KR100567269B1 - 유근피 추출물을 포함하는 건강 증진용 식품 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유근피 추출물을 포함하는 건강 증진용 식품에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 건강 증진용 식품은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성 불균형을 효과적으로 회복시키므로 이와 관련된 질환을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유근피 추출물을 포함하는 건강 증진용 식품 {HEALTH IMPROVING FOOD CONTAINING AN EXTRACT OF THE ROOT BARK OF ULMUS DAVIDIANA VAR}
도 1은 유근피 추출물이 과산화수소(H2O2)에 의해 발생되는 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제를 회복하는 효능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 FOX2 측정법에 따라 유근피 추출물 및 분획물을 H2O2와 반응시킨 후 H2O2의 양의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 유근피, 즉 느릅나무(Ulmus davidiana var) 뿌리 껍질의 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성을 유지시키기 위한 건강 증진용 식품에 관한 것이다.
갭 결합(Gap Junction)은 인접한 세포간을 연결하는 복합체의 한 형태로서 이웃하는 세포의 내부와 직접적으로 연결시켜 주며, 포유동물에서는 골격근섬유, 몇몇의 신경 및 순환 혈액세포를 제외한 모든 세포에 분포한다(Bennett et al., Neuron, 6: 305-320, 1991).
갭 결합의 통로는 두 개의 코넥손(connexon)이라 불리우는 반통로(hemichannel)로 이루어져 있으며, 코넥손은 코넥신(connexin)이라는 작은 단백질 6개의 집합체로 이루어진다. 이 통로의 지름은 약 1.2-2 nm 정도이고, 이것의 크기는 갭 결합을 형성하는 단백질의 종류에 따라 달라지며, 이것을 통해서 작은 분자 (<2000 Da)나 이온(예: 각종 이온, 물, 당분, 뉴크레오타이드(nucleotide), 아미노산, 지방산, 작은 펩타이드, 약물 및 발암물질) 등이 확산할 수 있다(Loewenstein, Physiol Rev, 61:829-913, 1981). 이러한 갭 결합 통로를 통한 세포간의 물질 흐름을 갭 결합을 통한 세포간 정보전달(Gap Juntional Intercellular Communication, GJIC)이라 부르며, 이것은 ATP를 필요로 하지 않는 수동적 확산에 의해서 이루어진다.
갭 결합의 기능을 종합해 보면, 첫째, 가장 기본적이고도 중요한 기능으로서 세포간의 영양분, 이온, 유동물질의 빠른 평형을 이루게 해주고(Loewenstein, Physiol Rev, 61:829-913, 1981); 둘째, 심근세포, 평활근세포, 뉴론 등의 전기적 흥분세포에서의 전기적 시냅스(synapse)의 역할을 하며(Bennett et al., Neuron, 6:305-320, 1991); 셋째, 환상 뉴클레오타이드(cyclic nucleotide), 칼슘, 이노시톨 포스페이트(inositol phosphate)와 같은 이차 전달물질을 통과시킴으로써 외부 자극에 대한 조직의 반응을 증진시켜 조직의 호르몬에 대한 반응에 관계하며(Loewenstein, Physiol Rev, 61:829-913, 1981); 넷째, 배아단계에서 화학적, 전기 적 신호로써 배아 발생을 조절한다(Kalimi et al., J Cell Biol, 107: 241-225, 1988).
이와 같이, 갭 결합은 조직에서의 항상성과 인접한 세포로의 빠른 2차 전달 물질의 수송으로 세포반응 조절을 촉진한다. 암을 비롯한 수많은 질병들, 예를 들면, 당뇨, 대뇌허혈, 차코-마리-투드 1형(Chacot-Marie-Tooth disease type 1, CMT1)을 포함한 신경계 질환, 정자형성 이상질환, 심혈관계 고혈압을 포함하는 혈관계 질환, 신장 질환, 간질 및 근질환 등이 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 이상으로 생기는 항상성 불균형에 기인한다는 사실이 각종 문헌에 이미 보고된 바 있다(Nalin et al., Cell, 84: 381-388, 1996; Blanc et al., J. Neurochem., 70: 958-870, 1998; Trosko et al., Toxicol. Lett.,102: 71-78, 1998; Upham et al., Carcinogenesis, 18: 37-42, 1997).
우리나라에서 유근피는 전통적으로 약으로 이용되어 왔으며 건강식품의 형태로 다양하게 이용되어 왔다. 유근피는 예로부터 그 성분으로 플라보노이드, 사포닌, 점액질, β-시토스테롤(Sitosterol), 파이토스테롤(Phytosterol), 시그마스테롤(Sigmasterol), 레진(Resin), 패티오일(Fattyoil) 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있고(약초성분: 일월서각), 약효 및 응용에는 임탁(淋濁), 수종, 단독개선(한약 규격: 보건복지부), 기침, 수렴, 항염, 구충, 항균(약초성분: 일월서각), 이뇨, 소종독(消腫毒), 치습(治濕), 자수보제(滋水補劑)(본초학: 육창수) 등의 내용약으로 기재되어 있으며, 민간요법으로 구전된 것은 종기나 종창을 고치는데 효능이 알려져 왔으며, 한방이나 민간에서는 위궤양, 십이지장궤양 등 여러 궤양에도 뛰어난 효과가 있다고 알려져 있다.
본 발명자들은 인체 안전성이 확보된 천연 식품 또는 식물 유래의 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 검색하던 중, 유근피의 추출물이 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성 불균형을 효과적으로 회복시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은 유근피 추출물을 유효성분으로 하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 유근피 추출물을 유효성분으로 하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성을 유지시키기 위한 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 활성 성분으로서 유효량의 유근피 추출물 또는 분획물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 갭 결합(Gap Junction)을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 세포간 정보전달 및 항상성을 유지하기 위한 식품을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 사용되는 유근피 추출물은, 유근피 또는 이의 건조물을 에탄올 추출 또는 고압열탕 추출함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 유근피 또는 이의 건조물을 에탄올 수용액, 바람직하게는 50 ％ 에탄올 수용액으로 80 내지 90℃에서 5시간 동안 추출하거나("에탄올 추출"), 100 내지 110℃의 온도에서 5시간 동안 열탕 추출하는("고압열탕 추출") 추출 공정을 2 내지 3회 반복한 후, 얻어진 추출액을 여과하고 감압 농축한 다음 건조함으로써 유근피 추출물을 얻을 수 있다.
또한, 이들 추출물로부터 흡착 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료 효능이 더욱 증강된 분획물들을 얻을 수 있다. 상기 흡착 칼럼 크로마토그래피는 유근피 추출물을 소수성 충진제, 예를 들어 XAD-4(Sigma, USA) 혹은 HP-20(Mitsbish, Japan)와 같은 스티렌계 다공성 수지가 충진된 컬럼에 흘려보내 흡착시킨 후, 에탄올의 농도를 단계적으로 높인 에탄올 수용액을 용출액으로 사용하여 분획화함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 에탄올의 농도를 20, 40, 60, 80 및 100 ％로 단계적으로 높인 에탄올 수용액을 사용할 수 있으며, 특히 60 ％ 및 80 ％ 에탄올 수용액을 사용한 경우 활성이 증강된 분획물들을 얻을 수 있다.
본 발명의 유근피 추출물 및 분획물은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억 제 및 항상성의 불균형을 효과적으로 회복시킴으로써, 암, 당뇨, 대뇌허혈, 차코-마리-투드 1형을 포함한 신경계 질환, 정자형성 이상질환, 심혈관계 고혈압을 포함하는 혈관계 질환, 신장 질환, 간질 및 근질환 등의 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환들을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 유근피 추출물 및 분획물은 생체내에 존재하는 주요한 질병 원인 물질인 과산화수소(H2O2)에 대한 직접적인 항산화 활성과는 무관하게 H2O2에 의해 발생하는 갭 결합을 통한 세포간 신호 전달의 억제만을 특이적으로 회복시킴으로써 관련 질환의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 유근피 추출물은 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물을 제조할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 유근피 추출물 및 분획물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 1,000 mg/kg 체중, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 유효량의 유근피 추출물을 포함하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성을 유지시키기 위한 건강증진용 식품 또는 음료 조성물을 제공한다. 상기 효과를 나타내기 위하여 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들면 각종 식품류, 육류, 음료, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그밖의 건강보조식품류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유근피 추출물은 식품 제조시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 상기한 건강 증진용 식품 또는 음료를 제조할 수 있으며, 이 경우 최종적으로 제조된 식품 또는 음료 중에 유근피 추출물의 함량은 0.1 내지 80 중량％ 범위이다.
이하에서 유근피 추출물 또는 분획물의 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 또는 치료 효능을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 하기 실시예에서 고체와 고체 혼합물, 액체와 액체, 및 액체와 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 실온에서 수행하였다.
실시예 1: 유근피로부터 갭 결합을 통한 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 및 치료 효능을 갖는 추출물 및 분획물의 제조
<1-1> 열수 추출 및 용매 추출에 의한 유근피 추출물의 제조
건조된 유근피 1 중량부에 80-90 ℃의 50 ％ 에탄올(Duksan, Korea) 또는 100-110 ℃의 더운 물을 약 5-10배 정도 첨가하여 실온에서 교반기를 이용하여 5시간 환류추출하였다. 추출물들을 8,000 rpm으로 4 ℃에서 30분간 원심분리(Vision, Korea)하여 상층액을 얻고, 남은 잔사는 동일한 방법으로 1-2회 반복하여 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물들을 모아 여과지 (Whatmann 41)로 여과시킨 후 냉동 건조하여 유근피 추출물들을 얻었다.
<1-2> 흡착 칼럼 크로마토그래피에 의한 유근피 추출 분획물의 제조
상기 실시예 1-1에서 얻어진 에탄올 추출물로부터 갭 결합을 통한 정보전달 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 및 치료 효능이 증강된 분획물을 제조하기 위하여, 흡착 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획물을 제조하였다. 즉, 소수성 polyaromatic 충진제인 XAD-4(Sigma, USA)나 HP-20(Mitsbish, Japan)가 충진된 유리 컬럼(150mm ×φ6mm)에 추출물을 가하여 흡착시킨 후 20 ％ 에탄올을 흘려서 단백질이나 당과 같은 영양적 성분을 포함하는 분획("분획물 1")을 얻었다. 이어서, 40, 60, 80, 100 ％ 에탄올을 차례로 흘려서 각 용출액에 의한 분획물들을 얻었다. 이 분획들은 각각 분획물 2, 3, 4 및 5로 명명하였다.
하기 실시예들에서는 상기와 같이 얻어진 유근피 추출물 및 분획물들의 세포간 정보전달 억제 및 이와 관련된 질환을 예방 치료하는 효능을 측정하고, 이것이 항산화 활성과는 무관한 세포간 신호 전달에 관여하는 것임을 보이기 위하여 시료 처리에 의한 H2O2 변화량을 측정하였다.
실시예 2: 유근피 추출물 및 분획물의 갭 결합을 통한 정보전달의 불균형을 회복시키는 효능 측정
실시예 1에서 얻은 유근피 추출물 및 분획물의 갭 결합을 통한 세포간 정보전달(gap junctional intercellular communication)의 억제를 회복시키는 효능을 확인하기 위해, 하기와 같이 SL/DT 측정법(Scrape Loding/Dye Transfer assay: Upham, B. L. 등, Carcinogenesis 18:37-42, 1997)을 실시하였다.
WB-F344 세포(입수처: 미국 미시건대학교)를 10 ％ 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 페니실린 7.5 mg/L, 스트렙토마이신 7.5 mg/L, 네오마이신 15 mg/L를 함유하고 페놀 레드가 없는 D-배지를 사용하여 5 ％ CO2, 37℃ 배양기(Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 상기세포를 배양하였다. 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA)사 제품을 사용하였다. 배양된 세포를 2 ml 플라스틱 디쉬에 ml 당 1×105 개로 분주하여 약 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포가 90 ％ 정도 디쉬에 가득 차면 각 디쉬에 배양된 세포를 1 내지 20 ㎍/㎖의 상기 실시예에서 제조된 유근피 추출물 및 분획물을 함유한 배양액 및 500 μM의 H2O2로 처리하였다. 대조군은 배양액으로만 처리한 그룹과 배양액 및 500 μM H2O2로 처리한 그룹의 두 그룹으로 나누었다. 1시간 후 루시퍼 옐로우(lucifer yellow) 염색액을 이용하여 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 정도를 공초점 현미경(BioRad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였다.
그 결과는 하기 표 1 및 도 1에 나타내었으며, 도 1에서 도 1a는 무처리 대조군, 도 1b는 500 μM H2O2 처리군, 도 1c는 20 ㎍/㎖ 유근피 추출물 + 500 μM H2O2 처리군, 도 1d는 5 ㎍/㎖ 유근피 분획 3(60 ％ 에탄올 분획물) + 500 μM H2O2 처리군이다.
표 1에서 유근피 추출물 및 분획물의 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 증가율(％)은 {(시료 처리군의 염색된 세포수 - H2O2 처리군의 염색된 세포수)/(대조군 의 염색된 세포수 - H2O2 처리군의 염색된 세포수)}× 100의 방법으로 계산하였으며, 각각은 모두 3번의 반복 실험을 통해 구한 값의 평균값이다.
Figure 112005033687679-pat00001
표 1 및 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 유근피의 50 ％ 에탄올 추출물은 10 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 H2O2에 의해 억제되는 갭 결합을 통한 세포간 정보전달을 현저히 회복시키는 효과를 나타내었다. 따라서 유근피 추출물이 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환을 예방 및 치료하는 효능을 갖는 것을 알 수 있다. 또한, 표 1 및 도 1에서 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획물들, 특히 분획물 3 및 4는 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 억제를 회복시키는 효능이 더욱 증강된 것을 알 수 있다.
실시예 3: 유근피 추출물 및 분획물 처리 후 H2O2 변화량 측정
유근피 추출물 또는 분획물이 H2O2에 의해 발생되는 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제를 회복시키는 주요한 원인이 항산화 효과가 아닌 세포내 신호 전달에 의한 것임을 확인하기 위하여, 다음과 같이 H2O2 변화량을 측정하는 공지된 방법인 FOX2 측정법(Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., & Wolff, S. P. Analytical Biochemistry 220:403-409, 1994)을 실시하였다. 자일레놀 오렌지(Xylenol orange)와 암모늄 페로스 설페이트(Ammonium ferrous sulfate)를 250 mM H2SO4에 각각 1 mM과 2.5 mM이 되게 가하였다. 이렇게 제조된 시약을 4.4 mM BHT(butylated hydroxyltoluene)를 함유한 HPLC-급의 메탄올과 부피비가 1:9가 되도록 섞어서 작업 시약(working reagent)을 제조하였다. 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 96-웰 마이크로 플레이트에 500 uM의 H2O2를 포함한 시료와 작업 시약을 1:9 부피비로 섞어 넣고 37℃ 배양기(Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 1시간 동안 반응시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기에서 유근피 50 ％ 에탄올 추출물 군과 분획물 3군에서는 500 uM의 H2O2와 함께 시료로서 유근피 50％ 에탄올 추출물 및 분획물 3을 각각 0 내지 200 ㎍/㎖의 농도로 사용하였고, 대조군은 500 uM의 H2O2를 포함한 배양액만을 시료 대신에 사용하였다.
그 결과, 도 2와 같이 500 uM의 H2O2만을 첨가한 대조군의 경우는 H2O2의 양이 변화가 없는 것을 알 수 있다. 또한, H2O2를 제거하는 것으로 잘 알려진 catalase의 경우 500 uM의 H2O2를 농도 의존적으로 줄이는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 각각의 50％ 에탄올 추출물과 분획물 3의 경우 오히려 H2O2의 양이 약간 증가하는 결과를 보였다. 이러한 결과로부터 50％ 에탄올 추출물과 분획물 3이 H2O2에 의해 억제된 GJIC를 회복시키는 것이 H2O2를 제거하는 항산화 효과에 의한 것이 아니라 세포 간 신호전달에 의한 것임을 확인 할 수 있다.
이상의 결과에서, 유근피의 추출물 및 분획물은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 억제 및 항상성의 불균형과 관련된 질환의 예방 및 억제 효과를 가지는 것을 확인하였다. 또한, 유근피 추출물 및 분획물을 처리한 이후에 H2O2의 변화량을 측정함으로써 시료에 의한 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 회복이 시료의 항산화 활성과는 무관하고, 세포간 신호 전달에 관여하는 것임을 확인할 수 있다.
본 발명의 유근피 추출물 및 분획물을 함유하는 건강 증진용 식품은 갭 결합을 통한 세포간 정보전달의 불균형을 회복시킬 수 있다.

Claims (3)

  1. 유근피 또는 유근피 건조물의 에탄올 또는 열수 추출물, 또는 에탄올 추출물로부터 소수성 충진제 및 40 내지 100% 에탄올 수용액을 사용한 흡착 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 분획물을 함유하는, 갭 결합을 통한 세포간 정보전달 및 항상성을 유지시키기 위한 건강 증진용 식품.
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