KR100993247B1

KR100993247B1 - 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 ｄｎａ칩 검출방법

Info

Publication number: KR100993247B1
Application number: KR1020070085118A
Authority: KR
Inventors: 최용성; 이경섭
Original assignee: 동신대학교산학협력단
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2010-11-10
Also published as: KR20090020384A

Abstract

본 발명은 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 표적DNA에 수식된 형광 물질을 여기시킴으로서 약 1nM의 낮은 DNA 농도에서도 염기배열의 위치 및 개수를 확인할 수 있는 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 주요구성은 에바네센트파 형광 현미경을 이용하여, 생체재료로부터 유래한 DNA가 칩상에 고정된 DNA칩 자체를 검출하는 방법에 있어서, Au가 증착되어 있는 담체를 칩상에 고정화하는 단계와; 표적 DNA의 말단에 형광 물질을 수식시키는 단계와; 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 DNA에 수식된 형광 물질을 여기시키는 단계와; 상기 여기된 형광 물질을 에바네센트파 형광 현미경으로 검사하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

고집적 DNA칩, ,에바네센트파 형광 현미경, 로다민, 형광물질

Description

에바네센트파 형광 현미경을 이용한 ＤＮＡ칩 검출방법{Detecting method of DNA chips using evanescent wave Fluorescence microscopy}

도 1은 DNA칩의 제작 공정도.

도 2는 다이싱테이프에 붙이고 다이싱머신으로 400μm의 크기로 자른 UV조사후의 담체의 사진.

도 3은 비오틴이 수식된 프로브 DNA를 비오틴-아비딘 결합법에 의해 담체에 고정시키는 공정도.

도 4는 패턴칩에 고정된 담체의 DNA칩 마이크로어레이 공정도.

도 5는 패턴칩에 고정된 담체 사진.

도 6은 프로브 DNA(PB-1)와 매치 DNA(CR-1)의 hybridization에 따른 형광 이미지의 농도별 사진.

도 7a는 프로브 DNA와 매치 DNA의 농도에 따른 hybridization을 실시간으로 측정한 그래프.

도 7b는 표적 DNA의 농도에 따른 형광 농도를 측정한 그래프.

도 8은 프로브 DNA(PB-1)와 중앙 부분과 말단 부분에 미스매치 염기배열을 가진 미스매치 DNA의 hybridization에 따른 형광 이미지의 농도별 사진.

도 9a는 프로브 DNA와 매치 및 각 미스매치 DNA의 hybridization을 실시간으로 측정한 ΔFI 그래프.

도 9b는 프로브 DNA와 매치 및 각 미스테리 DNA의 농도에 따른 형광 강도를 나타낸 그래프.

최근, DNA칩을 비롯한 다종류의 생체재료를 마이크로머신 기술 (Micro Electro Mechanical System, MEMS)을 이용하여 하나의 칩에 집적화한 디바이스가 주목받고 있다. 단순히 많은 분석을 동시에 할 수 있을 뿐만 아니라, 미소화에 의한 시약이나 시료의 소비량을 억제하고, 단일종 또는 수종류의 인식재료로부터는 알 수 없는 복합적인 정보를 얻을 수 있을 것으로 기대되고 있다.

DNA칩의 제작 방법은 크게 나누어 리소그래픽을 이용한 방법과 스탬프를 이용한 방법의 2종류로 나눌 수 있다. 리소그래픽을 이용하는 방법은 고상합성에서 신장말단(伸張末端)의 탈보호기 반응을 광반응으로 행하는 것으로, 조사(照射) 위치를 결정하는 마스크패턴의 조합에 의하여 임의의 배열을 미소한 spot으로서 형성할 수 있다. 그러나, 고상합성의 제한으로서 신장가능한 길이가 20∼30mer 정도로 짧고, 큰 분자의 구축에는 적합하지 않은 문제가 있다. 스탬프를 이용하는 방법은 미리 준비한 다종류의 재료를 단순한 자동화된 장치에 의해 침 끝에 붙여 칩상에 옮기는 것이다. 이 방법은 재료의 제약이 없으나, 옮기는 전량이 고정화되지 않거나 인접 사이트와의 contamination 등의 문제가 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출한 본 발명의 목적은 SPR에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 표적DNA에 수식된 형광 물질을 여기시킴으로서 약 1nM의 낮은 DNA 농도에서도 염기배열의 위치 및 개수를 확인할 수 있는 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법을 제공함에 있다.

본 발명은 에바네센트파 형광 현미경을 이용하여, 생체재료로부터 유래한 DNA가 칩상에 고정된 DNA칩 자체를 검출하는 방법에 있어서, Au가 증착되어 있는 담체를 칩상에 고정화하는 단계와; 표적 DNA의 말단에 형광 물질을 수식시키는 단계와; 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 DNA에 수식된 형광 물질을 여기시키는 단계와; 상기 여기된 형광 물질을 에바네센트파 형광 현미경으로 검사하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 형광 물질은 로다민(Rhodamin)인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 따른 담체에 고정된 생체재료의 DNA칩 검출방법에 대하여 자세히 설명한다.

<시료>

본 발명에 사용된 매치 표적 DNA는 장출혈성 대장균(Eschenrichia coli) O157:H7에서 독소를 생산하는 베로톡신(verotoxin)의 전 DNA 염기배열 중에서 90% 이상을 차지하는 STL2의 염기배열인 subunit A 부분(gap 2 부분 중)을 선택하여 사용하였다.

본 발명에 사용된 모든 DNA는 0.2μM 스케일의 이중나선 DNA를 일본 Nisshinbo에 위탁 합성 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하여 사용하였다. 각 DNA의 염기배열은 표 1에 나타내었다. 다만 프로브 DNA를 비오틴-아비딘 결합법에 의해 담체 위에 고정시키기 위해 5 말단에 비오틴을 수식시켰다. 또한 에바네센트파 형광 현미경 측정을 위해서 매치 및 각 미스매치 DNA의 5 말단에 로다민(Rhodamin)이라는 형광 물질을 수식시켰다. 이러한 비오딘-아비딘 결합법은 당단백질인 아비딘이 저분자량 비타민인 비오틴에 친화력이 매우 강한 원리를 이용할 수 있다. 참고로, 아비딘은 계란 흰자위에 존재하는 당단백질로 4개의 비오틴과 결합할 수 있는 입체 구조를 가지고 있다.

DNA의 고정화를 위해 사용된 시약인 3,3'-dithiodipropionic acid(3,3'-디티오디프로피온산)은 PFALTZ&BAUER사의 제품을 사용하였다. 또한, NHS(엔-하이드록시서시니마이드, N-hydroxy succinimide , C₄H₅NO₃), 아비딘(Mw = 67,000), Tris[2-Amino-2-hydroxymethy1-1,3-propanediol], H₂NC(CH₂OH)₃, 염화나트륨(NaC1), 2-아미노에탄올(H₂NCH₂CH₂OH)은 은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.의 것을 사용하였다. EDC(에틸디메틸아미노프로필카르보디이미드, 1-Ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, C₈H₁₇N_3·HCI)은 TOKYO Kasei Organic Chemistry의 제품을 사용하였다.

Kind of DNA	base sequence
probe (PB-1) match (CR-1) Mismatch 1 (MR-1) Mismatch 2 (MR-2) Mismatch 3 (MR-3) Mismatch 22 (MR-22) Mismatch 33 (MR-33)	5' TGCAGAGTGGTATAACTG 3' 5' CAGTTATACCACTCTGAA 3' 5' GGTTTCCATGACAACGGA 3' 5' CAGTTATGCCACTCTGCA 3' 5' CAGTTATGCCACTCTGCG 3' 5' CAGTTATAGGACTCTGCA 3' 5' CAGTTATACCACTCTGGG 3'

여기서 매치 DNA(CR-1)와 미스매치 DNA(MR-1)은 대장균 O157:H7의 subunit A 부분의 DNA 염기배열의 일부분이다. 염기배열중 밑줄친 부분은 미스매치 염기배열을 나타낸다. 여기서 미스매치 DNA 중 MR-2와 MR-3은 중앙 부분과 말단부분에 한 개씩의 미스매치 염기배열을 가졌으며, 미스매치 DNA 중 MR-22와 MR-33은 중앙 부분과 말단부분에 두 개씩의 미스매치 염기배열을 가졌다. 이 매스매치 DNA를 사용하여 미스매치 염기배열의 위치 및 개수가 DNA hybridization에 어떤 영향을 미치는지를 알아보았다.

모든 DNA는 파워더 형식으로 제공되었으며 TE 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.4)에 의해 100μM의 농도로 용해해서 사용하였다. 또한 모든 DNA의 농도는 수용성 완충액(10mM Tris-HCI, 0.2M NaC1, pH7.9)에 의해 0.1nM부터 10μM까지 조정되었으며 사용하지 않을 경우는 -20℃의 상태에서 보관하였다.

또한 본 발명에서 사용된 지시제(indicator)는 Methylen blue(MB)와 Mitoxantrone(MXT)이다. 참고로, MB는 진한 녹청색의 냄새가 없는 결정으로 물, 에탄올, 클로로포름에 잘 녹아 청색 용액이 되나 에테르에는 녹지 않으며 햇빛에 약한 것이 결점이다. 디메틸아닐린을 원료로 하여 만드는 p-아미노디메틸아닐란에서 합성하는 방법과 페노티아딘을 브롬화한 후 디메틸아민을 반응시켜 얻는 방법이 있다. 산성 용액 속에서 Ti(III)염, V(II)염, CR(II)염, Sn(II)염, Cu(I)염, Mo(III)염, W(V)염 등에 의해 환원되어 무색의 류코 화합물이 되므로 이들의 검출이나 계량에 이용된다. 이 밖에 산화 환원지시제, 세포의 핵 염색제, 혈구의 염색제, 살균제, 진통제 등에 사용된다. 또한, MXT은 Anthracenedion계의 약품으로 DNA와의 상호작용에 의해 유방암, 급성 백혈병 및 비호즈킨 림프종의 이차 치료제로 널리 사용된다. MXT는 분자 외부 니트로겐 체인에 양전하인 2차원 이중 환식(heterocyclic)링 구조를 가지고 있기 때문에 음전하를 띠고 있는 쌍염기 DNA의 염기 사이에 삽입하여 안정화된다. 따라서 MXT는 쌍염기 DNA의 수소 결합사이에서 반응하기 때문에 전기화학측정법에 의한 DNA 바이오센서 연구에 많이 사용되고 있으나 아직 정확한 메카니즘은 밝혀지지 않았다.

<담체의 제작>

cover glass의 담체 제작과정을 도 1에 나타내었다. 우선, cover glass 기판(0.13∼0.16mm, 18mm×18mm, Takahashi Giken, Glass Co.)이 표면은 초음파세척기 (W-222, Honda)를 이용하여 순수, 아세톤, 순수의 순서로 각각 30분간 세정하였다. 그리고, cover glass의 한쪽면은 스핀코팅기(1H-D3, MIKASA)를 이용하여 500rpm에서 10초, 1,000∼4,000rpm에서 20초간으로 회전하면서 (C₄F₉)₃N 용제액으로 0.45∼9.0wt%의 농도로 희석시킨 CPFP를 피펫으로 100μL 적하시킴으로서 0.5∼2.0μm의 두께로 코팅하여 소수성으로 하였다. 다음에, 115℃의 항온오븐(DS64, YAMATO SCIENFITIC) 중에 넣고 4시간 하드베이킹하였다.

그리고, 그 반대면에 텡스턴보트를 이용한 저항가열형의 소형진공증착장치(SVC-700TURBO-TM, SANYU)를 이용하여 크롬을 약 200Å 증착하고, 그 후 진공을 계속 유지하면서 금(2Φ 500L)을 약 2,000Å 증착하였다. 막두께는 수정진동자(6MHz, PKG 10, LEYBOLD INFICON)를 이용한 막두께 모니터(TM-200R, Maxtek)로 측정하고, 증착속도를 클롬의 경우는 0.5∼1.0Å/s으로, 금의 경우는 5.0∼10.0Å/s의 범위가 되도록 조절하였다. 진공도는 이온진공게이지(ULVAC GI-TL3)로 측정하였고, 10^-6Torr 이하를 유지하였다. 증착후, 어닐링 등의 열처리는 실시하지 않았다. 계속해서, cover glass를 점착성의 다이싱테이프(Adwill D-210, LINTEC)에 붙인 후, 다이싱머신(A-WD-10A, Tokyo Seimitsu)을 이용하여 다이아몬드커터(52D-0.1T-40H, Asahi Diamond)로 0.5mm/s의 속도로 순수를 뿌리면서 400μm의 크기로 잘라서 담체를 제작하였다. 그 후, 5분간 다이싱테이프에 UV조사하여 점착성을 UV조사전 19,600mN/25mm (카탈로그값)에서 UV조사후 250mN/25mm로 약화시켜 담체가 점착성테이프에서 쉽게 떨어지도록 하였다. 이 공정에 의하여 1,000∼8,000개 정도의 담체를 제작할 수 있었으며, 도 2와 같이 디지털카메라로 촬영하였다.

도 2에서 금색 부분은 제작된 담체이고, 흰색부분은 다이싱테이프이다. 다이싱테이프상의 담체는 핀셋 등으로 쉽게 박리될 수 있으므로 DNA칩으로서 활용할 수 있다.

<프로브 DNA의 고정>

비오틴이 수식된 프로브 DNA를 비오틴-아비딘 결합법에 의해 담체에 고정시키는 공정을 도 3에 나타내었다.

먼저, 1mM 농도의 3,3'-dithiodipropionic acid 수용액 3ml 중에 담체를 실온에서 20분간 담근 후, 이 수용액에 100mg/ml 농도로 만든 NHS와 EDC를 혼합액으로 하여 카르복실산과 1시간 반응시킨 후 건조시켰다. 그리고, 아비딘은 수용성 완충액을 0.2mg/ml가 되도록 조제한 1ml 용액에 30분동안 담궈 놓았다. 다음 1M 농도의 에탄올아민 수용액 1ml에 담체를 30분동안 담궈 카르복실시를 불활성화하였다. 마지막으로 아비딘을 수식한 담체를 수용성 완충액에 비오틴화 프로브 DNA를 1μM이 되도록 1ml 의 용액에 25℃에서 1시간동안 담궈 두었다. 여기서, 비오틴화 프로브 DNA의 고정량은 DNA 용액에 담궈지는 시간에 의하여 제어되었다.

이와 같은 과정을 통하여 프로브 DNA는 DNA칩 마이크로어레이 표면의 아비딘과 결합하여 고정되었다.

<패턴칩에 담체의 고정>

패턴칩(500㎛)상에 담체(400㎛)를 고정하기 위하여 도 4와 같이 샤레에 패턴칩을 고정하고 에탄올 90%, 순수 10%의 현탄액을 넣었다. 그리고, 현탄액에 1500∼4000개 정도의 담체를 넣고 흔들면 중력에 의하여 담체가 가라앉으며, 소수성 상호작용에 의하여 패턴칩과 비오틴화 DNA가 수식된 담체의 소수성 부분끼리가 무작위로 수많은 사이트에서 결합되어 담체가 고정화되었다. 소수성상호작용에 의하여 패턴칩에 고정된 담체 사진을 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보이는 것과 같이, 대부분의 담체는 패턴칩과 소수성 부분끼리 접하고 있다.

<에바네센트파 형광 현미경 실험>

현탁액에 화학·생화학적으로 성질이 다른 생체재료를 고정화한 담체의 혼합물을 이용하여, 다종류의 생체재료를 고밀도로 고정화한 다항목 측정 및 고집적마이크로어레이형 DNA칩을 얻을 수 있었다. SPR에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 표적DNA에 수식된 형광 물질을 여기시킴으로써 에바네센트파 형광 현미경(Y-FL, Nikon)으로 DNA간의 상호작용을 실시간으로 모니터링 하였다.

즉, 프로브 DNA가 고정된 DNA칩 마이크로어레이의 광 산란을 막기 위하여 오일(n_d=1.516, 23℃)이 주입된 프리즘 위에 고정하였다. 그리고, 0.1nM부터 10μM의 농도로 조정된 로다민이 수식된 매치 및 각 미스매치 DNA 400μl를 DNA칩 위에 주입한 후, 프로브 DNA와 표적 DNA의 hybridization에 따른 형광 물질의 존재 여부를 CCD카메라로 이미지화 하고, 형광 이미지에 의해 구해진 형광 강도의 변화값은 Histogram 프로그램에 의해 기록하였다. 측정 시간은 90분, 측정 온도는 실온 (23℃)의 조건하에서 수행되었다. 이에 따라 매치 및 각 미스매치 DNA의 hybridization에 따른 형광 강도의 변화 값으로부터 미스매치 염기배열의 위치 및 개수가 DNA hybridization에 어떤 영향을 미치는지를 관측 할 수 있었다.

<농도에 따른 매칭 DNA의 반응 특성>

표 1에 나타낸 각 DNA 중 프로브 DNA 중 프로브 DNA(PB-1)와 매치 DNA(CR-1)의 hybridization에 따른 형광 이미지를 여러 농도로 측정하여 그 결과를 도 6의 사진으로 나타내었다.

도 6의 사진에 나타난 바와 같이, 에바네센트파 형광 현미경에 의해 구해진 형광 강도는 매치 DNA의 농도에 비례하여 증가하고 있으며, 약 1nM의 농도까지는 형광 이미지가 확인이 된다. 따라서 본 발명에 사용된 에바네센트파 형광 현미경의 측정 가능 농도는 약 1nM이상이며, BIACORE 장치보다 1000배 정도의 낮은 농도로도 결과값을 구할 수 있었다.

또한, 프로브 DNA와 매치 DNA의 농도에 따른 hybridization을 실시간으로 측정한 결과를 도 7a에 나타내었으며, 표적 DNA의 농도에 따른 형광 농도를 도 7b에 나타내었다. 여기서, ΔF.I.는 형광 강도의 변화값을 나타내며, 이 값은 표적 DNA를 주입한 후의 형광 강도에 주입전의 형광 강도를 뺀 값이다. 프로브 DNA의 농도는 1μM로 조정하여 사용하였다.

도시된 바와 같이, SPR에 의해 발생하는 에바네센트파에 따른 표적 DNA에 수식된 형광 물질의 형광 강도는 DNA칩 마이크로어레이 표면에 근접한 매질의 굴절률에 의존한다. 즉, 금 박막을 형성한 DNA칩 마이크로어레이 표면에 프로브 DNA를 고정화하고 표적 DNA가 들어있는 시료를 주입하면 DNA hybridization에 의해 DNA칩 마이크로어레이 표면상에 있는 DNA의 질량이 증가하며 그 결과로서 DNA칩 마이크로어레이 표면의 굴절률이 증가한다. 이 굴절률의 변화에 대해 에바네센트파 발생 강도 I_Z가 증가하게 된다.

이 에바네센트파 발생 강도와 형광 강도는 비례하며, 형광 강도의 변화를 이미지로 비교함으로서 도 7a에 나타난 바와 같이, 시간이 증가할수록 형광 강도의 변화값 ΔF.I.가 비례적으로 증가하지만 약 45분 정도에서 포화되고 있음을 보여 주고 있다. 이것은 시간이 증가할수록 프로브 DNA 및 매치 DNA의 hybridization에 의한 DNA칩 마이크로어레이 표면의 굴절률이 증가하기 때문에 선형적으로 증가하며, 약 45분 후에는 DNA의 hybridization에 의한 DNA칩 마이크로어레이 표면의 굴절률 변화가 없기 때문에 ΔF.I.가 포화되는 것으로 생각된다.

그리고, 도 7b에 나타난 바와 같이, 에바네센트파 형광 현미경에 의해 구해진 형광 강도는 DNA의 농도에 비례하여 증가하고 있으며, 약 1nM의 농도까지는 농도 의존성이 있음을 확인할 수 있다.

<여러 조건의 미스매치 DNA의 반응 특성>

표 1에 나타낸 각 DNA 중 프로브 DNA(PB-1)와 중앙 부분과 말단 부분에 미스매치 염기배열을 가진 미스매치 DNA(MR-2~MR-33)의 hybridization에 따른 형광 이미지를 1μM의 농도로 측정하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 것처럼, 에바네센트파 형광 현미경에 의해 구해진 매치 및 각 미스매치 DNA의 형광 이미지는 확실한 차이를 보이고 있다. 따라서 본 발명에 사용된 에바네센트파 형광 현미경을 사용하여 매치 및 각 미스매치 DNA의 hybridization에 따른 형광 강도를 비교함으로서 미스매치 염기배열의 위치 및 개수가 DNA hybridization에 어떤 영향을 미치는지를 관측할 수 있다.

한편, 프로브 DNA와 매치 및 각 미스매치 DNA의 hybridization을 실시간으로 측정한 결과를 도 9a에 나타내었고, 프로브 DNA와 매치 및 각 미스테리 DNA의 농도에 따른 형광 강도를 도 9b에 나타내었다.

도 9a의 결과를 비교해보면 매치 DNA가 각 미스매치 DNA에 비해 가장 형광 강도의 변화값 FI가 크며, DNA hybridization 가장 일어나기 쉽다는 것을 알 수 있다. 이와 반대로, 12mer의 미스매치 DNA 염기배열을 가지고 있는 MR-1의 경우에는 형광 강도의 변화값 FI가 가장 작으며, DNA hybridization이 가장 일어나기 어렵다는 것을 의미한다.

미스매치 DNA 중 MR-2와 MR-3를 이용하여 미스매치 염기배열의 위치에 대한 형광 강도의 변화값 FI를 비교해 보면, 미스매치 염기배열이 말단부 위치하는 경우가 더 변화값이 크다. 역으로 해석하면, 미스매치 염기배열이 중앙부에 위치할수록 DNA hybridization이 어렵다는 것을 알 수 있다.

다음, 미스매치 DNA 중 MR-2와 MR-22 혹은 MR-3과 MR-33을 이용하여 미스매치 염기배열의 개수에 대한 형광 강도의 변화값 FI를 비교해 보면, 미스매치 염기배열의 개수가 적을수록 더 변화값이 크며, 미스매치 염기배열의 개수가 많을수록 DNA hybridization이 어렵다는 것을 알 수 있다.

또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 에바네센트파 형광 현미경에 의해 구해진 형광 강도는 농도에 비례하여 거의 선형적으로 증가하고 있으며, 각 미스매치 DNA의 경우에도 매치 DNA와 같이 약 1nM의 농도까지는 농도 의존성이 있음을 확인할 수 있다.

이상에서 살펴본 봐와 같이, 본 발명의 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법에 의하면 SPR에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 표적DNA에 수식된 형광 물질이 여기되기 때문에 약 1nM의 낮은 DNA 농도에서도 염기배열의 위치 및 개수를 확인할 수 있는 장점이 있다.

Claims

에바네센트파 형광 현미경을 이용하여, 생체재료로부터 유래한 DNA가 칩상에 고정된 DNA칩 자체를 검출하는 방법에 있어서,

Au가 증착되어 있는 담체를 칩상에 고정화하는 단계;

표적 DNA의 말단에 형광 물질을 수식시키는 단계;

표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)에 의해 발생하는 에바네센트파를 이용하여 DNA에 수식된 형광 물질을 여기시키는 단계;

상기 여기된 형광 물질을 에바네센트파 형광 현미경으로 검사하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 형광 물질은 로다민(Rhodamin)인 것을 특징으로 하는 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 DNA는 매치 또는 미스매치 DNA인 것을 특징으로 하는 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 담체(particles)에 생체재료를 고정화하는 방법은

3,3`-dithiodipropionic acid(3,3'-디티오디프로피온산) 수용액에 담체를 담그는 단계;

NHS(엔-하이드록시서시니마이드, N-hydroxy succinimide)와 EDC(에틸디메틸아미노프로필카르보디이미드, 1-Ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)의 혼합액에서 상기 수용액을 카르복실산과 반응시킨 후 건조시키는 단계;

상기 건조된 담체를 아비딘 완충액에 담구어 놓는 단계;

상기 아비딘 완충액의 담체를 에탄올아민 수용액에 담그고 카르복실기를 불활성화시키는 단계;

아비딘을 수식한 담체를 완충액에 비오틴화 프로브 DNA를 용액에 담그는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에바네센트파 형광 현미경을 이용한 DNA칩 검출방법.