KR101064570B1

KR101064570B1 - 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 함유하는 피부자극완화용 조성물

Info

Publication number: KR101064570B1
Application number: KR1020100068689A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 김영희; 고강일; 한창성; 박선희; 송계용; 김범준; 임윤영
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2011-09-14

Abstract

본 발명은 새로운 천연식물 혼합 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 함유하는 자극완화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물은 일정의 비율로 혼합됨으로써 자극완화에 있어 각 원료들간의 뛰어난 시너지 효과를 갖으며, 이러한 효과를 갖는 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 또는 피부외용제를 제조할 수 있다. 본 발명의 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물이 NO 생성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 자극 매개 물질인 여러 사이토카인의 생성을 억제시키는 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서 상기 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 자극완화용 화장료 조성물로서의 사용이 기대된다.

Description

고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 함유하는 피부자극완화용 조성물 {Composition for anti-irritancy comprising the extract of Sophora flavescens, Cinnamomum cassia Blume, Saururus chinensis and Poncirus trifoliata}

본 발명은 새로운 천연식물 혼합 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 각 원료들 간의 자극완화 시너지 효과를 갖는 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 함유하는 자극완화용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부표면은 피지선에서 분비되는 피지와 땀샘에서 나오는 수분이 자연적으로 잘 혼합된 피지막이 각질층을 덮고 있어, 매끄럽고 윤기 있으며 촉촉한 상태로 유지된다. 이러한 피부 각질층의 수분 함량이 20 % 정도일 때 피부는 가장 이상적이고 아름다운 상태가 되며 피부 각질층의 수분 함량이 10 % 이하로 떨어지면 피부에서 각질이 떨어져 나가게 되고, 이물질의 침투가 용이하게 되어 각종 염증 및 알러지가 유발되기 쉬워진다. 특히 나이가 들어감에 따라 피부의 신진대사가 원활하지 못하므로 각종 자극에 의한 염증 및 알러지는 가중된다. 또한 실내 환경, 공해, 자외선, 바람, 오용된 화장품이나 세제류 등 외부자극에 의해 피부가 민감해져가는 사람들이 늘어나고 있다. 외부 자극에 의해 민감해진 피부는 홍반과 같이 단순히 가시적인 경우도 있으며, 또한 가려움, 따가움 등과 같이 격심하고 불쾌한 염증반응을 나타내는 경우가 있으므로 대중적인 피부 화장료 조성물을 사용하기에는 약간 부담스럽고 지속적으로 사용하는 것을 자제하게 된다.

화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용되는 제품이지만 화장품 조성물을 자세히 살펴보면, 본래의 피부 보호 목적과는 상이한 성분들이 제품형성에 불가결한 존재이기 때문에 사용된다. 예컨대, 가용화제 및 유화제, 방부제, 향료, 자외선 차단제 및 기타 효능, 효과를 부여하기 위해 사용되는 여러 가지 부가물을 들 수 있다. 이러한 성분들은 일반적으로 피부에 자극이나 염증, 알러지, 뾰루지, 부종 등을 유발하는 주원인으로 알려져 있다.

한편, 사이토카인은 각종 생리학적, 병리학적 과정에 관여하며 특히, 면역반응, 염증, tissue remodelling 그리고 배 발생과정에 중요한 역할을 한다. 이들 사이토카인 중에서 특히, 감염이나 조직상해 등에 깊이 관련이 있는 것으로는 IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ 등이 있다. 이들 사이토카인들은 특히 체내에서 endogenous pyrogen으로 작용하며 염증성 사이토카인으로 불리고 있다. 염증성 사이토카인들에 의해 면역계에서 생성될 수 있는 물질의 하나로서 Nitric Oxide(NO)의 역할이 최근 많은 관심을 유발시키고 있다. NO는 포유세포에서 정상적으로 분비되는 물질로서 Vascular tone의 조절, 혈소판 기능, 신경전달 및 숙주 방어기전에 중요한 역할을 하고 있다. NO는 일반적으로 상당히 적은 양이 일부세포(endotherial cell, neuron)에서 생성되지만, Ca⁺-independent NO synthesis(iNOS)는 대식세포(macrophage), 중성구, Kupffer 세포 그리고 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유도됨이 알려져 있으며 [Biochemistry, 27, 8706-8711, 1988], 특히 대식세포는 세포질 내에서 상당히 많은 양의 iNOS가 발현되는 것으로 알려져 있다. 대식세포는 외부물질에 노출되어 활성화되면 다양한 종양세포나 미생물을 탐식하거나 증식을 저해시킴으로서 숙주방어기작에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. NO는 이러한 대식세포의 세포용해작용에 관여하는 것으로 보고되어 있다 [Science, 235, 473-476, 1987]. 대식세포가 IL-1α와 같은 사이토카인이나 LPS에 의해 활성화되면 inducible NO synthesis(iNOS)를 발현하게 되고, 이 iNOS는 L-arginine과 molecular oxygen으로부터 NO를 생성하는 반응을 촉매하게 된다.

대식세포는 또한 항원 제시(antigen presentation) 및 IL-1α와 같은 사이토카인 생성을 통해 T 세포의 면역반응을 촉진시킨다. iNOS와 같은 IL-1α는 정상적인 면역반응 수행이외에도 과도하게 생성될 때에는 염증반응을 유발하는 것으로 보아, 유전자의 발현조절이 면역, 염증 반응에 매우 중요함을 알 수 있다 [Adv. Pharmacol. 34, 155-170, 1995]. 염증성 사이토카인들의 유전자 발현조절은 주로 이들 유전자의 전사단계에서 조절되며, 이것은 이들 유전자의 프로모터(Promotor)와 enhancer element를 특이하게 인식하여 결합 상호작용하는 전사인자와 같은 DNA-binding proteins에 의해 조절된다. 따라서 대식세포는 자연면역에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 특이 획득면역에 관여함으로써 다양한 숙주방어와 유지에 작용한다. 또한 염증 반응 시에는 reactive oxygen species(ROS)와 reactive nitrogen species(RNS)와 같은 cytotoxin과 IL-1, TNF-α 및 IL-6와 같은 사이토카인을 생산하여 감염 초기에 생체를 방어하는 중요한 역할을 하기도 하나, 이로 인하여 동시에 정상조직의 DNA 등 생체 내의 여러 물질에 손상을 초래하기도하며 암의 전이를 촉진시키기도 하는 등 양면성을 가지는 세포이다.

현재까지 홍반이나 부종 같은 자극완화 목적으로 이용되고 있는 물질로는, 비스테로이드계로 프루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고, 스테로이드계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone)등이 있으며 [김창종, 병태생리학, 한림상사, p61-69, 1988], 알란토인, 아즈렌, ε-아미노키프론산, 하이드로코티존, 감초산 및 그 유도체(β-글리칠레친산, 글리칠레친산유도체)등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [광정무부, 신화장품학, 남산당, p162, 1993]. 이렇듯 화장품에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있으며, 이를 해결하고자 여러 가지 연구가 진행되어 왔으나, 인도메타신(indomethacin)은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이고, 하이드로코티존은 사용량이 제한되어 있으며, 감초산 및 그 유도체는 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 적용시 농도의 제한으로 인하여 실질적인 효과를 거두기가 어려운 점이 있는 등 지금까지 알려진 자극완화제는 피부안전성 면이나 화장료 배합시의 안정성면에서 대부분 문제점을 가지고 있어서 그 사용이 제한되고 있다. 최근에는 그린(green)이라는 사회 흐름과 소비자들의 욕구에 부응하기 위해 천연 원료를 이용한 화장료에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 자극완화에 효능이 있는 물질을 찾고자 여러 천연물질들 중에서 피부자극완화 효과에 유효한 물질을 스크리닝한 결과, 자극완화 효과를 보인 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자를 각 원료별로 사용하였을 때 보다, 4가지 원료가 일정 비율로 혼합 추출된 추출물이 자극완화효과에 있어 각 원료들 간에 더 뛰어난 시너지 효과를 보임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 피부자극완화 효능이 우수하고, 안전성 및 안정성에 문제가 없는 식물성 천연 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 효능을 갖는 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부자극완화용 조성물을 제공한다.

고삼(苦參)이라는 이름은 맛이 써서 고(苦)라는 글자를 사용하고 효능이 삼과 유사하다하여 삼(參)이라는 글자를 사용한다. 고삼(Sophora flavescens)은 뿌리의 생김새 때문에 도둑놈의 지팡이라는 식물명을 가지고 있다. 이 약은 특이한 냄새가 있고, 잔류성이며 약성은 매우 쓰고 차다. 하초습열로 인한 이질, 대하, 임부소양증, 피부가려움증 등에 사용하며 방광열로 인하여 소변을 잘 못보고 통증이 있을 때 사용한다. 약리효과로는 백혈구감소증 치료 및 항방사능 작용, 관상동맥혈류량 증가, 심장근육 강화, 혈당 낮추는 작용, 항종양, 항균, 면역기능 억제작용 등이 보고되었다. 고삼은 원주형이며 바깥 면은 어두운 갈색 ~ 황갈색이며, 세로 주름이 뚜렷하고 가로로 긴 피목(皮目)이 있다. 주피를 벗기면 황백색을 띠며 꺾은 면은 약간 섬유성이다. 고골(苦骨), 고직(苦), 교괴(驕槐), 금경(芩莖), 토괴(槐), 녹백(祿白), 능낭(陵郎), 백경(白莖), 수괴(水槐), 야괴(野槐), 지괴(地槐), 호마(虎麻) 등으로 부르기도 한다.

계피(Cinnamomum cassia Blume), 육계나무는 중국의 남부지방에서 자생하는 늘 푸른 큰키나무로 여름부터 가을 사이에 나무껍질을 채취하여 사용한다. 잎맥의 가운데 주맥과 양쪽의 측맥이 도드라져 보여 규(圭)자를 연상하게 해서 식물명에 사용하게 되었는데 규(圭)란 홀기(笏記) 즉, 제사의 차례를 적은 부채모양의 도구로 여러 갈래의 잎맥이 있는 것처럼 보이기 때문이다. 또한 육계나무가 규(圭)를 들고 있는 관리처럼 모든 약을 총괄하기 때문에 규(圭)라는 글자를 쓰게 되었다는 유래도 있다. 육계나무를 침이라고도 했는데, 이는 다른 나무를 침범해서 해를 끼친다는 뜻으로 육계나무가 다른 식물의 생장을 억제하므로 붙여진 이름이며, 이 나무로 다른 나무 뿌리에 못질을 하면 나무가 바로 죽는 다고도 하였다. 이 약은 특이한 냄새가 있으며, 나중에는 약간 점액성이고 수렴성이며, 맛은 맵고 달며 성질은 뜨겁다. 계피는 혈액순환을 촉진시켜 흉복부의 냉증을 제거하며, 식욕을 증진시키고 소화를 촉진하며 사지마비 등에 사용한다. 위장의 경련성 통증을 억제하고 위장관의 운동을 촉진해 가스를 배출하고 흡수를 좋게 하기도 한다. 장내의 이상발효를 억제하는 방부효과도 있다. 약리작용으로 개선균 억제작용, 백색염주균병 억제작용, 건위작용, 타액 및 위액 분비촉진작용 등이 보고되었다. 생김새는 반관상 또는 말려 들어간 관상을 이루고, 바깥면은 어두운 적갈색, 안쪽면은 적갈색을 띠며 매끈하다. 꺾이기 쉬우며 꺽은 면은 적갈색을 띠고 엷은 갈색의 엷은 층이 있으며, 약간 섬유성이다. 다른 이름으로 육계피(肉桂皮), 관계(官桂), 대계(大桂), 목계(木桂), 자계(紫桂), 통계(筒桂), 옥계(玉桂), 랄계(辣桂), 균계(菌桂), 계(桂) 등이 있다.

삼백초(Saururus chinensis)는 습지에서 자란다. 뿌리줄기는 흰색이고 진흙 속에서 옆으로 뻗는다. 줄기는 높이가 50 ~ 100 cm이다. 잎은 어긋나고 달걀 모양의 타원형이며, 길이가 5 ~ 15 cm이고, 끝이 뾰족하며, 밑 부분이 심장 모양이고, 5 ~ 7 개의 맥이 있으며, 가장자리가 밋밋하다. 잎 표면은 녹색이고 뒷면은 연한 흰색이지만, 줄기 윗부분에 있는 2 ~ 3개의 잎은 표면이 흰색이다. 잎자루는 길이가 1 ~ 5 cm이고, 밑 부분이 넓어 줄기를 감싼다. 꽃은 양성화이고, 6 ~ 8월에 흰색으로 피며 수상꽃차례를 이루며 달린다. 꽃차례는 잎과 마주나고 길이가 10 ~ 15 cm이며, 꼬불꼬불한 털이 있고 밑으로 처지다가 곧게 선다. 소포는 달걀 모양의 원형이고, 꽃잎은 없으며, 수술은 6 ~ 7개 이다. 암술은 3 ~ 5개의 심피로 구성된다. 열매는 둥글고 종자가 각 실에 1 개씩 들어 있다. 뿌리ㆍ잎ㆍ꽃이 흰색이기 때문에 삼백초라고 한다. 한방에서는 식물체 전체를 말려 몸이 붓고 소변이 잘 안 나올 때 쓰고, 각기ㆍ황달ㆍ간염 등에서 사용한다. 한국ㆍ일본ㆍ중국 등지에 분포한다.

탱자(Poncirus trifoliata)는 높이 3 ~ 4 m이다. 가지에 능각이 지며 약간 납작하고 녹색이다. 가시는 길이 3 ~ 5 cm로서 굵고 어긋난다. 잎은 어긋나며 3 장의 작은 잎이 나온 잎이고, 잎자루에 날개가 있다. 작은 잎은 타원형 또는 달걀을 거꾸로 세워놓은 모양이며, 혁질(革質: 가죽 같은 질감)이고, 길이 3 ~ 6 cm이다. 끝은 둔하거나 약간 들어가고 밑은 뽀족하며 가장자리에 둔한 톱니가 있다. 잎자루는 길이 약 25 mm이다. 꽃은 5월에 잎보다 먼저 흰색으로 피고, 잎겨드랑이에 달린다. 꽃자루가 없고 꽃받침조각과 꽃잎은 5개씩 떨어진다. 수술은 많고 1개의 씨방에 털이 빽빽이 난다. 보통 귤나무류보다 1개월 정도 먼저 꽃이 핀다. 열매는 장과로서 둥글고 노란색이며 9월에 익는데, 향기가 좋으나 먹지는 못한다. 종자는 10여 개가 들어 있으며 달걀 모양이고 10월에 익는다. 열매는 건위ㆍ이뇨ㆍ거담ㆍ진통 등에 약으로 쓴다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 종래 알려진 어떠한 추출방법으로 추출될 수도 있으나, 바람직하게는 물, 무수 또는 함수 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 고삼 : 계피 : 삼백초 : 탱자를 2 ~ 5 : 1 ~ 5 : 2 ~ 3 : 1 ~ 3의 혼합 중량비율로 추출된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 고삼 : 계피 : 삼백초 : 탱자를 2 : 5 : 2 : 1 또는 4 : 1 : 2.5 : 2.5의 중량비로 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 건조 중량으로서 0.01 내지 10.0 (W/V)%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 추출물을 5 내지 37 ℃에서 용매에 1 내지 15 일간 침적시켜 추출하거나, 용매를 가해 50 내지 100 ℃에서 3 내지 20 시간 가열하여 추출되는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 건조된 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자를 중량에 대하여 추출 용매로서 물이나 무수 또는 함수 에탄올, 메탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 5 ~ 20 배 부피량을 가한 후, 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 ~ 95 ℃, 3 ~ 20 시간 가열하여 추출하거나, 5 ~ 37 ℃에서 1 ~ 15 일간 침적시켜 유효성분을 추출한다. 이렇게 추출된 추출물을 냉각 콘덴서가 장착된 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후, 동결건조나 분무 건조하여 건조 추출물을 얻는다. 이후 혼합 추출물의 고형분 환산으로 0.01 내지 10.0 중량 %의 넓은 범위에서 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 항염 및 항알러지 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 혼합 추출물은 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 각각의 단일 추출물을 사용했을 때보다 원료를 혼합하여 추출한 경우에 각 원료들 간의 뛰어난 자극완화 시너지 효과를 보였다. 구체적으로 생쥐의 대식세포에 인위적으로 NO를 유발시킨 후 본 발명의 혼합 추출물을 처리하는 경우, iNOS의 활성을 농도 의존적으로 저해시켰으며, 특히 4 : 1 : 2.5 : 2.5의 중량비로 혼합한 혼합 추출물을 20 μg/ml 처리하는 경우에는 대조군 수준으로 감소시켜 높은 NO 활성 저해 효과를 갖는다. 또한 자극을 준 세포에 본 발명의 혼합 추출물을 처리하는 경우, 여러 자극 매개 물질(사이토카인)이 상기 혼합 추출물 처리에 의해 억제된다. 이후 3차원 생인공피부에서 자극완화 효과를 관찰한 결과, 피부자극물질의 투여로 자극이 유발된 생인공피부에서 본 발명의 혼합 추출물의 처리로 IL-α의 방출량이 대조군과 유사하게 감소되었다. 따라서 본 발명의 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물은 항자극 효과가 매우 뛰어나다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저 제형의 제형으로 구성된 그룹에서 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 제형들은 당업계에 종래 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부자극완화용 피부 외용제를 제공한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물은 각 원료들 간의 우수한 피부자극완화 시너지 효과를 갖으며, 이러한 효과를 갖는 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부자극완화용 화장료 조성물 또는 피부외용제를 제조할 수 있다.

본 발명의 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물이 iNOS 활성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 자극 매개 물질인 여러 사이토카인의 생성을 억제시키는 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서 상기 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서의 사용이 기대된다.

도 1은 혼합 추출물의 농도별 세포독성을 측정한 결과이다.
도 2는 혼합 추출물의 농도별 NO 생성 저해 효과를 측정한 결과이다.
도 3은 혼합 추출물의 농도별 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF의 생성 억제 효과를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 메탄올 혼합 추출물의 제조

완전 건조시킨 고삼 200 g, 계피 500 g, 삼백초 200 g, 탱자 100 g을 메탄올 10 kg에 넣고, 냉각 콘덴서가 장착된 추출기를 이용하여 5 시간 가온하여 추출한 후, 400 메쉬 여과포로 여과하였다. 이후 상온으로 냉각시킨 후, 5 ~ 15 ℃에서 7 일간 방치하여 숙성시킨 후, 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 상기 여과된 추출물을 0.45 μm의 필터로 여과한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60 ℃로 감압 농축하여 18.5 g(건조중량)의 메탄올 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 2. 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 에탄올 혼합 추출물의 제조

추출 용매를 70 % 에탄올로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 20.2 g의 에탄올 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 3. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 열수 혼합 추출물의 제조

추출 용매를 증류수로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 16.4 g의 열수 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 4. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 에탄올 혼합 추출물의 제조

추출 용매를 30 % 에탄올로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 19.7 g의 에탄올 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 5. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 글리세린 혼합 추출물의 제조

추출 용매를 30 % 글리세린으로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 14.9 g의 글리세린 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 6. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 부틸렌글리콜 혼합 추출물의 제조

추출 용매를 30 % 부틸렌글리콜로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 15.8 g의 부틸렌글리콜 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 7. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 메탄올 혼합 추출물(2)의 제조

완전 건조시킨 고삼 400 g, 계피 100 g, 삼백초 250 g, 탱자 250 g을 메탄올 10 kg에 넣고, 냉각 콘덴서가 장착된 추출기를 이용하여 5 시간 가온하여 추출한 후, 400 메쉬 여과포로 여과하였다. 이후 상온으로 냉각시킨 후, 5 ~ 15 ℃에서 7 일간 방치하여 숙성시킨 후, 와트만 2번 여과지로 여과하였다. 상기 여과된 추출물을 0.45 μm의 필터로 여과한 후, 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 60 ℃로 감압 농축하여 21.2 g(건조중량)의 메탄올 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 8. 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 에탄올 혼합 추출물(2)의 제조

추출 용매를 70 % 에탄올로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 19.6 g의 에탄올 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 9. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 열수 혼합 추출물(2)의 제조

추출 용매를 증류수로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 17.3 g의 열수 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 10. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 에탄올 혼합 추출물(2)의 제조

추출 용매를 30 % 에탄올로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 18.4 g의 에탄올 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 11. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 글리세린 혼합 추출물(2)의 제조

추출 용매를 30 % 글리세린으로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 15.2 g의 글리세린 혼합 추출물을 수득하였다.

실시예 12. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 부틸렌글리콜 혼합 추출물(2)의 제조

추출 용매를 30 % 부틸렌글리콜로 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 16.6 g의 부틸렌글리콜 혼합 추출물을 수득하였다.

실험예 1. 혼합 추출물을 구성하는 각 원료들의 NO 생성량 측정

각 원료들을 70 % 에탄올로 추출하여 여과한 후, 감압농축하여 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 각각의 추출물을 얻어내었다. 혼합 추출물은 고삼 : 계피 : 삼백초 : 탱자 = 4 : 1 : 2.5 : 2.5의 비율로 70 % 에탄올로 추출한 실시예 8의 혼합 추출물을 이용하였다.

상기 혼합 추출물과 각 원료들의 NO 생성량을 알아보기 위해, 대식세포인 Raw264.7세포를 배양하고 자극을 유발시킨 후 각 추출물의 NO생성량을 알아보았다.

먼저, 페놀-레드(phenol-red)가 첨가되지 않은 10 % FBS(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청)-DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(기브코 사) 배지에 8×10⁵ 세포를 현탁시켜 24-웰 배양판에 접종하여 부착시켰다. 부착 하루 후, 시료를 농도별로 처리하여 18 시간 배양한 후, 1 μg/ml의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide, 시그마 사)와 IFN-γ를 동시 처리한 후, 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액을 회수하여 96-웰 플레이트에 100 μl씩 넣고, 그리에스 시약(Griess reagent, 시그마 사)을 동량 첨가하여 상온에서 10 분간 가볍게 흔들어 준 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소디움 나이트리트(sodium nitrite)를 표준품으로하여 검량선을 작성하고, 각 시료를 배양액 중의 나이트릭 옥사이드의 생성량을 측정하였다. 이때 대조군은 LPS 및 IFN-γ를 처리하지 않는 군이었다. 리포폴리사카라이드를 처리한 군의 나이트릭 옥사이드의 생성량을 100 %로 하여 각 시료의 % 생성량을 구하였으며, 측정 결과는 표 1에 나타내었다.

측정 결과, 각각의 원료들은 NO 생성을 감소시키는 것으로 관찰되었으며, 특히 혼합 추출물의 경우 가장 효과적인 NO 생성 저해 효과를 나타내었다. 따라서 혼합 추출시 각 원료들간의 시너지(synergy) 효과가 있음을 확인하였다.

[표 1. 각 추출물의 NO 생성 저해 효과]

실험예 2. 혼합 추출물을 구성하는 각 원료들의 PGE ₂ , IL -1β, IL -6, TNF -α 및 VEGF 생성 억제 효과

상기 혼합 추출물과 각 원료들의 사이토카인 생성량을 알아보기 위해, 대식세포인 Raw264.7세포를 배양하고 자극을 유발시킨 후 각 추출물의 사이토카인 생성량을 알아보았다. 시험 시료는 실험예 1의 것과 동일한 것을 사용하였다.

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포(murine macrophage cell line)를 8×10⁵의 세포수로 10 % FBS-DMEM 배지에 현탁시켜 24-웰 배양판에 접종하고, 24 시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이후 LPS와 IFN-γ를 상기 웰에 처리하여 24 시간 동안 자극을 준 후, 시료(혼합 추출물과 혼합 추출물을 구성하는 각 원료들)를 농도별로 처리하여 48 시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 배양액을 수거하여 ELISA 분석을 수행하였다. PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α및 VEGF는 알앤디 시스템(R&D system)사의 ELISA 키트를 사용하였으며, 회사의 매뉴얼에 따라 실험하였다. 측정 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

측정 결과, 각각의 원료들은 자극 매개 물질인 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α및 VEGF의 생성량을 감소시키는 것이 관찰되었으며, 특히 혼합 추출물의 경우에는 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α및 VEGF의 생성량이 각각의 추출물에 비해 현저하게 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 사이토카인 생성 억제 효과에 있어 각 원료들의 단독으로 사용한 경우보다 혼합 추출시 각 원료들간의 시너지(synergy) 효과가 있음을 확인하였다.

[표 2. 각 추출물의 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α및 VEGF의 생성 억제 효과]

실험예 3. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물의 세포독성 측정

본 발명의 혼합 추출물의 세포독성 및 세포 생존율을 관찰하기 위해, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에 존재하는 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase or mitochondrial dehydrogenase)에 의해 수용성이고 노란색 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)가 수불용성인 파란색의 포르마잔(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 MTT 분석법을 수행하였다. MTT 분석은 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로, 생성된 포르마잔(formazan) 유도체는 용해제(일반적으로 dimethylsulfoxide)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정하여 관찰한다. 상기 방법을 자세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포(murine macrophage cell line)를 8×10⁵의 세포수로 10 % FBS-DMEM 배지에 현탁시켜 24-웰 배양판에 접종하여 부착시켰다. 접종 24 시간 후, 혈청이 없는 배지로 교체하고, 시험 시료(실시예 2 및 실시예 8에서 수득한 혼합 추출물)를 농도별로 첨가한 후, 1일 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, 상등액을 제거하고, 다시 5 % PBS(phosphate buffered saline) 200 μl씩 가하여 세척하고, MTT 용액을 웰당 1.0 ml씩 가한 후, 4 시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 웰당 1.0 ml씩 가한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험의 대조군은 본 발명의 추출물이 제외된 추출용매만으로 배양한 군이며, 세포 생존률은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

측정 결과, 하기 표 3 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 모든 농도에서 세포독성을 보이지 않음을 확인할 수 있다.

<수학식 1>

세포 생존율 (%) = (시료 OD570) / (대조군 OD570) × 100

[표 3. 혼합 추출물의 세포독성]

실험예 4. LPS 로 활성화된 Raw 264. 7 에서의 NO ( Nitric oxide ) 생성 억제 확인

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 인위적으로 유발시킨 자극 완화 효과를 알아보기 위해 NO의 생성량을 측정하였다.

페놀-레드(phenol-red)가 첨가되지 않은 10 % FBS(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청)-DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(기브코 사) 배지에 8×10⁵ 세포를 현탁시켜 24-웰 배양판에 접종하여 부착시켰다. 부착 하루 후, 시료를 농도별로 처리하여 18 시간 배양한 후, 1 μg/ml의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide, 시그마 사)와 IFN-γ를 동시 처리한 후, 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액을 회수하여 96-웰 플레이트에 100 μl씩 넣고, 그리에스 시약(Griess reagent, 시그마 사)을 동량 첨가하여 상온에서 10 분간 가볍게 흔들어 준 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소디움 나이트리트(sodium nitrite)를 표준품으로하여 검량선을 작성하고, 각 시료(실시예 2 및 실시예 8에서 수득한 혼합 추출물)를 배양액 중의 나이트릭 옥사이드의 생성량을 측정하였다. 리포폴리사카라이드를 처리한 군의 나이트릭 옥사이드의 생성량을 100 %로 하여 각 시료의 % 생성량을 측정하였다. 대조군은 배지만 처리한 군이다. 측정 결과는 하기 표 4 및 도 2에 나타내었다.

측정 결과, 본 발명의 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물은 NO의 생성을 농도 의존적으로 저해시켰으며, 특히 실시예 8의 혼합 추출물을 20 μg/ml로 처리하는 경우에는 NO의 생성을 약 80%정도 감소시킴을 관찰할 수 있었다.

[표 4. 혼합 추출물의 NO의 생성 저해 효과]

실험예 5. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물의 iNOS 유전자 발현 저해 효과

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포에 리포폴리사카라이드를 처리하여 인위적으로 iNOS 유전자 발현을 증가시킨 후, 혼합 추출물에 의한 저해능을 RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다.

Raw 264.7 세포를 10 % FBS-DMEM 배지에 8×10⁵ 세포수로 현탁시킨 후, 100 mm 디쉬(dish)에 접종하여 부착시켰다. 24 시간 후, 시료를 농도별로 처리하여 18 시간 동안 배양한 후, 1 μg/ml의 리포폴리사카라이드와 IFN-γ를 처리하여 8 시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 배지를 제거하고 트라이졸(Trizol, 인비트로젠 사) 1 ml를 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리하고, 260 nm에서 정량하여 역전사 중합 반응(Recerse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하였다. 역전사 중합 반응은 올 인원 역전사 중합 반응 키트(All-in-one RT-PCR kit, 수퍼바이오 사)를 사용하였으며, 상기 키트의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. 사용한 프라이머 및 반응 조건은 하기에 나타내었다. 시료로는 실시예 2 및 실시예 8에서 수득한 혼합 추출물을 사용하였으며, 이때 대조군은 LPS 및 IFN-γ를 처리하지 않는 군을 이용하였다. 측정 결과는 표 5에 나타내었다.

하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물은 iNOS 유전자의 발현을 농도 의존적으로 감소시키며, 특히 실시예 8의 혼합 추출물을 50 μg/ml 농도로 처리하는 경우에는 iNOS 발현을 대조군 수준으로 감소시켰다. 따라서 본 발명의 혼합 추출물은 자극 완화 효과가 뛰어남을 확인할 수 있다.

iNOS 프라이머

센스 : 5'-CAGTTCTGCGCCTTTGCTCAT-3'

안티센스 : 5'-GGTGGTGCGGCTGGACTTT-3'

(반응 조건 : 50 ℃에서 30 분간 역전사 후, 96 ℃에서 3 분간 역전사 효소를 불활성화, 94 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분간 32 회(cycle)로 PCR 반응)

액틴 ( Actin ) 프라이머

센스 : 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'

안티센스 : 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'

(반응 조건 : 50 ℃에서 30 분간 역전사 후, 96 ℃에서 3 분간 역전사 효소를 불활성화, 94 ℃ 1 분, 62 ℃ 1 분, 72 ℃ 1 분간 22 회(cycle)로 중합 반응)

[표 5. 혼합 추출물의 iNOS 유전자 발현 저해율]

실험예 6. 고삼 , 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물의 PGE ₂ , IL -1β, IL -6, TNF-α, IP -10, MCP -1, RANTES 및 VEGF 생성 억제 효과

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포(murine macrophage cell line)를 8×10⁵의 세포수로 10 % FBS-DMEM 배지에 현탁시켜 24-웰 배양판에 접종하고, 24 시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. LPS와 IFN-γ를 상기 웰에 처리하여 24 시간 동안 자극을 준 후, 시료(실시예 2 및 실시예 8에서 수득한 혼합 추출물)를 농도별로 처리하여 48 시간 동안 반응시켰다. 이후 배양액을 수거하여 ELISA 분석을 수행하였다. PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF는 알앤디 시스템(R&D system)사의 ELISA 키트를 사용하였으며, 회사의 매뉴얼대로 실험하였다. 측정 결과는 하기 표 6 및 도 3에 나타내었다. 도 3에서 추출물의 처리는 실시예 8의 혼합 추출물을 처리한 결과이다.

자극 매개 물질인 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF의 생성량이 본 발명의 혼합 추출물의 첨가로 인해 현저하게 감소한 것으로 보아, 혼합 추출물이 상기 자극 매개 물질들의 억제 효과를 가짐을 확인할 수 있다. 실시예 2의 혼합 추출물의 경우 IL-1β에서 첨가 농도가 20 μg/ml일 때 생성량이 대조군 수준으로 억제되었으나 IL-6와 RANTES에서는 억제효과를 보이지 않았다. 실시예 8의 혼합 추출물의 경우 20 μg/ml 첨가시 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF 모두에서 생성량이 대조군 수준으로 감소되거나 우수한 억제효과를 보였다. 특히, PGE₂와 VEGF의 경우에는 20 μg/ml의 혼합 추출물의 농도에서 대조군 보다 낮은 생성량을 보여 완벽하게 억제시킴을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 볼 때, 실시예 8의 혼합 추출물은 실험된 모든 사이토카인들에서 뛰어난 억제 효능을 보임을 알 수 있다.

[표 6. 혼합 추출물의 PGE₂, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, RANTES 및 VEGF의 생성 억제 효과]

실험예 7. 3 차원 생인공피부에서의 IL -1α 생성 억제 효과

IL-1α(interleukin-1α)는 전염증 작용인자(pre-inflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질(cytokine)로 염증, 감염 등에 의한 자극에 골형성세포, 단핵세포, 대식세포, 각질형성세포, 간세포, 섬유아세포 등이 일시적으로 증가 생산한다. 또한 IL-1α는 상처(wound)의 재상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라, 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 류코트리엔 B4(leukotriene B4), 5-, 12-, 15 HETE 같은 arachidonic acid lipoxygenase metabolites 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다.

3 차원 인공피부를 배양하여 자극을 유발시킨 후, 본 발명의 혼합 추출물 처리에 따른 IL-1α 방출양을 관찰하였다. Type Ⅰ collagen matrix(Bioland, Korea)와 5 배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2 % NaHCO₃와 200 mM HEPEs, 0.05 N NaOH로 제조된 완충용액을 7:2:1로 섞어 만들고, human fibroblasts cell line(ATCC, American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-2076)을 1×10⁵ cells/ml의 밀도로 혼합하여 직경 10 mm의 insert에 fibroblast가 혼합된 collagen solution을 각각 200 μl씩 넣어 진피를 제조하였다. 진피 제조 후, 10 % FBS를 함유하는 DMEM을 2 일마다 교체하여 7 일간 배양시켰다. 배양된 진피 위에 normal keratinocyte를 3×10⁵ cells/insert로 접종하였다. DMEM(10 % FBS)와 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium, GIBCO, USA) (supplemented with EGF(epidermal growth factor) and BPE(bovine pituitary extract))를 1:1로 섞은 배지를 넣고, 7 일간의 submerge culture 후 기액 계면에서 배양(air-liquid interface culture)하기 위해, insert 안의 배지는 제거하고 insert 밖에만 submerge culture시 사용한 배지를 사용하여 14 일 동안 air-liquid interface culture하였다. 배양된 인공피부의 배양배지를 모두 제거한 다음, 새 배지를 조직 배양 용기밖에 1.5 ml을 넣는다. Insert 내에 10 μl의 피부자극물질(SLS, sodium lauryl sulfate)을 투여하고, 4 시간 뒤 각 농도의 혼합 추출물을 10 μl 적용한 후, 37 ℃, 5 % CO₂에서 24 시간 동안 배양하였다. SLS와 혼합 추출물의 용매는 DMSO를 사용하였으며, 농도는 용액에 대한 독성 물질의 무게 퍼센트로 하였다. IL-1α는 배지 표본을 취하여 Human IL-1α assay kit(Endogen Inc. Boston, MA, USA)를 이용하였으며, ELISA-reader(enzyme-linked immunosorbent assay)로 450 nm에서 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

3 차원 인공피부를 배양하여 자극을 유발시킨 후 여러 사이토카인에서 뛰어난 효능을 보인 실시예 8의 혼합 추출물의 IL-1α의 방출양을 측정한 결과, 농도 의존적으로 IL-1α의 방출양을 감소시켰을 뿐만 아니라, 50 μg/ml의 농도에서는 대조군 수준의 생성량을 보여 완벽하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

[표 7. 3 차원 생인공피부에서의 항염증 효과]

처방예 1. 화장수(스킨로션)

실시예 8의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 화장수(스킨로션)의 처방예는 다음 표 8과 같다.

[표 8. 화장수(스킨로션)의 처방예]

<제조방법>

11 번에 2, 3, 4, 8 번을 순서대로 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5 번을 60 ℃에서 가열하여 용해시킨 후, 10 번을 투입하고 이를 상기 11 번에 투입한다. 마지막으로, 1, 6, 7, 9 번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.

처방예 2. 영양로션

실시예 8의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 영양로션의 처방예는 다음 표 9와 같다.

[표 9. 영양로션의 처방예]

<제조방법>

10, 11, 13, 16을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12를 80 ~ 85℃사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃ 까지열 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 35℃에 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

처방예 3. 영양크림

실시예 8의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 처방예는 다음 표 10과 같다.

[표 10. 영양크림의 처방예]

<제조방법>

처방예 3 및 3-1: 12, 13, 14, 16을 혼합교반하면서 80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11을80 ~ 85℃사이로 가열하여 투입한 뒤 15를 투입하여 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

비교예 1: 12, 13, 14, 16을 혼합교반하면서80 ~ 85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11을 80 ~ 85℃사이로 가열하여 투입한 뒤 15를 투입하여 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 17번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

처방예 4. 에센스

실시예 8의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음 표 11과 같다.

[표 11. 에센스의 처방예]

<제조방법>

2, 3, 4, 5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 1, 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루 이다이져를 통과하고 이어 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루이다이져에 재차 통과시킨다 그리고 10, 11, 12, 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

적용 실험예 1. 피부 1차 자극 후 홍반 완화 효과(폐쇄첩포실험)

처방예 3, 3-1 및 비교예 1의 영양크림에 피부자극제인 소디움라우릴설페이트(Sodium Laurly Sulfate)가 0.5 % 되도록 넣은 후, 이를 피부 도포시 자극 완화효과를 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 아토피 피부염과 다른 습진의 현병력 및 과거력이 없는 현재 피부질환이 없다고 판단된 20세 이상의 건강한 남, 여 20명(연령분포: 20 ~ 35세, 평균연령: 28세, 남자 7명, 여자 13명)을 대상으로 하였다.

피검자의 양측 전완부 내측 부위에 시료를 도포하기 전, 홍반지수(erythema index; E-index)를 측정하고, large finn chamber(Epitest, Hyryla Finland)와 여과지를 이용하여 각 시료의 일정량(0.2 g)을 도포한 후 24 시간 동안 첩포를 부착하였다. 첩포를 제거한 후, 홍반지수측정은 공기의 이동이 없고, 직사광선이 없는 공간에서 피검자가 검사 부위를 노출시킨 다음, 30 분 동안 안정을 취한 후 시행하였다. Dermaspectometer(Cortex Technology, Hadsund, Denmark)를 이용하여 측정 후, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 실내온도는 22 ℃, 습도는 43%였다.

하기 표 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물을 첨가하여 제조한 처방예 3, 3-1의 경우, 비교예 1에 비해 피부 자극 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

[표 12. 피부 1차 자극성 완화 실험 결과]

적용 실험예 2. 피부 자극 실험( Stinging test )

처방예 3, 3-1 및 비교예 1의 영양크림에 피부자극제인 젖산이 6.0 % 되도록 넣은 후, 이를 피부 도포시 자극 완화효과를 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 상기 피부자극제에 민감한 반응을 보이는 남, 여 15명(연령분포: 20 ~ 38세, 평균연령: 27세, 남자 5명, 여자 10명)을 대상으로 하였다.

먼저, 젖산에 민감한 자극을 보이는 피실험자들을 비누 세안 시킨 후, 항온 항습실(21 ℃, 47 % 상대습도)에서 15 분간 적응시켰다. 이후, 부직포에 각각 400 μl씩 도포한 후, 따가움과 가려움을 잘 느낀다고 보고된 코 주변과 빰에 부직포를 붙인 후, 20초 경과 후 제거하였다. 부직포 제거 후 경과 시간대 별로(10초, 2분 30초, 5분, 8분) 하기 표 13의 기준에 의거하여 피시험자의 주관적 판정으로 따가움, 가려움 정도를 측정하여 하기 표 14에 나타내었으며, 이들로부터 항자극율을 계산하여 표 15에 나타내었다. 항자극율은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

하기 표 15에 나타낸 바와 같이, 젖산에 민감한 반응을 보이는 피시험자들을 대상으로, 피부 자극제인 젖산을 제형에 넣고 자극완화 효과를 관찰한 결과, 본 발명의 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 첨가하여 제조한 처방예 3, 3-1의 시료를 처리하였을 경우, 비교예 1에 비해 젖산에 대한 피부 자극 완화 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

<수학식 2>

[표 13. 자극지수]

[표 14. 각 제형의 피부자극제에 대한 자극 지수]

[표 15. 각 제형의 피부자극제에 대한 항자극율]

Claims

고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 물, 무수 또는 함수 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 벤젠, 클로로포름, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 고삼 : 계피 : 삼백초 : 탱자를 2 내지 5 : 1 내지 5 : 2 내지 3 : 1 내지 3의 혼합 중량비율로 추출된 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 건조 중량으로서 0.01 내지 10.0 (W/V)%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 고삼, 계피, 삼백초 및 탱자 추출물을 5 내지 37 ℃에서 용매에 1 내지 15 일간 침적시켜 추출하거나, 용매를 가해 50 내지 100 ℃에서 3 내지 20 시간 가열하여 추출되는 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 항염 및 항알러지 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 조성물.
제 1항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 화장료 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저 제형의 제형으로 구성된 그룹에서 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 화장료 조성물.
제 1항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 홍반, 따가움 또는 가려움에 의한 피부자극 완화용 피부 외용제.