KR101051659B1

KR101051659B1 - 애기장대 유래 구성적 프로모터, 이를 포함하는 발현벡터 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR101051659B1
Application number: KR1020090021452A
Authority: KR
Inventors: 김호방; 이형석; 오현정; 안효민; 오창재; 전경용; 최상봉; 안정선; 정진호
Original assignee: 주식회사 바이오애그진앤텍; 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-13
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2011-07-29
Also published as: KR20100103048A

Abstract

본 발명은 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 모두에서 특정 유전자의 발현을 유도할 수 있고 또한 식물의 뿌리, 잎, 줄기 등 대부분의 기관에서 특정 유전자의 발현을 유도할 수 있는 애기장대 유래 프로모터를 개시한다. 또한 본 발명은 그 프로모터를 포함하는 발현벡터와 이들의 용도에 대해서도 개시한다.

프로모터, 애기장대

Description

애기장대 유래 구성적 프로모터, 이를 포함하는 발현벡터 및 이들의 용도{Constitutive Promoter Isolated from Arabidopsis thaliana, Expression Vector Containing the Promoter and Uses Thereof}

본 발명은 애기장대 유래 프로모터, 이를 포함하는 발현벡터 및 이들의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 프로모터는 유전자의 앞 부분에 위치하고 전사개시점을 포함하는 염기서열 부위을 말한다. 프로모터는 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스 부위, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위, 위치와 방향에 상관없이 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서(enhancer) 등으로 이루어져 있다.

이러한 프로모터는 모든 식물체 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터("구성적 프로모터")와, 특정 외부 자극에 반응하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터("유도성 프로모터"), 특정 발달 시기나 특정 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로 분류될 수 있다.

모든 식물체 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 구성적 프로모터로서, 대표적인 것이 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터이며, 그 밖에 유비퀴틴(ubiquitin) 계열의 프로모터(Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18, 675-689; EP0342926; Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567-581), 애기장대의 액틴 유전자 프로모터(An et al. 1996, Plant J. 10, 107-121), 벼 액틴 프로모터(Zhang et al. 1991, The Plant Cell 3, 1155-1165), 애기장대 유래 마이크로좀 올레산 불포화제 유전자의 프로모터(대한민국 공개특허 제2005-0035314호) 등이 있다.

유도성 프로모터로서는 스테로이드 덱사메타손(dexamethasone)을 유도체로 사용하는 프로모터, 구리 이온을 유도체로 사용하는 프로모터, IPTG을 유도체로 사용하는 프로모터, 살리신산 메칠에스터(MeSA)를 유도체로 사용하는 프로모터(Gorlach et al., Plant Cell, 8: 629-643, 1996), 벤젠설포마이드(benzensulfomide)를 유도체로 사용하는 프로모터(De Veylder et al., Plant Cell Physiol., 38: 568-577, 1997) 등을 들 수 있다.

발달 시기나 조직 특이적 프로모터로서는 예컨대, 벼 글루테린(glutelin) 프로모터, 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 등의 종자 특이적 프로모터, 고구마 유래 매즈 유전자(ibMADS) 프로모터(대한민국 특허 제18771호), 익스텐신 프로모터 PATLRX(대한민국 특허 제790809호) 등 뿌리 특이적 프로모터 등을 들 수 있다.

본 발명은 애기장대에서 유래한 구성적 프로모터를 개시한다.

본 발명의 목적은 쌍떡잎 식물이나 외떡잎 식물 모두에서 발현을 유도할 수 있고 또한 잎, 뿌리, 줄기 등 대부분의 기관에서 발현을 유도할 수 있는 애기장대 유래의 스테롤 생합성 유전자 AtCYP51A2 프로모터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 그 구체적인 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은, 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 서열번호 1의 염기서열로 특정되는 스테롤 생합성 유전자 AtCYP51A2 프로모터를 애기장대로부터 분리한 후, β-glucuronidase(GUS) 유전자를 발현시키도록 이를 발현벡터에 삽입하고 애기장대에 형질전환시켰을 때 애기장대의 꽃눈, 꽃, 싹, 줄기, 측엽, 잎, 배축, 뿌리 등 대부분의 기관에서 양성대조군으로 사용된 CaMV 35S 프로모터와 유사한 수준으로 GUS 유전자를 발현시킴을 확인할 수 있었으며, 나아가 쌍떡잎 식물인 담배와 외떡잎 식물인 벼에서도 그 잎, 줄기, 뿌리 등 다양한 기관에서 GUS 유전자의 발현을 유도함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 완성된 것으로서, 일 측면에 있어서 본 발명은 아래의 (a) 내지 (c)로 구성된 군에서 선택되는 프로모터에 관한 것이다.

(a) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프로모터,

(b) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터의 기능성 단편, 및

(c) 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 서열 유사성을 갖는 프로모터

본 발명의 프로모터는 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물 모두에서 활성을 보이며, 대부분의 조직(또는 기관), 적어도 꽃눈, 꽃, 싹, 줄기, 측엽, 잎, 배축 및 뿌리에서 활성을 갖는 구성적 프로모터이다.

본 명세서에서, "프로모터"의 의미는 당업계에 알려진 통상의 의미를 따르는데, 구체적으로는 어떤 유전자의 전사 개시점을 기준으로 상류(5'쪽)에 위치하

고, DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사개시점, 전사 인자 결합 부위 등을 포함하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 서열을 의미한다. 이러한 프로모터는 그것이 진핵 생물 유래일 경우 전사 개시점 상류에 있는 TATA 박스(통상 전사 개시점(+1) -20 내지 -30 위치에 존재), CAAT 박스(통상 전사 개시 부위와 비교하여 대략 -75 위치에 존재), 5'인핸서, 전사 억제 인자 등을 포함한다.

또한 본 명세서에서, "서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터의 기능성 단편"이란 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터보다 활성은 낮더라도, 서열번호 1의 핵산 서열의 일부를 포함하면서 여전히 프로모터의 활성을 갖는 단편으로서 그 단편에 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 유도할 수 있는 핵산 단편을 의미한다. 서열번호 1의 염기서열의 일부를 포함하는 핵산 단편이 그것에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 유도하는가의 여부의 검정은 당업계의 통상의 지식에 따라 수행가능하다. 예컨대 당업자는 서열번호 1의 핵산 서열의 단편을 공지된 마 커 유전자(항생제 내성 유전자, 제초제 내성 유전자 등)나 리포터 유전자(녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 루시퍼라제 유전자, GUS 유전자 등)를 포함하는 발현벡터에 기능적으로 연결시켜 적합한 숙주 유기체에 형질전환시키고 그 마커 유전자 또는 그 리포터 유전자의 발현 여부나 발현 정도를 확인할 수 있다.

또한 본 명세서에서, "작동가능하게 연결된"의 의미는 어떤 유전자의 전사 및/또는 번역이 영향을 받도록 연결된다는 의미이다. 예컨대 어떠한 프로모터가 그것에 연결된 어떤 유전자의 전사에 영향을 준다면 그 프로모터와 그 유전자는 작동가능하게 연결된 것이다. 또 예컨대 키메라 단백질을 생산하도록 어떤 유전자가 다른 유전자와 연결되었을 때 그 리딩프레임이 보존되게 연결되었다면 작동가능하게 연결된 것이다.

또한 본 명세서에서 "서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 서열 유사성을 갖는 프로모터"는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터의 활성 보다는 낮을지라도, 여전히 프로모터서의 기능을 가지면서 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 서열 유사성을 갖는 프로모터를 말한다. 이러한 프로모터가 프로모터로서의 기능을 여전히 가지는가의 검정 방법은 앞서 설명한 바와 같이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 프로모터는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열과 75% 서열 유사성을 가지는 경우이며, 80%, 85%, 90%, 95% 및 99%의 순으로 서열 유사성이 증가할수록 바람직하다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 발현시키고자 하는 목적 유전자와 작동가능하게 연결된 전술한 바의 프로모터를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서, "목적 유전자"는 목적하는 생성물을 암호화하는 일정 길이의 핵산 서열로서 정의될 수 있다. 목적하는 생성물은 그 자체가 생물학적으로 활성인 단백질이거나 전사 후 특정 유전자의 불활성에 관여하는 RNA(예컨대 RNAi에 관여하는 siRNA)일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 일반적으로 센스 방향으로 벡터 내에 존재할 것이지만, 특정 유전자를 불활성화시키기 위하여 안티센스 방향으로 존재할 수도 있다. 목적 유전자가 생물학적으로 활성인 단백질을 암호화하는 유전자라면 그 유전자는 통상 5' 비번역리더서열(5'UTR), 코딩 서열 및 3'비번역서열(3'UTR)을 포함할 것이다.

또한 목적 유전자는 절단된 형태의 단백질, 융합된 형태의 단백질, 태그된 형태의 단백질을 암호화하는 서열일 수 있으며, cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있고, 천연 형태의 생성물을 암호화하는 서열이거나 원하는 돌연변이 형태의 생성물을 암호화하는 서열일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 그 목적 생성물이 인간에게 직·간접적으로 유용한 것이라면 임의의 것이라도 무방하다. 또한 이러한 목적 유전자는 임의의 것으로부터 기원할 수 있는데, 예컨대 식물, 세균, 동물, 바이러스 등으로부터 기원할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 상기 목적 유전자에 작동가능하게 연결된 조절 핵산서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절 핵산서열은 그것에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사/번역에 영향을 줄 수 있는, 전사 개시 부위의 상류 또는 하류에 존재하는 임의의 핵산서열을 말한다. 예컨대 인핸서, 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제 개시점, 전사 종결 서열 등을 말한다.

본 발명의 발현벡터는 바람직하게는 형질전환된 숙주 유기체의 선별을 가능·용이하게 하기 위하여 선택 마커 유전자를 하나 이상 포함하거나, 발현시키고자 하는 목적 유전자의 발현 여부를 정성적·정량적으로 분석하기 위하여 리포터 유전자를 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 선택 마커 유전자나 리포터 유전자는 전술한 바와 같이 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 "숙주 유기체"란 인위적으로 특정의 핵산 분자, 바람직하게는 본 발명의 전술한 바의 프로모터나 발현벡터가 도입되는 대상이 되는 유기체로서, 식물, 식물 유래의 세포, 식물 조직 등을 포함하는 의미이며, 나아가 임의의 원핵생물, 임의의 진핵생물, 포유동물, 인간 유래의 세포를 포함하는 의미이다. 바람직하게는 식물, 식물 세포, 식물 조직이다. 식물 세포나 식물 조직이 사용될 경우에 형질전환된 식물 세포나 식물 조직은 유럽특허 EP0116718, 유럽특허 EP0270822, 국제특허 WO 84/02913, 문헌(Gould et al. 1991, Plant Physiol 95,426-434)에 개시된 방법을 사용하여 성숙한 식물체로 재생시킬 수 있다.

본 발명의 발현벡터로 숙주 유기체를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있는데, 예컨대 유전자 총을 사용한 직접적인 유전자 전달 방법, 프로랄 딥(floral dip)을 이용한 in planta 형질전환 방법, 화분 매개 형질전환 방법, 원형질체의 형질전환 방법, 바이러스 매기 형질전환 방법, 리포좀 매개 형질전환 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 특정 식물체에 적합한 형질전환 방법을 선택하여 사용할 수도 있는데, 예컨대 옥수수를 형질전환시키는 방법은 미국특허 US6,140,553, 문헌(Fromm et al, 1990, Bio/Technology 8, 833-839), 문헌(Gordon-Kamm et al, 1990, The Plant Cell 2, 603-618) 등에 개시된 방법을 사용할 수 있으며, 벼를 형질전환시키기 위한 방법은 문헌(Shimamoto et al, 1989, Nature 338, 274-276), 문헌(Datta et al 1990, Bio/Technology 8, 736-740), 국제특허 WO 92/09696, 국제특허 WO 94/00977, 국제특허 WO 95/06722 등에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 또 토마토나 담배 형질전환에 있어서는 문헌(An G. et al., 1986, Plant Physiol. 81: 301-305), 문헌 (Horsch R.B. et al, 1988, In: Plant Molecular Biology Manual A5, Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers, pp 1-9), 문헌(Koornneef M. et al, 1986, In: Nevins DJ. and R.A. Jones, eds. Tomato Biotechnology, New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. pp 169-178) 등에 개시된 방법을 사용할 수 있다.

한편 본 발명의 발현벡터는 클로닝을 용이하게 하기 위하여 제한효소 인식 부위가 집중되어 있는 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 발현되는 목적 단백질을 미토콘트리아, 엽록체 등 세포 소기관이나 세포외로 이동시키기 위한 표적 펩티드 유전자(표적 펩티드 유전자는 발현시키고자 하는 목적 단백질의 아미노 말단을 코딩하는 핵산 서열에 융합된다)를 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 본 발명의 발현벡터가 도입된 형질전환 숙주 유기체에 관한 것이다.

본 발명의 형질전환 숙주 유기체는 본 발명의 스테롤 생합성 유전자 AtCYP51A2 프로모터의 존재를 특징으로 하며, 또한 그 프로모터에 작동가능하게 연 결된 목적 유전자의 존재를 특징으로 한다. 이러한 목적 유전자로부터 발현된 RNA 전사체, 단백질 등은 형질전환된 숙주 유기체의 표현형을 변화시킬 수 있다.

이러한 목적 유전자는 동종성 유전자나 이종성 유전자일 수 있다. 여기서 "동종성 유전자"란 숙주 유기체 또는 그와 동일한 생물종의 내인성 유전자를 의미하며, "이종성 유전자"란 그것이 형질전환되는 유기체에서는 존재하지 않는 유전자를 말한다. 예컨대 토마토 유래 유전자는 토마토 식물에게는 동종성 유전자이지만 감자 식물에서는 이종성 유전자가 된다.

바람직하게는 본 발명의 형질전환 숙주 유기체는 식물, 식물 세포 또는 식물 조직이다.

본 발명의 발현벡터는 적당한 숙주 유기체에 형절전환되었을 때 숙주 유기체의 게놈에 통합되어 복제되거나 숙주 유기체의 게놈과 무관하게 복제될 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 형질전환된 숙주 유기체의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 형질전환된 숙주 유기체의 제조 방법은 (a) 전술한 바의 발현벡터를 제작하는 단계, 및 (b) 그 발현벡터를 숙주 유기체에 도입하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 숙주 유기체는 식물 세포, 식물 조직 또는 식물이다.

본 발명에 따르면, 애기장대 유래 구성적 프로모터를 제공할 수 있다. 이 프로모터는 특히 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물 모두에서 특정 유전자를 발현시키는 데 유용하게 사용될 수 있고, 또한 모든 기관, 적어도 뿌리, 잎, 줄기 등의 주요 기관에 특정 유전자를 발현시키는 데 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 애기장대 유래의 스테롤 생합성 유전자 AtCYP51A2 프로모터의 분리 및 염기서열 분석

AtCYP51A2 유전자는 cytochrome P450 그룹에 속하는 유전자 중의 하나이며, 식물 스테롤 생합성 경로에서 obtusifoliol 14α-demethylase로 작용함이 알려져 있다 (Bak S et al., 1997. Plant Journal 11:191-201; Kushiro M et al., 2001. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285:98-104). 애기장대에는 두 개의 CYP51A2 유전자 (AtCYP51A1, AtCYP51A2)가 존재하는데, AtCYP51A1 유전자는 전형적인 P450 유전자 서열 특성을 갖지 않으며 expressed pseudogene일 가능성이 높다. 반면, AtCYP51A2 유전자는 전형적인 P450 유전자의 특성을 갖고 있으며, 효소학적으로 sterol 14α-demethylase의 기능을 수행한다 (Kushiro M et al., 2001. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285:98-104).

애기장대 게놈 서열 정보[The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408: 796-815]를 바탕으로 AtCYP51A2 유전자의 해독개시 서열로부터 약 1.5 kb 부분에 대해 PlantCARE database (URL http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/; Lescot M. et al., 2002, Nucleic Acid Res. Database Issue 30(1): 325-327)를 이용하여 cis-acting regulatory element를 분석하였다. 그 결과, 개시코돈으로부터 +620 부분에 1 개의 잠정적인 TATA-box 서열, +970 ~ +1,000 사이에 2 개의 잠정적인 CAAT-box 서열이 존재하였다. 이러한 결과를 바탕으로 개시코돈으로부터 약 1.5 kb 부분을 AtCYP51A2 유전자에 대한 프로모터로 판단하고, 이를 클로닝하였다. 상기 프로모터를 포함할 것으로 판단되는 애기장대 게놈 단편(1,555 bp)에 대해 애기장대 게놈 DNA를 주형으로 Pwo DNA 폴리머라아제(Roche, Germany)와 서열번호 2의 정방향 프라이머와 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용한 PCR 연쇄반응을 통해 증폭시켰다. 상기 프로모터 단편은 GUS 유전자와 번역 융합을 하기 위해 상기 유전자의 부분적인 ORF를 포함하였다.　PCR 산물의 클로닝을 용이하게 하기 위하여 정방향 프라이머(서열번호 2) 말단에는 제한효소 BamH I 인식부위, 역방향 프라이머(서열번호 3)에는 제한효소 Xba I 인식부위를 도입하였다. PCR 증폭산물은 pBluscript II KS(+) 벡터에 클로닝하였고, PCR 과정에서의 점돌연변이 유무 여부를 확인하기 위하여 염기서열을 결정하였다. (서열번호 2, 3번은 다음과 같습니다. 혹시 다르다면 수정바랍니다)

<실시예 2> AtCYP51A2 프로모터를 삽입한 발현벡터의 제조 및 애기장대의 형질전환

상기 프로모터를 함유하는 제한효소 절편 (1,555 bp 크기의 BamH I/Xba I 절편)을 식물형질전환용 pCAMBIA1303 바이너리 벡터(리포터 유전자로 GUS/GFP 융합 단백질 유전자를 포함함)의 BglII/SpeI 부위(BamH I과 BglII, XbaI과 SpeI은 서로 연결가능)에 서브클로닝 하였다. 상기 프로모터 구축물을 전기천공에 의해 Agrobacterium tumefaciens GV3101 균주내로 형질전환하고, 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 애기장대 생태형 Ws-2 식물 내로 도입하였다 (Clough SJ, Bent AF (1998) Plant J 16: 735-743). 형질전환 식물을 하이그로마이신 (40 mg/L)을 포함하는 MS 플레이트에서 선발하였다. 프로모터 구축물을 포함하는 동형접합 형질전환 라인을 T3 세대로부터 선발하였다.

한편 양성대조군으로는 CaMV 35S 프로모터를 바이너리 벡터 pBI121에 삽입하여 상기와 동일한 방식으로 애기장대에 형질전환시키고 상기와 동일한 방식으로 형질전환체를 선별하였다.

<실시예 3> 형질전환된 애기장대의 조직화학적 염색, 효소학적 분석 및 웨스턴 블럿

상기 선별된 형질전환 애기장대의 각 조직에서의 GUS 활성을 조직화학적 염색 방법 및 효소학적 방법으로 분석하고 웨스턴 블럿으로 GUS 발현 정도를 정량하 였다.

<3-1> 조직화학적 분석

Stomp의 방법(Stomp A-M (1992) In S.R. Gallagher ed, GUS protocols: Using the GUS gene as a reporter of gene expression, Academic Press, San Diego, CA, pp. 103-113)에 따라 GUS 조직화학적 분석을 수행하였다. 즉 형질전환 식물체의 각 조직을 진공하에서 3분 동안 GUS 염색 용액(0.1 M sodium phosphate buffer (pH7.0), 0.1% (v/v)Triton X-100, 10 mM EDTA, 0.5 mM K₃Fe(CN)₆, 0.5 mM K₄Fe(CN)₆, and 1 mM X-gluc)에 침윤시키고 37℃에서 12시간 동안 반응시키고, 에탄올을 사용하여 탈색시켰다. 올림푸스 디지탈 카메라(Model C5060)가 장착된 올림푸스 SZX9 스테레오 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.

그 결과 <도 1>에서 보여지는 바와 같이, 전 조직에서 GUS 활성이 확인되었다(도 1의 A). 양성대조군으로 사용된 CaMV 35S 프로모터의 형질전환체(도 1의 B)와 비교하였을 때도 특별한 차이가 없음을 확인할 수 있다.

<도 1>에서 a는 꽃눈(floral bud), b는 개화 상태의 꽃, c는 싹, d는 줄기, e는 꽃대의 측엽, f는 로제트 잎, h는 떡잎과 배축, i는 뿌리이다. 떡잎과 배축 그리고 뿌리는 9일된 식물체로부터 얻어진 것이고, 나머지 조직은 35일된 식물체로부터 얻어진 것이다.

<3-2> 효소학적 분석

GUS 활성의 형광 분석은 Jefferson(Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plant: the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep 5: 387-405)의 방법에 따랐다. 10일 된 애기장대 유식물체와 3주된 애기장대의 지상부(aerial part)로부터 수용성 단백질 전체를 추출하였다. 다음 이들 수용성 단백질을 GUS 분석 용액(1 mM 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide, 50 mM sodium phosphate buffer (pH7.0), 10 mM β-mercaptoethanol, 10 mM Na₂EDTA, 0.1% (v/v) sodium lauryl sarcosine, and 0.1% (v/v) Triton X-100)과 혼합시켜 반응시키고 정지 버퍼(0.2 M Na₂CO₃)로 반응을 종료시킨 후 GUS 활성을 Victor 2(Perkin-Elmer)로 측정하였다. 활성 값은 pmol 4-methylumbelliferone (4-MU) min^-1 mg protein^-1로 나타내었다.

결과를 <도 2의 A>에 나타내었다. <도 2의 A>를 참조하여 보면 AtCYP51A2 프로모터로 형질전환된 식물체에서의 GUS 활성도(AtCYP51A2::GUS)는 양성대조군으로 사용된 CaMV 35S 프로모터의 형질전환체의 GUS 활성도(35S::GUS)와 비교하여 특별한 차이가 없음을 알 수 있다.

<3-3> 웨스턴 블럿

형질전환된 애기장대의 유식물체로부터 단백질 샘플을 일정량의 protease inhibitor cocktail (P9599, Sigma, Canada)을 함유한 RIPA 버퍼(Biosaesang, Korea)로 추출하고, SDS-PAGE로 20 ㎍의 단백질을 분리하였다. 다음 PVDF 막으로 옮기고 5% skim milk powder가 용해된 PBS (1.5 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄ (pH 7.4), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% (v/v) Tween 20) 용액으로 block시켰다. GUS에 대 한 토끼 유래 폴리클로날 항체 IgG(Molecular Probes, USA)를 PBS로 1:4000 비율로 희석시켜 사용하였다. 상기 항체에 대한 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 접합된 염소 유래 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:15,000 희석 비율로 사용하여 ECL Plus detection system (Amersham, UK)을 이용 제조사의 매뉴얼에 따라 단백질을 검출하였다.

결과를 <도 2의 B>에 나타내었다. <도 2의 B>를 참조하여 보면 상기 결과들과 유사하게 AtCYP51A2 프로모터의 형질전환 식물체의 GUS 단백질 발현 정도(AtCYP51A2::GUS)와 양성대조군으로 사용된 CaMV 35S 프로모터 형질전환체의 GUS 단백질 발현 정도(35S::GUS)가 비슷함을 확인할 수 있다. <도 2의 B>에서 AtCYP51A2 프로모터의 형질전환 식물체의 GUS 단백질은 GFP와 융합된 형태(GUS-GFP; 96.8kDa)로 검출되었으며, 35S 프로모터 형질전환체의 GUS 단백질은 GUS 단백질 자체(69.6kDa)로 검출되었다.

<실시예 4> AtCYP51A2 프로모터가 삽입된 발현벡터에 의한 담배 형질전환

상기 <실시예 1>에서 AtCYP51A2 프로모터가 삽입된 바이너리 벡터로 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens GV3101를 50 mg L^-1 kanamycin과 50 mg L^-1 gentamycin이 함유된 YEP 배지에서 배양하였다. 아그로박테리움에 의한 담배(Nicotiana tabacum cv. nc)의 형질전환은 Horsch 등의 방법(Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL, Eichholtz D, Rogers SD, Fraley RT (1985) A simple and general method for transferring genes to plants. Science 227: 1229-1231)에 따라 수행 하였다. 먼저 잎을 0.5 cm 크기가 되게 짜르고 이 잎 절편들을 아그로박테리움의 현탁액에 5 내지 10분 동안 침지시킨 다음 한천을 이용한 MS 고체 배지(1 mg L^-1 benzyladenine (BA) 및 0.01 mg L^-1 naphthylacetic acid (NAA) 함유)에 옮겼다. 2일 동안 배양한 후 1 mg L^-1 BA, 0.01 mg L^-1 NAA, 30 mg L^-1 hygromycin 및 500 mg L^-1 cefotaxime을 함유하는 MS 배지로 옮겨 형질전환체를 선별 배양하였다. 유도된 shoot를 30 mg L^-1 hygromycin 및 500 mg L^-1 cefotaxime을 함유한 MS 배지로 옮겨 뿌리의 발육을 유도하였다. 뿌리가 발육한 식물체를 토양으로 옮겨 생장 조절기(growth chambers)내에서 재배하였다.

재배하여 얻어진 식물체의 각 조직(잎, 뿌리 및 줄기)을 상기 <실시예 3-1>의 방법에 따라 조직화학적 염색을 실시하였다.

결과를 <도 3>에 나타내었다. <도 3>를 참조하여 보면 잎, 뿌리 및 줄기 모두에서 GUS 활성을 확인할 수 있다. <도 3>에서 A는 잎, B는 뿌리, C는 줄기이고, D는 줄기의 단면 사진(P: pith(수), V:vascular system(관다발계), C:cortex(피층))이다.

<실시예 5> AtCYP51A2 프로모터가 삽입된 발현벡터에 의한 벼 형질전환

벼 형질전환은 Toki 등의 방법에 따라 Agrobacterium에 의한 scutellum 조직의 조기 감염법을 이용하여 수행하였다(Toki et al. (2006) Plant J 47: 969-976).

벼 형질전환에는 낙동 품종(Oryza sativa cv. Nakdong)을 사용하였고, pCAMBIA1303 바이너리 벡터에 클로닝된 AtCYP51A2 유전자 프로모터-GUS 구축물은 전기천공법에 의해 Agrobacterium tumefaciens AGL1 균주로 도입하였다. 종피가 제거된 종자를 멸균 증류수로 세척한 후 1 분 동안 70% 에탄올로 멸균하였다. Tween-20이 한 방울 들어간 (1 방울/50 mL) 2.5% sodium hypochlorite로 15 분간 살균한 후 멸균 증류수로 5분 이상 5회 세척하였다. 멸균된 종자는 0.4% (w/v) Gelrite를 포함하는 N6D 배지(Toki et al. (2006) Plant J 47: 969-976)에 파종한 후 32℃ 연속광 배양기에서 1-5일간 배양하였다.

AtCYP51A2 유전자 프로모터-GUS 구축물을 함유하는 Agrobacterium AGL1 균주는 카나마이신 (50 ug/mL)과 리팜피신 (50 ug/mL)이 포함된 LB (10 g/L NaCl, 5 g/L yeast extract, 10 g/L tryptone, pH7.0) 액체 배지 2 mL에 접종하여 28℃ 진탕 배양기에서 48 시간 배양한 후, 카나마이신 (50 ug/mL)이 포함된 AB 고체 평판 배지(5 g/L　 glucose, 3 g/L K₂HPO₄, 1.3 g/L NaH2PO₄·H₂O, 150 mg/L NH₄Cl, 10 mh/L CaCl₂·H₂O, 2.5 mg/L FeSO₄·H₂O, 15 g/L Bacto-Agar, pH7.2)에 도말한 후 28℃ 암 배양기에서 3 일 동안 정치 배양하였다. 고체 평판 배지에 자란 Agrobacterium 을 멸균한 약수저로 긁어 모으고, 이를 아세토시링곤 (100 ug/L)이 함유된 AAM 배지(Toki et al. (2006) Plant J 47: 969-976)에 현탁 시키고 발아한 종자와 90 초 동안 섞어 준 후, 멸균된 여과지를 이용하여 과량의 Agrobacterium을 제거하였다. 표면의 Agrobacterium이 제거된 벼 종자는 0.4 % (w/v) Gelrite를 포 함하는 2N6-AS 고체배지(Toki et al. (2006) Plant J 47: 969-976)에 0.5 mL의 AAM 액체 배지를 넣어 촉촉하게 만든 평판 크기의 멸균한 여과지 위에 옮겨 놓았다. 이를 25℃ 암 배양기에서 3일 동안 공배양한 후, 종자를 멸균 증류수로 4회, 세포탁심 (500 mg/L)을 포함하는 멸균 증류수로 1회 세척하여 남아있는 Agrobacterium을 제거하였다. 이 종자들을 멸균한 여과지로 옮겨 건조 시킨 후 하이그로마이신 (500 mg/L)과 cefotaxime (400 mg/L)이 함유된 N6D 배지(Toki et al. (2006) Plant J 47: 969-976)로 옮겼다. 2-3 주 동안 32℃ 연속광하의 배양기에서 배양 후 유도된 캘러스를 RE-III 배지(Toki et al. (2006) Plant J 47: 969-976)에 옮겨준 후 28℃ 광배양기에서 2-4 주 동안 추가 배양하였다. 캘러스에서 유도된 어린 shoot을 HF 배지에 옮겨 shoot의 생장을 유도하였다. 재분화된 식물체는 증류수에 옮겨 2-3 일 정도 순화를 거친 후 수도작용 흙으로 옮겨 온실에서 생육시켰다.

상기 생육시킨 식물체의 잎을 상기 <실시예 3-1>의 방법에 따라 조직화학적 염색을 실시하였다.

결과를 <도 4>에 나타내었다. <도 4>에서 보는 바와 같이 재분화된 벼 형질전환체의 잎이 GUS 효소의 활성에 의해 염색됨을 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명의 AtCYP51A2 프로모터(도 1의 A)와 CaMV 35S 프로모터(도 1의 B)를 GUS 유전자와 연결시켜 애기장대에서 발현시키고 각 조직에 대해서 조직화학적 염색을 실시한 결과이다.

도 2는 본 발명의 AtCYP51A2 프로모터와 CaMV 35S 프로모터를 GUS 유전자와 연결시켜 애기장대에서 발현시킨 후 효소 활성도(도 2의 A)를 측정한 결과와 웨스턴 블럿으로 발현 정도를 측정한 결과(도 2의 B)이다.

도 3은 본 발명의 AtCYP51A2 프로모터를 GUS 유전자와 연결시켜 담배에서 발현시키고 각 조직에 대해서 조직화학적 염색을 실시한 결과이다.

도 4는본 발명의 AtCYP51A2 프로모터를 GUS 유전자와 연결시켜 벼에서 발현시키고 잎에 대해서 조직화학적 염색을 실시한 결과이다.

<110> MYONGJI University Industry-Academic Cooperation Foundation Bio-Agr.Co <120> Constitutive Promoter Isolated from Arabidopsis thaliana, Expression <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1531 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tgttgaaaat tctcaacatg ataatccaaa acgtaacagg ctcaataaga taagcgggcc 60 tgaaaattaa aacaagccca aagaacagaa tcagaaactg gtgggcgtta gtgaaggacc 120 actcctgctt gctcttggcc ttggctgctt agtgaaggga agggagagaa ttgccagagc 180 agacgctaag cccaaagaaa gtgtcaacat ctgagttgtg cgacttgtga gacactaact 240 gagaaaaaaa ctaattgttt atttatgttg aaaacagaaa aaaaaaacta ttctaattga 300 atattgtaag aataccgtgt gcgtaaacat aaatgttatc taaagagatt actactagtg 360 gttcctcgac atgcacacaa ttactttagt ttaaagctta gcttttaacc caactcggca 420 ctactataag gtatggtgag agatcaatct caagaaacaa gaatattcga agtctgggaa 480 ctataatgag acaaaacaat ctttaaaata ctcgatcgca tgtgttgtga tcacgagctc 540 actacgactc agtcactttg ttctttcttt aatttagtaa aaaagtcgag ttactttgtt 600 ttctccgtct taaggcatta gccatataaa tcgcatcatt gtccggatca actcttgagt 660 ttaaaaaccc acatagacat aaatttggtt cgtagtggaa tcaatccgaa tatatgttgt 720 gattttacgc agaaaatggg aatttacatt cgtcaaaatt tgagttatgt tggattttta 780 catgaataat actattgtgc aataacatat actacaactg aacataaatt ttaatttttg 840 tgtcaaagca tataccatca acgccgttgg ttttactttt gttgtaacga cgtcgttggc 900 tggttaatga atatgaagct tttccgtaat tataccatca acgccgttgg ttttactttt 960 gttgaaataa tccaatcata ttactagaaa aaaacaaaat tgccacatgg gtgtgttttc 1020 actttttact ttttactttt tacagttgaa ttttatatta aggaaaaagt cgaaatgaaa 1080 tagtaaatcg aaaacaaaat cagagttaaa agagtaaatt caggtgagag aaatcagctt 1140 caagcttaag agagcttcga aagcgaaagc gacgatttct tctccatcgt gagagcaaat 1200 ctccagagcc gttttctctt cttcttcttc ctcctcgcgc cgtctctgaa actccatcat 1260 cgtatcaatc aaattgcttc ctcctccaaa gtaagcttct tttcgattct caaccaatca 1320 tagtagtagt gtgcttctct cttatcctct gttttctaag ttttgtatca atctccacat 1380 agcttttctc gttctattat cgtagaaact cttaaactat agattagatc actcacgatt 1440 caatcataat caatctggat ctgaatctaa ttacgcatcg tgattcaaaa tttgtgtttt 1500 tttgtgtgtg tgtgacagtt gaaaaacaat g 1531 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cgggatcctg ttgaaaattc tcaacatgat aatcca 36 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gctctagaca atttgttctc cgaatccaat tccat 35

Claims

서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프로모터.
삭제
삭제
삭제
발현시키고자 하는 목적 유전자에 작동가능하게 연결된 제1항의 프로모터를 포함하는 발현벡터.
제5항에 있어서,

상기 목적 유전자는 생물학적으로 활성인 단백질을 암호화하는 유전자이고, 그 유전자는 5' 비번역리더서열(5'UTR), 코딩 서열 및 3'비번역서열(3'UTR)을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제5항에 있어서,

상기 발현벡터는 상기 목적 유전자에 작동가능하게 연결되고, 그 목적 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 줄 수 있는 조절 핵산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제7항에 있어서,

상기 조절 핵산서열은 인핸서, 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위, 복제 개시점 및 전사 종결 서열로 구성된 군에서 하나 이상의 것을 포함하는 발현벡터.
제5항에 있어서,

상기 발현벡터는 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제5항에 있어서,

상기 발현벡터는 제한효소 인식 부위가 집중되어 있는 다중 클로닝 부위(MCS)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제5항에 있어서,

상기 발현벡터는 표적 펩티드 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제5항 내지 제11항 중 어느 한 항의 발현벡터에 의하여 형질전환된 숙주 유기체로서,

상기 숙주 유기체는 애기장대, 담배 및 벼로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환 숙주 유기체.
제12항에 있어서,

상기 숙주 유기체는 식물, 식물 조직 또는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주 유기체.
(a) 발현시키고자 하는 목적 유전자에 작동가능하게 연결된 제1항의 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계, 및

(b) 그 발현벡터를 숙주 유기체에 도입하는 단계를

포함하되,

상기 숙주 유기체는 애기장대, 담배 및 벼로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환된 숙주 유기체의 제조 방법.
제14항에 있어서,

상기 숙주 유기체는 식물, 식물 조직 또는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 유기체의 제조 방법.