loss and microsatellite instability. Int J Cancer. 2005 Jan 10;113(2):249-58.

3. Kim KM, Kwon MS, Hong SJ, Min KO, Seo EJ, Lee KY et al. Genetic classification of intestinal-type and diffuse-type gastric cancers based on chromosomal loss and microsatellite instability. Virchows Arch 2003; 443(4):491-50

4. Choi SW, Lee KJ, Bae YA, Min KO, Kwon MS, Kim KM et al. Genetic classification of colorectal cancer based on chromosomal loss and microsatellite instability predicts survival. Clin Cancer Res 2002; 8(7):2311-2322.

본 발명의 목적은 내시경 조직에서 암의 예측, 암의 유무, 암 전이의 정도는 물론 예후도 정확히 예측할 수 있는 수술 전 유전학적 진단법 및 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다.

'메틸 가변 부위(methylation transitional zone)'란 게놈 DNA 상에서 가변적으로 메틸화가 일어나는 부분으로서, CpG 섬이 있는 경우에는 CpG 섬의 상류(upstream) 지역의 첫 번째 역전위체와 CpG 섬의 하류(downstream) 지역의 첫 번째 역전위체 사이에 걸쳐 있는 연속된 염기서열로서 CpG 섬을 제외한 부분을 의미하고, CpG 섬이 없는 경우에는 전사 개시부의 상류 지역의 첫 번째 역전위체와 전사 개시부 하류 지역의 첫 번째 역전위체 사이에 걸쳐있는 연속된 염기서열을 의미한다.

'역전위체(retrotransposon)'란 게놈 내에서 스스로 증폭가능한 유전 요소이자, 많은 진핵생물의 게놈 내에 산재해 있는 요소이다. 역전위체는 전위체의 일종으로서, 포유동물의 경우 전체 게놈의 절반 정도(45 내지 48%)가 전위체 또는 전위체 잔존물로 구성되어 있다. 인간 게놈의 경우 약 42%가 역전위체로 구성되어 있는 반면, DNA 전위체는 약 2-3%에 불과하다. 인체 내에 존재하는 역전위체에는 LTR(long terminal repeat), Alu, L1 등이 존재한다.

'CpG 섬(CpG island)'란 주로 R 밴드에 위치하며, G/C가 풍부한 (60-70%) 적어도 200 bp 정도되는 영역으로 정의된다(Carcinogenesis vol.18 no.5 pp.869-82, 1997).

'메틸산개'란 메틸화가 진행된 염기서열의 분포(distribution)를 의미한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하여 암의 예측, 암의 유무, 암 전이 정도 또는 예후를 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 메틸 가변 부위의 메틸화 여부를 확인할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

아울러, 본 발명은 염색체 소실(Loss of heterozygosity, LOH)과 염색체 불안정성 정도를 측정할 수 있는 단순 반복염기서열 올리고뉴클레오티드군을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드군을 이용한 암진단 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하여 암의 예측, 암의 유무, 암 전이 정도 또는 예후를 확인하는 방법을 제공한다.

메틸 가변 부위(methylation transitional zone)는 역전위체 반복염기서열 전사밀도에 따라 상이하게 메틸산개가 형성되는 부위로 암 진단에 중요한 역할을 할 수 있다. 또한 개인별 가변화 정도가 다르고, 정상과 종양 간의 차이가 크기 때문에 암 진단에 더욱 유용하게 사용될 수 있다.

메틸 가변 부위는 공지된 게놈 DNA의 염기서열에서 컴퓨터를 이용하여 CpG 섬 또는 전사 개시부를 찾은 뒤 그 상류와 하류에 존재하는 역전위체를 찾게 되면 메틸 가변 부위를 확인할 수 있다.

암 진행과 관련한 유전자들을 선별하는 기준으로는 1) 유전자와 역전위체와의 거리 2) 유전자와 가까운 역전위체의 종류 3) 유전자 주변의 역전위체 밀도 4) 유전자와 유전자간의 거리 5) CpG 섬 염기서열과 역전위체 위치관계 및 6) 핵 내의 역유전체 밀도를 고려하였다. 이러한 기준으로 암 진단과 관련하여 제작된 표 1)의 28개의 후성 유전자의 5'-비전사부위의 중에서 메틸 가변 부위를 선정하였으며,

상기 메틸 가변 부위의 메틸화 측정 올리고뉴클레오티드는 CpG섬 염기서열이 풍부한 부위에서 제작된 RABGEF1, STAG, CHGB 등의 올리고뉴클레오티드들과 CpG섬이 결핍된 부위에서 제작된 TNFRSF14, SERPINB5, ANGPTL7, TFF2, BGLAP, MSLN, DDX53, MAGEA2의 올리고뉴클레오티드들과, CpG 섬 염기서열과 인접한 역전위체 사이에서 거리에 따라 근위(proximal)와 원위(distal) 두 부위 이상에서 고안된 VDR, ST14, CDKN2A, MYBPC2, RUNX3, RUNX2, MLH1, PTEN 등으로 구분할 수 있다.

상기 방법으로 진단할 수 있는 암으로는, 유방암, 방광암, 신경교종, 비소세포성 폐암, 췌장암, 난소암, 위암, 폐암, 침샘암 및 두경부암, 피부암, 비암, 안암, 자궁암, 소장암, 뇌암, 설암, 소장암, 대장암, 전립선암, 골수암, 및 백혈병 등이 포함된다.

메틸화를 측정하기 위해서는 암조직 영역과 정상조직 영역에서 DNA를 각각 수득하여 NaOH 용액을 넣고 방치한 후 하이드로퀴논과 중아황산 나트륨(sodium bisulfate, pH 5.0)을 첨가하고 미네랄 오일을 위에 가하여 반응시킨 후 정제한 다음, NaOH를 첨가하여 변형을 시켜, 상기 수득된 중아황산-변형된 DNA 또는 변형되지 않은 DNA를 주형(template)으로 하여 PCR을 수행한 후 전기영동후 방사형광 스캐너로 관찰하면 메틸화 정도를 구할 수 있다.

본 발명의 유전자 올리고뉴클레오티드는 메틸 가변 부위의 메틸화 또는 탈메틸화 정도를 특이적으로 측정할 수 있는 염기서열에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 모든 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 하기의 표 1에서 RABGEF1, STAG, CHGB, TNFRSF14, SERPINB5, ANGPTL7, TFF2, BGLAP, MSLN, DDX53, MAGEA2, VDR, ST14, CDKN2A, MYBPC2, RUNX3, RUNX2, MLH1, PTEN, PPARG, RB1, PAX5, CDH1, KIAA1752, FLJ43855, MUC8, ESR2 또는 E2F4 유전자의 메틸 가변 부위 서열에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 모든 올리고뉴클레오티드 서열에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 메틸화가 일어나지 않은 메틸 가변 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 4k-3 및 4k-2(k는 1≤k≤40인 정수)로 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 메틸화가 일어난 메틸 가변 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 4k-1 및 4k(k는 1≤k≤40인 정수)로 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 중에서 선택될 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 메틸 가변 부위의 염기서열을 공지의 올리고뉴클레오티드 제작프로그램을 이용하여 당업자가 제작할 수 있으며, 바람직하게는 염기서열의 길이는 10 내지 35개, 보다 바람직하게는 15 내지 32개, 가장 바람직하게는 17 내지 30개의 사이에 있도록 설계하고, Tm 값은 52℃ 내지 65℃ 사이, 보다 바람직하게는 54℃ 내지 62℃ 사이에 있는 것이 바람직하다.

상기 올리고뉴클레오티드는 메틸 가변 부위의 메틸화 정도를 매우 정확히 측정할 수 있으며 PCR, 전기영동 또는 마이크로어레이 칩 등을 포함하는 다양한 진단키트를 이용한 다양한 진단법에 적용 가능하다.

또한, 본 발명은 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 여러 가지 형태의 암 진단용 키트를 제공한다.

키트에 포함되는 올리고뉴클레오티드는 메틸 가변 부위의 메틸화 또는 탈메틸화 정도를 특이적으로 측정할 수 있는 염기서열에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 모든 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기의 표 1에서 RABGEF1, STAG, CHGB, TNFRSF14, SERPINB5, ANGPTL7, TFF2, BGLAP, MSLN, DDX53, MAGEA2, VDR, ST14, CDKN2A, MYBPC2, RUNX3, RUNX2, MLH1, PTEN, PPARG, RB1, PAX5, CDH1, KIAA1752, FLJ43855, MUC8, ESR2 또는 E2F4유전자의 메틸 가변 부위 서열에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 모든 올리고뉴클레오티드 서열에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 메틸화가 일어나지 않은 메틸 가변 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 4k-3 및 4k-2(k는 1≤k≤40인 정수)로 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 메틸화가 일어난 메틸 가변 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 4k-1 및 4k(k는 1≤k≤40인 정수)로 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 중에서 선택될 수 있다.

상기 진단 키트에서 올리고뉴클레오티드로 증폭된 PCR 산물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 PCR 분석 장치를 이용하여 확인할 수 있다.

상기 증폭된 PCR 산물의 메틸화를 측정하여 탈메틸화가 많이 진행되어 있다면, 암에 걸릴 위험이 높거나, 암에 걸렸거나, 암의 전이 가능성이 높거나 예후가 좋지 않다고 판단할 수 있다(도 9).

또한, 본 발명은 염색체 소실(Loss of heterozygosity, LOH)과 염색체 불안정성 정도를 측정할 수 있는 단순 반복염기서열 올리고뉴클레오티드군을 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드군은 빈번한 염색체 결손을 보이는 암 관련 염색체 중 서열번호 161 내지 240으로 기재되는 40개의 단순 반복염기서열로서, 하기 표 2에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드이다.

염색체 소실과 염색체 불안정성의 정도에 대해서는 염색체 소실이 일어난 염색체의 개수와 병변의 크기를 가지고, 장형 (intestinal type)에서는 이형 접합성 소실(Loss of heterozygosity, LOH) 정도에 따라 LOH-H(고등도, 4~8개 소실), LOH-L(저등도, 0~3개 소실) 형으로 구분하였고, 미만형(diffuse type)에서는 LOH-H(고등도, 4~8개 소실), LOH-L(저등도, 2~3개 소실), LOH-B(초등도, 0~1개 소실)로 구분하였고, 동형 접합성 소실(Loss of homozygosity)의 경우 새로운 유전자가 40% 이상이면 유전자 불안정형 (microsatellite instability, MSI)으로 구분하여, 크게 4가지로 구분할 수 있음을 확인하였다.

이들 유전자 변이를 고위험 유전자형(LOH-H 및 LOH-B)과 저위험 유전자형(LOH-L 및 MSI)으로 분류할 수 있으며 2기와 3기 위암 환자의 생존률에 대한 매우 중요한 예측인자임이 확인되었다(도 8).

따라서 위암의 임상병리학적 특성을 잘 대변하는 반복열 불안정성과 염색체 소실의 정도를 근거로 기존의 형태학적 병기로서 예측할 수 없었던 전이와 재발에 대한 설명이 가능한 유전형에 대한 분류를 마련하였다.

아울러, 본 발명은 단순 반복염기서열 올리고뉴클레오티드군을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

키트에 포함되는 올리고뉴클레오티드는 암 관련 염색체 중에서 빈번한 염색체 결손을 보이는 염색체의 염기서열에 상보적으로 결합하여 증폭할 수 있는 모든 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는 표 2에 기재되는 서열번호 161 내지 240으로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드의 제작은 당업자에게 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있고, 올리고뉴클레오티드로 증폭된 마커 유전자의 PCR 산물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 PCR 분석 장치를 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명자들은 염색체 소실의 정도가 많을수록 탈메틸화의 정도가 증가하고 염색체 소실의 정도가 낮을수록 메틸화의 정도가 증가하는 서로 상관관계를 규명 하였다(도 9). 따라서 동일 병변에 대하여 메틸화 정도 분석과 염색체 소실인 LOH를 동시에 측정하면 기존 염색체 소실의 비연속성에 의한 부정확성을 크게 감소시킬 수 있다. 본 발명에서 제공하는 유전학적 방법 내지는 종양의 크기와의 조합에 의한 예측된 림프절 전이 정도는 CT에 의한 병기보다 정확했으며, 이러한 수술 전 유전학적 진단은 위암의 임상적 행로에 대하여 정보를 제공해줄 것이다. 따라서 수술 전의 본 발명에서 제공하는 유전학적 진단은 수술과 치료 방침을 세우는데 있어 매우 유용할 것으로 여겨진다.

본 발명은 1) 암 진단에 있어서 CpG 섬 염기서열 부위보다 우수한 신규한 메틸 가변 부위를 제공하고, 2) 상기 메틸 가변 부위의 후성학적 메틸화 정도를 이용하여 암의 진행, 진단, 예후, 암과 정상 조직간의 분자생물학적 차이 등을 확인할 수 있는 방법을 제공하며, 3) 메틸 가변 부위의 메틸화를 측정하여 암 진단에 활용할 수 있는 올리고뉴클레오티드군을 제공하고, 4) 염색체 소실과 관련된 단순 반복염기서열 올리고뉴클레오티드군을 제공하며, 5) 메틸 가변 부위의 메틸화 정도와 염색체 소실 정도를 동시에 분석하여 암 예측 정확성을 획기적으로 개선하는 방법을 발명하였다. 따라서 본 발명은 병변의 작은 일부분인 내시경 조직에서 암 전이의 정도는 물론 예후도 정확히 예측할 수 있는 수술 전 유전학적 진단법 및 진단 키트를 제공하여 수술과 치료 방침을 세우는 데 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 개략적인 블록도로서 CpG 섬(island)이 있는 경우 중 CpG 섬의 상류 경계로부터 첫 번째 역전위체 사이에 위치하는 메틸 가변 부위로 조직이나 세포의 반복 염기서열 전사밀도에 따라 상이하게 메틸산개가 형성되는 부위로서 조직 특이적이고 개인별 편차가 있다는 것을 나타낸 도면이다. 이 가변 부위에서의 후성유전 올리고뉴클레오티드를 통해 암세포로의 진행과정을 예측하게 된다.
도 2는 위암에서 염색체 소실이 일어난 염색체의 개수와 병변의 크기를 가지고 장형(intestinal type)에서는 LOH-H (고등도, 4~8개 소실), LOH-L(저등도, 0~3개 소실) 염색체 소실형으로, 미만형(diffuse type)에서는 LOH-H(고등도, 4~8개 소실), LOH-L (저등도, 3~2개 소실), LOH-B (초등도, 0~1개 소실)로 구분하여 내시경조직과 수술조직의 유전자형 비교와 암병변의 크기에 근거해 수술 전 진단에 LOH를 활용하는 방법에 관한 도면이다.
도 3은 메틸 가변부위 및 인접 CpG섬 부위 메틸화 정도 (5단계)를 암 환자의 암 부위 및 정상 부위로 나누고 이는 다시 암 예후를 말해주는 염색체 소실 정도로 세분화한 결과이다.
도 4와 도 5는 CpG섬이 없는 경우 가변부위 표지자 6개와 CpG섬이 있는 경우 표지자 9개를 가지고 암 환자의 정상 부위와 암 부위의 메틸화 차이를 분석하고 이를 염색체 소실과 상관 관계를 조사한 결과이다.
도 6은 염색체 불안정성이 생긴 저위험군 (case10)과 고위험군(case25) 각각에 대해 정상 조직과 종양 조직을 비교해 본 발명의 가변부위 후성유전 올리고뉴클레오티드와 기존 CpG섬 용 올리고뉴클레오티드를 이용 중합효소 연쇄반응과 전기영동을 수행하여 메틸화를 비교한 결과이다.
case 10 : 저위험군 (염색체 불안정성이 나타난 경우)
case 25 : 고위험군 (염색체 불안정성이 없으나 고등도의 염색체 소실이 있음)
U : 탈메틸화 올리고뉴클레오티드로 증폭한 결과
M : 메틸화 올리고뉴클레오티드로 증폭한 결과
% : 메틸화 정도를 백분율로 환산한 값
도 7은 위암에서 염색체완 4p, 5q, 9p, 13q, 17p, 18q 에 위치한 40개의 단순 반복열 올리고뉴클레오티드로 정상 조직과 종양 조직을 중합효소 연쇄반응과 전기영동을 수행한 결과이다. * 로 표시된 부분은 정상과 비교했을 때 염색체 소실이 일어난 부위이며, case 25는 LOH-H (고등도)의 염색체 소실을 보이고 있다.
도 8은 임상 2기(위)와 3기(아래)에 따른 수술 후 위암 환자 130 명에서의 생존곡선에 관한 도면이다. 유전자형으로 환자들을 분류했을 때 저등도 위험군(저등도 소실형, 염색체 불안정성)에서는 높은 생존율을 고등도 위험군(고등도 소실형, 초등도 소실형)에서는 낮은 생존율을 보이고 있다.
도 9는 암 진단에 염색체 소실 정도와 가변부위의 메틸화 정도를 병행하여 실시할 경우, 고위험군(LOH-H, LOH-B)과 저위험군(LOH-L, MSI)의 구분이 명확해지는 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 암 진단에 있어서 CpG 섬 염기서열 부위보다 우수한 신규한 메틸 가변 부위의 선택

암 진단과 관련된 유전자들을 선별하는 기준으로는, 1) 유전자와 역전위체와의 거리, 2) 유전자와 가까운 역전위체의 종류, 3) 유전자 주변의 역전위체의 밀도, 4) 유전자와 유전자간의 거리, 5) CpG 섬 염기서열과 역전위체 위치관계 및 6) 핵 내의 역 유전체의 밀도를 고려하여 선별하였다.

상기 선별과정은 염색체 불안정성이 생긴 저위험군(case 10)과 고위험군(case 25) 각각에 대해 정상 조직과 종양조직을 비교해 본 발명의 메틸 가변 부위 후성 유전 올리고뉴클레오티드와 기존 CpG 섬 용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR과 전기영동을 수행하여 메틸화를 비교함으로써 완성되었다(도 3, 4, 5).

< 실시예 2> 신규 메틸 가변 부위의 메틸화 정도를 측정하는 PCR 올리고뉴클레오티드 이용 암 진단

<2-1> 미세절제 및 DNA 추출

파라핀 블록(Paraffin block)에 고정된 암조직 견본을 5㎛두께로 얇게 자른 후 자일렌(xylene)으로 왁스 제거작업을 한 후 에탄올에 수화시켰다. 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-eosin)으로 염색하여 슬라이드 글라스에 고정시켰다. 현미경 관찰을 통해 슬라이드 글라스에서 바늘을 이용하여 암조직 영역과 정상조직 영역을 나누어 긁어냈다. 상기와 같이 각각의 영역에서 긁어낸 조직 세포들을 세포파쇄 완충용액(lysis buffer)에 넣고 37℃에서 3시간 50℃에서 3시간동안 방치하였다. 그리고 PCR 분석에 들어가기 전에 열을 가하여 단백질분해효소 K(proteinase K)를 비활성화시켰다.

<2-2> 메틸화 패턴 분석-시료 확보를 위한 Bisulfite modification 및 메틸화 특이 PCR

상기 실시예 <2-1>에서 수득한 DNA에 NaOH를 넣고 10분간 37℃에서 방치한 후 하이드로퀴논과 중아황산 나트륨(sodium bisulfite, pH 5.0)를 신선하게 만들어 첨가하고 섞어주며, 미네랄 오일을 위에 올리고 50℃에서 16시간 동안 반응시켰다. Wizard DNA purification resin(Promega, USA)을 사용하여 순수 정제하고, 용리한 다음, NaOH를 0.3 M이 되게 넣어 실온에서 5분간 반응시킴으로써 변형을 완료하였다. 에탄올 침전을 위해 글리코겐과 아세트산 나트륨 존재 하에서 에탄올을 가하고 섞어준 후 -20℃에서 하룻밤 두었다. 30분간 원심분리하여 침강시킨 후 70% 에탄올로 세척하고 증류수에 녹여 즉시 사용하거나 -20℃에 보관하였다.

PCR 반응액은 1X PCR 완충용액, dNTPs, P³²-dTTP, 올리고뉴클레오티드 그리고 중아황산-변형된 DNA 또는 변형되지 않은 DNA를 포함 한다. 반응은 95℃에서 5분간 hot-start하고 Taq 중합효소를 가한 다음 증폭 반응 후 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다. PCR 산물을 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하고 전기영동 후 방사형광 스캐너(radioluminograph scanner, BAS 2500, Fuji Photo Film, Japan)로 관찰한다. 메틸화 정도(%)는 표준 검량선을 이용해 구했으며 도면 밴드 아래에 %로 표기하였다. 메틸화의 다른 표현으로 다섯 등급, 즉 level 1 (0-20% methylation), level 2 (21-40% methylation), level 3 (41-60% methylation), level 4 (61-80% methylation), level 5 (81-100% methylation)도 사용하였다.

도 3은 메틸 가변부위 및 인접 CpG섬 부위 메틸화 결과 (5단계)를 암 환자의 암 부위 및 정상 부위로 나누고 이는 다시 암 예후를 말해주는 염색체 소실정도로 세분화한 결과이며 표 3은 이 결과를 정리한 것이다. 암 예후가 안 좋은 고 위험군의 고등도 염색체 소실(LOH-H) 군 환자의 암 부위, 정상부위 메틸화 차이가 CpG섬 보다 메틸가변부위에서 확연함을 알 수 있다. 즉 표 3 하단 메틸가변부위 마커인 14개를 이용한 암환자의 암 부위와 정상부위 메틸화 차이에 대한 통계적 유의 수준인 p value가 표 상단 CpG섬 마커의 메틸화 차이의 p value 보다 전반적으로 낮아 메틸가변부위 마커가 암과 정상 부위를 분별하는데 효용성이 있음을 보여 준다. 표 4는 메틸가변부위 마커인 14개를 이용하여 위암 환자(n=39)의 암 부위의 메틸화 변화와 암 조직의 임상병리소견의 상관관계를 조사한 표이다. 환자의 암 부위가 정상부위와 비교하여 메틸화가 증가했으면 고 메틸화(Hypermethylation), 메틸화가 감소했으면 저 메틸화(Hypomethylation)로 구분하고 환자 당 14개 마커의 메틸화 차이를 과 메틸화 몇 %, 저 메틸화 몇 %로 나타냈다. 이 메틸화 차이와 임상 병리 소견과 상관 관계를 조사해 보니 암 단계 진행도(말기)와 림프절 전이는 저 메틸화 %가 높은 환자일수록 높았고(p, 0.006, 0.015), 고 메틸화 %가 낮을수록 정맥전이, 림프절 전이, 암 단계 진행도(말기)가 높아짐(p, 0.041, 0.003, 0.023)을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 메틸 가변부위의 메틸화 정도가 그동안 잘 알려진 인접 CpG섬 부위 메틸화 변화에 비해 암 환자의 암 부위 및 정상 부위의 구분 및 예후 예측에 더 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.

도 4와 도 5는 CpG섬이 없는 경우 가변부위 표지자 6개와 CpG섬이 있는 경우 표지자 9개를 가지고 암 환자의 정상 부위와 암 부위의 메틸화 차이를 분석하고 이를 염색체 소실과 상관 관계를 조사한 것이다. 특히 도 5에서 보듯이 CpG섬 유,무에 관계없이 위암 경우 메틸 가변부위의 메틸화 (고메틸화, 저메틸화)정도가 기 알려진 암 예후 마커인 염색체 소실 LOH-H와 LOH-L와 연관 됨을 알 수 있어 메틸가변 부위의 분자 후성학적 메틸화 차이가 염색체 소실과 더불어 암의 분류, 진단, 예후 예측에 다양하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

도 6에서 U는 탈메틸화 올리고뉴클레오티드로 증폭한 결과, M 은 메틸화 올리고뉴클레오티드로 증폭한 결과 및 %는 메틸화 정도를 백분율로 환산한 값이다.

도 6은 염색체 불안정성이 생긴 저위험군(case10)과 고위험군(case25) 각각에 대해 정상 조직과 종양 조직을 비교하고 본 발명의 메틸 가변부위 후성유전 올리고뉴클레오티드 및 기존에 많이 연구된 CpG섬 염기서열에서 제작된 올리고뉴클레오티드를 이용 중합효소 연쇄반응과 전기영동을 수행한 결과이다. 기존에 많이 연구되어 왔던 CpG섬 염기서열에서 제작된 올리고뉴클레오티드의 경우, 정상과 종양간의 차이가 비교적 적으나, CpG섬 염기서열을 벗어난 (Non-island CpG) 본 발명의 메틸이행 부위를 타겟으로 제작된 올리고뉴클레오티드의 경우 저위험군(case10)에서는 메틸화, 고위험군(case25)의 경우에는 탈메틸화 경향을 나타내었다. CpG섬 염기서열에서 제작된 올리고뉴클레오티드의 경우, 정상과 종양간의 차이가 비교적 적으나, 본 발명의 메틸이행부위 올리고뉴클레오티드 활용은 확연히 정상과 암의 메틸화 정도 차이를 보여줘 더 우수한 암진단 방법임을 증명하고 있다. 예를 들어 고위험군(case25)에서 P15나 RASSF1A와 같은 기존에 연구되고 있는 CpG섬 염기서열 부위에서 제작된 올리고뉴클레오티드들 결과로는 정상과 종양 간에 적은 차이를 보인 반면, 본 발명의 메틸 이행 부위 쪽의 MLH1, MAGEA2 같은 올리고뉴클레오티드들은 정상과 종양 간에 메틸화 정도에 있어 큰 차이를 보여 주고 있다. 한편 고위험군 (case25)에서 MLH1 -0.6 kb 경우는 본 발명의 메틸 가변 부위가 아닌 CpG 섬 염기서열 부위에서 제작한 올리고뉴클레오티드로 염색체 소실의 정도에 따른 차이나 정상과 종양 간의 메틸화 정도에 차이를 나타내지 않아 암 진단에 예측력이 떨어지는 올리고뉴클레오티드임을 알 수 있으나 본 발명의 메틸 가변 부위에서는 정상과 종양간의 차이를 확연히 구분할 수 있는 유용한 올리고뉴클레오티드임을 알 수 있다.

< 실시예 3> 단순 반복열 올리고뉴클레오티드로 LOH (이형 접합부소실) 정도 측정

위암에서 염색체완 4p, 5q, 9p, 13q, 17p, 18q 에 위치한 40개의 단순 반복열 올리고뉴클레오티드로 정상 조직과 종양 조직을 중합효소 연쇄반응과 전기영동을 수행하였다. 그 결과, Case 10의 경우 15개 동형접합올리고뉴클레오티드 중 40% 이상에서 고등도의 염색체 불안정성을 보이고 Case 25는 LOH-H (고등도)의 염색체 소실을 보이고 있다.

< 실시예 4> 내시경 병변과 수술 병변에 있어 염색체 소실 정도 비교

내시경 병변이 전체 병변의 유전자형을 대표할 수 있다면 수술 전 유전자 진단에 내시경 병변 염색체 소실(loss of heterozygosity, LOH) 분석을 이용할 수 있다. 위암 환자에서의 91 쌍의 내시경 병변과 수술 병변을 비교한 결과 96%가 유사한 유전자형을 나타내는 대표성이 있어 위암 환자 수술 전에 내시경 병변 유전자 진단이 가능하다.

< 실시예 5> LOH 정도 및 병변 크기와의 조합에 의한 수술조직 정확도

130명의 위암환자에 대한 다병소 연구에서 림프절 전이는 크기와 관계없이 고위험 유전자형에서 빈번했으며, 저위험 유전자형은 5cm 이상의 병변에서 83%로 나타났다. 장막침습은 유전자형과 관계없이 병변이 작은(<5 cm) 경우보다 큰(>5 cm) 경우에 빈번했다. 내시경 병변의 유전자형과 병변의 크기를 조합하여 예측할 경우 수술조직에 대한 예측 정확도는 림프절 전이 및 장막침습 각각에 대해 Roc area(Receiver operating characteristics area)가 0.815 와 0.685 Roc area로 우수하였다.

< 실시예 6> 염색체 소실( LOH ) 정도와 병변 크기와의 조합에 의한 수술조직 예측 정확도와 컴퓨터 단층촬영간의 정확도 비교

표 5는 LOH 정도와 병변 크기와의 조합 검사와 컴퓨터 단층촬영 간의 정확도를 비교한 실시예이다.

장막침습(ROC 영역 = 0.691 vs 0.548)이나 림프노드 전이(ROC 영역 = 0.691 vs 0.642)로 컴퓨터 단층촬영보다 유전자 검사와 병변 크기를 조합한 예측도가 높게 나타났음을 보여주는 표이다.

< 실시예 7> 염색체소실 ( LOH ) 정도 와 염색체 불안정성에 따른 유전자형 분류와 생존률 관계

도 8은 임상 2기와 3기에 따른 수술 후 위암 환자 130 명에서의 생존곡선에 관한 도면이다. 유전자형으로 환자들을 분류했을 때 저 위험군(저등도 소실형, 염색체 불안정성)에서는 높은 생존율을 고 위험군(고등도 소실형, 초등도 소실형)에서는 낮은 생존율을 보이고 있다.

< 실시예 8> 염색체 소실정도와 가변부위의 메틸화 정도를 병행 측정하여 유전자 진단의 예측 정확성 향상

도 9는 염색체 소실의 정도를 고등도, 저등도, 초등도, 염색체 불안정성으로 구분할 경우 메틸화 정도를 병행하여 조사함으로써 염색체 소실의 정도 구분이 더욱 명확해짐을 보여주는 도면이다. 도 9의 A, B에서는 염색체 소실에 따라 메틸화의 정도가 감소함을 나타낸 그래프이고, 도 9의 C, D는 염색체 소실 정도가 증가함에 따라 메틸화 정도는 감소하는 경향을 보여주고 있다. 염색체 소실 정도에 따라 고등도, 초등도 소실에서는 메틸화가 감소하고, 저등도, 염색체 불안정성에서는 메틸화가 증가하는 경향을 나타내고 있다. 이러한 염색체 소실과 메틸화 정도가 유의한 차이를 보이는 점을 이용해 암 진단 시 예측력을 더욱 높일 수 있다. 즉 가변부위의 메틸화 정도와 LOH 정도 사이 상관관계가 높으므로 메틸화 정도는 LOH의 비연속성에 의한 부정확성을 크게 감소시켜 두 가지 측정방법을 동일 병변에서 분석하면 기존 유전자 진단의 정확성을 크게 향상시킬 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간의 시료 유전자 상에 존재하며 하기와 같이 정의되는 신규의 메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는,
암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법.

'메틸 가변 부위(methylation transitional zone)'란 게놈 DNA 상에서 가변적으로 메틸화가 일어나는 부분으로, CpG 섬이 있는 경우에는 CpG 섬의 상류(upstream) 지역의 첫 번째 역전위체와 CpG 섬의 하류(downstream) 지역의 첫 번째 역전위체 사이에 걸쳐 있는 연속된 염기서열로서 CpG 섬을 제외한 부분을 의미하고, CpG 섬이 없는 경우에는 전사 개시부의 상류 지역의 첫 번째 역전위체와 전사 개시부 하류 지역의 첫 번째 역전위체 사이에 걸쳐있는 연속된 염기서열을 의미한다.
제1항에 있어서,
메틸 가변 부위는 RABGEF1, STAG, CHGB, TNFRSF14, SERPINB5, ANGPTL7, TFF2, BGLAP, MSLN, DDX53, MAGEA2, VDR, ST14, CDKN2A, MYBPC2, RUNX3, RUNX2, MLH1, PTEN, PPARG, RB1, PAX5, CDH1, KIAA1752, FLJ43855, MUC8, ESR2 및 E2F4의 메틸 가변 부위로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
인간의 시료 유전자 상의 메틸 가변 부위의 메틸화가 일어나지 않은 정도를 파악하기 위해 메틸 가변 부위를 특이적으로 증폭하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4k-3 및 4k-2(k는 1≤k≤40인 정수)로 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드이고,
메틸화가 일어난 정도를 파악하기 위해 메틸 가변 부위를 특이적으로 증폭하는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4k-1 및 4k (k는 1≤k≤40인 정수)로 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는,
암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법.
제3항의 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예측, 암의 진단, 암 전이 정도 또는 예후의 확인용 키트.
제4항에 있어서,
PCR 또는 마이크로어레이 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 예측, 암의 진단, 암 전이 정도 또는 예후의 확인용 키트.
제1항에 있어서,
메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하는 단계 외에,
염색체 소실(Loss of heterozygosity, LOH) 정도를 측정하는 단계 및
메틸화 정도와 염색체 소실 정도를 조합하여 판단하는 단계가 더 포함된 것을 특징으로 하는,
암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법.
제6항에 있어서,
염색체 소실 정도를 측정하기 위한 올리고뉴클레오티는, 서열번호 161 내지 240으로 기재되는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는,
암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법.
제7항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예측, 암의 진단, 암 전이 정도 또는 예후의 확인용 키트.
제8항에 있어서,
PCR 또는 마이크로어레이 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 예측, 암의 진단, 암 전이 정도 또는 예후의 확인용 키트.
제1항에 있어서,
메틸 가변 부위(methylation transitional zone)의 메틸화 여부를 측정하는 단계는,
1) 환자의 시료인 대상 DNA를 주형으로 메틸 가변 부위 특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 메틸화 특이적 PCR을 수행하는 단계; 및
2) 상기 메틸 가변 부위의 DNA 메틸화 정도를 측정하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는,
암의 예측, 암의 진단, 암의 전이 정도 또는 예후 확인에 필요한 정보를 제공하기 위하여 데이터를 수집하는 방법.