KR101020665B1 - 동결견의 진단을 위한 ｉｃａｍ-1의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1)에 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함하는 동결견 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 동결견을 진단하고자 하는 환자로부터 얻은 시료, 특히, 관절낭, 관절액, 또는 혈청내 ICAM-1의 mRNA 또는 단백질 양을 측정함으로써 동결견의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후를 평가할 수 있다.

동결견, ICAM-1, 관절낭, 관절액, 진단

Description

동결견의 진단을 위한 ＩＣＡＭ-1의 신규한 용도{Novel Use of ICAM-1 for Diagnosing Frozen Shoulder}

본 발명은 동결견의 진단을 위한 것으로서, 보다 자세하게는 ICAM-1에 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함하는 동결견 진단용 조성물에 관한 것이다.

동결견(frozen shoulder) 혹은 오십견은 어깨의 기능제한과 통증의 통상적 원인이다. 일반적인 발병률은 2% 내지 5%인데 반하여, 당뇨병을 가진 환자에서는 10.8% 내지 29%까지 증가한다. 이의 임상 전반은 통증과 어깨 관절의 능동 및 수동 운동 모두의 진행성 제한으로 시작하는 지연성 및 잠행성의 질환이다. Bunker 등은 동결견의 병리학적 진행은 활성형 섬유모세포(fibroblastic)의 증식이며, 활액막(synovium)의 염증이 관련되어 있지 않다고 하였음에도 불구하고, 동결견의 병태 생리학적 진행은 활액막의 염증이 후속된 관절낭(joint capsule)의 섬유화와 관련이 있을 것으로 추정하고 있다. Uitvlugt 등은 동결견의 주요 관절내(intraarticular)의 소견은 관절내 유착 또는 퇴행성 변화 없는 활액막 염(synovitis)과 같다고 재시하였다. Ogilvie-Harris 등은 회전근 간격(rotator interval area)이 붉어진 염증 조직 및 이두근 건(biceps tendon)까지 고밀도의 상처 조직(scar tissue)으로 채워져 있다는 것을 보여주었다. 동결견에 대한 이러한 소견은 동결견의 기본 병리는 활액막 조직의 염증일 수 있다는 예측에 이르렀다. 활액막의 염증은 혈관의 투과성, 세포의 이동 및 증식의 여러 측면에 영향을 미치는 다양한 사이토카인 및 성장인자에 의해 조절된다. 그러나, 동결견과 관련된 염증성 사이토카인 및 이 질환에서 그들의 역할에 대하여 알려진 바가 거의 없다. 이렇듯 동결견은 견관절 부위에 심한 동통과 기능 제한을 일으키는 매우 흔한 질환임에도 불구하고 발병 원인 및 병태 생리학에 대해 밝혀진 바가 거의 없으며, 임상에서 시도되는 여러 치료법의 치료 효과를 설명할 수 있는 정확한 기전 또한 아직 밝혀지지 않았다.

한편, ICAM-1은 백혈구, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포를 포함한 여러 종류의 세포에 의해 발현되는 Ig 유사 세포 접착 분자이다. ICAM-1은 면역 매개 염증 반응에서 중요한 역할을 하고 백혈구 활성화 및 림프구 증식에서 자극 신호를 제공한다. 공개된 바에 의하면 ICAM-1의 분자량은 76~114kD으로 다양하고 이의 발현양은 염증, 감염 및 암 조건하에서 증가되는 것으로 보고되어 있다. ICAM-1은 혈관의 내피세포를 통한 백혈구의 이동과 그의 세포외기질에 대한 단단한 결합을 통해 염증 조직에 잔류하는데 특히 중요한 역할을 한다.

본 발명자들은 동결견의 염증 원인을 밝혀내던 중 동결견 환자의 관절낭, 관절액 및 혈청내에 ICAM-1의 발현양이 정상인에 비하여 높기 때문에 ICAM-1의 발현양을 확인함으로써 동결견을 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 ICAM-1에 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함하는 동결견 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 real time RT-PCR을 통해 동결견 환자의 관절낭과 관절액에서 ICAM-1의 발현양이 정상인에 비하여 유의적이 높다는 것이 확인되었다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명에서는 웨스턴 블롯(Western blotting)을 통해 동결견 환자의 관절낭과 관절액에서 ICAM-1의 발현양이 정상인에 비하여 유의적으로 높다는 것이 확인되었다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명에서는 동결결 환자의 관절낭 조직의 배양 세포에 스테로이드를 처리한 결과 처리전에 비하여 ICAM-1의 발현양이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

또한, 본 발명에서는 ELISA를 통해 동결견 환자의 혈청에서 ICAM-1의 양이 정상인에 비하여 유의적으로 높다는 것이 확인되었다(실시예 6 참조).

따라서, 동결견을 진단하고자 하는 대상의 생체내 ICAM-1의 발현양을 측정함으로써 동결견의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 ICAM-1을 이용한 동결견 진단 및 예후 평가는 동결견을 진단하고자 하는 대상의 시료 중에서 ICAM-1 또는 이를 암호화하는 핵산을 검출하고 검출된 량을 정량하여 정상상태(혈청 중 102 내지 450ng/ml)와 비교함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단 마커"란 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 질병의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상 조직과 질병이 발병된 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명에서 진단 마커는 ICAM-1이며 ICAM-1의 발현양을 단백질 수준 또는/및 mRNA 수준에서 확인함으로써 동결견을 진단할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "시료"는 동결견을 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직, 세포, 혈액, 분비물 일 수 있으며, 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 본 발명에서 시료는 상위관절의 관절낭, 관절액, 혈청이 바람직하다. 상기 대상은 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

상기 ICAM-1의 발현을 mRNA 수준에서 검출하는 방법으로는 당업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, ICAM-1 핵산의 검출은 ICAM-1을 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 혼성화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.

보다 구체적으로 프라이머를 이용한 ICAM-1 핵산의 검출은 RT-PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 ICAM-1 유전자의 mRNA를 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

따라서 본 발명은 ICAM-1 핵산에 특이적인 프라이머를 포함하는 동결견의 진단용 조성물을 제공한다.

상기 "프라이머"는 ICAM-1 핵산 분자 전체 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 것으로서 ICAM-1 핵산 중 7개 이상의 연속적인 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 기본으로 한다. 일반적으로 상기 프라이머는 17-25bp, 바람직하게는 20bp의 길이를 가지며, ICAM-1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약 60%, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는 상기 프라이머는 서열번호: 1 및 서열번호: 2에 나타낸 염기서열로 이루어진 것이다.

상기 본 발명의 동결견 진단용 조성물은 상술한 ICAM-1 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, RT-PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 역전사효소, 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 동결견 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다.

상기 ICAM-1의 발현을 단백질 수준에서 검출하는 방법으로는 당업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시료를 ICAM-1에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정한다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 시료 중의 ICAM-1과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

따라서 본 발명은 ICAM-1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 동결견의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

ICAM-1 단백질은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 ICAM-1 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 ICAM-1은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있 다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 ICAM-1 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 ICAM-1 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 ICAM-1 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 ICAM-1 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 ICAM-1 단백질에 특이적인 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 ICAM-1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 동결견 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 시료 중의 ICAM-1 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 혈청 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 ICAM-1에 특이적인 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 ICAM-1 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함한 진단용 조성물을 이용하여 시료 중 ICAM-1의 발현양을 검출함으로써 동결견의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후의 평가할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시 예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시 예에만 국한되는 것은 아니다.

실시 예 1: RNA 추출 및 Oligo-Array 분석에 의한 염증성 사이토카인 유전자의 발현 스크리닝

20명의 환자 지원자를 2그룹으로 나누었다. 동결견 환자 15명과 근위 상완골 골절 및 견관절 전하방 불안정성(shoulder anteroinferior instability, 대조군)을 갖는 5명의 환자로 분류하였다. 동결견 환자와 대조군 환자 모두에서 수축된 관절낭 조직을 회수하였다. 관절낭 조직은 회수 후 즉시 -20℃에서 RNAlater® (Ambion, CA)에 보관하였다. 관절낭 및 윤활액 조직의 총 RNA는 TRIZOL (Invitrogen, Rockville, MD)을 이용하여 제조업자의 설명문에 따라 추출되었다. 분광광도 계수에서 1.7 보다 높은 260nm/280nm 비율을 갖는 RNA 산물이 수득되었다. 먼저 표준 cDNA가 1㎍의 총 RNA로부터 RT-PCR을 위한 Superscript TM First-strand synthesis system (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 the Perkin Elmer DNA thermal cycler를 이용하여 합성하였다. 화학발광(chemiluminescent) 검출 시스템을 이용하는 GEArray® Series (Bioscience Corporation, Fredrick, MD) for Human Extracellular Matrix & Adhsion Molecules가 112개 유전자의 발현을 검출하기 위해 이용되었다.

cDNA 프로브는 분리된 RNA 상에 Super Array® AmopLabeling-LPR kit (Bioscience Corporation, Fredrick, MD) 및 Biotin-16-dUTP (Roche Applied Sciences, IN)를 이용하여 제조하였다. 총 1㎍의 RNA가 각 프로브 합성에 이용되었고 각 단계별 제조업자의 프로토콜에 따라 진행하였다. 막은 변성된 연어 정자의 DNA(Invitrogen, Cambridge, MA)를 포함하는 GEAhyb 혼성화 용액 (Bioscience Corporation, Fredrick, MD)의 용액에서 60℃에서 1시간 동안 전혼성화하였다. 그 다음 Biotin-16-dUTP로 표지된 프로브를 5 내지 10rpm으로 연속적으로 진탕하며 60℃에서 하룻밤 동안 혼성화하였다. 막 상으로 하룻밤 동안 혼성화시킨 후에 제거하고 막을 세척 완충용액(리터 당 100 ml 20X SSC 및 50 ml 20% SDS)로 2차례 세척하고 더욱 희석된 세척 완충용액(리터당 5 ml 20X SSC 및 25 ml 20% SDS)으로 15분 동안 60℃에서 2차례 세척하였다. 막을 블로킹 용액 Q(SuperArray)로 블로킹한 후 알칼라인 포스파타제-콘쥬게이티드 스트렙타비딘으로 염색하였다. 이어서, 제조업자에 의해 제공된 완충용액으로 막을 세척한 후 CDP-Star 화학발광 기질로 염색하 고 Kodak BioMan light film (Rochester, NY)에 다양한 시간에 노출하였다. 이미지는 스캐닝하였고 어레이의 데이터 분석은 ScanAlyze and GEArray TM Analyzer (Esien, Stanford University) version 2.5 computer software를 사용하여 판독하였다.

분석 결과, 콜라겐 분자(COL4A2, COL6A2, COL6A3, COL8A1, COL8A2, COL16A1, COL19A1, COL27A1) 및 여타 접착 분자 (연결 조직 성장 인자: CTGF, Catenin: CTNNB1, D2, 세포간 접착 분자: ICAM1, Integrin: ITGB4, Laminin: LAMA1, 전환 성장 인자: TGFB1, Thrombospondin: THBS1, S2, 금속단백분해효소: TIMP3) 유전자의 발현이 그룹 II(정상 관절낭)에 비하여 그룹 I (동결견)에서 증가하였다(p<0.05).상대적인 발현 강도의 평균은 동결견 그룹에서는 14666.44 unit이고 대조군에서는 5881.22 unit이었다. ICAM-1 유전자는 동결견 환자의 관절낭 막 상에 밝은 사각형 점으로 발현되는데 반하여 대조군 시료의 막에서 ICAM-1의 발현은 없었다.

실시 예 2: real time RT-PCR에 의한 관절낭 조직에서 ICAM-1 유전자의 검출

Oligo-array 검사에서 동결견과 대조군 간에 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 사이토카인의 mRNA를 real time RT-PCR로 분석하였다. real time RT-PCR은 Tag 폴리머라제와 연관된 5'-3' 뉴클레아제 활성을 이용하는 방법이다. PCR 주기의 연장 단계 동안에 Tag DNA 폴리머라제의 핵산분해 활성은 프로브를 절단하고, 증폭 초기 단계 동안 개시 DNA 타겟 개수에 비례하는 형광 시그널이 생성된다. PCR 반응은 384-구판에서 구 당 20㎕의 부피로 수행되었고, 각 시료는 3반복으로 분석되었다. 각 구에 1 x TagMan Universal PCR MasterMix, 300 nM 포워드 프라이머, 300 nM 리버스 프라이머, 100 nM 프로브 및 1 ㎕ 주형이 이용되었다. 반응은 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 동안 초기 정치한 후에 9℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 1주기로 총 40-50주기로 수행하였다.

상기 실시 예에서 두 그룹 간의 차이를 보이는 유전자에 대한 프라이머는 National Center of Biotechnology Information (NCBI) 웹사이트에 있는 MEGABLAST 데이터베이스를 사용하여 설계하였다. 프라이머는 Sigma Genosys (Fischer Scientific, Pittsburg, PA)에 의해 제조되었다. 실시간 RT-PCR을 위한 ICAM-1에 대한 프라이머는 다음과 같다: 센스: 5'-tatggcaacgactccttct-3'(서열번호: 1) 및 안티센스: 5'-cattcagcgtcaccttgg-3'(서열번호: 2). 실시간 PCR은 SMART Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) 및 Syber Green dye를 이용하여 40주기까지 수행하였다. 반응 혼합물은 6 pmol의 각 프라이머, 1 U의 Taq DNA 폴리머라제, 200 mM의 dNTP, 2.5 ㎕의 10×PCR 완충용액, 5 ㎕의 5×첨가제 [7.5 ml의 1M Trehalose (Sigma), 1 ml의 1% BSA, 1 ml의 10% Tween 및 최종 부피가 10ml가 되도록 이차 증류수를 넣어줌], 1.5 ㎕의 50 mM MgCl₂, 그리고 총 부피가 25㎕가 되도록 이차 증류수를 넣어주었다. 어닐링 온도는 프라이머의 용융 온도보다 정확히 1.5℃ 낮게 하였다. 밴드의 크기는 2.0% 아가로스 젤 상에서 100bp DNA 래더로 확인하였고 에티듐 브로마이드를 사용하여 가시화하였다. 각 시료는 2반복으로 테스트되었고 상대 적인 발현양은 GADPH의 발현 정도에 따라 조정하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 ICAM-1의 mRNA 발현양은 대조군에 비하여 동결견 환자에서 유의적으로 높았다(p<0.05). 평균 발현양은 동결견 그룹에서 1.698±0.186이었고 대조군에서 0.999±0.236이었다.

실시 예 3: 웨스턴 블로팅에 의한 동결견 환자의 관절액에서 ICAM-1 검출

관절액은 동결견 환자 7명과 견관절 전하방 불안정성 환자 2명으로부터 추출하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay reagent kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 의해 측정하였고 같은 농도로 조정하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 페이퍼로 이동시켰다. 멤브레인을 0.1% Tween20 (TBS-T)을 함유한 Tris 완충용액(TBS; 25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl)에 용해된 3%의 무지방 건조 밀크로 블로킹하였다. 그 다음 1:1000으로 희석된 항 사람 ICAM-1 모노클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)와 4℃에서 하룻밤 동안 정치하였다. 멤브레인을 세척한 후 TSB-T에 용해된 3%의 무지방 건조 밀크에 1:2000으로 희석된 이차 퍼옥시다제-콘쥬게이티드 항-마우스 항체(Amersham Biotech, Arlington Heights, IL)와 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 염색은 화학발광 키트 (Amersham Biotech)로 검출하였고 Image Analyzer LAS-3000 Multi Gauge software (Fujifilm corporation, Tokyo. Japan)로 음영계측기에 의해 측정하였다.

웨스턴 블로팅의 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이 동결견 환자의 상완 관절액에서 ICAM-1의 발현이 대조군에 비하여 명백하게 증가된다는 것을 보여준다. ICAM-1의 분자량은 85~115kDa이다. 동결견 환자에서 평균 단백질 량은 12.906이었고, 대조군에서 평균 단백질 량은 10.330이었다.

실시예 4: 스테로이드 처리 후 배양된 관절낭 세포에서 ICAM-1 발현 분석

4-1: 일차 세포 배양

동결견 환자 3명과 견관절 전하방 불안정성 환자 2명으로부터 얻은 관절낭 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유한 DMEM(Dulbecco's minimal essential medium, Hyclone, Logan UT)에서 배양하였다. 관절낭 조직을 회수하여 0.15mg/ml 콜라게나제, 0.1mg/ml 히알루로니다제 및 1% 항생-항진균 용액을 함유한 HBSS (Hank's balanced salt solution)에서 1시간 동안 37℃에서 소화시켰다. 세포 현탁액을 100㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과하고 HBSS 완충용액으로 3차례 세척하였다. 세포를 10% FBS, 1% 항생-항진균 용액 (Gibco, Grand Island, NY)으로 DMEM에 플레이팅하고 5%의 CO₂를 포함한 습한 공기에 37℃에서 보관하였다. 배양 세포는 80-90%의 컨플루언시에 도달하였을 때 0.25% 트립신(Gibco, Grand Island, NY)으로 처리한 후 회수하였다. 세포를 주별로 계대배양하고 배지는 3-4일마다 교환하였다. 본 실시 예에서는 3번째 계대 세포가 이용되었다.

4-2: 스테로이드 처리 후 배양 관절낭 세포에서 실시간 RT-PCR에 의한 ICAM-1 mRNA 검출

세포는 600mm 디쉬 배양 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 5 x 10⁴ 의 세포 농도로 계대배양하였다. 접종 다음 날 혈청이 없는 배지(Serum Free Media, SFM)으로 교환하고 덱사메타손(10nM)으로 처리한 후 배지는 24시간 별로 교환하였다. 처리 후 1일 및 3일에 각 시료에서 ICAM-1 mRNA를 전술된 실시예에 기재된 바와 같은 RT-PCR을 통해 검출하였다. 관절낭 조직의 총 RNA는 TRIZOL (Invitrogen, Grand Island, NY)을 사용하여 제조업자의 지시문에 따라 추출하였다. 분석 결과, 덱사메타손 처리 후 1일에 덱사메타손 미처리 세포에서 ICAM-1의 평균 발현양은 0.00107였고, 덱사메타손 처리 그룹의 모든 세포의 발현 수준은 0.00068로 미처리 세포 그롭보다 다소 낮았다

하지만, 덱사메타손 처리 후 3일에 덱사메타손 처리 그룹에서 ICAM-1평균 발현양은 0.00044로, 덱사메타손 미처리 그룹의 발현양인 0.00085에 비하여 현저히 감소되었다.

실시예 5: WST-1 에세이에 의한 세포 생존율의 측정

세포를 구당 1.5×10⁴ 으로 96구판에 100㎕의 배양 배지에 접종하고 SFM 또는 덱사메타손(10nM)을 함유한 SFM에서 배양하였다. 세포 증식은 Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 이용하여 3일 동안 24시간마다 측정하였다. WST-1을 구당 10㎕의 농도로 첨가한 후 5%의 CO₂ 및 95% 공기에서 37℃에서 4시간 동안 정치하였다. 각 구의 흡광도를 450/600nm의 파장에서 분광광도계로 측정하였다. 세포의 증식은 흡광도인 OD 값으로서 표현하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이 10nM 덱사메타손 처리 전 대조군 세포의 증식 흡광도 0.706이었고, 실험군 세포의 증식 흡광도는 0.705였다. 덱사메타손 처리 1일, 3일 후 덱사메타손 미처리 대조군 세포에서 증식 흡광도는 0.574, 0.260이었고 덱사메타손 처리 실험군 세포의 증식 흡광도는 0.260, 0.146이었다.

실시예 6: ELISA에 의한 혈청에서 s(soluble)ICAM-1의 검출

동결견 환자 43명, 당뇨병 환자 20명, 질병이 없는 14명의 정상 후보군의 혈청에서 총 sICAM-1 수준을 정량분석하였다. 각 에세이는 각 시료별로 2반복으로 수행되었다. 혈청 시료는 1:100으로 희석하고 각 구에 호스라디쉬 퍼옥시다제-항-sICAM-1 항체의 효소 콘쥬게이트를 첨가하였다. 1시간 동안 정치한 후 흡인하고 씻어주었다. 그 다음 기질인 TMB (Tetra-methylbenzidine)를 넣고 반응을 1N NaOH로 정지시켰다. 각 구의 흡광도는 분광광도계를 이용하여 450/620nm의 파장에서 측정하였다. sICAM-1의 표준 농도는 0.25ng/ml 내지 8ng/ml의 범위이다.

분석 결과, ICAM-1 단백질 양은 대조군에 비하여 동결견 환자에서 증가하였다. 동결견 환자에서 평균 발현양은 635.426±51.382이고 대조군에서는 359.864±44.286이었다.

도 1은 동결견 환자와 견관절 전하방 불안정성을 보이는 환자(대조군)의 관절낭 조직에서 ICAM-1 유전자의 발현양을 real time RT-PCR에 의해 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 동결견 환자와 견관절 전하방 불안정성을 보이는 환자(대조군)의 관절액 조직에서 ICAM-1 단백질 양을 웨스턴 블로팅에 의해 측정한 결가를 나타낸 것이다.

도 3은 덱사메타손 처리 또는 미처리된 경우에 관절낭 세포의 생존율을 WST-1 에세이에 의해 측정한 결과를 나타낸 것이다.

<110> Catholic University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel Use of ICAM-1 for Diagnosing Frozen Shoulder <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tatggcaacg actccttct 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cattcagcgt caccttgg 18

Claims (7)

1. ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1) 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머를 포함하는 동결견 진단용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호: 1 및 서열번호: 2에 나타낸 염기 서열로 이루어진 것임을 특징으로 하는 동결견 진단용 조성물.
3. ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1)을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머를 포함하는 동결견 진단용 키트.
4. ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1)을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머가 부착된 동결견 진단용 마이크로어레이.
5. ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1) 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 동결견 진단용 조성물.
6. ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1) 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 동결견 진단용 키트.
7. ICAM-1(Intercelluar Adhesion Molecule-1) 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 동결견 진단용 마이크로어레이.

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