KR100973941B1

KR100973941B1 - 소석적려를 이용한 당뇨합병증 치료 및 예방용 조성물과기능성 식품

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Publication number: KR100973941B1
Application number: KR1020080042047A
Authority: KR
Inventors: 김진숙; 장대식; 김영숙; 이윤미; 김주환; 손은진; 김찬식; 김온순; 김정현; 정동호; 김난희; 김종민; 이가영; 이준; 유남희; 유정림
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2008-05-06
Publication date: 2010-08-05
Also published as: KR20090116229A

Abstract

본 발명은 소석적려 추출물의 당뇨합병증 치료 또는 예방 효능에 관한 것으로 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하고, 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈)의 비정상적인 활성을 억제하는 효과가 있다. 또한 ex vivo 실험에서 수정체 혼탁 지연 효과도 나타났다. DPPH 법 스크리닝을 통하여 항산화 효능도 입증되었다. 그러므로 본 발명은 소석적려추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 치료 또는 예방, 항산화 효능, 노화방지 또는 지연용, 항암예방 또는 치료용 약학 조성물 및 기능성 식품을 특징으로 한다.

또한, 상기 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 노르말 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 얻어지는 각각의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 개선용 건강기능식품, 항산화효능, 노화방지 또는 지연용, 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

소석적려, 최종당화산물, 알도즈 리덕테이즈, 당뇨합병증, 항산화

Description

소석적려를 이용한 당뇨합병증 치료 및 예방용 조성물과 기능성 식품{Compositions and functional food for prevention and treatment of diabetic complications using Osteomeles schwerine}

본 발명은 당뇨합병증 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있는 소석적려 추출물과 소석적려 추출물을 이용한 계통분획물(헥산층, 에칠아세테이층, 부탄올층, 물층)에 관한 것이다.

당뇨병은 전 세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로서, 최근 우리나라에서도 급속한 경제 성장과 더불어 당뇨병 유병률이 7 ~ 8％에 달하며, 특히 합병증이 유발되기까지 전반적으로 수명이 길어짐에 따라 당뇨병 환자들은 합병증의 고통을 피할 수 없게 되었다. 일반적으로 당뇨병에 걸린 후 10 ~ 20년이 지나면 체내 거의 모든 기관이 손상을 받아 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 등으로 나타난다. 만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 치료 및 말기 신부전의 가장 중요한 원인이 되고 있으며, 당뇨성 백내장은 실명을 초래하고 결국엔 죽음에 이른다.

이러한 당뇨합병증을 유발하는 기전으로는 크게 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of proein), 폴리올 경로(polyol pathway) 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 등으로 설명되고 있다.

단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein)이란, 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없이 축합반응 즉 밀리아드 반응에 의한 것으로, 이 반응의 결과로 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)이 생성된다. 단백질의 비효소적 당화반응은 (1)단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당의 알데히드 또는 케톤이 효소 작용 없이 친핵성 첨가 반응을 하여 초기 단계 산물인 쉬프염기(schiff base)를 형성하고, 상기 쉬프염기와 인접한 케토아민 어닥트(ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적인 아마도리형의 조기당화산물이 생성되는 단계와 (2)고혈당 상태가 지속되어 가역적인 아마도리(Amadori)형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열(rearrangement)되어 단백질과 교차결합(cross-linking)하여 비가역적인 최종당화산물이 생성되는 단계로 나눌 수 있다.

가역적인 아마도리형의 조기당화산물과 달리 최종당화산물은 비가역적인 반응 산물이므로, 일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 조직 곳곳에서 합병증을 유발시킨다(Vinson, J. A. et al., 1996, J. Nutritinal Biochemistry 7: 559-663; Smith, P. R. et al., 1992, Eur . J. Biochem., 210: 729-739).

예를 들면, 포도당과 여러 종류의 단백질이 반응하여 생성된 최종당화산물 중 하나인 당화 알부민은 만성 당뇨성 신증을 일으키는 중요한 요인으로 작용한다. 당화 알부민은 당화가 진행되지 않은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고, 고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외 기질(extracellular matrix)합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외 기질로 인하여 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게 되어 혈액투석 또는 장기이식 등의 극단적인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 되는 것이다. 또한, 만성 당뇨로 인하여 동맥벽에서는 콜라겐이, 신사구체에서는 기저막성 단백질이 최종당화산물과 결합되어 조직에 축적됨이 보고된바 있다(Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632).

이처럼 비효소적 단백질 당화반응에 의하여 기저막, 혈장 알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등의 단백질에서 당화가 일어나며, 생성된 최종당화산물이 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 등의 만성 당뇨합병증을 유발시킨다.

또한, 고혈당 상태에서 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고된바 있다(Yokozawa, T., et al, 2001, J. of Trad . Med., 18: 107-112). 이처럼 비효소적 당화반응과 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전이 서로 연관되어 있다.

폴리올 경로란 (1)알도스나 케토스로부터 알도스 환원효소(AR)작용에 의해 환원되어 솔비톨을 형성하는 단계 및 (2)솔비톨이 솔비톨 탈수소효소에 의해 산화되어 과당을 생성하는 단계로 이루어지는 과정이다. 고혈당에 의하여 폴리올 경로가 활성화되고, 이로 인해 솔비톨과 과당이 과도하게 생성되고 조직에 축적되어 삼투압이 증가된다. 증가된 삼투압으로 인하여 수분이 인입되어 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 등으로 진행된다(당뇨병학, 김응진 외, 대한 당뇨병학회, 고려의학, 483쪽; Soulis-Liparota, T., et al., 1995, Diabetologia, 38: 357-394).

최종당화산물이 사람의 미세혈관 내피세포에서 폴리올 경로의 주효소인 알도스 환원효소(AR)를 활성화시키는 것이 보고된바 있다(Nakamura, N., et al., 2000, Free Radic Biol . Med., 29: 17-25). 정상상태에서는 알도스 환원효소가 포도당에 대하여 친화력이 매우 낮지만, 고농도의 포도당에서는 알도스 환원효소가 활성화되어 과도하게 포도당을 솔비톨로 환원시키고, 이 솔비톨이 솔비톨 탈수소효소에 의해 과당으로 전환된다. 이 과당은 포도당에 비하여 단백질의 비효소적 당화반응의 속도가 약 10배 정도 빠르다. 따라서 고농도의 과당이 단백질과 결합하여 결국은 최종당화산물의 형성을 가속화시킨다.

이와 같이 비효소적 당화반응, 폴리올 경로 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전들이 서로 연관되어 당뇨합병증을 유발시킨다. 따라서, 당뇨합병증의 발병을 지연하거나 예방 또는 치료하기 위해서는 최종당화산물의 형성을 억제하는 것이 매우 중요함이 밝혀졌다(Brownlee, M., et al., 1988, N. Engl . Med ., 318, 1315-1321).

현재, 단백질 당화 억제제로 합성제제인 아미노구아니딘(aminoguanidine)은 친핵성 히드라진(hydrazine)으로 아마도리 산물과 결합하여 단백질과의 교차결합을 방지함으로써 최종당화산물의 생성을 억제하여 합병증으로 진전되는 것을 지연 또는 방지한다(Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632; Edelstein, D. et al., 1992, Diabetes, 41, 26-29). 아미노구아니딘은 당뇨합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 합성 의약품으로 제 3상 임상실험까지 진행되었으나, 장기간 투여 시 독성이 유발되는 문제점이 나타나 중단되었다. 그래서, 안전하고 효능이 우수한 천연약제의 개발이 요망되고 있는 실정이다.

이에 본 출원인은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 당뇨합병증의 원인, 처방 및 치료법 등에 대한 계속적인 연구를 하였으며, 본 발명은 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 억제하고 알도즈 리덕테이즈의 비정상적으로 과도한 효과를 억제하고 ex vivo 실험에서 쥐의 수정체의 혼탁을 지연 효능이 있는 소석적려 추출물과 이로부터 계통분리하여 얻은 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 층을 제공하여 당뇨합병증의 예방, 지연, 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 소석적려 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 및 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물과 기능성 식품을 제공하는 것이다. 또한, 상기 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 노르말 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 얻어지는 각각의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 개선용 건강기능식품, 항산화, 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명은 소석적려의 소지(小枝)와 잎 추출물과 종자추출물들은 건조된 소석적려의 소지와 잎, 및 종자를 세절하여 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 소석적려의 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 분획되는 소석적려 추출물의 헥산층 분획물, 에칠아세테이트층 분획물, 부탄올층 분획물, 물층 분획물을 특징을 한다.

또한, 본 발명은 상기의 성분들을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 개선용 건강기능식품, 항산화, 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물 및 건강기능식품인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 소석적려 추출물과 계통분획(헥산층, 에칠아세테이층, 부탄올층, 물층)들이 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하고, 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈) 비정상적인 활성을 억제하는 효과가 있다.

이에 따라, 본 발명에 따른 소석적려 추출물과 계통분획(헥산층, 에칠아세테이층, 부탄올층, 물층)이 당뇨합병증 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.

DPPH법에 이용하여 항산화 효능이 입증되었으며, 또한, 최종당화산물의 생성을 억제하고 알도즈 리덕테이즈 활성을 억제하는 경우 산화적 스트레스의 유발 비율이 줄어들어, 산화적 스트레스에 의한 노화의 방지, 지연용 및 항산화 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.

그리고, 최종당화산물이 발암(carcinogenesis)을 유발함이 이미 보고되었는 바 최종당화산물의 생성을 억제하여 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.

본 발명은 소석적녀를 세절하여 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적녀 추출물과 상기 소석적려의 추출물을 각각 계통분리하여 계통분획 층인 헥산층, 에칠아세테이트 층, 부탄올 층과 물 층의 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 개선용 건강기능식품, 항산화, 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

소석적려(Osteomeles schwerine)은 장미과에 속한 낙엽반상록 관목이며, 크기는 1~3 m, 소지는 얇고 약하며 약간 굽어있으며, 홍갈색 또는 자갈색이다. 어린가지는 회백색 털이 빽빽이 나 있으며 후에 점점 떨어진다. 다년생 가지는 흑갈색이다. 그 약성은 미삽(

)하고 평(平)하며 淸熱解毒(청열해독), 收斂止瀉(수렴지사), 祛風除濕(거풍제습). 主治瘡瘍腫毒(주치창양종독), 咽喉腫痛(인후종통), 자시(

), 痢疾(이질), 泄瀉(설사), 腸風下血(장풍하혈), 陰挺(음정),

(풍습비통) 의 주치를 나타낸다.(중화본초, 상해과학기술출판사, Vol. 4, 2677).

소석적려의 구성성분과 생리활성 연구는 지금까지 보고된 바가 없다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

Ⅰ. 소석적려의 추출물 제조방법

실험에 사용된 소석적려[Osteomeles schwerinae; Rosaceae]은 중국 곤명으로부터 공급되었으며, 증거표본(no. KIOM-DiAB.141)은 한국한의학연구원 한약제제연구부의 식물표본실에 보관중이다.

1. 추출단계

소석적려의 소지와 잎, 및 종자를 음건·세절한 후 에탄올에 넣고, 추출용기에서 상온상태로 2~5회 추출한 후, 40℃에서 감압 하에 농축시켜 에탄올 추출물을 얻었다.

본 발명에서는 소석적려의 추출물을 얻기 위해 상기의 에탄올을 포함하여 알콜 및 알콜수용액을 모두 사용할 수 있다.

2. 농축단계

상기 추출액을 여과한 후 감압 상태에서 농축한다. 이때, 구성성분의 분해 및 가수분해를 방지할 수 있도록 농축 시 온도를 40~45℃ 이하로 유지한다.

3. 소석적려 추출액 계통분리 단계

상기의 제조방법으로 제조된 소석적려의 소지와 잎, 추출물을 도 1에 도시된 바와 같이 노르말 헥산 층, 에칠아세테이트 층, 노르말 부탄올 층, 물 층으로 계통분리를 하여 각각의 추출물의 노르말 헥산 층, 에칠아세테이트 층, 노르말 부탄올 층, 물 층의 분획물을 획득하였다.

II. 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험

1. 시험관 내에서 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험

소석적려의 소지와 잎 추출물과 그 추출물의 헥산층, 에칠아세테이트 층, 부탄올 층 및 물 층의 각각 분획물과 종자 추출물들을 시험관내에서 최종당화산물 생성 억제 효능분석하였다.

[실험예]

단백질원(原)으로 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA라고 한다: 미국 시그마 제품)을 택하였다. BSA을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 50 mM 인산 완충 용액(phosphate buffer; pH 7.4)에 가하여 제조하였다. 당원(原)으로는 0.2 M 과당과 0.2 M 글루코스가 혼합된 액을 사용하였다. 제조된 BSA 용액에 과당과 글루코스 혼합액을 가하였다. 소석적려 소지와 잎 추출물은 5㎍/㎖, 10㎍/㎖ 25㎍/㎖ 농도로 조제하였고, 헥산층은 10㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 에칠아세테이트층은 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 25㎍/㎖ 부탄올층과 물층은 2.5㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖ 농도로 조제하였다. 소석적려 종자 추출물의 경우에는 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 25㎍/㎖의 농도로 각각 조제하였다. (모든 화합물을 DMSO에 녹인 후 15% tween 80를 가한다. 이때 총 DMSO의 함량은 0.2%), 이를 상기 BSA 와 당의 혼합액에 첨가하고 37℃에서 14일, 28일간 배양하였다.

이때 0.02% 소디움아자이드(sodium azide)와 안티마이코틱스 (antimycotics)를 항 박테리아제 및 항진균제로서 첨가하였다. 대조군은 BSA와 당 혼합액을 배양한 것이며, 시험군과 대조군의 공시험군(blank)은 각각 조제한 후 배양하지 않은 것이다. 한편 효능의 우수함을 비교할 수 있는 지표인 양성 대조군으로서 아미노구아니딘을 사용하였다. 모든 배양액은 4 개씩 준비하여 최대한 오차를 피하였다. 7일, 14일 후 각각의 배양액에서 생성된 최종당화산물의 함량을 분석하여 그 결과를 나타내었다. 최종당화산물은 형광, 갈색을 띠고 있으며 교차결합을 할 수 있는 물리화학적인 특성을 지니고 있을 뿐 아니라 세포막 수용체가 인지할 수 있는 배위자를 지니고 있다. 이러한 특성을 지닌 최종당화산물의 양을 Microplate reader(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하여 그 생성 억제 정도를 분석하였다(Vinson, J.A. et al., J. Nutr . Biochem ., 7: 659-663, 1996).

생성억제율은 하기의 식으로 계산된다.

생성억제율(%)= 100-(시료군의 형광강도-시료 공시험군의 형광강도)/(대조군의 형광강도-대조군 공시험군의 형광강도)×100

-. 양성대조군 : 아미노구아니딘의 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험

아미노구아니딘을 증류수에 용해하여 상기에 기재한 방법으로 37℃에서 37 ㎍/㎖, 55.5 ㎍/㎖, 74 ㎍/㎖의 농도로 14일 동안, 18.5 ㎍/㎖, 37.0 ㎍/㎖, 92.5 ㎍/㎖의 농도로 28일 동안 각각 배양하였다. 14일, 28일 후 각각 배양액에서 생성된 최종당화산물의 양을 Microplate reader (Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하였다.

2. ELISA 법을 이용한 AGEs-BSA 함량 분석

최종당화산물 생성 억제 효능이 우수하였으므로, AGEs 특이 항체를 이용한 면역학적 아래와 같이 정량법인 ELISA법으로 그 효능을 재확인 하였다.

[실험예]

AGEs-ELISA는 Engvall법으로 수행하였다 (Engvall, E.,et al., J mmunochem., 1971, 8:871-874). 96 well plate에 시료를 코팅완충액 (50 mM carbonate buffer, pH 9.6)과 1:2 비율로 혼합하여 최종용량이 100 ㎕가 되도록 한 후, 37 ℃에서 2시간 방치한다. 0.05 % PBST로 세 번 세척한 후 1 % BSA/PBS로 blocking한다. 1시간 방치한 후 0.05 % PBST로 세 번 세척한다. AGE antibody (6D12, TransGenic Inc., Kobe, Japan)를 1:1000으로 희석한 후 well 당 100 ㎕ 씩 로딩 후 상온에서 1시간 방치한다. 0.05 % PBST로 세 번 세척 후 HRP-conjugate 2nd antibody (Santa Cruz, USA)를 1:1000으로 희석한 후 100 ㎕를 로딩하여 1시간 방치한다. 0.05 % PBST로 세 번 세척 후 100 ㎕의 기질 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TMB)을 첨가한다. 5 분 방치 후 반응 정지 용액 (1M H2SO4)을 100 ㎕ 첨가 후 ELISA reader로 흡광도를 측정한다.

3. 최종당화산물 (Advanced glycation end products: AGEs)의 교차결합(Cross-link) Inhibition 또는 breaking 효능 검정

최종당화산물 생성 억제 효능이 생성되기 전 억제하는 것인지 또는 이미 생성된 최종당화산물을 break 하는 것인지, 또는 두가지 효능을 다 보유하는지를 확인하였다.

[실험예]

① AGEs Cross-link의 inhibition 효능평가를 위한 in vitro assay

1.0 ㎍ AGE-BSA (MBL international, Woburn, MA)와 다양한 농도의 샘플 약물 및 AGEs cross-linking inhibitor로 알려진 약물인 aminoguanifine의 mixture를 준비한 후 collagen-coated 96 well microtitre plate에 분주한 후 37 ℃에서 4시간 동안 incubation한다. 0.05 % Tween in PBS에 3번 washing하여 unattached AGE-BSA를 제거하고, rabbit polyclonal anti-AGE-BSA antibody를 1:250으로 희석하여 각 well 분주한 후 37 ℃에서 1시간 배양한다. 1시간 후 0.05 % Tween in PBS로 3번 수세하고, horseradish peroxidase-linked goat anti-rabbit antibody를 적용한 후 TMB를 substrate로 하여 발색한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정한다. AGE-BSA의 Cross-linking %는 아래의 수식으로 계산한다.

AGE-BSA (%)=(약물을 첨가한 well의 흡광도/약물을 첨가하지 않은 well의 흡광도)× 100

② AGEs Cross-link의 breaking 효능평가를 위한 in vitro assay

1.0 ㎍ AGE-BSA를 collagen-coated 96 well microtitre plate에 분주한 후 37 ℃에서 4시간 동안 배양한다. 0.05 % Tween in PBS에 3번 수세하여 unattached AGE-BSA를 제거한 후, 샘플 약물 및 AGEs cross-linking breaker로 알려진 약물인 ALT-711 (4,5-dimethyl-3-(2-oxo-2-phenylethyl)-thiazolium chloride; Alteon Inc., Ramsey, NJ) 을 1000 ㎍/㎖부터 2배식 연속 희석하여 1 ㎍/㎖까지 준비한 후 각 well에 triplicate하여 분주하고 37 ℃에서 4시간 동안 배양한다. 이후 각 well을 0.05 % Tween in PBS로 3번 washing하고, collagen과 cross-link되어 남아있는 AGE-BSA를 검출하기 위하여 rabbit polyclonal anti-AGE-BSA antibody (MBL international, Woburn, MA)를 1:250으로 희석하여 각 well 분주한 후 37 ℃에서 1시간 배양한다. 1시간 후 0.05 % Tween in PBS로 3번 수세하고, horseradish peroxidase-linked goat anti-rabbit antibody (Sigma, USA)를 적용한 후 TMB (3.3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 substrate로 하여 발색한 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정한다. AGE-BSA의 breaking %는 위와 같이 동일한 방법으로 계산한다.

III. 본 발명의 알도즈 환원효소 ( 알도즈 리덕테이즈 )활성 억제 효능분석

소석적려의 소지와 잎 추출물과 추출물의 헥산층, 에칠아세테이트 층, 부탄올 층 및 물 층의 각각 분획물의 시험관내에서 알도즈 환원 효소(알도즈 리덕테이즈) 활성 억제 효능분석하였다.

[실험예 1]

Dufrane (1984) 방법으로 SD 랫트(Sprague-Dawley rat, 250-280g)의 안구로부터 천연상태의 aldose reductase를 얻기 위하여, 135 mM Na, K-phosphate buffer (pH 7.0)와 10 mM 2-mercaptoethanol을 적출한 렌즈와 함께 균질기(Homogenizer)와 Sonicater를 이용해 분쇄하였다. 14000 rpm에서 30분간 원심 분리한 다음 상층액을 0.2 ㎛의 filter에 여과 후 실험에 사용하였다. 위 과정은 모두 4℃에서 수행하였다. 효소(Enzyme)의 단백질원(原)으로 BSA을 이용하여 라우리(lowry) 방법으로 정량하였다. 135 mM Na, K-phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM Lithium sulfate, 0.03 mM NADPH, 0.04 mM DL-glycealdehyde 와 100 ㎍/ml enzyme의 mixture를 0.1% DMSO에 녹인 후 각 농도로 희석한 sample 50 ㎕에 첨가하여 total volume이 1 ml 되도록 한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이때 BLK는 0.04 mM DL-glycealdehyde를 첨가하지 않은 mixture를, STD는 135 mM Na, K-phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM Lithium sulfate에 50 ㎕ NADP (0.2-5 μM)를 첨가한 것을 사용하였다. Sample 0.3 ㎖의 0.5 N HCl을 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤, 10 mM imidazole이 첨가된 6 M NaOH 1 ㎖을 가하여 60℃에서 10분간 반응시켜 NADP가 fluorescent product로 전환되는 정도를 측정하였다. sample은 triplicate로 수행하였다. 효능 정도는 Spectrofluorophotometric detector (Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 Ex. 360 nm, Em. 460 nm에서 측정하여, IC50 로 나타내었다.

소석적려 소지와 잎 추출물의 경우는 은 1㎍/㎖, 2.5㎍/㎖ 5㎍/㎖ 농도로 조제하였고, 헥산층은 2.5㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖의 농도로, 에칠아세테이트층은 0.25㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 1㎍/㎖의 농도로, 부탄올층은 2.5㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖의 농도로, 물층은 20㎍/㎖, 30㎍/㎖, 40㎍/㎖의 농도로 각각 조제하였다.

[실험예 2] 3,3-테트라 메칠렌 글루타릭산의 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈) 활성 억제효능

비교대조군으로 우수한 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈) 활성억제제 중의 하나인 3,3-테트라 메칠렌 글루타릭산을 3.72㎍/㎖, 4.66㎍/㎖, 5.59㎍/㎖의 농도로 조제한 후 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈) 활성 억제효능을 측정하였다.

IV . Ex vivo 에서의 항백내장 효능

소석적려의 소지와 잎 추출물의 Ex vivo에서 항백내장 효능을 분석하였다.

[실험예]

(1) 시료 조제

한약재의 Stock solution이 1000× 가 되도록 DMSO(Sigma, USA)에 녹인 후, 0.22 ㎛ syring filter(Millipore, USA)로 여과하였다. 양성대조군으로는 Epalrestat를 사용하여 비교하였다.

(2) 수정체 organ culture

생후 4주된 체중 200 g 내외의 흰쥐(Sprague-Dawley)를 사용하였으며, 경추 파열로 동물을 희생시킨 뒤 안구를 적출하고, PBS(Welgen, USA) 1 ㎖ 가 들어있는 1.5 ㎖ 튜브에 담가놓는다. 안구에서 수정체를 분리하기 위해 후방(posterior approach)에서 조심스레 꺼내 홍채와 모양소대를 제거하였고 외과적 손상 (surgical damage)이 없는 온전한 수정체들을 골라 실험에 사용하였다(Spector et al., Exp . Eye Research , 1993, 57, 656~667). 배양은 24 well plate(Nagel Nunc, Denmark)에 수정체를 5 ㎎/L Gentamycine(Gibco, USA)과 0.5 ㎎/L Fungizione(Gibco, USA)이 첨가된 1 ㎖ medium 199(Gibco, USA)에 옮겨 담은 후 5 % CO2, 95 % air atmosphere와 37 ℃를 유지하면서 한약재를 처리하고 4일 동안 배양하였다(Bradford, M., Analytical Biochemistry , 1976, 72, 248~254).

Sugar cataract는 20 mM xylose(Aldrich, USA)를 첨가하여 유도하였고, positive control은 1 ㎍/㎖ 또는 3 uM epalrestat로 처리하여 배양하였다(Obazawa H.,etal., Invest. Opthalmol , 1974, 13, 204).

(3) 수정체 혼탁도 측정

배양된 수정체는 4일 동안 CCD carmera가 연결된 광학 현미경으로 관찰하였다(Chand et al., Exp . Eye Research , 1982, 35, 491~497). 수정체 혼탁도는 Scion image analyzer (Scion Corporation, USA)로 측정하였고 측정수치는 pixel 당 arbitrary units (AU)로 표현하였다.

V. 항산화 효능

소석적려의 소지와 잎 추출물과 그 추출물의 헥산층, 에칠아세테이트 층, 부탄올 층 및 물 층의 각각 분획물의 시험관내에서 항산화 효능을 분석하였다.

DPPH법에 의해 시료의 free radical 소거능을 측정하였다(Brand-Williams W, et al., Technology, 1995, 28, 25-30). 에탄올에 시료를 용해시킨 후 각 농도로 희석한 시료 20 ㎕를 96well plate에 분주하고, 에탄올에 용해시킨 100mM DPPH용액을 180 ㎕씩 첨가하여 최종 반응용액이 200 ㎕가 되도록 하였다. 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 조사하였다. Free radical 소거활성은 DPPH의 50%를 환원시키는데 필요한 시료의 양(㎍/㎖)을 RC50으로 나타냈으며, positive control로는 Vit. C, Vit. E, butylated hydroxytoluene (BHT)를 사용하였다.

V. 실험 결과

1. 소석적려 추출물

음건·세절한 소석적려 120g을 에탄올 1ℓ에 넣고, 상온에서 3회 추출한 후, 40℃에서 감압 하에 농축시켜 에탄올 추출물 12g을 얻었다.

상기의 방법으로 추출된 잎 추출물을 도 1에 도시된 바와 같이 노르말 헥산(1.28g), 에칠아세테이트(3.75g), 노르말 부탄올(4.10g), 물(2.87g)층으로 계통분리한 후, 각각의 층들의 분획물을 얻었다.

2. 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험

2-1. 시험관 내에서 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험

본 발명에 따라 소석적려 소지와 잎 추출물과 그 분획물 및 종자 추출물을 상기 실험예를 따라 실험하여 시험관 내에서 최종당화산물 생성 억제 효능을 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

표 1과 같이 본 발명에 따라 소석적려 소지와 잎과 종자 추출물의 최종당화산물 생성억제효능은 각각 IC50값이 16.34 ㎍/㎖(소지와 잎의 경우; 14일), 17.64 ㎍/㎖(소지와 잎의 경우; 28일)이며, 13.93 ㎍/㎖(종자의 경우; 14일), 20.20 ㎍/㎖(종자의 경우; 28일)로 이는 양성대조물질인 아미노구아니딘(IC50 값: 71.13 ㎍/㎖, 91.30 ㎍/㎖)보다 각각 4배, 5배 정도 우수하다.

소석적려 소지와 잎 추출물의 분획층 경우는 부탄올층, 물층, 에칠아세테이트층, 헥산층 순으로 효능이 우수하였으며, 양성대조군과 비교하였을 경우 모든 분획층이 우수하다.

2-2. ELISA 법을 이용한 AGEs-BSA 함량 분석

① 도 2는 28일 배양한 소석적려 소지와 잎 추출물의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량 분석으로 소지와 잎 추출물의 경우 25, 50 ㎍/㎖에서 유의성 있는 AGEs 생성 억제효과를 보였다 (### p<0.001 vs. control).

도 3은 28일 배양한 소석적려 소지와 잎 추출물의 헥산층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량 분석으로 헥산층의 경우 AGEs 생성 억제효과를 보이지 않았다. 표1에 나타난 것과 같이 IC50값이 50 ㎍/㎖인 것과 일치함을 알 수 있다

도 4는 28일 배양한 소석적려 소지와 잎 추출물의 에칠아세테이트층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석으로 에칠아세테이트층의 경우, 각각 50 ㎍/㎖에서 유의성 있는 AGEs 생성 억제효과를 보였다

도 5는 28일 배양한 소석적려 소지와 잎 추출물의 부탄올층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석으로 부탄올층의 경우, 1.25, 2.5, 5.0, 10, 25, 50 ㎍/㎖ 전 농도에서 유의성 있는 AGEs 생성 억제효과를 보였다.

도 6은 28일 배양한 소석적려 소지와 잎 추출물의 물층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석으로 물 층의 경우, 각각 25, 50 ㎍/㎖에서 유의성 있는 AGEs 생성 억제효과를 보였다

② 도 7은 28일 배양한 소석적려 종자 추출물의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석으로 25, 50 ㎍/㎖에서 유의성 있는 AGEs 생성 억제효과를 보였다.

도 7에서 알 수 있듯이 ELISA를 이용한 AGEs-BSA 함량을 분석과 시험관 내 최종당화산물 생성억제 경향은 서로 일치하였다.

2-3. 최종당화산물 (Advanced glycation end products: AGEs)의 교차결합(Cross-link) Inhibition 또는 breaking 효능 검정

28일 배양한 소석적려 소지와 잎 추출물과 그 분획층의 Inhibition 또는 breaking 효능 시험결과는 아래와 같다.

도 8은 소석적려 소지와 잎 추출물의 AGE-BSA inhibition 효능이고, 도 9는 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프로 소석적려 소지와 잎 추출물은 Inhibition 효능과 breaking 효능 두가지를 다 보유하고 있으며, 특히 inhibition 효능이 더 우수한 것을 알 수 있다.

도 10은 소석적려 소지와 잎의 헥산층의 AGE-BSA inhibition 효능이고, 도 11은 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프로 Inhibition 효능과 breaking 효능 두 가지를 다 보유하고 있으며, 특히 inhibition 효능이 더 우수한 것을 알 수 있다.

도 12는 소석적려 소지와 잎의 에칠아세테이트층의 AGE-BSA inhibition 효능이고, 도 13은 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프로 소석적려 소지와 잎의 에칠아세테이트층은 Breaking 효능은 없으나 inhibition 효능이 우수한 것을 알 수 있다.

도 14는 소석적려 소지와 잎의 부탄올층의 AGE-BSA inhibition 효능이고, 도 15는 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프로 소석적려 소지와 잎의 부탄올층은 inhibition 효능과 breaking 효능, 두 가지 효능을 보유하는 것을 알 수 있다.

도 16은 소석적려 소지와 잎의 물층의 AGE-BSA inhibition 효능이고, 도 17은 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프로 소석적려 소지와 잎의 물층은 Inhibition 효능과 breaking 효능, 두 가지 효능을 보유하는 것을 알 수 있다.

3. 알도즈 환원효소( 알도즈 리덕테이즈 ) 활성 억제 효능

본 발명에 따라 소석적려 소지와 잎 추출물을 상기 실험예를 따라 실험하여 시험관 내에서 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈) 활성 억제 효능을 측정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2와 같이 본 발명에 따라 소석적려 소지와 잎 추출물의 알도즈 환원효소(알도즈 리덕테이즈) 활성억제효능은 각각 IC₅₀값이 3.20 ㎍/㎖이며, 이는 양성대조물질인 3,3-테트라메칠렌글루타릭산(IC₅₀값: 4.50㎍/㎖)보다 우수하다. 분획층의 경우는 에칠아세테이트층(IC₅₀값: 0.95㎍/㎖) 양성대조군보다 5배 우수하다.

따라서 본 발명에 따른 소석적려 추출물과 모든 분획층들이 합성품에 비하여 효능이 우수함을 증명되었으며, 새로운 당뇨합병증 및 관련 질병 치료제로서의 개발 가능성이 매우 크다고 판단된다.

4. Ex vivo 에서의 항백내장 효능

본 발명에 따른 소석적려 소지와 잎 추출물과 그 분획물(헥산층, 에칠아세테이트층, 부탄올층 및 물층)들을 상기 실험 예를 따라 실험하여 ex vivo에서 항백내장 효능을 측정하였으며, 그 결과는 추출물의 경우는 도 18과 도 19이며, 분획물들의 경우는 도 20과 도 21이다.

도 18은 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물의 항백내장 효능을 나타낸 사진이며, 도 19는 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물의 항백내장 효능분석을 나타낸 그래프로 소석적려 소지와 잎 추출물 10㎍/㎖ 투여군이 백내장 유도 2일째와 3일째 xylose로 백내장을 유도한 군에 비하여 각각 유의성 있게 백내장 유발을 억제하였다(** p<0.01, *** p<0.001 vs. xylose로 백내장 유발군).

도 20은 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물 분획층들의 항백내장 효능을 나타낸 사진이며, 도 21은 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물 분획층들의 항백내장 효능분석을 나타낸 그래프로 5㎍/㎖씩 투여한 소석적려 소지와 잎 추출물의 모든 분획층들이 백내장 유도 2일째와 3일째 xylose로 백내장을 유도한 군에 비하여 각각 유의성 있게 백내장 유발을 억제하였다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs. xylose 백내장 유발군).

5. 항산화 효능

본 발명에 따라 소석적려 소지와 잎 추출물을 상기 실험예를 따라 실험하여 in vitro에서 항산화 효능을 측정하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.

Sample	RC₅₀ (㎍/㎖)
소석적려 에탄올 추출물	8.46 ± 1.47
Hex 층	41.88 ± 11.61
EA 층	7.54 ± 1.55
BuOH 층	11.98 ± 5.46
Water 층	15.68 ± 8.89
Vit.C (positive control)	4.04 ± 0.19
BHT (positive control)	26.75 ± 10.75
Vit.E (positive control)	10.53 ± 2.47

표 3에 나타난 바와 같이 소석적려 소지와 잎 추출물은

에탄올 추출물과 헥산 분획층을 제외한 모든 분획층의 항산화 효능이 우수하였다.

그리고, 최종당화산물이 발암(carcinogenesis)을 유발함이 이미 보고되었는바(Tokuda, H., et al., 2005. Book of Abstract of 53rd GA Congress joint with SIF, P076), 이로써 본 발명에 따라 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.

따라서 상기 실험예를 통해 본 발명인 소석적려 추출물과 계통분획(헥산층, 에칠아세테이층, 부탄올층, 물층)의 각각의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물 또는 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여 시 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 소석적려 추출물과 계통분획(헥산층, 에칠아세테이층, 부탄올층, 물층)의 각각의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 기능성 식품 또는 노화방지 및 지연용 기능성 식품 또는 항암예방 또는 치료용 기능성 식품에 관한 것으로서, 상기 기능성 식품은 최종 제품의 상품성과 소비자 기호도에 따라 다른 식품소재를 첨가할 수 있다.

도 1은 소석적려의 추출 및 계통분리를 나타낸 도면이다.

도 2는 28일 배양한 소석적려 추출물의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량 분석을 나타낸 그래프이다.

도 3은 28일 배양한 소석적려 추출물의 헥산층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량 분석을 나타낸 그래프이다.

도 4는 28일 배양한 소석적려 추출물의 에칠아세테이트층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석을 나타낸 그래프이다.

도 5는 28일 배양한 소석적려 추출물의 부탄올층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석을 나타낸 그래프이다.

도 6은 28일 배양한 소석적려 추출물의 물층의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석을 나타낸 그래프이다.

도 7은 28일 배양한 소석적려 종자 추출물의 ELISA를 이용한 AGE-BSA 함량분석을 나타낸 그래프이다.

도 8은 소석적려 추출물의 AGE-BSA inhibition 효능을 나타낸 그래프이다.

도 9는 소석적려 추출물의 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프이다.

도 10은 소석적려 추출물 헥산층의 AGE-BSA inhibition 효능을 나타낸 그래프이다.

도 11은 소석적려 추출물 헥산층의 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프이다.

도 12는 소석적려 추출물 에칠아세테이트층의 AGE-BSA inhibition 효능을 나타낸 그래프이다.

도 13은 소석적려 추출물 에칠아세테이트층의 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프이다.

도 14는 소석적려 추출물 부탄올층의 AGE-BSA inhibition 효능을 나타낸 그래프이다.

도 15는 소석적려 추출물 부탄올층의 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프이다.

도 16은 소석적려 추출물 물층의 AGE-BSA inhibition 효능을 나타낸 그래프이다.

도 17은 소석적려 추출물 물층의 AGE-BSA breaking 효능을 나타낸 그래프이다.

도 18은 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려의 항백내장 효능을 을 나타낸 사진이다.

도 19는 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물의 항백내장 효능분석을 나타낸 그래프이다.

도 20은 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물 분획층들의 항백내장 효능을 나타낸 사진이다.

도 21은 Ex vivo 쥐의 수정체에서의 소석적려 소지와 잎 추출물 분획층들의 항백내장 효능분석을 나타낸 그래프이다.

Claims

소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 헥산으로 분획되는 소석적려 추출물의 헥산층 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 에칠아세테이트로 분획되는 소석적려 추출물의 에칠아세테이트층 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 부탄올로 분획되는 소석적려 추출물의 부탄올층 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 물로 분획되는 소석적려 추출물의 물층 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 에칠아세테이트로 분획되는 소석적려 추출물의 에칠아세테이트층 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 에칠아세테이트로 분획되는 소석적려 추출물의 에칠아세테이트층 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 에칠아세테이트로 분획되는 소석적려 추출물의 에칠아세테이트층 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 건강기능식품.
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소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 부탄올로 분획되는 소석적려 추출물의 부탄올층 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 및 개선용 건강기능식품.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 부탄올로 분획되는 소석적려 추출물의 부탄올층 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물.
소석적려를 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 후, 추출된 추출액을 여과하고 감압 농축하여 얻어지는 소석적려 추출물을 헥산, 에칠아세테이트, 부탄올, 물 순으로 계통분리하여 부탄올로 분획되는 소석적려 추출물의 부탄올층 분획물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 건강기능식품.