KR101065608B1

KR101065608B1 - 안드로그라폴라이드 또는 안드로그라폴라이드를유효성분으로 함유하는 천심련 추출물을 포함하는가려움증 억제 또는 완화 조성물

Info

Publication number: KR101065608B1
Application number: KR1020030098988A
Authority: KR
Inventors: 조호성; 이민호; 노경옥; 강상진
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2003-12-29
Filing date: 2003-12-29
Publication date: 2011-09-19
Also published as: KR20050067951A

Abstract

본 발명은 가려움의 주된 중재자인 물질 P (Substance P)-NK1수용체의 결합을 방해하거나(고) 염증성 싸이토카인의 억제를 통한 항염작용으로 민감성 피부질환에 따른 가려움증이나, 두피 가려움증, 알러지에 의한 가려움증을 완화시키고자 안드로그라폴라이드(Andrographolide) 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련 (Andrographis paniculata )추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10중량% 포함하여 이루어지는 두피 세정 조성물, 저자극성 화장료, UV등으로부터 피부보호제, 전신세정제, 세안제, 비누 및 크림, 일회용 기저귀, 아토피성 유아 제품 등의 조성물에 관한 것이다.

물질 P-NK1수용체, 민감성 피부질환, 두피 가려움증, 천심련(Andrographis paniculata), 안드로그라폴라이드(Andrographolide)

Description

안드로그라폴라이드 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련 추출물을 포함하는 가려움증 억제 또는 완화 조성물 {Andrographolide or Andrographis paniculata extract containing composition having anti-itching effect}

도 1은 천심련 추출물에 의한 TNF-a mRNA 변화를 보여주는 것이다.

도 2는 천심련 추출물에 의한 IL-1 mRNA 변화를 보여주는 것이다.

도 3은 안드로그라폴라이드에 의한 TNF- mRNA 변화를 보여주는 것이다.

도 4는 안드로그라폴라이드에 의한 IL-1 mRNA 변화를 보여주는 것이다.

본 발명은 가려움의 주된 중재자인 물질 P (Substance P)-NK1수용체의 결합을 방해하거나(고) 염증성 싸이토카인의 억제를 통한 항염작용으로, 민감성 피부질환에 따른 가려움증이나, 두피 가려움증을 억제 또는 완화시키고 알러지에 의한 가려움증을 완화시키고자 안드로그라폴라이드(Andrographolide) 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련(Andrographis paniculata) 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10중량% 포함하여 이루어지는 두피 세정 조성물, 저자 극성 화장료, UV등으로부터 피부보호제, 전신세정제, 세안제, 비누 및 크림, 일회용 기저귀, 아토피성 유아 제품등의 조성물에 관한 것이다.

가려움증이란 긁고 싶어하는 불쾌감을 유발하는 피부의 상태를 일컫는 것으로 가벼운 접촉, 온도변화, 스트레스 등의 자극이나 화학적, 물리적, 전기적인 자극으로도 유발할 수 있다. 또한 아토피, 건선, 접촉성 피부염과 같은 피부질환자나 민감성 피부 보유자의 증상으로 동반된다.

민감성 피부 보유자란 피부 병변에 관한 어떠한 임상적 또는 조직학적 증상 없이 피부장애를 경험할 잠재력을 가진 사람들로써 화장품이나 비누, 샴푸와 같은 세정제의 사용 후, 눈으로 드러나는 자극현상 이외에도, 감각적으로 가려움을 호소 또는 제품에 불평하곤 한다.

또한 아토피, 건선, 접촉성 피부염과 같이 외부 알러젠에 의해 발생하는 피부 질환 및 가려움은 여러 싸이토카인(TNF-a, IL-1등) 및 가려움의 중재자인 히스타민의 분비를 유도하여 일어나는 것으로 알려져 있다.(Br J Haematol, 1996; Cancer Biother, 1995)

최근 들어 이러한 가려움에 대한 신경생리학적 접근 및 면역학적 연구가 활발히 진행되어 가려움은 C-섬유 말단의 유해 감수기를 통해 무수구심신경으로 전달되며, C-섬유 말단에서 분비되는 푸루리토젠(pruritogen)으로써 물질 P, CGRP등은 각각의 수용체와 결합하여 가려움을 촉발하는 것으로 알려지고 있다.(Kuraish et al, J Pharmacol Exp Ther. 1998, p270-275) 또한 이들 푸루리토젠들은 비만세포(mast cell)의 활성화를 이루어 가려움의 또 다른 중재자인 히스타민의 방 출을 유도하는 증거가 있다.(Morohashi et al, Arch Dermatol Res. 2000, p418 421)

또한 과민성 피부염의 경우, 가려움은 항 히스타민제에 의해서 억제되지 않지만 면역억제제인 사이클로스포린 A에 의해서 억제된다는 보고로 보아 가려움의 발생엔 자가면역이상도 관여한다고 볼 수 있다.

현재 가려움을 치료하기 위한 요법들은 국소 및 전신약제, 예를 들면 스테로이드, 항 히스타민제, 면역억제제등이 있으나, 경구투여로 인한 졸림, 면역력 저하 및 국소투여에 따른 피부에 대한 안전성 면에서나 피부용 조성물 배합시의 안정성 면에서 대부분 문제점을 안고 있어 그 사용이 제한되고 있는 실정으로(김창종, 병태심리학, 한림상사, 1988, p61-69) 인체에 부작용이 적으며 자극완화 효과가 있는 물질이 연구, 개발되고 있는 중이다.(Yakhak Hoeji, Arch. Pharm Res 21, 1998, p406-410)

본 발명의 목적은 현재 가려움억제를 위해 사용되어 지는 스테로이드, 항 히스타민제들의 문제점을 극복하고, 인체 안전성이 우수하며 가려움증의 억제 및 완화할 수 있는 안드로그라폴라이드(Andrographolide) 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련(Andrographis paniculata)추출물을 포함하는, 두피 세정 조성물, 저자극성 화장료, UV등으로부터 피부보호제, 전신세정제, 세안제, 비누 및 크림, 일회용 기저귀, 아토피성 유아 제품등에 적용할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 안드로그라폴라이드 (Andrographolide) 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련 (Andrographis paniculata) 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10중량% 포함하여 이루어지는 두피 세정 조성물, 저자극성 화장료, UV등으로부터 피부보호제, 전신세정제, 세안제, 비누 및 크림, 일회용 기저귀, 아토피성 유아 제품 등의 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 가려움 억제를 위한 유효성분으로 함유되는 안드로그라폴라이드는 하기 일반식 1로 표시된다.

천심련(Andrographis paniculata)추출물은 쓴 맛의 강장제, 해열제와 대장 증상에 있어 전통적인 약제로 널리 사용된다(인도 약초 총람, R. N. Chopra, S. L. Nayer, I. C. Chopra편집, p18, 1996; 인도의 유용한 약초, S. B. Ambasta 편집, p39, 1992). 상기 식물은 또한 항말라리아성(Pharmacognology, 1992, 30(4), p263-274)과 면역성촉진기능(천연 생산품 잡지, 1993, 56(7), p995-999)을 가진 것으로 알려져 있다. 상기 식물의 추출물과 그 성분은 좋은 간 보호기능(Planta Medica, 1987, 53(2), p135-140)을 보이는 것으로 알려져 있다. 또한 최근 천심련 추출물에 의한 세포독소 작용, 항종양 생성, 세포분화 유도기능과 항 HIV성 때문에 어러 연구자들이 주의를 기울여 왔다.

한편, 본 발명자들은 안드로그라폴라이드(Andrographolide) 또는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하는 천심련(Andrographis paniculata) 추출물의 가려움억제 효과를 알아보기 위해 SP-NK1결합 방해 시험, 염증성 싸이토카인(TNF-a, IL-1b) 억제여부 시험, 가려움 유발 동물 행동 모델 시험을 하였으며 그 결과 천심련추출물 또는 안드로그라폴라이드(Andrographolide)의 효과가 우수함을 알아내어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명을 위해 안드로그라폴라이드는 천심련(Andrographis paniculata)에서 추출할 수 있다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예 들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 제조예 및 실시예 들에 한정되는 것으로 해석되어져서는 안된다.

천심련(Andrographis paniculata) 추출물 제조예 1

먼저 건조된 천심련의 모든 부분 4kg을 잘게 분쇄한 후 메탄올 용매로 환류 냉각기가 달린 추출기에서 60 ~ 80℃로 1 ~ 5시간 가열 추출한다. 이 메탄올 추출물을 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상 더 추출한 후, 추출액을 합하여 감압 농축한 다음 결정이 형성되도록 하룻밤동안 나둔뒤, 건조하여 건조추출물 40g을 얻었다.

상기 추출용매로는 메탄올 이외에 피트럼 에테르(petroleum ether), 클로로포름, 에탄올 등이 사용될 수 있다.

안드로그라폴라이드 제조예 2

상기 천심련 건조추출물 40g을 용매 분획을 통하여 핵산 및 클로로포름 분획을 제거하고, 얻은 분획을 수포화된 부탄올로 3회 분획하여 얻은 부탄올 분획 24g을 실리카겔 컬럼크로마토그라피와 고속액체크로마토그라피(HPLC)로 정제한 다음, 재결정 방법을 이용하여 안드로그라폴라이드 1g 얻었으며, 질량분석 및 핵자기공명 스펙트럼으로 그 구조를 확인하였다.

상기 안드로그라폴라이드 의 추출 용매로는 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르로 구성된 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합용매를 사용할 수 있다.

상기 천심련(Andrographis paniculata) 추출물 및 안드로그라폴라이드 는 두피 세정 조성물, 저자극성 화장료, UV등으로부터 피부보호제, 전신세정제, 세안제, 비누 및 크림, 일회용 기저귀, 아토피성 유아 제품 등의 조성물에 첨가 할 수 있으며 첨가량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10중량% 함유되는 것이 바람직하 다. 10중량%를 초과하는 경우에는 조성물 제조시 안정성이 떨어지며, 0.0001%미만의 경우에는 그 작용이 미미하다.

실험예 1

물질 P-NK1 경쟁 결합 방해 시험

상기 제조예에 따라 얻은 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 물질 P의 수용체인 NK1(Neurokinin 1)이 많이 존재하는 인간세포U373-MG(한국세포주은행에서 분양받음 : KCLB-30017)을 이용하여 물질 P와 경쟁적 결합정도를 알아보았다. 간략히 요약하면 U373-MG세포를 24웰 플래잇트에 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 70 ~ 80% 자란 상태의 세포는 0.1%FBS/RPMI 1640으로 교체한 후, 3nM ³H-SP를 실시예 1 내지 8과 같이 1 내지 200ug/ml농도의 시험물질과 동시에 1시간 동안 처리하였다. 비교예로는 시험물질의 용매(DMSO)만 처리하였다. 그 후 PBS(Phospate Buffer Saline)로 깨끗이 세척한 후 5% SDS(Sodium Dodesyl Sulfate)/0.01N HCl을 이용하여 세포를 용해시키고, 액체섬광계수기(LSC)를 이용하여 용해액의 방사성 정도를 측정하였다. 이 측정값은 대조군에 대한 상대적인 물질 P 결합 억제률(%)로 계산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.

(N=3)

시료명	결합 저해율(%)
비교예 1(DMSO용매)	0
실시예 1(천심련 추출물-최종농도 10ug/ml)	25
실시예 2(천심련 추출물-최종농도 50ug/ml)	42
실시예 3(천심련 추출물-최종농도 100ug/ml)	60
실시예 4(천심련 추출물-최종농도 200ug/ml)	100
실시예 5(안드로그라폴라이드-최종농도 1ug/ml)	35
실시예 6(안드로그라폴라이드-최종농도 5ug/ml)	65
실시예 7(안드로그라폴라이드-최종농도 10ug/ml)	92
실시예 8(안드로그라폴라이드-최종농도 50ug/ml)	100

표 1을 참조하면, 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물은 비교예 1과 비교할 때 농도 의존적으로 NK1 수용체에 대한 물질 P의 경쟁적 결합 저해력이 있음을 알 수 있다.

실험예 2

염증성 싸이토카인(TNF-a, IL-1b)억제 여부 시험

상기 제조예에 따라 얻은 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 염증시 형성되는 염증 싸이토카인(TNF-a, IL-1b)의 억제여부를 반 정량적RT-PCR법에 의하여 알아보았다. 먼저 RAW264.7 뮤린 대식세포를 1시간동안 제조예 1 내지 2에서 수득한 성분을 1ug/ml 내지 50ug/ml의 존재 및 부재하(DMSO 처리)에 배양한 후 LPS(Lipopolysaccharides, Sigma Chemical Co., L 2880)(1ug/ml) 와, IFN- (100unit/ml) (Sigma Chemical Co.) 의 첨가를 통한 염증성 싸이토카인의 활성화를 유도한 뒤 6시간 후 RNA를 추출하였다. TNF-a에 대한 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 각각 5'-AGT TCT ATG GCC CAG ACC CT-3'(388 - 407번) 및 5'-CGG ACT CCG CAA AGT CTA AG-3'(852 871번)으로 484 bp이고, IL-1b는 5'-TCT TTG AAG TTG ACG GAC CC-3'(142 161번) 및 5'-AGG CCA CAG GTA TTT TGT GG-3'(608 627번)으로 486 bp이다. 또한 -액틴에 대한 센스 및 안티센스 올리고 프라이머는 5'-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3' 및 5'-TCT CAG CTG TGG TGG TGA AG-3' 으로 410 bp이다. 폴리머라제 연쇄 반응은 DNA 열 주기(참조:Perkin-Elmer 9600)로 수행한다. 전체 RNA를 TRI-시약(MRC Inc., Cincinnati, OH 제조원)을 사용하여 추출한다. cDNA를 M-MLV(Promega Co, Madison 제조원) 을 사용하여 동량(1 내지 2㎍)의 전체 RNA에서 제조한 후, 동량의 cDNA를 사용하여 mRNA를 증폭시킨다. PCR 증폭은 1.75 mM MgCl₂, 20PpM 프라이머, 200 uM dNTP, 1U 단위의 Taq 폴리머라제(ELPIS BIOTECH 제조원)을 함유하는 20㎕ 용액중에서 수행한다. 증폭 조건은 TNF-a, IL-1b(30 사이클), -액틴(25 사이클) 모두 94℃에서 5분 변성 후, 94℃에서 30초, 58ㅀC에서 30초, 72℃에서 30초로 25 내지 30 사이클 수행 한 후, 72℃에서 10분간 수행한다. 그 후 생성물을 1.2% 아가로즈 젤 상에서 전기영동에 의해 분석한다.

정량 분석시 -액틴의 양을 Densitometer를 이용하여 모두 정상화 한 후 평가하였다.

그 결과 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물은 도면 1 내지 4에서 보듯, 농도 의존적으로 TNF-a와 IL-1b의 mRNA를 억제함을 알 수가 있다. 이 데이터는 동일 시료 농도에 대한 2개의 별개 실험을 나타낸다.

이하에서는 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 샴푸, 크림, 에센스 등에 첨가하여 가려움완화 조성물을 제조하고 마우스를 대상으로 가려움 억제효과를 살펴본다.

실시예 9 내지 12

표 2에 기재된 조성비율로 혼합한 후, 이 혼합물의 온도가 60℃ 가 될 때까지 가온하여 균일하게 용해시킨 다음 40℃ 까지 냉각시켰다. 여기에 색소(청색 1호), 파라옥시안식향산에스텔, 향료 및 구연산을 투입하여 혼합한 후 실온으로 냉각하여 샴푸를 제조하였다.

비교예 2

안드로그라폴라이드 또는 또는 천심련 추출물을 혼합하지 않은 것을 제외하고는 실시예 9 내지 12와 동일한 방법으로 샴푸를 제조하였다.

원료명(중량%)	실시예 9	실시예 10	실시예 11	실시예 12	비교예 2
라우릴황산나트륨	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0
폴리옥시에틸렌라우릴황산나트륨(30%)	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0
야자유지방산디에탄올아미드	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
프로필렌글리콜	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
천심련 추출물(%)	0.5	2	-	-	-
안드로그라폴라이드(%)	-	-	0.1	1	-
아연피리티온	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
피록톤올아민	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
파라옥시안식향산에스텔	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
색소(청색 1호)	적량	적량	적량	적량	적량
향료(조합향 SKP-3473: Haesegawa)	적량	적량	적량	적량	적량
구연산	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100

실시예 13 ~ 16

표 3에 기재된 조성비율로 혼합기에서 잘 유화시키고 탈기, 여과, 냉각하여 크림 조성물을 제조하였다. 그 이외의 첨가제인 방부제, 향료, 색소 등을 첨가한 후, 작은 크기의 유성성분이 존재하도록 수중유형(O/W)으로 제조하였다.

비교예 3

안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 혼합하지 않은 것을 제외하고는 실시예 13 내지 16과 동일한 방법으로 크림을 제조하였다.

원료명(중량%)	실시예 13	실시예 14	실시예 15	실시예 16	비교예 3
스테아린산	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0
스테아릴알코올	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
스테아린산부틸	6.0	6.0	6.0	6.0	6.0
프로필렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
천심련 추출물	0.5	2	-	-	-
안드로그라폴라이드	-	-	0.1	1	-
모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
수산화칼륨	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
색소	적량	적량	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량	적량	적량
방부제	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100

실시예 17 ~ 20

표 4에 기재된 조성비율로 에센스를 제조하였다.

비교예 4

안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 혼합하지 않은 것을 제외하고는 실시예 17 내지 20와 동일한 방법으로 에센스을 제조하였다.

원료명(중량%)	실시예 17	실시예 18	실시예 19	실시예 20	비교예 4
프로필렌글리콜	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
글리세린	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
히알루론산나트륨수용액(1%)	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
천심련 추출물	0.5	2	-	-	-
안드로그라폴라이드	-	-	0.1	1	-
에탄올	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
폴리옥시에틸렌경화피마자유	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
향료	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100

실험예 3

가려움 유발 동물 행동 모델 시험

사토(Satoh)등의 하기원고에 기술된 방법은 본 발명에서 개발된 마우스 모델 의 원형을 제시하였다.(Satoh et al, 1995, Eur J Pharmacol, p229 233)

이를 간단히 설명하면, 23 내지 26g 중량의 10마리의 수컷 ICR 마우스로 된 군을 시험에 사용하였다. 이들을 23 내지 25℃로의 온도 조절 하에 수용하였다. 음식물 및 물은 자유로이 먹을 수 있게 하였다.

가려움 유발 동물 행동 모델 시험을 위해서 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 실시예 9 내지 20와 같이 0.1 내지 2% 함유하여 처리하였다. 또한 비교예 2 내지 4과 같이 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 포함하지 않은 각각의 제형을 대조군으로 처리하였다.

긁기를 유발시키기 위하여, 사람에게 가려움 감각을 일으키는 것으로 알려진 Compound 48/80을 사용하였다. 이때 Compound 48/80은 멸균생리 식염수에 용해 시켰다.

먼저 마우스의 목 뒤에 용매 또는 시험물질 100ul을 도포하고 30분 후 Compound 48/80(2mg/ml : 100ug/site) 50ul를 목 뒤에 피내 주사 한다. 이 후 30분간 마우스의 움직임을 관찰하여, 뒷다리로 주사한 부위를 긁는 횟수를 헤아린다.

이 자료는 평균과 표준편차를 계산하여 분석하였으며, 평균값의 통계적 차이는 스튜던트 티-테스트(student t-test)를 사용해 결정하였다.

그 결과는 하기 표 5 에 나타냈다.

시험물질	가려움 억제%	시험물질	가려움 억제%
실시예 9	33	실시예 17	30
실시예 10	64	실시예 18	65
실시예 11	45	실시예 19	40
실시예 12	87	실시예 20	75
실시예 13	38	비교예 2	0.2
실시예 14	78	비교예 3	0.1
실시예 15	52	비교예 4	0.1
실시예 16	87

상기 표 5에 나타난 바와 같이 샴푸, 크림, 에센스 제형 내 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물의 함유량이 많아질수록 마우스에서 유발시킨 가려움의 억제율이 높아짐을 알 수 있다. 또한 상기 제형의 비교군들에서는 가려움의 억제력이 없어 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물의 가려움 억제력을 알 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따른 안드로그라폴라이드 또는 천심련 추출물을 함유하는 가려움억제, 완화용 조성물은, 가려움 유발인자인 물질P의 수용체에 대한 결합을 방해하고, 염증성 싸이토카인을 억제함으로써 가려움 개선에 효과적이다. 또한 피부내에 어떤 부작용도 나타나지 않으므로 안전하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 일반식 1로 표시되는 안드로그라폴라이드를 유효성분으로 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 가려움억제 또는 완화 화장료 조성물.

[화학식 1]
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안드로그라폴라이드를 유효성분으로 함유하고 있는 천심련(Andrographis paniculata) 의 추출물을 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 가려움억제 또는 완화 화장료 조성물.
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