KR101143363B1 - 키토산을 이용한 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자 및 그 제조방법, 그 나노입자를 함유한 식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산을 이용하여 병출의 면역 증진용 성분을, 흡수가 용이하고 식용에 적합하도록 나노입자로 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 나노입자 등에 관한 것이다. 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 나노입자 제조 방법은 병풀 내 수용성 성분의 용출을 위한 용매 추출공정 및 수용성 추출물의 나노입자화라는 단계를 거쳐 시행된다.

보다 구체적으로 본 발명의, 키토산을 이용한 병풀의 면역 증진 성분의 식용 나노입자 제조방법은,

(1) 종래의 공지된 방법에 따라 수용성 용매를 사용하여 병풀 내 수용성 유효성분을 추출하는 단계;

(2) 하기 (3)의 병풀 수용성 추출물 수용액 대비 0.05 내지 0.5 중량%의 키토산을 약산성의 용매에 녹여 상온에서 다시 증발 건조시키는 방법으로 키토산의 박막 유상을 만드는 단계; 및

(3) 위 키토산의 박막 유상을, 0.1 내지 1.0 mg/mL 농도의 병풀 수용성 성분의 수용액과 혼합 분산하여 w/o(water in oil) 형식의 나노입자를 제조하는 단계;로 이루어진다.

병풀, 수용성 추출물, 키토산, 식용 나노입자

Description

키토산을 이용한 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자 및 그 제조방법, 그 나노입자를 함유한 식품{The preparing method of Centella asiatica nanoparticle using chitosan, the product, and the food containing the product}

본 발명은 키토산을 이용하여 병출의 면역 증진용 성분을, 흡수가 용이하고 식용에 적합하도록 나노입자로 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 나노입자 등에 관한 것이다.

병풀(Centella asiatica L. Urban)은 산형과에 속하는 포복성 다년생 초본으로 아프리카의 마다가스카르(Madagascar) 섬이 원산지이나 그 외 인도양의 해안지역, 북부 오스트레일리아 및 일부 중남미 등지의 고온 다습한 곳에서 폭넓게 자생하며, 국내에서는 난대지방에 속하는 제주도 및 남부지방의 도서지역에 자생하고 있다.

병풀은 인도 및 아시아 지역의 전통요법을 통해 오래전부터 약용으로 이용되 어 왔는데, 주요성분인 asiaticoside와 madecassoside는 α-amyrin-ursolic acid group에 속하는 pentacyclic triterpene glycoside로 피부 상처 및 만성 궤양 치료 활성 등을 나타낸다. 또한 이들 물질은 Mycobacterium leprae의 waxy capsule을 용해하기 때문에 나병 치료에도 사용되었는데, 그중에서도 특히 asiaticoside는 항박테리아, 항균 및 항염증 활성을 가지고 있어 피부 상처, 위궤양은 물론 다양한 피부질환, 정신질환, 결핵, 정맥질환, 치매 등의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

병풀은 asiaticoside, madecassoside, asiatic acid, madecassic acid, vallerin과 미량의 알칼로이드(alkaloid) 등을 함유함에 따라 상처 치료에 탁월하고, 항치매 및 위장병 등에 효과가 있어 질병 치료제의 원료로 다양하게 사용되고 있다. 특히 이들 물질들은 피부조직의 재생력을 갖는 물질들로 콜라겐 생성을 촉진시켜 실제 임상에서는 상처 치료 목적의 연고제를 구성하는 주성분으로 사용되고 있다.

이처럼 병풀은 피부치료제, 상처치료제, 기억력 증강제 및 강장제 등으로 다양하게 이용되고 있는 약용식물로서 국내에서도 의약품, 기능성 화장품 소재로 사용하기 위한 수요가 증가하고 있으나, 주요 서식지역이 열대 및 아열대 지방에 국한되고 국내에서는 재배 및 채취에 어려움이 있어 상용 원료는 전량 국외로부터의 수입에 의존하고 있는 실정이다. 또한 병풀 및 주요성분에 대한 효용이 널리 인식되어 왔음에도 이의 효율적인 활용 연구는 매우 미흡한 상황이다.

한편 생체 내 물질 송달과 관련한 연구는, 투여 약물을 표적 부위에 선택적, 효율적으로 수송시켜 원하는 시간 동안 작용하도록 하여 최대의 치료 효과를 발현하도록 하고, 다른 부위나 조직으로는 약물의 송달을 최소화시켜 부작용을 저감할 수 있는 약물 수송방법을 개발하는 데 주안점이 두어지고 있다.

이와 관련하여 나노기술은 나노미터(10^-9m) 수준을 제어하는 기술로 약물송달체계(DDS)의 적용을 통해 특정 부위에 대한 선택적 송달이 가능하기 때문에 최근 질병치료의 첨단 기술로 각광받고 있다. 나노기술은 유효 성분의 지속시간을 늘려줄 뿐 아니라 나노 소재화된 성분이 원하는 시간에 원하는 장소에서 작용하도록 조절이 가능해 상업적 이용 면에서도 점차 증가하는 추세이다.

앞서 본 병풀은 그 수용성 추출물이 외상치료, 피부면역 활성, 면역증진 등의 활성을 나타내는 유효성분을 함유하고 있음에도, 그 활성성분인 다당류의 소화기작 등의 이유에서 내복을 통해서는 효과적으로 작용하지 못하기 때문에 외피 도포 등을 통한 외용제로만 사용되는 제한이 있었다. 다시 말해 병풀 수용성 추출물은 인체에 유효한 성분을 함유하고 있으나 이들 유효성분들 대부분이 triterpene계 화합물 또는 다당류로 구성됨에 따라 체내 흡수 이전의 소화 작용으로 분해 변형되기 쉬운 구조를 가지고 있다. 본 발명에서는 이러한 단점을 개선하고자 식용 키토산을 이용하여 내복 및 생체활용성 증진이 가능한 병풀 식용 나노입자를 제조하고자 하였다.

본 발명자들이 본 발명의 창안에 있어서 주목한 키토산(chitosan)은 생체 내에서 독성을 띠지 않고 영향흡수 조절, 소화 촉진 작용은 물론 면역증강 효과를 나타낼 뿐 아니라, 나노입자 제조를 통해 방출 기작의 제어가 가능해 키토산을 이용한 수용성 물질의 식용 나노입자를 제조할 경우 면역증진용 식음료 및 향장 의약품에 사용하여 상승효과 유도를 기대할 수 있다.

키토산은 게나 가재, 새우 껍데기 등에 들어 있는 키틴(chitin)을 탈아세틸화 하여 얻어낸 물질을 말하는데, 노폐해진 세포를 활성화하여 노화를 억제하고 면역력을 강화해주며 질병을 예방해주는 것으로 알려져 있다. 또한 생체의 자연적인 치유 능력을 활성화하는 기능과 함께 생체 리듬을 조절해주는 것으로 알려져 있으나 그 메커니즘은 아직 완전히 규명되지 않았다. 유해 콜레스테롤의 흡착, 배설 및 항암작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 혈압 상승의 원인이 되는 염화물 이온을 흡착하여 장에서의 흡수를 억제한 뒤 체외로 배출시킴으로써 혈압 상승 억제 작용 및 장내의 유효 세균을 증식시키고 세포를 활성화시키기도 한다. 혈당 조절과 간 기능 개선 작용, 체내 중금속 및 오염 물질 배출 등의 효과가 있으며, 키토올리고당 함량이 전체 성분 중에서 20% 이상 넘어야 체내에 쉽게 흡수되어 효과를 보인다.

위에서 기재한 바에 의해 어느 정도 드러났지만, 본 발명의 목적은 주로 외용제로 사용돼온 병풀의 단점을 개선하여 그 유효성분의 흡수가 용이하고 식용에 적합하도록 내복 및 생체활용성 증진이 가능한 병풀 식용 나노입자를 제조하는 것이다.

본 발명에서는 병풀의 수용성 추출물이 유용한 활성을 나타내는 성분을 함유하고 있으나 내복을 통해서는 효과적으로 작용하지 못하는 단점을 개선하고자 식용 키토산을 이용하여 내복 및 생체활용성 증진이 가능한 병풀 식용 나노입자를 제조하였다.

종래 의약품을 위한 나노입자의 제조는 합성 고분자 화합물이나 지용성 물질을 이용한 제형 개발에만 집중돼 있을 뿐 아니라 그 제조방법에 있어 PCL(polycaprolactone)이나 PGLA(poly glycolide-co-lactide)는 물론 유기용매 등을 이용하고 있어 그 독성으로 인해 사용범위가 제한되고 식의약용 화합물의 최대 원천인 천연물의 수용성 추출성분으로의 적용 공정은 이루어지지 못한 것이 사실이다. 본 발명을 통한 병풀의 키토산 나노입자는, 종래 병풀을 이용한 피부 외용제 및 향장품의 경우 병풀의 활성성분인 고분자 화합물의 효율적인 피부 침투를 위해 비식용 소재 및 유기용매를 사용하여 제형화되던 것과 달리 독성을 나타내지 않는 식용 가능 키토산을 이용함에 따라 식음료 등에 첨가하는 게 가능하다.

또한 종래 제시되었던 식용 가능 나노입자 공정에서 나노입자 제조에 레시틴 이나 젤라틴 등의 인지질을 사용함으로써 나노입자의 크기가 대형화되고, 나노입자로부터의 유효성분의 용출 속도가 저하되며, 특유의 냄새를 띠어 관능적으로 제품성 저하를 야기하던 것과 달리, 본 발명에서는 키토산을 이용함에 따라 무색무취의 나노제형 제조가 가능해 제품 제조 시 관능적인 영향을 미치지 않을 뿐 아니라 키토산 소재 자체가 면역증강에 효과를 나타냄에 따라 면역증진 작용이 배가되는 효과를 얻을 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 나노입자 제조 방법은 병풀 내 수용성 성분의 용출을 위한 용매 추출공정 및 수용성 추출물의 나노입자화라는 단계를 거쳐 시행된다.

보다 구체적으로 본 발명의, 키토산을 이용한 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자 제조방법은,

(1) 종래의 공지된 방법에 따라 수용성 용매를 사용하여 병풀 내 수용성 유효성분을 추출하는 단계;

(2) 하기 (3)의 병풀 수용성 추출물 수용액 대비 0.05 내지 0.5 중량%의 키토산을 약산성의 용매에 녹여 상온에서 다시 증발 건조시키는 방법으로 키토산의 박막 유상을 만드는 단계; 및

(3) 위 키토산의 박막 유상을, 0.1 내지 1.0 mg/mL 농도의 병풀 수용성 성분의 수용액과 혼합 분산하여 w/o(water in oil) 형식의 나노입자를 제조하는 단계; 로 이루어진다.

이때 병풀의 수용성 성분 추출 공정의 수득률 증진을 위해서, 상기 (1)의 추출 공정에 앞서 시료에 100 Mpa 내지 500 Mpa의 압력을 가하는 고압 공정을 시행하는 단계와, 일반 추출 공정 이후에 40 내지 120 kHz의 초음파를 15 내지 60 분간 시행하는 초음파 공정 단계의 적어도 어느 하나를 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조되는, 키토산을 이용하여 제조되는 병풀의 면역 증진 성분의 식용 나노입자인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 나노입자의 크기는 200 nm 이하인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 위와 같이 제조된 식용 나노입자를 함유한 식품, 음료 또는 의약품인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따라 제조된 나노입자는 50 내지 300 ㎚의 범위까지 형성될 수 있으나 필터링(filtering) 등을 통해 입자의 선별이 가능하다. 또한 나노입자의 크기는 나노입자화 공정의 유상 물질 사용량 및 실시 조건의 조정을 통해 조절이 가능하다.

본 발명을 통한 w/o(water in oil) 형식의 나노리포좀(nano liposome)은 입자 내부에 수용성 물질을 포집하는 형태를 띠는데 이를 통해 내부 수용성 물질의 서방형 또는 민감성 방출 제어가 가능하다. 또한 본 발명을 통한 병풀의 나노입자 는 무색무취의 나노입자가 직경 200㎚ 이하 수준에서 w/o(water in oil) 형식의 리포좀(liposome) 형태로 제조됨에 따라 세포막 투과가 용이해 내복을 통한 생체 흡수 및 활용성 증진을 도와 수용성 추출물이 가지는 면역 증진 활성 효과의 극대화를 꾀할 수 있을 뿐 아니라, 종래 레시틴 등을 이용한 식용 소재 나노입자가 관능적으로 제품성을 저하시키는 것과 달리, 나노입자의 외부를 이루는 키토산의 관능적 특성 때문에 식음료 및 향장 의약품 등에 다양하게 적용할 수 있다.

전술한 바와 같이 병풀 수용성 추출물은 면역증진 활성을 나타내는 유효성분을 함유하고 있으나 이들 유효성분들 대부분이 triterpene계 화합물 또는 다당류로 구성됨에 따라 체내 흡수 이전의 소화 작용으로 분해 변형되기 쉬운 구조를 가지고 있다. 본 발명에서는 이들을 나노입자화 하여 체내 영양흡수 기관까지 특성을 유지시킴에 따라 유효성분의 생체 흡수 효율을 향상시키는 것이 가능하다. 식용 키토산은 체내에서 독성을 나타내지 않을 뿐 아니라 체내 소화기관에서 식이섬유와 유사한 효과를 나타냄에 따라 수용성 물질을 포집할 경우 소화작용에 의한 유효성분의 변형을 최소화할 수 있다. 또한 키토산 소재 자체로서 영양흡수조절, 정장작용, 노폐물 배출 및 호전반응 유도를 통한 면역증강 작용 등을 나타냄에 따라 병풀 유효성분이 가지는 면역증진 활성의 상승 효과 유도가 가능하다.

또한 본 발명을 통한 병풀 수용성 추출물의 나노입자화 기술은 기존의 나노입자화 공정이 단일 화합물을 원재료로 사용하는 것과 달리 수용성 용매 추출물 상태 그대로 사용하여 천연소재가 가지고 있는 유용성분 및 생리활성을 그대로 보존할 뿐 아니라 시행 및 제품화 공정 적용이 용이한 기술이다.

위와 같은 본 발명의 제조방법을 공정별로 보다 상세히 설명한다.

[제1공정 : 추출 공정]

종래의 공지된 방법에 따라 수용성 용매를 사용하여 병풀 내 수용성 유효성분을 추출하는 단계이다.

병풀 유용성분의 용출을 위해 물 및 에탄올 등 식품공전에 의거 식품에 사용 가능한 추출용매를 이용하여 60℃ 내지 100℃ 조건에서 열수 추출을 비롯한 통상적인 방법을 시행하여 추출한다. 수득된 수용성 추출물은 농축 및 동결건조 등을 통해 분말화하여, 이어지는 제2공정에서 물에 녹여 사용한다. 만일 병풀 성분의 추출을 위해 물을 용매로 사용한 경우라면 추출된 수용액 상태 그대로 사용하여 제2공정을 생략하고 제3공정으로 가는 것도 가능하다.

한편 병풀 추출 공정의 수득률 증진을 위해 전술한 추출 공정에 앞서 시료에 100 Mpa 내지 500 Mpa의 압력을 가하는 고압 공정 및/또는 추출 공정 이후 40 내지 120 kHz의 초음파를 15 내지 60분간 병행하는 초음파 공정을 병행할 수 있다.

[제2공정 : 수용성 추출물 제조 공정]

제1공정을 통해 수득된 시료가 분말 상태의 병풀 추출물일 경우 제품화 공정 적용 등을 위해 농도 설정 단계를 거침으로써, 일정 농도로 증류수 및 수용성 용매 에 용해된 병풀 수용성 추출물을 얻을 수 있다. 이때 수용성 추출물의 수용액의 최종 농도는 나노입자화 공정 조건을 고려하여 0.1 내지 1.0 mg/mL가 되도록 하는 것이 바람직하다.

[제3공정 : 키토산을 이용한 리포좀 제조 공정]

나노입자화 하고자 하는 병풀 수용성 추출물 수용액의 0.05 내지 0.5 중량%에 해당하는 식용 키토산을 약산성의 용매에 녹인다.

그 다음 회전증발기를 이용하여 상온 감압 하에 용매를 전량 회전 증발시키면 표면적이 늘어나 수용성 물질 포집에 용이한 박막 키토산의 제조가 가능하다. 이 박막에 제1 또는 제2 공정을 통해 제조된 병풀 수용성 추출물의 수용액을 부어준 후 핸드 세이킹(hand shaking)하여 수화시켜준 다음, 초음파 분산기를 이용하여 40℃ 이하 조건에서 초음파를 20 내지 60분 정도 가해 분산시켜 준다. 이상의 공정은 수용성 추출물의 변성을 방지하기 위해 상온 범위에서 수행하는 것이 바람직하며 균질화 및 분산을 위해 균질기(homogenizer) 및 고압분산기(microfludizer)를 이용할 수 있다.

[제4공정 : 나노입자 분리 정제 공정]

상기 공정을 통해 수득된 나노입자는 마이크로 필터(0.2 내지 0.4 μm)에 통과시켜 크기에 따라 선별이 가능하며, 세파덱스 겔(G-50, G-75 등)을 이용하면 수용액과 나노입자의 분리가 가능하다.

본 발명을 통해 제조된 병풀의 키토산 식용 나노입자는 식용 키토산이 병풀 수용성 추출물을 포집하는 w/o(water in oil) 형식의 리포좀(liposome) 형태로 제조됨에 따라 체내에서 소화기작에 따른 병풀 면역증진 활성성분의 변형, 손실이 적고 흡수율이 높을 뿐 아니라, 키토산이 가지는 고유의 정장작용, 영양흡수 조절 작용 및 면역증강 작용 등을 함께 가져 면역증진 활성의 극대화가 가능하며, 무색무취한 성질을 가짐에 따라 제품에 적용 시 관능 저하가 없어 식음료는 물론 향장 의약품으로의 활용이 용이한 특징을 가진다.

실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1.

본 발명을 통한 병풀 수용성 추출물의 나노입자 제조를 위해 제주도에서 채취한 병풀 초본을 이용하여 실시예를 수행하였다.

건조중량 50 g의 병풀을 에탄올 500 mL를 용매로 하여 100℃에서 24시간 추출하였다. 이를 다시 초음파발생기에 넣고 30분간 60 kHz의 초음파를 병행하였다. 초음파병행 공정의 온도는 추출 온도와 동일하게 조정하였다. 추출물을 감압여과, 농축 및 동결건조를 통해 분말 상태로 하였다. 이 분말시료를 1 mg/mL의 농도로 증류수에 녹여서 수용성 병풀 수용성 추출액으로 사용하였다.

키토산 25 mg을 0.5% 아세트산용액 10 mL에 녹인 후, 회전증발기를 이용하여 감압상태에서 용매를 증발시켰다. 농도를 맞춘 50 mL의 병풀 수용성 추출액을 준비된 키토산에 부어준 후 핸드 세이킹(hand shaking)하여 지질을 수화시켜 주었다. 이렇게 제조된 용액을 30℃의 수욕에 넣고 초음파분산기를 이용하여 20분간 분산시켜 주었다.

실시예 2.

상기 실시예 1의 공정을 통해 제조된 병풀 수용성 나노입자를 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 촬영한 결과, 병풀 나노입자는 직경 200 nm 이하 수준의 크기를 가진 w/o 리포좀 형식의 구형 입자임을 알 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1. 본 발명의 병풀 수용성 나노입자화 공정을 통해 제조된 나노리포좀 의 TEM 사진

실시예 3.

상기 실시예 1의 공정을 통해 제조된 병풀 수용성 나노리포좀의 크기별 분포를 알아보기 위해 DLS(dynamic light scattering) 측정 및 image analyzer를 이용한 상 분석 결과, 나노입자의 60% 이상이 200 nm 이하의 크기로 균일하게 형성되어 평균 78.2 nm의 직경을 가지고 고르게 형성 분포되어 있음을 확인하였다(Fig. 2 및 Fig. 3).

Fig. 2. 본 발명의 병풀 수용성 나노입자화 공정을 통해 제조된 나노입자의 DLS 측정 결과

Fig. 3. 본 발명의 병풀 수용성 나노입자화 공정을 통해 제조된 나노입자의 크기열 분포도이다.

실시예 4.

상기 실시예 1을 통해 제조된 병풀 수용성 나노입자의 제품화 적용 가능성을 확인하고자 세포수준에서의 독성을 측정하였다. 세포독성은 인간 정상 간 세포주인 Human Embryonic Kidney 293(HEK293)을 이용하여 세포 단백질을 염색하고 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법인 SRB(sulforhodamine B) assay로 측정하였다. 결과를 통해 병풀 수용성 추출물 및 나노입자가 1.0 mg/mL의 투여농도에서도 32% 이하의 세포독성을 나타내었으며, 본 발명의 나노입자화 공정을 통한 수용성 추출물의 독성 저감 효과도 관찰되었다(Fig. 4).

Fig. 4. 병풀 수용성 추출물 및 본 발명의 병풀 수용성 나노입자화 공정을 통해 제조된 나노입자의 인간 정상 간세포에 대한 세포독성을 측정한 그래프

* 60℃ EtOH : 병풀을 에탄올을 용매로 하여 60℃에서 추출한 추출물

* 100℃ Water : 병풀을 물을 용매로 하여 100℃에서 추출한 추출물

실시예 5.

상기 실시예 1의 공정을 통해 제조된 병풀 나노입자의 면역 증강 효과를 확인하고자 병풀 수용성 추출물 및 나노입자 시료 첨가를 통한 면역세포의 생육도를 확인하였다. 면역세포는 인간 유래 면역 B 세포인 Raji를 이용하였으며, 생육도는 생존세포의 formazan 염색을 통한 MTT (3-(4,5-dimethythiazo-2-gl)-25-dipheny- tetrazolium bromide) assay로 확인하였다. 실험결과 모든 시료가 시료첨가를 통해 면역세포의 생육 증진 활성을 나타내었으며 그중에서도 본 발명을 통해 제조된 나노입자가 평균적으로 14%의 증진 효과를 나타내었다(Fig. 5).

Fig. 5. 병풀 수용성 추출물 및 본 발명의 병풀 수용성 나노입자화 공정을 통해 제조된 나노입자의 첨가를 통한 B세포의 생육도를 나타낸 그래프

* 60℃ EtOH : 병풀을 에탄올을 용매로 하여 60℃에서 추출한 추출물

* 100℃ Water : 병풀을 물을 용매로 하여 100℃에서 추출한 추출물

상기 실시예는 본 발명의 청구 내용을 제한하지 않으며, 해당 관련 분야의 당업자가 이해할 수 있는 범위의 변형 조건을 포함한다.

위에서 살펴본 본 발명은 키토산을 이용하여 병출의 면역 증진용 성분을, 흡수가 용이하고 식용에 적합하도록 나노입자로 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 나노입자 등에 관한 것으로서, 식음료 및 향장 의약품 등에 다양하게 적용할 수 있다.

Claims (5)

1. (1) 수용성 용매를 사용하여 병풀 내 수용성 유효성분을 추출하는 단계;

   (2) 하기 (3)의 병풀 수용성 추출물 수용액 대비 0.05 내지 0.5 중량%의 키토산을 약산성의 용매에 녹여 상온에서 다시 증발 건조시키는 방법으로 키토산의 박막 유상을 만드는 단계; 및

   (3) 위 키토산의 박막 유상을, 0.1 내지 1.0 mg/mL 농도의 병풀 수용성 성분의 수용액과 혼합 분산하여 w/o(water in oil) 형식의 나노입자를 제조하는 단계;로 이루어지는,

   키토산을 이용한 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자 제조방법.
2. 제1항에 있어서,

   병풀의 수용성 성분 추출 공정의 수득률 증진을 위해, 상기 (1)의 추출 공정에 앞서 시료에 100 Mpa 내지 500 Mpa의 압력을 가하는 고압 공정을 시행하는 단계와, 일반 추출 공정 이후에 40 내지 120 kHz의 초음파를 15 내지 60 분간 시행하는 초음파 공정 단계의 적어도 어느 하나를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는,

   키토산을 이용한 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는,

   키토산을 이용하여 제조되는 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자.
4. 제3항에 있어서,

   나노입자의 크기는 200 nm 이하인 것을 특징으로 하는,

   키토산을 이용하여 제조되는 병풀의 면역 증진용 성분의 식용 나노입자.
5. 제4항의 식용 나노입자를 함유한 식품.