KR101051613B1 - 모틸리드 화합물 - Google Patents

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에두아르도 제이. 로드리게스
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Abstract

본 발명은 화학식 I의 모틸리드 화합물, 이의 제조방법, 및 위 운동 감소를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료시의 이의 용도에 관한 것이다.
화학식 I
Figure 112008059696423-pct00024
위의 화학식 I에서,
R1, R2, R3 및 R4는 본원에서 정의한 바와 같다.
모틸리드 화합물, 위 운동 감소, 삭카로폴리스포라 에리스라에아 K24-1/159-44, 유전자(eryAI, eryAII 및 eryAIIl), 디히드라타제 도메인, 엔오일리덕타제 도메인, 케토리덕타제 도메인, 재조합 숙주 세포, 11-데옥시에리스로마이신

Description

모틸리드 화합물{Motilide compounds}
기술 분야
본 발명은 위장관 운동 질환의 치료에 뛰어난 약리학적 및 약동학적 특성을 갖는 위장운동 프로모터(prokinetic agent)를 제공한다. 본 발명은 화학, 의화학, 의약, 분자 생물학 및 약리학 분야에 관한 것이다.
배경 기술
위장관("GI") 운동은 소화관을 통해 섭취된 물질의 규칙적인 운동을 조절하여 영양소, 전해질 및 유액의 적절한 흡수를 보증한다. 식도, 위, 소장 및 결장을 통한 적절한 수송은 전진 운동을 조절하고 GI 내용물의 역류를 방지하는 수개의 괄약근 및 관내 압력의 구역적 조절에 의존한다. 표준 GI 운동 패턴은 질병 및 수술을 포함하는 다양한 상황에 의해 감소될 수 있다.
위장관 운동 질환은, 예를 들면, 위마비 및 위식도 역류 질환("GERD")을 포함한다. 위마비는 위 내용물을 비우는 것을 지연시킨다. 위마비 증상은 배탈, 가슴쓰림, 구역질 및 구토를 포함한다. 급성 위마비는, 예를 들면, 약(예: 아편제), 바이러스성 장염 및 고혈당증에 의해 유발될 수 있으며, 통상 운동 장애보다는 내재하는 질환을 치료함으로써 해결된다. 만성 위마비의 가장 통상적인 원인은 오래 지속되는 당뇨병 또는 특발성 유사 폐쇄증, 흔히 소위 "비-궤양" 또는 "기능성" 소화불량과 관련된다.
GERD는 위 및 십이지장 내용물이 식도로 역류하는 다양한 임상 증상을 말한다. 가장 통상적인 증상은 가슴쓰림 및 연하곤란이며, 혈액 손실은 또한 식도 미란으로부터 발생할 수 있다. GERD는 하부 식도 괄약근의 낮은 긴장 및 부적절한 이완과 관련될 수 있으며 위마비가 약 40% 정도로 발생한다. 대부분의 경우, GERD는 위에 의해 자극성인 산의 방출을 감소시키는 제제[예: 프릴로섹(Prilosec)] 또는 하부 식도 괄약근의 긴장을 증가시키는 제제[예: 시사프라이드(cisapride)]로 치료될 수 있는 것으로 보인다. 감소된 위장관 운동을 포함한 증상을 갖는 질환의 다른 예로는 식욕부진, 담낭 울혈, 수술후 무력장폐쇄증, 피부경화증, 관내 유사 폐쇄증, 위염, 구토 및 만성 변비증(만성 무력증) 등이 있다.
이러한 GI 질환은 일반적으로 추진 운동을 증강시키는 위장운동 프로모터로 치료한다. 모틸리드는 모틸린 수용체의 효능제 (agonist)인 에리스로마이신 및 이의 유도체와 같은 마크롤리드 화합물이다. 모틸리드의 잠재적 임상 유용성의 증거는, 유주 운동 복합체 ("MMC": Migrating Motor Complex)의 상 III을 유도하는 능력을 포함한다. MMC는 공복 상태에서 위 및 소장에 의해 나타나는 전기 활성의 4개의 상(I-IV)에 관한 것이다. 근육 수축은 상 III 및 IV에서 발생하며, 동시에 연동파가 발생하여, 공복 중에 장 내용물을 멀리 몰아낸다. 기타 임상적으로 연관된 효과는 GERD를 앓고 있는 환자 및 정상의 지원자에게 식도 연동운동 및 LEB 압력을 증가시키고; 위마비를 앓고 있는 환자에게 위 배출을 촉진시키고; 정상의 지원자, 담석을 제거한 환자 및 자율신경 신경장애를 앓고 있는 당뇨병 환자에게 담낭 수축을 자극함을 포함한다.
에리스로마이신은 방선균 (Actinomycete)인 삭카로폴리스포라 에리트라에아 (Saccharopolyspora erythraea)(이전의 스트렙토마이세스 에리트레우스(Streptomyces erythreus))를 발효시켜 제조된 마크롤리드 항생제 부류이다. 에리토마이신 A는 통상 사용되는 항생제로서, 가장 풍부하며 중요한 성분의 부류이다.
Figure 112004061318041-pct00001
1950년대 이래, 에리스로마이신 A(1)는 구역질, 구토 및 복부 불괘감과 같은 GI 부작용을 초래하는 것으로 공지되어 왔다. 에리스로마이신 A는 위 속에서 산 촉매로 분해되어 처음에 8,9-안하이드로-6,9-헤미아세탈(2)(에리스로마이신 A 에놀 에테르라고도 공지됨)을 형성한 다음, 반응식 A에서 예시된 바와 같은 스피로케탈(3)을 형성한다. GI 부작용은 에리스로마이신 A 자신과 헤미아세탈(2)(스피로케탈(3)은 불활성임)에서의 모틸린 효능제 활성에 의해 주로 설명된다.
Figure 112004061318041-pct00002
오무라(Omura) 등의 문헌[참조: Gastrointestinal motor-stimulating activity of macrolide antibiotics and the structure-activity relationship, "J. Antibiotics(1985) 38: 1631-2]에는, 에리스로마이신 A, 9-디하이드로에리스로마이신 A 및 기타 마이크로리드가 개의 소화관 수축을 자극할 수 있는 관련 능력이 기재되어 있다. 이러한 분석에서, 9-디하이드로에리스로마이신 A는 1mg/kg의 투여량에서 에리스로마이신 활성의 65%을 가지는 것으로 보고되고 있다. 9-디하이드로에리스로마이신은 에놀 에테르를 형성할 수 없으므로, 에놀 에테르의 형성은 모틸리드 활성이 필수적이지 않음이 명백하다. 에리스로마이신 A는, 이의 항균 활성에 의해 내성 미생물이 발생된다는 우려가 제기되고 있지만, 현재 운동 질환을 치료하는 데 사용되고 있다. 9-디하이드로에리스로마이신은 또한 향균 활성을 나타내므로, 이를 모틸리드로서 사용하는 것에 대한 유사한 우려가 있다.
다수의 에리스로마이신 에놀 에테르 동족체는 아래에 구조를 도시한 EM-523(4); EM-574(5); LY267,108(6); GM-611(7); 및 ABT-229(8)을 포함하는 모틸리드로서 제조되어 왔다. 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,578,579호; 제5,658,888호; 제5,922,849호; 제6,077,943호; 및 제6,084,079호를 참조한다.
Figure 112004061318041-pct00003
,
Figure 112004061318041-pct00004
,
Figure 112004061318041-pct00005
및
Figure 112004061318041-pct00006
기타 모틸리드의 이점은 락탐 에놀 에테르 및 락탐 에폭사이드 유도체를 포함한다는 것이다. 각각 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,712,253호; 제5,523,401호; 제5,523,418호; 제5,538,961호; 및 제5,554,605호를 참조한다.
모틸리드로서 에리스로마이신 에놀 에테르의 고효능에도 불구하고, 이의 대사 불안정성은 임상에서 이의 개발을 지연시켜 왔다. 게다가, 화합물 7 및 8은 세포-기반 및 근육 스트립 수축 검정 둘 모두에서 모틸린 수용체 탈민감화를 나타낸다. 이러한 탈민감화는 모틸리드의 다중 투여시의 효능 감소를 예고한다.
따라서, 항균 활성이 감소되고 대사 안정성이 증가되며 수용체 탈민감화가 감소된 신규한 모틸리드 화합물이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요건에 충족되는 9-디하이드로에리스로마이신 동족체를 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 한 양태는 화학식 I의 화합물, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 이의 에스테르 및 이의 프로드러그 형태를 제공한다.
Figure 112004061318041-pct00007
위의 화학식 I에서,
R1은 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알키닐, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 또는 치환되거나 치환되지 않은 헤테로사이클로이고;
R2는 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 또는 치환되거나 치환되지 않은 헤테로사이클로이고;
R3은 H 또는 OH이고;
R4는 H 또는 OH이거나;
R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하며; 단 (a) R1이 에틸이고 (b) R3이 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는 경우, R2는 H 또는 메틸이 아니다.
제2 양태에 있어서, 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 위 운동 질환을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 위 운동 질환의 치료방법이 제공된다.
제3 양태에 있어서, 본 발명의 화합물과 약제학적으로 허용되는 이의 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
제4 양태에 있어서, 본 발명의 화합물(I)은 환자의 위 운동 질환 치료용 약제의 제조방법에 사용된다.
제5 양태에 있어서, 본 발명은, 11-데옥시에리트로마이신(특히, 11-데옥시에리트로마이신 B)을 생산하는 재조합 숙주 세포와 함께, 이들이 발현하는 변형된 폴리케티드 신타아제 유전자 및 이들을 조작하는데 사용되는 벡터를 제공한다. 11-데옥시에리스로마이신은 본 발명의 화합물의 합성용 중간체로서 유용하다. 재조합 숙주 세포는 모듈(2) 속의 케토리덕타제 도메인을 디히드라타제 도메인, 엔오일리덕타제 도메인 및 케토리덕타제 도메인을 포함하는 카세트로 대체함으로써 조작된 eryAI 유전자를 갖는다. 제6 양태에 있어서, 본 발명은 이러한 재조합 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 11-데옥시에리스로마이신의 제조방법을 제공한다.
발명을 수행하기 위한 양태
정의
아래에 주어진 용어들의 정의는, 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않는 한, 명세서 및 청구의 범위 전체에 걸쳐서 사용되는 용어로 적용된다.
"알킬"은 주쇄에 특정한 수의 탄소원자를 갖거나, 탄소원자의 수가 특정되지는 않지만 주쇄에 탄소원자가 5개 이하인 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다.
"알케닐"은 주쇄에 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합과 특정한 수의 탄소원자를 갖거나, 탄소원자의 수가 특정되지는 않지만 주쇄에 탄소원자가 5개 이하인 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다.
"알키닐"은 주쇄에 하나 이상의 탄소-탄소 삼중결합과 특정한 수의 탄소원자를 갖거나, 탄소원자의 수가 특정되지는 않지만 주쇄에 탄소원자가 5개 이하인 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 잔기를 의미한다.
"알킬아릴", "아릴알킬", "헤테로사이클로알킬", "알킬헤테로아릴", "알킬헤테로사이클" 등은 벤질, 펜에틸 등에서와 같이 알킬 잔기에 직접 결합될 수 있는 아릴, 헤테로사이클릭 또는 헤테로아릴 그룹을 의미한다.
"아릴"은 각각 임의로 하나 이상의 위치가 치환될 수 있는, 페닐, 나프틸 및 비페닐 잔기와 같은 환 부분에 탄소원자를 6 내지 12개 갖는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 방향족 탄화수소 환 시스템을 의미한다.
"사이클로알킬"은, 불포화 C3-C7 카보사이클릭 환이 추가로 융합될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3개의 환 및 환 1개당 탄소원자 3 내지 7개를 함유하는 임의로 치환된 포화 사이클릭 탄화수소 환 시스템을 의미한다. 예시적인 사이클로알킬 환 시스템은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로데실, 사이클로도데실 및 아다만틸이다.
"할로겐" 또는 "할로"는 불소, 염소, 브롬 및 요오드이다.
"헤테로사이클","헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클로"는, 예를 들면, 4 내지 7원 모노사이클릭, 7 내지 11원 비사이클릭 또는 10 내지 15원 트리사이클릭 환 시스템이며, 하나 이상의 탄소원자 함유 환에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는, 임의로 치환되고 완전 포화되거나 불포화된 방향족 또는 비방향족 환 시스템을 의미한다. "헤테로아릴"은 환 시스템이 아릴인 헤테로사이클을 의미한다. 헤테로원자를 함유하는 헤테로원자를 함유하는 헤테로사이클릭 그룹의 각각의 환은 N, O 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자(여기서, N과 S는 임의로 산화될 수 있으며 N은 임의로 4급화될 수 있다)를 가질 수 있다.
예시적인 모노사이클릭 헤테로사이클릭 환 시스템은 피롤리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 피라졸릴, 옥세타닐, 피라졸리닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸리디닐, 이속사졸리닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 티아졸리디닐, 이소티아졸릴, 이소티아졸리디닐, 푸릴, 테트라하이드로푸릴, 티에닐, 옥사디아졸릴, 피페리디닐, 피페라지닐, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 2-옥사제피닐, 아제피닐, 4-피페리도닐, 피리디닐, N-옥소-피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로티오피라닐 설폰, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 설폭사이드, 티오모르폴리닐 설폰, 1,3-디옥솔란 및 테트라하이드로-1,1-디옥소티에닐, 디옥사닐, 이소티아졸리디닐, 티에타닐, 티이라닐, 트리아지닐, 트리아졸릴, 등을 들 수 있다. 바람직한 헤테로사이클로 그룹은 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티에닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐 등을 들 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 에스테르"는 모(母) 화합물 또는 이의 염을 생성하거나 모 화합물과 유사한 그 자체 활성을 갖도록 생체내에서(예를 들면, 사람 신체 내에서) 가수분해되는 에스테르를 의미한다. 적합한 에스테르 그룹은 약제학적으로 허용되는 지방족 카복실산, 특히 각각의 알킬 또는 알케닐 잔기가 바람직하게는 탄소원자를 6개 이하 갖는 알칸산, 알켄산, 사이클로알칸산 및 알칸디오산으로부터 유도된 그룹을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 예시적인 에스테르는 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아크릴레이트, 시트레이트, 석시네이트 및 에틸석시네이트를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적 제형에 적합한 화합물의 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 적합한 염은 화합물의 용액을, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 벤조산, 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 인산, 탄산 등과 같은 약제학적으로 허용되는 산의 용액과 혼합함으로써 형성될 수 있는 산 부가염을 포함한다. 화합물이 하나 이상의 산 잔기를 포함하는 경우, 약제학적으로 허용되는 염은 화합물의 용액을, 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 테트라알킬암모늄 하이드록사이드, 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 암모니아, 알킬아민 등과 같은 약제학적으로 허용되는 염기의 용액으로 처리함으로써 형성될 수 있다.
그룹이 ("치환된 알킬", "치환된 알케닐" 등에서와 같이) 치환되는 것을 특징으로 하는 경우, 이러한 그룹은, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 하나 이상의 독립적으로 선택된 치환체를 가질 수 있다. 치환체 및 치환 양태는 당해 분야의 통상의 숙련가 중의 어느 한 사람에 의해 선택되어 화학적으로 안정하고, 당해 분야에서 공지된 기술 뿐만 아니라 본원에서 언급된 방법에 의해 합성될 수 있는 화합물을 제공할 수 있는 것으로 이해된다. 적합한 치환체의 예로는, 위에서 특정한 치환체 이외에, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, 알콕시, 사이클로알킬옥시, 헤테로사이클로옥시, 알카노일, 알카노일옥시, 아미노, 알킬아미노 4급 암모늄, 아르알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 헤테로사이클로아미노, 디알킬아미노, 알카노일아미노, 티오, 알킬티오, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실알킬, 카바밀, 알콕시카보닐, 알킬티오노, 아릴티오노, 알킬설포닐, 설폰아미도, 아릴옥시 등을 들 수 있다. 치환체는, 예를 들면, 할로, 하이드록시, 알킬, 알콕시; 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아르알킬 등에 의해 추가로 치환될 수 있다.
특별한 입체이성체가 (예를 들면, 구조식에서 해당 입체중심에서의 강한 결합에 의해) 구체적으로 언급되지 않는 한, 모든 입체이성체는 순수 화합물 및 이의 혼합물로서 본 발명의 범주내에 포함된다. 달리 언급되지 않는 한, 각각의 거울상이성체, 부분입체이성체, 기하이상체 및 이들의 배합물과 혼합물은 모두 본 발명에 포함된다. 다형태성 결정질 형태 및 용매화물도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다.
본 발명은 이의 범주내에 당해 발명의 화합물의 프로드러그를 포함한다. 이러한 프로드러그는 생체내에서 필수적인 화합물로 용이하게 전환될 수 있는, 일반적으로 화합물의 작용성 유도체이다. 따라서, 본 발명의 치료방법에서, 용어 "투여"는 언급된 다양한 질환을 구체적으로 언급된 화합물, 또는 구체적으로 언급되지는 않았지만, 해당 질환을 앓고 있는 환자에게 투여한 후 생체내에서 특정 화합물로 전환되는 화합물로 치료함을 포함한다. 적합한 프로드러그 유도체의 선택 및 제조를 위한 통상의 공정은, 예를 들면, 문헌[참조: Design of Prodrugs, Bundgaard, ed. , Elsevier, 1985]에 기재되어 있다.
화합물 및 방법
한 가지 양태에 있어서, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알키닐, 치환되거나 치환되지 않은 아릴 또는 치환되거나 치환되지 않은 헤테로사이클로이고; R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하고; 단 R1이 에틸이고 R3이 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는 경우, R2가 H 또는 메틸이 아닌, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬이고; R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하고; 단 (a) R1이 에틸이고 (b) R3이 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는 경우, R2가 H 또는 메틸이 아닌, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 에틸이고; R2가 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 에틸이고; R2가 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 치환된 에틸이고; R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5알키닐이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 플루오로에틸 또는 아지도에틸이고; R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 치환된 에틸이고; R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 플루오로에틸 또는 아지도에틸이고; R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 프로필이고; R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 프로필이고; R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 비닐, 부틸, 벤질, 부트-3-엔-1-일, 페닐, 또는 4-하이드록시페닐이고; R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 비닐, 부틸, 벤질, 부트-3-엔-1-일, 페닐 또는 4-하이드록시페닐이고; R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H 또는 OH이고; R4가 H 또는 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는, 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R3과 R4가 독립적으로 H 또는 OH이고; R1이 에틸, 2-플루오로에틸 및 1-프로필로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; R2가 메틸, 에틸, 이소프로필 및 2-부틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 단 R1이 에틸이고 R3이 OH인 경우, R2가 메틸이 아닌 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬(바람직하게는 에틸)이고; R2가 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고; R3이 H이고; R4가 H 또는 OH인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 다음과 같은 구조의 화합물이 제공된다:
Figure 112004061318041-pct00008
및
Figure 112004061318041-pct00009
본 발명의 또 다른 양태는 화학식 I의 제조방법을 제공한다. 한 가지 양태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 반응식 1에 예시된 상응하는 에리스로마이신(II)로부터 제조된다.
Figure 112004061318041-pct00010
이러한 양태에서, 에리스로마이신(II)은 메탄올 속에서 수소화붕소나트륨으로 처리하여 (9S)-9-디하이드로에리스로마이신(III)을 제공한다. 화합물(III)은, 예를 들면, 완충 메탄올 속에서 요오드 및 빛을 사용하거나 아세토니트릴 속에서 N-요오도석신이미드를 사용하여 탈메틸화함으로써 화합물(IV)을 수득한다. N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 염기의 존재하에 R2X(여기서, R2는 위에서 정의한 바와 같고, X는 할라이드, 바람직하게는 브롬 또는 요오드, 또는 설포네이트, 바람직하게는 트리플레이트 또는 토실레이트이다)를 사용하여 화합물(IV)을 알킬화하여, 화학식 I의 화합물을 수득한다.
대안으로, 디메틸화/알킬화 단계 및 수소화붕소 환원 단계의 순서는 반응식 1A에서 예시한 바와 같이 역전될 수 있다:
Figure 112004061318041-pct00011
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는 에리스로마이신(II)은 반응식 2에서 예시한 바와 같이 제조된다.
Figure 112004061318041-pct00012
염기, 예를 들면, 탄산칼륨 또는 4-(디메틸아미노)피리딘의 존재하에 R3과 R4가 모두 OH인 에리스로마이신(II)과 카보닐화제, 예를 들면, 에틸렌 카보네이트 또는 1,1-카보닐디이미다졸과의 반응에 의해 11,12-사이클릭 카보네이트가 수득된 다. 사이클릭 카보네이트는 반응식 1에서 예시한 방법에 따라 최종 생성물로 전환된다.
화학식 II의 에리스로마이신은 반응식 3에서 예시한 바와 같이 제조되며 각각 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,066,721호, 제6,261,816호 및 제6,395,710호에 기재되어 있다.
Figure 112004061318041-pct00013
간단히 말하면, 화학식 V의 디케티드 티오에스테르를 폴리케티드 신타아제에 공급하여 화학식 VI의 폴리케티드를 제조한다. 디케티드 티오에스테르의 제조는 본원에 참고로 인용된 국제 공개특허공보 제WO 00/44717호에 기재되어 있다. 본 발명에 있어서, 폴리케티드 신타아제는 6-데옥시에리트로놀리드 B 신타아제 또는 8,8a-데옥시올레안돌리드 신타아제이다. 6-데옥시에리트로놀리드 B 신타아제의 적합한 예로는, 각각 본원에 참고로 인용된 바와 같은, 미국 특허 제5,824,513호에 기재된 삭카로폴리스포라 에리스라에아(Saccharopolyspora erythraea) 및 국제 공개특허공보 제WO 01/27284호에 기재된 바와 같은 마이크로모노스포라 메갈로미세아(Micromonospora megalomicea)에서 발견된다. 8,8a-데옥시올레안돌리드 신타아제의 예로는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,251,636호에 기재된 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스(Streptomyces antibioticus)에서 발견된다. 이러한 폴리케티드 신타아제는 변형되어 이의 천연 개시자 단위체의 혼입을 억제한다. 예를 들면, 모듈(1) 케토신타아제의 불활성화에 의해 폴리케티드 신타아제를 돌연변이시켜 천연 개시자 단위체의 혼입을 억제하는 방법은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,066,721호에 기재되어 있다.
디케티드 티오에스테르(V)는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,080,555호에 기재된 바와 같이 폴리케티드 신타아제의 무세포 형태에 공급될 수 있으나, 돌연변이된 폴리케티드 신타아제를 발현하는 유기체의 배지에 디케티드 티오에스테르(V)를 공급하는 것이 보다 편리하다. 유기체는 각각 본원에 참고로 인용된, 미국 특허 제6,066,721호 및 국제 공개특허공보 제WO 01/83803호에 기재된 바와 같은, 방선균 (Actinomycete), 예를 들면, 스트렙토마이세스 (Streptomyces)또는 삭카로폴리스포라 (Saccharopolyspora), 바람직하게는 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor), 또는 국제 공개특허공보 제WO 01/31035호에 기재된 바와 같은 비-방선균, 예를 들면, 에스췌리키아 콜리 (Escherichia coli) 또는 사카로마이세스 세레베시아에 (Saccharomyces cerevesiae)일 수 있다. 생성된 폴리케티드(VI)는 임의로 배양 배지로부터 분리된다. 이러한 과정의 방법은 아래 실시예 1에서 상세하게 설명된다. 고유 폴리케티드 신타아제를 사용하면, R3이 OH인 폴리케티드가 제조된다.
본 발명의 한 가지 양태에 있어서, 천연 폴리케티드 신타아제가 돌연변이되어 R3이 H인 폴리케티드가 생성될 수 있다. 적합한 돌연변이된 폴리케티드 신타아제의 제조방법은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,391,594호 및 제6,403,775호에 기재되어 있다.
폴리케티드(VI)는 C-6에서 하이드록실화하고 3-OH에 마이카로제(mycarose)를 첨가하며 5-OH에 데소자민을 첨가하고 C-12에서 하이드록실화되며 마이카로제 3"-OH에서 메틸화함을 포함하는 일련의 테일러링 (tailoring) 단계를 통해 에리스로마이신(II)으로 전환된다. 에리스로마이신의 기타 형태는 적절한 아단위의 테일러링 효소를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 에리스로마이신 B(R4 = H)는 C-12에서 하이드록실화를 생략하여 제조된다.
이러한 테일러링 단계는, 형질전환에 필요한 모든 효소를 발현하는 유기체, 예를 들면, 삭카로폴리스포라 에리트라에아의 돌연변이주를 배양하기 위한, 불활성 폴리케티드 신타아제를 포함하는 배양물에 폴리케티드(VI)를 공급함으로써 가장 편리하게 수행된다 (참조: 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,395,710호). 이러한 공정의 방법은 다음 실시예 2에 상세하게 기재된다.
화학식 I의 화합물은 모틸린 수용체의 효능제이다. 표 1은 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Carreras et al., Anal. Biochem. 300, 146-151(2002)]에 기재된 칼슘-유입 검정에 의해 측정된 바와 같은 모틸린 수용체의 활성화를 위한 EC50 값을 기재한다.
Figure 112004061318041-pct00014
항균 활성(표 2)은 마크롤리드-민감성 균주인 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) ATCC 6301에 대한 시험관내 감수성 시험에 의해 측정되었다.
Figure 112008059696423-pct00025
화합물에 문헌[참조: Carreras et al., 미국 공개특허공보 제2002/0192709 Al호(2002), "Methods for Evaluating Therapeutic Efficacy"]에 기재된, 세포를 기준으로 한 검정을 사용하여 모틸린 수용체 탈민감화를 시험하였다. 표 3에 기재한 바와 같이, 화합물은 시험 화합물 1 내지 10μM에 노출한 후에 탈민감화가 거의 없거나 전혀 없다.
Figure 112008059696423-pct00026
본 발명의 또 다른 양태는 감소된 위 운동의 치료시 화학식 I의 화합물을 사용하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물을 사용하는 방법은 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량을 이를 요하는 환자에게 투여함을 포함한다. 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 이론의 예시적인 예로는 위마비, 위식도 역류병, 식욕부진, 담낭 울혈, 수술후 무력장폐쇄증, 피부경화증, 관내 유사 폐쇄증, 위염, 구토 및 만성 변비증(만성 무력증)을 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다.
치료적 유효량은 본 발명의 화합물(들)의 총 1일 용량으로서 표현될 수 있으며 단일 용량으로 또는 분할 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 총 1일 용량은, 예를 들면, 약 0.01 내지 약 10mg/체중kg, 보다 통상적으로는 약 0.1 내지 약 2mg/체중kg의 양일 수 있다. 단일 용량 조성은 1일 용량을 이루도록 상기와 같은 양 또는 이의 약수를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따르는 치료법은 단일 용량 또는 다중 용량으로 1일당 본 발명의 화합물(들)의 약 10 내지 약 1,000mg을 이러한 치료를 요하는 환자에게 투여함을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 화합물은 고체, 반고체 또는 액체 형태와 같은 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있는 약제학적 조성물 또는 제제의 일부이다. 일반적으로, 약제학적 제제는 활성 성분으로서 하나 이상의 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 전형적으로, 활성 성분은 외용, 장용 또는 비경구용에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와 혼합된다. 활성 성분은, 예를 들면, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 페서리제, 액제, 유제, 현탁제, 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태의 통상의 무독성의 약제학적으로 허용되는 담체와 배합될 수 있다. 경구 투여량은 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Hondo et al., 1987, Transplantation Proceedings, Supp. 6: 17-22]에 기재된 바와 같이 본질적으로 제조될 수 있다.
사용될 수 있는 담체는 물, 글루코즈, 락토즈, 아라비아 검, 젤라틴, 만니톨, 페이스트 전분, 마그네슘 트리실리케이트, 활석, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아, 및 기타 고체, 반고체 또는 액화 형태로 제제를 제조하는데 사용하기에 적합한 담체를 포함한다. 또한, 보조 안정화제, 증점제, 착색제 및 항료가 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 본질적으로 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제4,916,138호에 기재된 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈, 또는 본질적으로 본원에 참고로 인용된 유럽 특허공보 제428,169호에 기재된 계면활성제가 이용될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 모틸리드 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 사용 방법을 제공하며, 이들은 다음 실시예에 추가로 예시되지만, 이로써 제한되지 않는다.
실시예 1
당해 실시예에는 본 발명의 특정 화합물의 합성시에 사용된 중간체인 15-메틸-6-데옥시에리스로놀리드 B(13-프로필-6-dEB 또는 15-메틸-6-dEB라고도 일컬어짐)의 제조방법이 기재된다[다른 에리스로놀리드도 유사하게 호칭되며, 예를 들면, 15위치에 메틸 그룹 대신에 플루오로 그룹을 갖는 에리스로놀리드는 15-플루오로-6-dEB라고 일컫는다].
Figure 112008059696423-pct00027
작업 세포 뱅크 CH999/pJRJ2 (모듈(1)의 케토신타아제 도메인이 돌연변이에 의해 불활성화된 PKS를 함유하는 스트렙토마이세스 코엘리콜로르)으로부터의 바이알 1mL를 해동시키고, 바이알의 내용물을 250mL들이 배플 플라스크 속의 배지(1) 50mL에 가한다.
배지(1)는 옥수수 전분 45g/L; 옥수수 침지액 10g/L; 건조된 불활성화 양조 효모 10g/L; 및 CaCO3 1g/L를 포함한다. 이 용액을 121℃에서 90분 동안 오토클레이빙하여 멸균시킨다. 멸균 후, 100% DMSO 중의 멸균 여과된 50mg/ml 티오스트렙톤 1mL/L 및 오토클레이빙된 100% 소포제 B 규소 유액(J.T. Baker) 1mL/L를 사용 전에 가한다.
해동된 세포와 배지(1)를 함유하는 플라스크에 30±1℃ 및 175±25RPM으로 48±10시간 동안 유지시킨 배양기/진탕기 속에 넣는다. 배양물 50mL를 배지(1)를 500mL 함유하는 2.8L들이 배플 플라스크에 가한다. 이 플라스크는 30±1℃ 및 175±25RPM으로 48±10시간 동안 배양기/진탕기 속에서 배양한다. 배양물 500mL를 사용하여 배지(1)를 5L 함유하는 10L들이 발효조를 접종시킨다. 발효조는, 30℃에서, 5N H2SO4와 2.5N NaOH를 가하여 pH 6.5로, 교반 속도 600RPM 및 공기 유속 1 내지 2LPM으로 조절한다. 발포체는 요구되는 바와 같은 소포제 B 50% 용액을 가하여 조절한다. 발효 배양물은 24±5시간 동안 이러한 조건하에 성장시킨다.
150L 발효조를 121℃에서 45분 동안 배지(1) 100L를 멸균시켜 제조한다. 성장 기간이 지난 후, 10L 발효조로부터의 내용물을 150L 발효조에 무균적으로 가한다. 발효조는, 30℃에서, 2.5N H2SO4와 2.5N NaOH를 가하여 pH 6.5로, 교반 속도 (500 내지 700RPM), 공기 유속(10 내지 50LPM) 및/또는 역압 조절(0.1 내지 0.4bar)에 의해 용존 산소 ≥ 80% 공기 포화도로 조절한다. 발포체는 요구되는 바와 같은 소포제 B 50% 용액을 가하여 조절한다.
35±5시간만에 용존 산소가 최소에 이르고 발효조 오프가스(offgas) 중의 CO2 함량이 최대에 이른 후,(±)-(2R*,3S*)-2-메틸-3-하이드록시헥사노일-N-프로피오닐시스테아민(프로필 디케티드)를 최종 농도 4g/L에 이르도록 가한다. 프로필 디케티드는 2:3의 비율(디케티드 대 DMSO)로 메틸설폭사이드 속에 용해시켜 제조하고, 이어서 필터-멸균시킨다(0.2㎛, 나일론 필터). 15-메틸-6-데옥시에리스로놀리드 B(13-프로필-6-dEB)의 제조는 8일째에 중단하고 발효조를 수거한다. 발효 브로쓰 (broth)는 Alpha Laval AS-26 원심분리기 속에서 20,500g로 원심분리한다. 생성물은 우선적으로 상청액 속에 존재하며; 원심분리 세포 괴상은 폐기한다.
원심분리 후, 고상 추출은 HP20 수지[미쓰비시(Mitsubishi)]를 사용하여 수행한다. 컬럼 크기는, 상청액 용적 및 역가를 기준으로 하여 선별하여, HP20 수지 1L당 15-메틸-6-dEB 15g의 충전 용량이 초과되지 않도록 한다. 원심분리 브로쓰는 선형 유속 300±20cm/h로 수지층을 통해 통과시킨다. 컬럼 압력은 15psi를 초과하지 않는다. 수지를 물 2컬럼 용적(CV)으로, 이어서, 30% 메탄올 2CV로, 각각 300±20cm/h의 속도로 세척한다. 13-프로필-6-dEB는 300±20cm/h의 속도에서 100% 메탄올 7 내지 10CV를 사용하여 용출시킨다. 용출 동안에, 1CV의 분획을 수집한다. 분획을 분석하고, 생성물을 함유하는 분획을 합하여, 원심분리 브로쓰 속에서 최초의 15-메틸-6-dEB 95% 이상을 함유하는 생성물 풀 (pool)을 수득한다. 생성물 풀은 회전 증발기를 사용하여 고체로 만든다. 이 단계에서 생성물의 순도는 5 내지 35%이다. 메탄올 불용성 물질은, 최초의 브로쓰 용적 100L당 100% 메탄올 3L 속에서 고체를 현탁시키고, 20분 동안 혼합한 다음, 여과하여, 생성물 풀로부터 제거한다.
최종 정제 단계는 HP20SS 수지(미쓰비시)를 사용하여 크로마토그래피한다. 컬럼 크기는, 생성물의 양을 기준으로 선별하여, HP20 수지 1L당 15-메틸-6-dEB 15g의 충전 용량이 초과되지 않도록 한다. 여과한 메탄올 용액은 등용적의 물을 가하여 희석시킨다. 50% 메탄올 용액은 선형 유속 300±20cm/h로 수지층을 통해 통과시킨다. 컬럼은 300±20cm/h의 속도에서 50% 메탄올 2CV로 세척한다. 생성물은 300±20cm/h의 속도에서 70% 메탄올 12CV를 사용하여 용출한다. 용출 동안에, 1CV의 분획을 수집한다. 분획을 분석하고, L 당 15-메틸-6-dEB를 50mg 초과 함유하고, 20% 크로마토그래피 순도를 넘는 분획을 합한다. 생성물 풀은 회전 증발기를 사용하여 고체로 만든다. 이 단계에서 생성물의 순도는 65%를 초과하며, 적절한 에리스로마이신으로의 생체전환에 적합하다.
기타 변형된 6-dEB 동족체는 동일한 과정에 따라 프로필 데케티드 대신에 적절한 디케티드 티오에스테르를 사용하여, 제조한다. 따라서, 15-플루오로-6-dEB는 (±)-(2R*,3S*)-5-플루오로-2-메틸-3-하이드록시펜타노일-N-프로피오닐시스테아민을 사용하여 제조한다. 또한, 15-메틸-6-dEB 및 15-플루오로-6-dEB의 합성은 본원에 참고로 인용된 애쉴리(Ashley) 등의 국제 공개특허공보 제WO 00/44717 A2호에 기재된다.
실시예 2
이 실시예에는 15-메틸-6-데옥시에리스로놀리드 B의 15-메틸에리스로마이신 A(화학식 II, R1 = -CH2CH2CH3; R3 = R4 = OH)로의 전환이 기재되어 있다. 전환 기술은 또한 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Carreras et al., J. Biotechnology, 92, 217-228(2002)]에 기재되어 있다.
작업 세포 뱅크 CH39-14V (6-dEB를 생산할 수 있는 에스. 에리스라에아의 eryA 돌연변이주)으로부터의 바이알 1mL를 해동시키고, 바이알의 내용물을 250mL들이 배플 플라스크 속의 배지(2) 50mL에 가한다.
배지(2)는 옥수수 전분 16g/L; 옥수수 덱스트린 10g/L; 소이밀 분말 15g/L; CaCO3 4g/L; 옥수수 침지액 5g/L; 대두유 6g/L; NaCL 2.5g/L; 및(NH4)2SO 4 1g/L를 포함한다. 이 용액을 121℃에서 60분 동안 오토클레이빙하고 오토클레이빙된 100% 소포제 B 규소 유액(J.T. Baker) 1mL/L를 사용 전에 가한다.
해동된 세포와 배지(2)를 함유하는 플라스크에 34±1℃ 및 175±25RPM으로 48±10시간 동안 유지시킨 배양기/진탕기 속에 넣는다. 배양물 50mL를 배지(2)를 500mL 함유하는 2.8L들이 배플 플라스크에 가한다. 이 플라스크는 34±1℃ 및 175±25RPM으로 48±10시간 동안 배양기/진탕기 속에서 배양한다. 배양물 500mL를 사용하여, 배지(2)를 5L 함유하는 10L들이 발효조를 접종시킨다. 발효조는, 34℃에서, 2.5N H2SO4와 NaOH를 가하여 pH 7.0으로, 교반 속도 600RPM 및 공기 유속 1 내지 2LPM으로 조절한다. 발포체는 요구되는 바와 같은 소포제 B 50% 용액을 가하여 조절한다. 발효 배양물은 24±5시간 동안 이러한 조건하에 성장시킨다.
발효조 150L를 121℃에서 45분 동안 배지(3) 100L를 멸균시켜 제조한다. 배지(3)는 옥수수 전분 17.5g/L; 옥수수 덱스트린 16g/L; 소이밀 분말 16.5g/L; CaCO3 4g/L; 옥수수 침지액 6g/L; 대두유 3g/L; NaCL 3.5g/L; 및(NH4)2SO4 1g/L를 포함한다. 성장 기간이 지난 후, 10L 발효조로부터의 내용물을 150L 발효조로 무균적으로 옮긴다. 발효조는, 34℃에서, 2.5N H2SO4와 2.5N NaOH를 가하여 pH 7.0으로, 교반 속도(500 내지 700RPM), 공기 유속(10 내지 50LPM) 및/또는 역압 조절(0.1 내지 0.4bar)에 의해 용존 산소 ≥ 80% 공기 포화도로 조절한다. 발포체는 요구되는 바와 같은 소포제 B 50% 용액을 가하여 조절한다.
25±5시간째에 15% 덱스트린(w/v)을 58 내지 60mL/h으로 공급하기 시작한다. 덱스트린 용액은 공급 기간 동안예 계속해서 혼합한다. 24±5시간째에 13-프로필-6dEB 25g을 발효조에 가한다. 13-프로필-6dEB는 100% 에탄올 중의 400 내지 600mL 속에서 13-프로필-6dEB 25g을 용해시키고, 여과(0.2㎛, 나일론 필터)하여 제조한다. 13-프로필-6dEB의 13-프로필-에리스로마이신 A으로의 전환을 60±10시간 후 중단하고, 발효조를 수거한다. 발효 브로쓰는 Alpha Laval AS-26 원심분리기 속에서 20,500g로 원심분리한다. 생성물은 주로 상청액 속에 존재하며; 원심분리 세포 괴상은 폐기한다.
원심분리 후, 고상 추출은 HP20 수지(미쓰비시)를 사용하여 수행한다. 컬럼 크기는, 상청액 용적 및 역가를 기준으로 하여 선별하여, HP20 수지 1L당 15-메틸에리스로마이신 A 15g의 충전 용량이 초과되지 않도록 한다. 원심분리 브로쓰는 pH 9로 조절하고, 이어서 선형 유속 275±25cm/h로 수지층을 통해 통과시킨다. 컬럼 압력은 15psi를 초과해서는 안된다. 수지는 275±25cm/h의 속도로 물 1컬럼 용적(CV)로 세척한다. 15-메틸에리스로마이신은 275±25cm/h의 속도에서 100% 메탄올 5CV를 사용하여 용출시킨다. 용출 동안에, 1CV의 분획을 수집한다. 분획을 분석하고, 생성물을 함유하는 분획을 합하여 생성물 풀을 수득한다. 생성물 풀은 회전 증발기를 사용하여 고체로 만든다.
메탄올 불용성 물질은, 최초의 브로쓰 용적 100L당 100% 메탄올 1L 속에서 고체를 현탁시키고, pH 9로 조절한 다음, 여과하여, 생성물 풀로부터 제거한다. 생성물 풀(여액)은 회전 증발기를 사용하여 고체로 만든다.
15-메틸에리스로마이신 A는 최초의 브로쓰 용적 100L당 2L의 4:1 헥산:아세톤을 가하고, 20분 동안 혼합한 다음, 여과하여, 생성물 풀로부터 추출한다. 잔류하는 고체는 동일한 방식으로 2회 이상 추출하고, 여액을 합한다. 생성물 풀은 회전 증발기를 사용하여 고체로 만든다.
최종 정제 단계는 HP20SS 수지(미쓰비시)를 사용하여 크로마토그래피한다. 컬럼 크기는, 생성물의 양을 기준으로 선별하여, HP20SS 수지 1L당 15-메틸에리스로마이신 A 15g의 충전 용량이 초과되지 않도록 한다. 이전의 단계로부터의 고체는 최초의 브로쓰 용적 100L당 메탄올 1L에 용해시키고, 등용적의 물을 가한다. 50% 메탄올 용액은 선형 유속 275±25cm/h에서 수지층을 통해 통과시킨다. 컬럼은 50% 메탄올 1CV로, 이어서, 60% 메탄올 3CV로, 각각 275±25cm/h의 속도로 세척한다. 생성물은 70% 메탄올 3CV를 사용하고, 이어서 75% 메탄올 10CV를 사용하여, 각각 275±25cm/h의 속도로 용출시킨다. 용출 동안에, 1CV의 분획을 수집한다. 분획을 분석하고, 15-메틸에리스로마이신 A를 함유하는 분획을 합한다. 생성물 풀은 회전 증발기를 사용하여 고체로 만든다.
기타 변형된 에리스로마이신은, 동일한 과정에 따라 15-메틸-6-dEB 대신에 적당한 6-dEB 동족체를 사용하여, 제조한다. 따라서, 15-플루오로에리스로마이신 A는 15-플루오로-6-dEB를 사용하여 제조한다.

실시예 3
이 실시예는 반응식 1을 참고하여 (9S)-9-디하이드로에리스로마이신 (화학식 II)의 제조를 위한 일반적인 방법을 기재한다.
1:3 에탄올/에테르(20mL) 중의 에리스로마이신(0.36mmol) 용액을 -15℃로 냉각시키고, 수소화붕소나트륨(0.9mmol)으로 처리한다. 반응은 주위 온도에서 4시간에 걸쳐서 서서히 가온한다. 과량의 수소화붕소는 pH 6의 인산염 완충액을 가하여 분해시키고, 트리에탄올아민 10mL를 가한다. 1시간 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, MgSO4로 건조시킨 다음, 감압하에 농축시켜 건조시킨다. 생성물을 1% 트리에틸아민과 1:1 아세톤-헥산을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제한다. 다음 화합물은 이 과정을 사용하여 제조하였다:
(9S)-9-디하이드로에리스로마이신 A;
(9S)-9-디하이드로-15-메틸에리스로마이신 A; 및
(9S)-9-디하이드로-15-플루오로에리스로마이신 A.
실시예 4
이 실시예는 반응식 1을 참고하여 N-데스메틸-(9S)-9-디하이드로에리스로마이신 (화학식 III)의 제조를 위한 일반적인 방법을 기재한다.
8:2 메탄올/물 10mL 중의 (9S)-9-디하이드로에리스로마이신(150mg) 용액에 아세트산나트륨삼수화물 (139mg) 및 요오드 (52mg)을 순차적으로 가한다. 0.2M LiOH 용액 (1mL)을 1시간에 걸쳐서 4분획으로 가한다. 완전 반응은 박층 크로마토그래피 분석으로 측정한다. 과량의 반응물은 포화 티오황산나트륨 용액을 가하여 급냉시키고, 휘발물을 감압하에 제거한 다음, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출한다. 유기상을 포화 NaHCO3로 세척하고, Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과하고, 농축시켜 조생성물을 수득한다. 실리카 겔 크로마토그래피(아세톤/헥산 + 2% Et3N)하여 순수한 생성물을 수득한다. 다음 화합물은 이 과정을 사용하여 제조하였다:
N-데스메틸(9S) -9-디하이드로에리스로마이신 A;
N-데스메틸(9S) -9-디하이드로-15-메틸에리스로마이신 A; 및
N-데스메틸(9S) -9-디하이드로-15-플루오로에리스로마이신 A.
실시예 5
이 실시예는 반응식 1을 참고하여 화학식 II(R3 = R4 = OH)의 N-데스메틸-N-R2-(9S)-9-디하이드로에리스로마이신의 제조를 기재한다.
N-데스메틸(9S)-9-디하이드로-에리스로마이신 A 동족체(0.035mmol), 디이소프로필에틸아민(62.5uL), R2I(1.3mmol) 및 아세토니트릴(1mL)의 혼합물을 밀봉시키고, 70℃에서 밤새 교반한다. 혼합물을 냉각시키고, 수성 NaHCO3로 희석시킨 다음, 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 건조시킨다. 생성물을 2:1 헥산/아세톤 + 1% Et3H을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제한다. 다음 화합물은 이 과정에 따라 제조하였다:
(a) N-데스메틸(9S)-9-디하이드로-15-플루오로에리스로마이신 A와 에틸 요오다이드를 사용한 N-데스메틸-N-에틸(9S)-9-디하이드로-15-플루오로에리스로마이신 A;
(b) N-데스메틸(9S)-9-디하이드로-15-플루오로에리스로마이신 A와 이소프로필 요오다이드를 사용한 N-데스메틸-N-이소프로필(9S) -9-디하이드로-15-플루오로에리스로마이신 A;
(c) N-데스메틸(9S)-9-디하이드로-15-메틸에리스로마이신 A와 이소프로필 요오다이드를 사용한 N-데스메틸-N-이소프로필(9S) -9-디하이드로-15-메틸에리스로마이신 A; 및
(d) N-데스메틸(9S)-9-디하이드로-15-메틸에리스로마이신 A와 2-요오도부탄을 사용한 N-데스메틸-N-(2-부틸)(9S)-9-디하이드로-15-메틸에리스로마이신 A.
실시예 6
이 실시예는 당해 과정이 기타 유사한 화합물에 일반적으로 적용되는 것으로 이해되지만, N-데스메틸-15-메틸에리스로마이신 A (화합물 III'; R1 = 1-프로필; R3 = R4 = OH)를 특별히 참고하여, 반응식 1A의 디메틸화 단계를 예시한다.
메탄올-물(8: 2V/V, 100mL) 중의 15-메틸에리스로마이신 A(화합물 III, R1 = 1-프로필; R3 = R4 = OH; 5.00g, 6.15mmol)와 아세트산나트륨 삼수화물(4.18g, 30.75mmol)과의 혼합물을 50℃에서 교반한다. 요오드(1.56g, 6.15mmol)를 가하였다. 반응 동안에, 1N 수산화나트륨(6.15mL)을 소량씩 가하였다. 완전 반응은 박막 크로마토그래피 분석으로 측정하였다. 용매를 제거한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 조생성물(4.97g)을 황색 고체로서 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
실시예 7
이 실시예는 당해 과정이 기타 유사한 화합물에 일반적으로 적용되는 것으로 이해되지만, N-데스메틸-N-이소프로필-15-메틸에리스로마이신 A(화합물 IV'; R1 = 1-프로필; R2 = 이소프로필; R3 = R4 = OH)를 특별히 참고하여, 반응식 1A의 알킬화 단계를 예시한다.
아세토니트릴(50mL) 중의 이전의 실시예로부터의 조악한 N-데스메틸-15-메틸에리스로마이신 A (2.50g, 3.41mmol), 디이소프로필에틸아민(6.1mL, 10당량) 및 2-요오도프로판(10.2mL, 30당량)의 혼합물을 70℃ 욕에서 24시간 동안 가열하였다. 물과 포화 중탄산나트륨을 가하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 조악한 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(3: 1 헥산-아세톤, 1% 트리에틸아민)로 정제하여 순수한 N-데스메틸-N-이소프로필-15-메틸에리스로마이신 A(1.80g, 2단계 동안에 75%의 수율)를 수득한다. m/z: 777.0(MH) ; 13C-NMR(CDCl3): 221.86, 175.62, 103.11, 96.15, 83.30, 79.85, 78.01, 75.10, 74.90, 74.59, 72.58, 70.35, 68.91, 68.75, 65.48, 62.79, 52.49, 49.47, 45.12, 44.76, 39.32, 38.43, 37.85, 34.96, 33.06, 30.76, 30.19, 26.93, 21.48, 21.41, 20.99, 20.46, 19.47, 18.62, 18.27, 16.15, 15.84, 14.00, 12.04, 9.01.
실시예 8
이 실시예는 당해 과정이 기타 유사한 화합물에 일반적으로 적용되는 것으로 이해되지만, N-데스메틸-N-이소프로필-15-메틸-(95)-9-디하이드로에리스로마이신 A(화합물 I, R1 = 프로필 ; R2 = 이소프로필; R3 = R4 = OH)을 특별히 참고하여, 반응식 1A의 카보닐 환원 단계를 예시한다.
N-데스메틸-N-이소프로필-15-메틸에리스로마이신 A(1.74g, 2.24mmol)을 메탄올-에테르(1: 3V/V, 50mL)에 용해시키고, -20℃로 냉각시켰다. 수소화붕소나트륨(189mg, 5.0mmol)을 가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 서서히 가온하였다. 과량의 수소화붕소나트륨을, pH 6.0의 인산염 완충액을 가하고, 이어서, 트리에탄올아민(10mL)을 가하여 분해시켰다. 30분 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피(3: 1 헥산-아세톤, 1% 트리에틸아민)로 정제하였다. 순수한 N-데스메틸-N-이소프로필-15-메틸-(9S)-9-디하이드로에리스로마이신 A(1.63g, 93%의 수율)를 수득하였다. m/z: 779.0(MH); 13C-NMR(CDCl3): 177.28, 102.59, 95.81, 83.45, 82.76, 78.81, 77.86, 75.68, 75.03, 74.67, 72.68, 70.38, 70.24, 69.26, 65.97, 62.28, 52.52, 49.34, 44.83, 42.00, 36.78, 34.80, 34.37, 33.01, 31.96, 31.02, 30.76, 25.46, 21.58, 21.28, 21.10, 20.41, 19.93, 19.74, 18.27, 16.37, 14.86, 14.30, 14.02, 9.17.
실시예 9
이 실시예는, 11-데옥시에리스로마이신 B를 특별히 참고하여, 본 발명의 특정 화합물의 합성용 중간체로서 유용한 11-데옥시에리스로마이신의 생합성이 가능한 삭카로폴리스포라 에리스라에아(K24-1/159-44) 균주의 작제에 대해 기재한다.
11-데옥시에리스로마이신 B는 유전자(eryAI, eryAII 및 eryAIIl)의 DEBS 한 벌 (suite)의 변형된 형태를 발현하는 유전자 조작된 숙주 세포 속에서 단일 발효로 제조하였다. eryAI 유전자는, 모듈(2) 속의 케토리덕타제 도메인을 디히드라타제 도메인, 엔오일리덕타제 도메인 및 케토리덕타제 도메인을 함유하는, 예들 들면, 라파마이신 PKS의 모듈(1)로부터 수득된 카세트로 대체함으로써 조작된다. 도메인 대체 방법은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: 맥다니엘(McDaniel)의 미국 특허 제6,403,775호(2002)]에 제공된다. 조작된 eryAI 유전자는, eryAII와 eryAIII 유전자와 함께, 조작된 PKS 유전자가 첨가되는 경우 에리스로마이신의 제조시에 적합한 숙주 세포 속으로 혼입된다. 바람직한 양태에 있어서, 이러한 숙주 세포는 이의 고유 PKS 유전자가 제거되어진 "클린(clean) 숙주"이다. 적합한 숙주의 예로는, 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Santi et al., 미국 공개특허공보 제2002/0004229 A1호(2002)]에 기재된 바와 같이, 돌연변이된 PKS 유전자를 갖는 삭카로폴리스포라 에리트라에아 균주 및 상기 클린 숙주 삭카로폴리스포라 에스트라에아 K24-1이 포함되지만, 이로써 제한되지는 않는다. 균주 K24-1은, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,190,871호에 기재된 악티노파지 ΦC31의 attB 파지 부착 부위로 대체되고, ermE* 프로모터로 대체되는 천연 eryAI, eryAII 및 eryAIII 유전자를 갖는다. 이로써, 플라스미드 벡터는 파지 인테그라제의 존재하에 attB 부위에서 염색체로 전달하여 통합시키고자 하는 유전자와 함께 상보적인 attP 파지 부착 부위를 포함한다. 적합한 통합 파지 벡터의 예로는 pSET152 및 이의 유도체가 포함되지만, 이로써 제한되지는 않는다.
출발 숙주 균주 삭카로폴리스포라 에리트라아에 K24-1의 제조방법은 문헌[참조: Santi et al., US 2002/0004229 Al(2002), and the strain was deposited with the American Type Culture Collection, P. O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, USA, according to the terms of the Budapest Treaty on March 12,2003, with accession number PTA-5061]에 기재되어 있다.
pKOS159-8 및 pKOS159-10은 각각 ermEp* 프로모터 및 actIp/actII-ORF4 프로모터-활성화인자 쌍의 제어하에 eryA 유전자를 함유하는 pSET152의 유도체이다. eryA 유전자 및 actIp/actII-ORF4 영역를 포함하는 PKA0127로부터의 35kb NsiI 단편을 pKOS97-64c (ermEp* 프로모터 및 λcos 부위를 포함하는 pSET152 유도체)로 클로닝하여 pKOS159-10을 제조한다. pKAO127 단편으로부터의 fd 전사 터미네이터는 당해 플라스미드에서 ermEp* 프로모터로부터 임의의 유전자의 발현을 억제한다. pKOS159-10 중의 fd 터미네이터 및 actlp/actill-ORF4 절편을 함유하는 단편을 Pacl로 분해하여 제거하고, 자기-결찰 (self-ligation)시켜, pKOS159-8을 생성시켰다. 이러한 천연 프로모터 하에 eryA 유전자를 발현시키기 위해, pKOS159-10으로부터 유래된 eryA 유전자 (및 λ cos 부위)를 포함하는 Nedl-Xbal 단편 및 상기로부터 유래된 XbaI-NdeI 분해된 PCR 증폭된 eryAI 좌측 플랭크 단편을, Xbal로 분해된 pSET152으로 클로닝하여, pKOS159-31을 작제하였다. 에스. 에리트라아에 K41-135로부터의 eryA 유전자를 함유하는 pKOS159-33은 pKOS108-04로부터의 eryA 단편을 사용하여 유사한 방식으로 작제한다. 마찬가지로, 모든 조작된 DEBS 발현 플라스미드를 스캐폴드 및 적절한 제한 효소로서 pKOS159-31을 사용하여 제조하여, 기존 플라스미드로부터 유전자 변형된 eryA 단편을 이동시켰다.
pKOS159-44는 eryAI 프로모터의 제어하에 유전자 변형된 eryA 유전자 (KR2 →rapDH/ER/KR1) [참조: Rodriguez et al., J. Ind. Microbio. Biotechnol.,"Rapid Engineering of Polyketide Overproduction bygene Transfer to Industrially Optimized Strains," web-published as document no. 10. 1007/S10295-003-0045-1(HTTP://link.springer-ny.com)(16 Apr. 2003)]를 갖는 pSET152 [참조: Bierman et al., Gene 116, 43-49 (1992), "Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp."] 유도체 플라스미드이다. pKOS11-66 [참조: Xue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 96, 11740-11745 (1999), "A multiplasmid approach to preparing large libraries of polyketides"]로부터의 (유전자 변형된 eryA 유전자를 포함하는) 30kb Ndel-Nsil 단편을 분리하고, 벡터(pSET152, eryAp 프로모터 및 cos λ 부위)를 포함하는 pKOS159-33 [참조: Rodriguez et al., cited supra]으로부터의 8kb NdeI-Nsil 단편에 결찰(ligation)시켰다. 결찰 혼합물은 Gigapack III Gold 패키지 추출물(Stratagene)을 사용하여 패키지하며, 이를 사용하여 이. 콜라이 XL-1 블루를 감염시켰다. 재조합체를 60㎍/ml 아파라마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 선별하였다. pKOS159-44 플라스미드 DNA를 분리하여 제한 분해로 확인하였다.
3개의 eryA 유전자의 염색체 결실 및 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans)로부터 유래되는 스트렙토마이세스 파지 ΦC31에 대한 attB 유전자좌의 삽입을 포함하고, 적절한 위치에 ermE* 프로모터를 수반하는 에스. 에리스라에아 균주 K24-1은, 1 내지 2 M1 플레이트 (1L당, 글루코즈 5g, 트립톤 5g, 베타인 하이드로클로라이드 0.5g, 옥수수 전분 5g, 옥수수 침지액 1g(50%), MgSO4ㆍ7H20 200mg, ZnSO4ㆍ7H2O 2mg, CuSO4ㆍH2O 0.8mg, COCl2ㆍ6H20 0.2mg, FeSO4ㆍ7H2O 4mg, CaCl2ㆍ6H20 80mg, KH2PO4ㆍ150mg, NaCl 10g, 한천 20g) 상에서 성장시킨 균주로부터 포자를 수거하고, 당해 포자를 멸균 면을 통해 여과한 다음, 20% 글리세롤 1ml 속에 재현탁시킴으로써, 제조되었다. 포자 현탁액은 -20℃에서 저장되었다. 포자 현탁액 표본 20μL 분취량을 2 ×YT 5mL에 가하고, 진탕시키면서 30℃에서 배양하였다. 1시간 후, 포자를 원심분리(수령 세포)하여 수집하였다. 공여 세포는 pKOS159-44로 이. 콜라이 ET1267/pUZ8002를 형질전환시키고, 아프라마이신 내성만으로 선별하여 수득하였다. 수개의 콜로니를 1차 형질전환 플레이트로부터 떼어내어, 클로르암페니콜(10㎍/mL) 카나마이신(100㎍/mL) 및 아프라마이신(60㎍/mL)을 함유하는 LB 5ml에 접종하는데 사용하였다. 세포를 37℃에서 3 내지 4시간 (0.4 내지 0.6의 OD600) 동안 성장시키고, 원심분리로 수집한 다음, LB 5mL 속에서 세척한 다음, 원심분리하고, LB 100μL 속에서 재현탁하였다. 공여 세포와 수령 세포 사이의 짝 (conjugal) 전이는 공여 현탁액 100㎕ 속에서 수령 세포를 재현탁시킴으로써 수행되고, 세포는 날리딕산(nalidixic acid) 50㎍/mL를 함유하는 R5 플레이트[참조: Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual(The John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985)] 위에 도말하고, 34℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 날리딕산 1mg과 아프라마이신 2mg을 함유하는 소프트 영양소 한천 3mL로 덮었다. 접합전달체(exconjugant) K24-1/159-44는 추가로 배양한 지 48시간 후 관찰되었다.
균주 K24-1/159-44는 부다페스트 조약에 따라 2003년 3월 12일자로 미국 버지니아주 20108 마나싸스 피. 오. 박스 1549에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 수탁번호 PTA-5054로써 기탁되었다.
실시예 10
이 실시예는 선행 실시예에 기재된 균주를 사용하여, 본 발명의 특정 화합물 의 합성용 중간체인 11-데옥시에리스로마이신 B의 생합성을 기재한다.
Figure 112004061318041-pct00018
본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Frykman et al., Biotechnol. Bioeng., 76, 303-310 (2001) "Precursor-Directed Production of ErythromycinAnalogs by Saccharopolyspora erythraea," and Rodriguez ET al., cited supra]에 기재된 발효 기술은 다음과 같다.
다음 배지가 사용되었다: (a) 시드 (seed) 배지(V1): 옥수수 전분 16g/L, 덱스트린[D-2256, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)] 10g/L, 소이빈 분말(S-9633, 시그마-알드리치) 15g/L, 염화나트륨 2.5g/L, 옥수수 침지액 5g/L, 황산암모늄(A-2939, 시그마-알드리치) 1g/L, 대두유(S-7381, Sigma-Aldrich) 6g/L 및 탄산칼슘(C-4830, 시그마 알드리치) 4g/L 함유; (b) 발효 배지(F2): 옥수수 전분 28g/L, 소이밀 24g/L, 염화나트륨 5.5g/L, 옥수수 침지액 8g/L, 황산암모늄 1.5g/L, 대두유 4.5g/L 및 탄산칼슘 6g/L 함유. 모든 배지는 121℃에서 90분 동안 멸균되었다.
2개의 시드 플라스크는, 냉동 세포 뱅크로부터 삭카로폴리스포라 에리트라에아 K24-1/pKOS159-44의 1mL 바이알을 취하고, 해동시키고, 바이알 내용물을 배지 (V1) 50mL에 가하고, 34℃에서 40 내지 48시간 동안 배양함으로써 시작되었다. 2개의 2차 시드는 분취량 50mL를 시드 플라스크로부터 배지(V1) 500mL로 옮기고, 34℃에서 40 내지 48시간 동안 배양함으로써 제조하였다.
두개의 2차 시드 배양물 500mL를 배지(V1)를 9L 함유하는 B. Braun B10 발효조로 옮겼다. 발효조를, 34℃에서 작동시키고, 2.5N 황산과 2.5N 수산화나트륨을 가하여 pH 7.0에서 유지시켰다. 3LPM에서 통기시키고 600 내지 800rpm에서 교반시키고, 용존 산소압을 40% 이상으로 유지시켰다. 약 24시간 후 수거하였다.
이어서, 발효조 시드 배양물 10L를 배지(F2) 300L를 함유하는 B. Braun Biostat UD500 발효조로 옮겼다. Biostat UD500 발효조는 34℃에서 작동시키고, 2.N 황산과 2.5N 수산화나트륨을 가하여 pH 7.0에서 유지시켰다. 200 내지 300prm에서 교반시키고 40 내지 250 LPM에서 통시시키며, 용존 산소압을 40% 이상으로 유지시켰다. 덱스트린(150g/L)은 675mL/24h 내지 98h의 속도로 공급되었다. 대두유는 64mL/24h 내지 140h의 속도로 공급되었다. n-프로판올은 26mL/24h 내지 140h의 속도로 공급되었다. 180시간 후 수거하였다.
발포는 소포제 B[JT 베이커(Baker)] 50% 용액을 가하여 조절하였다.
발효 브로쓰를 원심분리하여 정화하고 HP20 수지(미쓰비스)를 사용하여 고상 추출되었다. 흡착된 생성물은 메탄올로 추출되고 건조되었다. 조생성물은 에틸 아세테이트/수분 액체: 액체 추출되었다. 합한 에틸 아세테이트 추출물을 건조시켰다. 생성물을 50 내지 80% 메탄올의 단계적 구배로 용출시키면서, HP20SS 수지를 사용하여 크로마토그래피로 정제하였다. 분획 함유 생성물을 모으고, 건조시켜 11-데옥시에리스로마이신 B를 수득하였다. m/z: 702.64(MH); 13C- NMR(CDCl3) : 219.13, 175.56, 102.48, 95.92, 82.73, 79.40, 78.92, 77.79, 74.88, 72.52, 010069.02 70.79, 68.80, 65.52, 65.13, 49.25, 45.98, 44.31, 43.40, 40.15(2x), 38.11, 37.20, 36.54, 34.79, 33.19, 28.52, 26.37, 24.55, 21.37, 21.19, 18.54, 18.31, 15.69, 14.68, 11.96, 10.36, 9.16ppm.
실시예 11
이 실시예는 반응식 1의 방법을 사용한, 11-데옥시에리스로마이신 B의 N-데스메틸-N-이소프로필-11-데옥시-(9S)-9-디하이드로에리스로마이신 B(화합물 I, R1 = 에틸, R2 = 이소프로필, 및 R3 = R4 = H; 화합물 J, 표 1)로의 전환을 기재한다.
11-데옥시에리스로마이신 B(200mg, 0.285mmol)을 일반적으로 실시예 8의 과정에 따라 환원시켜 (9S)-9-디하이드로에리스로마이신 B(94mg, 47%의 수율)를 수득하였다. m/z: 705.0(MH); 13C-NMR(CDCl3) : 176.82, 102.38, 95.82, 83.04, 80.95, 80.23, 79.01, 77.82, 74.89, 72.71, 70.89, 69.14, 66.04, 65.12, 49.28, 44.67, 42.23, 40.28(2x), 37.36, 34.81(2x), 33.50, 32.58, 29.39, 28.90, 25.29, 25.17, 21.53, 21.16, 20.04, 18.13, 17. 98, 13.82, 10.59, 10.22, 9.24.
일반적으로 실시예 6과 7의 과정에 따라, 11-데옥시-(9S)-9-디하이드로에리스로마이신 B(94mg, 0.134mmol)를 N-데스메틸-N-이소프로필-11-데옥시-(9S)-9-디하이드로에리스로마이신 B(57mg, 58%의 수율)로 전환시켰다. m/z: 733.0(MH); 13C- NMR(CDCl3): 176.98, 102.05, 95.55, 82.33, 81.11, 80.22, 78.90, 77.89, 74.93, 72.69, 70.29, 69.11, 65.98, 65.16, 52.53, 49.28, 44.52, 42.38, 37.27, 34.91, 34.73, 33.38, 32.96, 32.60, 30.99, 29.38, 25.18(2x), 21.54, 21.22, 21.05, 20.34, 19. 91, 18.12, 17.85, 13.68, 10.45, 10.21, 9.10.
지금까지, 본 발명을 발명의 상세한 설명 및 실시예에 의해 설명하였지만, 당해 분야의 숙련가는 본 발명이 다양한 양태로 실시될 수 있으며 발명의 상세한 설명 및 실시예가 설명을 목적으로 한 것이지 다음의 청구의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님은 인식할 것이다. 당해 발명의 기본적인 개념으로부터 이탈하지 않는 한 이러한 시스템에 다수의 변경이 만들어질 수 있다. 본 발명이 하나 이상의 특정 양태를 참고로 실질적으로 상세하게 설명되었지만, 당해 분야의 숙련가는 본원에 구체적으로 기재된 양태에 변화가 있을 수 있으며, 이러한 변경 및 개량은 다음의 청구의 범위에 언급된 바와 같은 본 발명의 범위 및 취지 내에 있음은 인식할 것이다. 당해 명세서에 인용된 모든 공보 또는 특허 문헌은 각각의 이러한 공보 또는 문헌이 본원에 참고로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 언급되는 바와 같이 본원에 참고로 인용된다.
위의 공보 또는 문헌의 인용은 어떠한 인용된 공보 또는 문헌도 선행 기술과 관련된다는 것을 시인하도록 의도된 것이 아니며, 이러한 공보 또는 문헌의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 시인을 하는 것도 아니다.

Claims (20)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염.
    화학식 I
    Figure 112010084540219-pct00029
    위의 화학식 I에서,
    R1은 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알키닐, 치환되거나 치환되지 않은 C6-C12 아릴, 또는 치환되거나 치환되지 않은, 하나 이상의 탄소원자 함유 환에 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 4 내지 7원 모노사이클릭, 7 내지 11원 비사이클릭 또는 10 내지 15원 트리사이클릭 환 시스템이고,
    R2는 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐, 치환되거나 치환되지 않은 C6-C12 아릴, 또는 치환되거나 치환되지 않은, 하나 이상의 탄소원자 함유 환에 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 4 내지 7원 모노사이클릭, 7 내지 11원 비사이클릭 또는 10 내지 15원 트리사이클릭 환 시스템이고, 여기서,
    치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 아릴 및 치환된 4 내지 7원 모노사이클릭, 7 내지 11원 비사이클릭 또는 10 내지 15원 트리사이클릭 환 시스템에서 치환체는, 치환되지 않거나 할로, 하이드록시, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 알콕시에 의해 치환된, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-C5 알콕시, C3-C12 사이클로알킬옥시, C1-C5 알카노일, C1-C5 알카노일옥시, 아미노, C1-C5 알킬아미노 4급 암모늄, C3-C12 사이클로알킬아미노, 디(C1-C5 알킬)아미노, C1-C5 알카노일아미노, 티오, C1-C5 알킬티오, C3-C12 사이클로알킬티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실-C1-C5 알킬, 카바밀, C1-C5 알콕시카보닐, C1-C5 알킬티오노, C1-C5 알킬설포닐 및 설폰아미도로부터 선택되고,
    R3은 H 또는 OH이고,
    R4는 H 또는 OH이거나,
    R3과 R4는 함께 O-C(=O)-O를 형성하며,
    단, (a) R1이 에틸이고 (b) R3이 OH이거나, R3과 R4가 함께 O-C(=O)-O를 형성하는 경우, R2는 H 또는 메틸이 아니다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C10 알키닐, 치환되거나 치환되지 않은 C6-C12 아릴, 또는 치환되거나 치환되지 않은, 하나 이상의 탄소원자 함유 환에 N, O 및 S로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 4 내지 7원 모노사이클릭, 7 내지 11원 비사이클릭 또는 10 내지 15원 트리사이클릭 환 시스템이고, 여기서,
    치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 치환된 아릴 및 치환된 4 내지 7원 모노사이클릭, 7 내지 11원 비사이클릭 또는 10 내지 15원 트리사이클릭 환 시스템에서 치환체는, 치환되지 않거나 할로, 하이드록시, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 알콕시에 의해 치환된, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-C5 알콕시, C3-C12 사이클로알킬옥시, C1-C5 알카노일, C1-C5 알카노일옥시, 아미노, C1-C5 알킬아미노 4급 암모늄, C3-C12 사이클로알킬아미노, 디(C1-C5 알킬)아미노, C1-C5 알카노일아미노, 티오, C1-C5 알킬티오, C3-C12 사이클로알킬티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실-C1-C5 알킬, 카바밀, C1-C5 알콕시카보닐, C1-C5 알킬티오노, C1-C5 알킬설포닐 및 설폰아미도로부터 선택되고,
    R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고,
    R3과 R4가 OH이며,
    단, R1이 에틸인 경우, R2가 H 또는 메틸이 아닌, 화학식 I의 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬이고,
    R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고, 여기서,
    치환된 알킬, 치환된 알케닐 및 치환된 알키닐에서 치환체는, 치환되지 않거나 할로, 하이드록시, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 알콕시에 의해 치환된, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-C5 알콕시, C3-C12 사이클로알킬옥시, C1-C5 알카노일, C1-C5 알카노일옥시, 아미노, C1-C5 알킬아미노 4급 암모늄, C3-C12 사이클로알킬아미노, 디(C1-C5 알킬)아미노, C1-C5 알카노일아미노, 티오, C1-C5 알킬티오, C3-C12 사이클로알킬티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실-C1-C5 알킬, 카바밀, C1-C5 알콕시카보닐, C1-C5 알킬티오노, C1-C5 알킬설포닐 및 설폰아미도로부터 선택되고,
    R3과 R4가 OH이며,
    단, R1이 에틸인 경우, R2가 H 또는 메틸이 아닌, 화학식 I의 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R1이 에틸이고,
    R2가 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고,
    R3과 R4가 OH인, 화학식 I의 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    R1이 치환된 에틸이고,
    R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5알키닐이고, 여기서,
    치환된 에틸, 치환된 알킬, 치환된 알케닐 및 치환된 알키닐에서 치환체는, 치환되지 않거나 할로, 하이드록시, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 알콕시에 의해 치환된, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-C5 알콕시, C3-C12 사이클로알킬옥시, C1-C5 알카노일, C1-C5 알카노일옥시, 아미노, C1-C5 알킬아미노 4급 암모늄, C3-C12 사이클로알킬아미노, 디(C1-C5 알킬)아미노, C1-C5 알카노일아미노, 티오, C1-C5 알킬티오, C3-C12 사이클로알킬티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실-C1-C5 알킬, 카바밀, C1-C5 알콕시카보닐, C1-C5 알킬티오노, C1-C5 알킬설포닐 및 설폰아미도로부터 선택되고,
    R3과 R4가 OH인, 화학식 I의 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    R1이 치환된 에틸이고, 여기서,
    치환된 에틸에서 치환체는, 치환되지 않거나 할로, 하이드록시, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 알콕시에 의해 치환된, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-C5 알콕시, C3-C12 사이클로알킬옥시, C1-C5 알카노일, C1-C5 알카노일옥시, 아미노, C1-C5 알킬아미노 4급 암모늄, C3-C12 사이클로알킬아미노, 디(C1-C5 알킬)아미노, C1-C5 알카노일아미노, 티오, C1-C5 알킬티오, C3-C12 사이클로알킬티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실-C1-C5 알킬, 카바밀, C1-C5 알콕시카보닐, C1-C5 알킬티오노, C1-C5 알킬설포닐 및 설폰아미도로부터 선택되고,
    R2가 H, 에틸, 프로필, 이소프로필 또는 2-부틸이고,
    R3과 R4가 OH인, 화학식 I의 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    R1이 프로필이고,
    R2가 H, 치환되거나 치환되지 않은 C1-C5 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알케닐 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2-C5 알키닐이고, 여기서,
    치환된 알킬, 치환된 알케닐 및 치환된 알키닐에서 치환체는, 치환되지 않거나 할로, 하이드록시, C1-C5 알킬 또는 C1-C5 알콕시에 의해 치환된, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, 할로, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로메틸, 하이드록시, C1-C5 알콕시, C3-C12 사이클로알킬옥시, C1-C5 알카노일, C1-C5 알카노일옥시, 아미노, C1-C5 알킬아미노 4급 암모늄, C3-C12 사이클로알킬아미노, 디(C1-C5 알킬)아미노, C1-C5 알카노일아미노, 티오, C1-C5 알킬티오, C3-C12 사이클로알킬티오, 우레이도, 니트로, 시아노, 카복시, 카복실-C1-C5 알킬, 카바밀, C1-C5 알콕시카보닐, C1-C5 알킬티오노, C1-C5 알킬설포닐 및 설폰아미도로부터 선택되고,
    R3과 R4가 OH인, 화학식 I의 화합물.
  8. 제1항에 있어서,
    R3과 R4가 독립적으로 H 또는 OH이고,
    R1이 에틸, 2-플루오로에틸 및 1-프로필로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    R2가 메틸, 에틸, 이소프로필 및 2-부틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    단, R1이 에틸이고 R3이 OH인 경우, R2가 메틸이 아닌, 화학식 I의 화합물.
  9. 제1항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 다음 표에 기재된 조합에 따르는, 화학식 I의 화합물.
    Figure 112010084540219-pct00030
  10. 제1항에 있어서,
    Figure 112010084540219-pct00031
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화학식 I의 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 화학식
    Figure 112010084540219-pct00032
    의 구조를 갖는, 화학식 I의 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 화학식
    Figure 112010084540219-pct00033
    의 구조를 갖는, 화학식 I의 화합물.
  13. 제1항에 따르는 화학식 I의 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 위 운동 질환 치료용 약제학적 조성물.
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