본 발명은 엽록소가 함유된 다시마 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 다시마를 물로 추출하여 농축물을 제조하고, 남은 잔사에 대해서 주정 또는 에탄올로 추출하여 얻어진 농축물에 엽록소를 첨가하여 기능성을 보강함으로서, 다시마가 가지는 특유의 색택을 가지는 엽록소를 함유하면서 추출, 농축액이 가지는 영양소를 함유함으로서 식품의 첨가제로서나 엽록소가 가지는 생리활성 물질이 함유된 기능성 다시마 농축물을 제조한 것으로, 이를 이용하여 스트레스로부터 피부를 보호하여 피부를 촉촉하고 깨끗하게 가꾸어주는 효과가 우수한 화장료 조성물 및 식품소재를 제공하는 것이다.
본 발명의 구성을 실시예 및 실험예를 통해 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1] 다시마 추출물의 제조방법
다시마는 우리나라 연안의 바다에서 양식되는 대표적인 해조류의 한가지로서 연간 25만톤(06년) 정도 생산되는데 길이는 1.5-4.5m, 넓이 25-40cm 정도로 자라는데 다시마에는 엽록소를 비롯하여 카로틴류, 크산토필류와 같은 색소 외에 만니톨, 라미나란 등의 탄수화물과 점질다당류인 알긴산이 많이 들어 있고 요오드, 비타민 B2, 및 글루타민산 등의 아미노산이 풍부하게 함유하고 있다. 다시마의 일반성분, 당류 및 황산기 등의 함량에 대해서는 분석한 결과를 표 1 및 2에 나타내었다.
생다시마를 구성하는 성분중 무기질은 3.5%를 포함하고 있는데 이들의 대부분은 바닷물의 주성분인 소금으로 이루어져 있다. 이것을 그대로 물로 추출하여 농축할 경우 다량의 소금이 함유되기 때문에 사용상 문제가 될 수도 있다.
도 1의 다시마 추출물 제조방법의 흐름도를 나타내는 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 본 발명에서는 소금함량을 급감시키기 위하여 다시마를 채취 즉시 담수 또는 수도수로 여러 번 수세를 함으로써 소금함량을 급감과 이물질을 제거하는 수세과정(1)과,
수세(1)한 다시마를 천일건조 또는 열풍건조기에서 50℃ 이하의 온도에서 엽체 양쪽 및 내부가 충분히 건조되도록 건조하는 건조과정(2)과,
상기 건조된 다시마를 500 mesh까지, 약 3-5mm 정도로 분쇄하여 추출물을 제조하는데 사용할 수 있도록 분쇄하는 분쇄과정(3)으로,
이는 수세한 생다시마를 그대로 갈아서 추출할 경우 페이스트상태로 되어 오히려 추출뿐만 아니라 여과하기도 어려운 단점이 있어 건조한 다시마를 사용하는 것이 오히려 좋았으며, 또한 건조한 다시마를 분쇄하여 3-5mm 정도가 되도록 하였는데 이는 다시마를 분말로 하여 추출하였을 경우 생다시마와 마찬가지로 페이스트상태가 되어 추출하기가 곤란하게 되기 때문에 다양한 크기로 분쇄하여 추출하여 본 결과 길이가 3-5mm 정도로 분쇄(3)하는 것이 추출수율이 다소 증가하였고 또한 분리하기도 양호하였다.
상기의 분쇄과정(3)에서 분쇄된 다시마를 덖음기에 추입하고 다시 95% 주정 또는 알코올을 분무한 후, 덖음기를 70℃에서 교반하는데 다시마 고유의 향이 기화되기 시작하면 밀폐된 덖음기의 내부온도가 120℃에서 150℃를 넘지 않도록 설정하면서 고속회전(200-250rpm)시켜 다시마의 향을 다시마에 덧입히게 덖음을 실시하는 덖음과정(4)으로,
이는 덖음기의 내부온도를 70℃에서 50rpm의 속도로 회전 시키면서 서서히 온도를 120-200℃ 정도의 온도를 유지하면서 200~250rpm으로 교반시키면서 다시마 특유의 향기성분과 덖음으로서 생성되는 독특한 향미성분을 다시 다시마에 마스킹함으로서 풍미가 좋을 뿐만 아니라 다시마 특유의 떫은맛을 제거할 수 있게 하며, 덖음과정(4)을 할 경우, 수율도 다소 증가하면서 다시마의 볶음으로 풍미좋은 향을 가지게 된다.
덖음기에서 덖음과정(4)이 완료되어, 분쇄된 다시마 중량에 대해서 20배 가량의 물을 가하여 65℃에서 3시간, 95℃에서 1시간을 가열하여 2단 추출함으로서 추출수율을 높이는 단계추출을 하는 단계추출과정(5)과,
단계추출과정(5)을 거친 다음, 60℃ 이하로 냉각(6)하여, 직경 1μm 중공사막을 이용한 연속여과장치를 통해서 여과하여 여과액을 조제하는 여과과정(7)과,
상기의 여과과정(7)을 통하여 얻어진 추출물을 60℃ 이하의 저온감압농축기를 이용하여 감압농축하여 10-15배로 농축하는 감압농축과정(8)을 거쳐 최종적으로 원하는 다시마추출물(A)이 얻어지게 된다.
한편, 추출물(A)이 얻어지고 남은 다시마 잔사(B)는 다시 건조(11)하여 엽록소의 추출효율을 높이기 위해 95% 주정 또는 알코올을 20배 가량 첨가(12)하여 상온에서 교반(13)하면서, 3시간동안 2회 반복하면서 엽록소 등을 포함하는 주정 또는 알코올 추출물인 엽록소 추출물액(14)을 제조하여,
50℃에서 저온감압농축을 통하여 주정 또는 알코올을 완전히 제거한 다음 농축되어진 농축물(15)을 만들어 최종적으로 상기의 다시마추출물(A)에 교반혼입하면서 서서히 가하게 된다. 이렇게 하면 풍미가 좋으면서 기능성성분인 엽록소함량이 높은 다시마 추출물이 얻어 식품 또는 기능성소재로서 이용지게 되는 것이다.
[실험예 ] 다시마 추출물의 기능성조사를 재료 및 측정방법
본 발명의 실시예로 제조한 다시마추출액의 기능성시험을 아래와 같이 동물실험을 통하여 실시하였다.
1. 시약 및 재료
본 실험에 사용된 다시마 추출물의 멸균 전,후(다시마 A, 다시마 B)를 그림 1과 같이 제조하여 실험에 사용하였다. 동물실험에 사용된 측정용 kit는 WAKO (WAKO, Japan), 신양화학 (신양화학, Korea) 제품을 사용하였으며, amyloglucosidase는 Sigma (Sigma Chemical Co., U.S.A.) 제품을 사용하였다. 그 외의 유기용매와 같은 일반시약은 특급시약을 사용하였다.
2. 실험방법
가. 시료의 조제
(1) 다시마추출물의 조제
다시마추출물을 멸균(121℃, 15분)한 것과 하지 않은 것으로 구분하였으며, 그리고 진공동결건조한 것을 분말로 조제한 다음 동물사료로 사용하였다.
(2) 동물실험 사료의 조제
본 동물실험에 사용된 기본 사료는 표 3과 같다. 콜레스테롤식이는 기초식이에서 콜레스테롤 1%를 급이한 양만큼 옥수수전분의 양을 줄여 조제하였고, 실험식이는 기초식이의 옥수수전분의 양에서 콜레스테롤 1%와 다시마의 4%에 해당하는 양만큼을 줄인 수준에서 각각 조제하였다. 제조한 사료는 4℃에서 보관하며 공급하였다.
나. 실험동물의 사육과 처리
(1) 실험동물의 사육
실험동물의 실험식이는 기초식이, 콜레스테롤식이, 다시마 A 4%식이, 다시마 B 4%식이로 구분하여 실시하였다. 동물실험은 Samtaco(경기도, 오산시)에서 분양받은 4주령된 Sparague Dawley계 숫쥐(체중 100~120g)를 사용하였다. 각 10마리씩 분류하여 연립식 사육케이지에 넣고, 일반사료로서 7일간 순치 예비사육한 후에 기초식이와 콜레스테롤식이, 다시마 A 4%식이, 다시마 B 4%식이를 함유하는 식이를 4주간 급여하였다. 예비사육 및 본 사육기간 중의 물과 식이는 자유급이(ad libitum) 하였으며, 사육실 온도 (22±1℃), 습도(50±10%) 및 명암(12시간, 06:00~18:00 주기로 조명)을 엄격히 조절하였다.
(2) 실험동물의 처리
실험동물은 실험사육 최종일에 18시간 동안 절식시킨 후에 단두하여 채혈하였고, 각 혈액시료는 빙수 중에 1시간 방치한 후에 원심분리(2,500 rpm, 20min 4℃)하여 취한 혈청을 저온 (-70℃)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 그리고 간장, 신장, 심장, 비장, 대장, 소장, 맹장도 별도로 적출하여 생리식염수로 씻은 후, 그 무게 를 칭량하였다. 특히, 간장은 채취한 즉시 생리식염수로 세척, 여과지로 물기를 제거하여 중량을 측정한 후, 액체질소에 넣어 급속 동결시킨 다음 실험에 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다. 분변은 실험식이 급여기간 중 실험종료 전 7일간 metabolic cage로부터 수집하였다.
다. 실험 시료의 분석
(1) 체중증가량, 식이섭취량, 식이효율 및 장기중량
식이 섭취량은 매일 일정한 시간에 먹은 식이의 양을 측정하였고, 체중은 1주일에 한번 일정한 시간에 동일한 순서로 측정하였다. 체중증가량은 실험 사육기간 동안 체중에서 실험 사육 시작할 때의 체중을 뺀 값으로 하였다. 식이효율은 체중 증가량을 같은 기간 동안 식이 섭취량으로 나누어 표시하였고 장기 중량은 간장, 신장, 심장, 비장, 대장, 소장, 맹장의 무게를 칭량하였다.
(2) 혈청 및 간장 지질의 분석
중성지질 및 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 혈당의 분석시료 중, 혈청은 저온보관중의 시료를 그대로 분석하였다. 간장분석시료는 간장조직 0.5g을 취하여 마쇄한 후, hexan : isopropanol 혼액 (3 : 2, v/v)으로 지질을 추출하고 N2 gas로 농축하였다. 농축한 시료는 chloroform : methanol 혼액 (2 : 1, v/v) 0.5㎖에 용해하여 분석용 시료로 사용하였다.
(가) 혈청 및 간장조직 중의 중성지질
혈청과 간장조직 중의 중성지질의 농도는 추출시료 각 10㎕를 취하여 TRYGLYZYME-V "Eiken" kit를 써서 Enzymatic법으로 반응시켜 분광광도계 (Ultrospec 2001 pro, Amersham Phamacia biotech, England)로써 505nm에서 측정하였다.
(나) 혈청 및 간장조직 중의 총콜레스테롤
혈청과 간장조직 중의 총콜레스테롤의 농도는 추출시료 각 10㎕를 취하여 총콜레스테롤 측정용 CHOLESTE ZYME-V "Eiken" kit를 사용하여 Enzymatic COD법으로 반응시켜 505nm에서 측정하였다.
(다) 혈청 중의 HDL-콜레스테롤 및 동맥경화지수
혈청 중의 HDL-콜레스테롤의 농도는 추출시료 각 100㎕를 취하여 HDL-C555 kit를 사용하여 phosphotungstic acid- Mg++헤파린망간 결합 침전법으로 반응시켜 555nm에서 측정하였으며, 동맥경화지수(Atherogenic index, AI)는 (Total cholesterol - HDL- cholesterol)/HDL-cholesterol로 계산하였다.
(3) 혈청 중 혈당
혈청 중의 혈당의 농도는 추출시료 각 10㎕를 취하여 Enzymatic glucose oxidase와 peroxidase 법에 따라 제조된 혈당측정용 GL ZYME "Eiken" kit 를 써서 500nm에서 측정하였다.
(4) 간장조직염색
각 실험식이별로 사육한 흰쥐의 간장조직을 떼어내어 생리식염수로 가볍게 씻어 혈액을 제거하였다. 간장 조직의 일부를 절단하여 0.5cm 두께로 잘라 Bouin 고정용액 (picric acid : formalin : glacial acetate = 15 : 5 : 1)에 고정하고, 동일 고정액을 사용하여 24시간 안에 tissue capsule에 넣어 재고정 하였다. 이를 수세하여 자동침투기 (autotechnicon)에 넣어 순차농도 알코올에 탈수하고 xylene으로 투명화 시켰다. Embedding center에서 tissue capsule에 paraffin을 침투시켜 포매 (embedding)하여 block으로 만들었다. Rotary microtome으로 block을 이를 5㎛ 두께로 박절하여 부유 항온수조에서 충분히 퍼지도록 둔 후 깨끗한 slide glass에 부 착시켰다. 그런 다음, slide glass와 조직절편을 단단히 접착시켜주기 위해서 60℃ 온도를 유지하는 slide warmer에 방치하였다. 마지막으로 기본적으로 세포의 배열과 형태학적 변화를 보기위해 모든 조직절편을 핵과 세포질을 구분해서 볼 수 있는 Hematoxylin & Eosin 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다.
(5) 분변의 분석
(가) 분변 중의 지질 분석
분변 시료 중 0.5g을 취하여 chloroform : methanol (3 : 1, v/v) 15㎖로 지질을 추출하고 여액을 회수하여 N2 gas로 용매를 증발시킨 후 1g 당 chloroform : methanol (2 : 1, v/v) 혼합액을 1㎖ 첨가시켜 완전히 용해시킨 후 총콜레스테롤 분석용 시료로 혈청과 동일한 방법으로 측정하였다.
(나) 분변 중의 총 담즙산 함량
0.2g의 분변에 4% KOH/glycerol 2㎖을 첨가하여 20분간 습열멸균하고 20% NaCl을 2㎖첨가하여 ether 20㎖로 2회 추출하였다. 추출한 잔사에 2N HCl 1.2㎖를 첨가하여 산성화 (pH 1~2) 시킨 후 ether 5㎖로 4회 추출하여 상층액을 회수하였다. 상층액을 Water bath에서 45℃로 용매를 증발시켜 methanol : H20 (5 : 1, v/v)혼합액 2㎖에 녹였다. 이것을 총 담즙산 test kit (Wako, Japan)를 이용하여 효소비색법으로 측정하였다.
(다) 분변 중의 총 식이섬유 함량
분변 시료 중 0.5g을 취하여 chloroform : methanol (3 : 1, v/v) 15㎖로 지질을 추출한 후 여액은 버리고 잔사에 증류수 10㎖를 첨가하여 95℃ water bath에서 15분간 가열한 후 55℃ water bath에서 15분간 냉각시켰다. 여기에 250㎕의 amyloglucosidase를 가하여 55℃에서 1시간 30분 가온한 후 취한 여액에 250㎕의 amyloglucosidase를 넣어 55℃에서 1시간 30분 가온하였다. 이것을 실온에서 1시간 방치하고 acetone으로 탈수하여 잔사를 회수하고 건조하여 항량을 구한 다음, 525℃ 회화로에 1시간 30분 회화시켜 회분을 구하였다. 즉, 분변 당 섬유소 잔사와 회분항량의 차를 분변 중의 총 식이섬유소로 하였다.
[실험 결과 ]
상기와 같이 준비된 사료를 이용하여 실험한 결과를 살펴보면,
먼저, 다시마추출물의 각종 기능성을 조사하기 위하여 동물시험을 실시하였는데 다시마추출물을 멸균(121℃, 15분)한 것과 하지 않은 것으로 구분하였으며, 실험동물의 실험식이는 기초식이, 콜레스테롤식이, 다시마 A 4%식이(멸균 하지 않은 것), 다시마 B 4%식이로 구분하여 4주간 실험사료 급이를 한 다음 실험을 실시하였다.
1) 혈청 및 간장 조직중의 중성지질 함량의 측정
중성지질은 세포의 기능유지와 에너지 대사에 사용됨으로 당연히 존재해야 하지만 너무 과하면 고지혈증, 동맥경화증 등을 유발하여 심각한 문제를 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 기초식이와 실험식이를 급이한 흰쥐의 혈청과 간장 조직에서의 중성지질의 하량을 측정하여 표 4에 나타내었다. 본 실험에서 혈청 중의 중성지질의 농도는 차이가 없었으나 간장조직에서의 중성지질의 농도는 기초식이군에 비하여 콜레스테롤군이 현저히 높은 값을 나타내었으며 다시마 A 및 B군은 콜레스테롤군에 비해 감소하는 것을 표 3에 나타내었다.
2) 혈청 및 간장 조직 중의 총콜레스테롤 함량
기초식이와 실험식이에 따른 총콜레스테롤의 함량을 표 5에 나타낸 것으로, 총콜레스테롤 농도는 혈청과 간장에서 모두 콜레스테롤군이 기초식이군에 비해 증가하였고, 다시마군은 콜레스텔롤군에 비해 감소한 것으로 나타났다.
한편, 도 2의 흰쥐의 간장조직의 현미경적 관찰사진에서와 같이, 실험동물의 실험 식이는 1) 기초식이, 2) 콜레스테롤식이, 3) 다시마 A 4%(멸균 하지 않은 것)+콜레스테롤 함유식이 4) 다시마 B 4%+콜레스테롤함유식이로, 실험식이에 따른 흰쥐의 간장조직을 조직학적으로 살펴보고자 염색 처리한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 간장 조직의 현미경관찰 결과 지방구를 제외한 부분은 붉게 염색되었으며, 지방구는 투명한 색으로 존재하였다. 기초식이군과 비교하였을 때, 콜레스테롤 급이군은 간장조직에서 큰 지방구들이 관찰되었다. 또한 다시마 식이군에서는 지방의 양이 감소되어 기초식이군과 거의 가깝게 나타났다. 이는 콜레스테롤과 다시마를 급이하면 콜레스테롤로 인하여 생길 수 있는 지방축적을 다시마가 억제시킬 수 있음을 보여주는 증거이며, 해부 시 간장의 사진과 간장조직 중의 지질함량과도 동일한 결과를 보였다.
3) 혈청중의 HDL-콜레스테롤의 함량 및 동맥경화지수
다시마와 미역귀, 고콜레스테롤 식이를 흰쥐에 4주간 급여시 혈청 중 HDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤/총콜레스테롤비와 동맥경화지수에 미치는 영향은 표 6에 나타내었다. HDL-콜레스테롤은 기초식이군에서 가장 높은 값을 가지며, 콜레스테롤을 급이한 군이 함량을 가진다. 다시마 A, B 4%군은 콜레스테롤군에 비하여 증가함을 볼 수 있다.
4) 분변중의 총콜레스테롤 및 총담즙산 함량
실험식이에 따른 분변 중의 총콜레스테롤 및 총담즙산함량을 표 7에 나타내었다. 분변 중의 총콜레스테롤의 함량은 기초식이군보다 콜레스테롤군이, 콜레스테롤군보다는 다시마 A 4%군, 다시마 B 4%군이 증가하였다. 다시마군은 콜레스테롤군에 대해 차이는 보이지 않았으나 더 높은 값을 보였으며, 수용성 식이섬유는 지방을 비롯한 영양소의 소화와 흡수에 영향을 미쳐 분변으로의 지방배설을 증가시켜 체내농도를 저하시킨다는 연구가 많은데, 특히 담즙의 배설을 증가시키는 효과가 있다고 알려져 있다.
총담즙산 함량은 다시마 식이군 모두 높은 값을 나타냈으며, 기초식이군에 비하여 콜레스테롤군에서 높았다.
5) 분변중의 총식이섬유 함량
식이섬유는 소화되지 않아 영양적 가치가 없고 영양소의 흡수를 저해한다는 단점이 있으나 수용성 식이섬유는 보수력이 커서 위에서 포만감을 형성, 장내에서 점도 증가, 당뇨환자의 포도당 내성 증진효과가 있고 장내에서 콜레스테롤 및 담즙산을 흡착한 후 대변으로 배설시킴으로써 혈중 콜레스테롤 농도 저하효과가 있다고 알려져 있다.
표 8는 실험식이에 따른 분변 중의 식이섬유 함량을 나타낸 것으로, 분변 중의 총식이함량은 각 군간에 차이는 보이지 않았으나, 기초식이군과 콜레스테롤군에 비하여 다시마와 미역귀 식이군이 증가하였다. 이는 식이섬유의 작용에 의해 소장에서 담즙산과 결합하여 분변으로 배설되었기 때문인 것으로 보인다.
본 연구는 갈조식물에 속한 다시마 추출물의 멸균전, 멸균후(다시마 A, 다시마 B)를 콜레스테롤과 함께 흰쥐에 급이하였을 때 혈청과 간의 지질대사에 미치는 효과를 검토하였다.
1. 다시마 급이가 흰쥐에게 미치는 영향
가. 체중의 증가와 식이효율은 각 실험군마다 약간의 차이를 보였으나 큰 차이는 없었다.
나. 간, 심장, 비장의 중량은 콜레스테롤군이 가장 높았으며, 다시마를 급이 하였을 때 다소 감소하였다.
2. 혈청 및 간장 조직 중의 지질 조성에 미치는 영향
가. 혈청 중의 중성지질의 함량은 다른 군과 유의적인 차이를 보이지 않았고, 혈청 중의 총콜레스테롤의 함량은 다시마 A, B군이 콜레스테롤군에 비하여 감소하였다.
나. 간장 조직에서 중성지질과 총콜레스테롤 함량은 콜레스테롤군에서 대부분 증가하였다.
다. 다시마 A, B를 급이하였을 때 동맥경화 지수가 감소하는 것과 HDL-콜레스테롤 농도 및 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 농도비가 증가하였다.
라. 다시마를 급이한 흰쥐에서는 콜레스테롤만 급이한 흰쥐의 간장 조직 현미경 검사에서 지방함량이 적었다.
3. 분변 중의 조성
총 식이섬유는 다시마 급이군이 다른군에 비하여 유의적으로 높은 값을 가졌다.
이상의 결과들에서 다시마를 멸균 전후로 나누어 검토하였을 때, 멸균 전후 사이에는 큰 차이를 보이지는 않았고 다시마는 콜레스테롤과 함께 섭취하는 경우, 콜레 스테롤로 인해 상승된 혈청과 간장의 지질수준을 떨어뜨리고 분변 중 지질배설량을 상승시키는 효과가 있어, 고콜레스테롤 혈증, 지방간, 동맥경화와 같은 질병에 개선효과가 있는 것으로 나타났다.
이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다.