KR100973682B1

KR100973682B1 - 에모딘을 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용조성물

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Publication number: KR100973682B1
Application number: KR1020080053016A
Authority: KR
Inventors: 남상윤; 윤영원; 이범준; 강혜정; 백인정; 연정민; 이세라; 김미라
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-05
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2010-08-03
Also published as: KR20090126750A

Abstract

본 발명은 항산화적 활성을 통해 알코올에 의한 기형발생으로부터 태아를 효과적으로 보호할 수 있는 에모딘을 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 알코올 처리에 의해 발생된 태아기형을 에모딘이 효과적으로 억제하였고 활성산소로 인하여 감소된 cGPx와 SOD1 수치를 에모딘 처리로서 회복시킴으로써, 알코올에 의한 기형발생으로부터 에모딘이 효과적으로 태아를 보호할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 에모딘을 유효성분으로 함유하는 약학적 또는 식품학적 조성물은 항산화적 활성을 통해 알코올에 의해 유도된 기형발생을 예방할 수 있으며, 태아알코올증후군의 치료제로서도 사용될 수 있다.

에모딘, 알코올성 태아기형, 태아알코올증후군, 항산화활성, cGPx, SOD1

Description

에모딘을 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물 {Preventive and therapeutic compositions containing emodin for alcohol-induced teratogenesis}

본 발명은 에모딘을 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항산화적 활성을 통해 알코올에 의한 기형발생으로부터 태아를 효과적으로 보호할 수 있는 에모딘을 유효성분으로 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

오늘날 임산부의 알코올 섭취는 태아기형의 중요한 원인이다. 태아알코올증후군(FAS)은 성장저하, 신경손상 (비정상적인 뇌 형태, 신경학적 이상, 발달과 지능장애를 포함), 안면기형, 팔다리와 심장결손이 특징이다 (Abel, 1990; Jones and Smith, 1973). 많은 연구결과에서, 태아가 중요한 기관발생기 동안 에탄올에 의한 기형발생에 노출된다는 것을 알 수 있다. 하지만, 음주여성의 60%에서 임신 후 4주까지 임신여부를 모르고 있었다 (Floyd et al., 1999). 태아알코올증후군은 선진국 에서 1,000명의 신생아에서 0.97건으로 보고되어왔다 (Abel, 1995).

에탄올에 노출되었을 때 나타나는 세포 손상에 대한 기전은 아직 명확하지 않다. 그러나 지난 10년 동안, 산화적 스트레스가 에탄올 독성을 일으키는 기전 중 하나라고 인식되어 왔다 (Abel and Hannigan, 1995). 에탄올에 노출되면 과도한 자유래디칼 (free radical)과 활성산소종으로 인한 세포손상이 나타나는데, 지질, 핵. 단백질이 과산화되고 (Montoliu et al., 1995; Navasumrit et al., 2000; Sun et al., 1997), 효소활성이 변성된다 (Sun and Mayhan, 2001). 모체의 알코올 섭취는 태아조직의 과도한 활성산소종 생성을 유도하여 알코올에 대한 몇몇 독성반응을 야기한다. 착상후 배양태아는 알코올 또는 아세트알데하이드 투여 농도에 따라 성장과 발달저하를 볼 수 있고, 발달중인 중간뇌에서 활성산소종으로 손상 받은 세포의 증가도 볼 수 있다 (Lee et al., 2005).

반면에 이전 연구결과에서 자궁내 에탄올을 노출시킨 후 항산화제의 투여가 기형발생율 감소 및 주요 기형발생을 유의적으로 개선한 것을 볼 수 있었다. 에탄올을 투여한 랫드에서 비타민 E의 보충은 지질과산화와 자유래디칼의 생성이 유의적으로 정상화되었다 (Altura and Gebrewold, 1996; Wang and Watson, 1994). Chen 등(2004)은 태아에 에탄올을 노출시켰을 때 앞다리싹 (forelimb buds)에서 세포사를 보고하였고, 합성 과산소디스뮤타아제와 카탈라제 유사체인 EUK-134은 에탄올을 투여한 어미의 태아에서 기형발생을 현저하게 감소시켰다. 앞다리의 기형발생율은 항산화제투여로 35.9% 감소되었다. 지금까지 알파-토코페롤 [α-tocopherol (vitamin E)], 베타카로틴 (ß-carotene), 엽산 (folic acid), 플라보노이드 (flavonoids)와 같은 천연 항산화제는 시험관내 (in vitro) 와 생체내 (in vivo) 실험에서 에탄올로 유도된 독성에 대해 효과적인 보호제로 알려져 왔다 (Cano et al., 2001; Mitchell et al., 1999).

한편, 에모딘(Emodin; 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)은 식물유래의 천연물질로서 전통 동양의학에서 오랫동안 사용되어 왔으며, Rhamnus (Buckthorn)속의 수많은 식물의 뿌리와 껍질에서 자연 상태에서 발견할 수 있는 anthraquinone이다. 또한, 에모딘은 중국의 약초의학요법 중에서 가장 오래되고 잘 알려진 rhubarb (Rheum palmatum)의 뿌리에 있는 rhamnoside 상태로 존재하며, senna나 aloe의 뿌리, 잎, 껍질에서도 관찰된다. 이러한 에모딘 유래 제품들은 식물성 완하제(herbal laxatives)로 사용되었다. 에모딘은 또한 야생버섯 (Dermocybe sanguinea)이나 다양한 곰팡이에서도 볼 수 있다. 사람은 주로 약초나 야생버섯의 섭취를 통해 에모딘에 노출되는 데, 식물에 존재하는 에모딘 양을 기준으로 사람이 하루에 섭취하는 에모딘은 70kg 성인에서 약 3 mg/kg/day 정도로 알려져 있다 (Jahnke, 2004).

또한, 에모딘은 알로에(aloe)에 많이 포함되어 있는 주요 활성성분으로, 알로에는 지난 3,000년 동안 위장관계를 강화시키고 변비를 치료하기 위한 대중적인 치료제로 사용되어져 왔으며 (John, 1990), 오늘날은 일반적인 건강식품으로 널리 사용되어지고 있다. 알로에는 위산 분비의 억제 효과와 (Hirota and Suga, 1977) 동상 치료(McCauley et al., 1990), 항염증 효과 (Davis et al., 1989; Saito et al., 1982), 방사선으로 인한 화상의 치료 (Lushbaugh and Hale, 1953; Davis et al., 1991; Rodriguez-Bigas et al., 1988), 혈당 수준의 개선 (Ajabnoor, 1990), 항바이러스 효과 (Sydiskis et al., 1991), 면역반응의 조절(Hart et al., 1989; Hart et al., 1990; Womble and Helderman, 1988; Shida et al., 1985)로 잘 알려져 있다. 그러나 알코올에 노출된 여성에서 태아발달과 기형발생에 미치는 에모딘의 영향에 관한 연구는 전혀 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 알코올 섭취에 의해 유도된 태아기형에 대하여 에모딘의 예방 및 치료 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 알코올 섭취에 의해 유도된 태아기형에 대하여 예방 및 치료 효과가 있는 에모딘을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 에모딘(emodin)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기 알코올성 태아기형은 다른 말로 태아알코올증후군이라고도 하며, 본 발명에서는 상기 에모딘이 알코올에 의해 발생하는 태아기형을 예방 및 치료 효과가 있음을 처음으로 밝혀냈다.

상기 에모딘(Emodin; 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)은 식물 유래의 천연물질로서 전통 동양의학에서 오랫동안 사용되어 왔으며, Rhamnus (Buckthorn)속의 수많은 식물의 뿌리와 껍질에서 자연 상태에서 발견할 수 있는 안트라퀴논(anthraquinone)이다. 또한, 에모딘은 중국의 약초의학요법 중에서 가장 오래되고 잘 알려진 대황(rhubarb; Rheum palmatum)의 뿌리에 있는 rhamnoside 상태로 존재하며, 차풀(senna)이나 알로에(aloe)의 뿌리, 잎, 껍질에서도 얻을 수 있으며 야생버섯(Dermocybe sanguinea)이나 다양한 곰팡이에서도 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 에모딘은 다양한 식물체에서 얻어지는 모든 형 태의 식물 유래 에모딘을 사용할 수 있으나, 하기 화학식을 갖는 에모딘이 바람직하다.

[화학식]

본 발명의 조성물은, 알코올에 의해 감소된 태아의 성장 및 태아의 기관발생을 회복시키는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서는, 난황주머니직경(yolk sac diameter), 머리-엉덩이 길이(crown-rump length), 머리 길이(head length), 체절 수(No. of somites) 등의 태아 성장지표를 확인함으로써 알코올에 의해 유도된 태아기형발생을 억제하는 것을 확인하였으며, 또한, 난황주머니 혈액순환(yolk sac circulation), 요막(allantois), 구부러진 정도(flexion), 심장(heart), 후뇌(hindbrain), 중뇌(midbrain), 전뇌(forebrain), 귀 기관(otic system), 눈기관(optic system), 인두굽이(brachial bars), 위턱뼈돌기(maxillary process), 아래턱뼈돌기(mandibular process), 후각기관(olfactory system), 뒤쪽신경관(caudal neural tube), 뒷다리싹(hindlimb), 앞다리싹(forelimb), 및 체절 등을 확인함으로써 알코올에 의해 감소된 태아의 기관발생이 회복되는 것을 확인하였다(표 1과 2 참조).

본 발명의 조성물은, 알코올에 의해 감소된 과산화디스뮤타아제 및 글루타티온 과산화효소 mRNA의 발현을 회복시키는 것을 특징으로 한다.

이전 연구에서, 착상 후 태아배양은 알코올 또는 아세트알데히드 투여 농도에 따라 태아성장과 발달저하가 나타나며, 발달 중인 중간뇌에서 활성산소종으로 손상 받은 세포의 증가도 나타나는 것이 알려져 있다(Lee et al., 2005). 따라서 상기 과산소디스뮤타아제(Superoxide dismutase, SOD1)는 태아성장 및 발달에 이러한 영향을 미치는 활성산소를 제거시키는 효소이므로, 본 발명의 조성물은 알코올노출에 의해 감소된 SOD1의 발현을 회복시킴으로서 태아기형의 발생을 막을 수 있다.

또 다른 연구에서, 태아에 에탄올을 노출시켰을 때 앞다리싹(forelimb buds)에서 세포사를 보고하였고, 효과적인 합성 과산소디스뮤타아제와 카탈라아제 유사체인 EUK-134는 에탄올을 투여한 어미의 태아에서 기형발생을 현저하게 감소시켰음이 알려져 있다(Chen, S.Y., et al., 2004). 따라서 본 발명의 조성물은 알코올 노출에 의해 감소된 대표적인 항산화 효소인 SOD1과 글루타티온과산화효소(glutathione peroxidase, cGPX)의 발현을 회복시킴으로서 태아기형의 발생을 막을 수 있다.

결론적으로, 알코올 처리에 의해 발생된 활성산소로 인하여 감소된 cGPx와 SOD1 수치를 에모딘 처리로서 회복시킴으로써, 알코올에 의한 기형발생으로부터 효과적으로 태아를 보호할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 결과는 에모딘이 항산화적 활성을 통해 에탄올에 의해 유도된 기형발생에 대하여 예방 및 치료효과 가 있음을 시사한다.

본 발명에서, 에모딘은 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물의 경우에도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 에모딘은 다양한 식물, 예컨대 Rhamnus (Buckthorn)속의 식물, rhubarb (Rheum palmatum), senna, aloe 등의 뿌리, 잎, 껍질로부터 분리 및 정제하거나 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다. 상기 에모딘을 식물로부터 분리 및 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 10-0623436에는 식물로부터의 에모딘 제조방법이 공개되어 있다. 또한, 분리 및 정제된 형태의 에모딘을 와코 퓨어 케미칼(Wako pure chemicals), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 글락소(Glaxo), 나카라이 테스퀴(Nacalai Tesque) 및 바이오몰 리서치 래버토리(BioMol Research Laboratories Inc) 사 등으로부터 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 구체적으로 알코올성 태아기형 예방 및 치료효과를 가지는 약학적 조성물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 에모딘을 유효성분으로 포함하고 그 외에 약학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 텍스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 제제화 방법은 특정한 방법에 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자가 목적에 따라 바람직한 방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 다를 수 있다. 특히, 본 발명의 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물은 투여 대상이 임산부인 것을 감안하여 적절한 투여량이 선택되어야 하는데, 에모딘의 일일 투여량은 0.001 내지 100 mg/kg의 범위에서 선택하는 것이 바람직하며 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 에모딘(emodin)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 식품 조성물은 에모딘을 유효성분으로 포함하는데, 그 외에 다른 식품 또는 식품 첨가제와 함께 사용될 수 있다. 유효성분과 기타 첨가제의 혼합량은 사용 목적(예방 또는 치료)에 따라 통상적인 범위 내에서 적절하게 결정될 수 있다. 에모딘은 전체 식품 조성물의 0.0001-10 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 알코올성 태아기형의 예방을 목적으로 장기간 섭취하는 경우의 함량은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용되는 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

특히 본 발명의 건강음료 조성물의 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물에는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로 덱스트린 등의 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 포함된다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 감미제, 또는 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 0.01-0.04 g, 바람직하게는 0.02-0.03 g이다.

본 발명의 조성물은 상기 성분 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부에 대하여 0.01-0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험동물

사육 실험실 환경은 온도 21± 2℃, 상대습도 55± 10 %, 조명시간 12시간으로 유지하였다. 8-10주령 암컷 ICR 마우스(Biogenomics Co., 한국)를 사육 실험실에서 야간에 교배시킨 후, 임신 확인은 다음날 아침 질도말하여 질전(vaginal plugs) 또는 정자가 발견된 암컷을 임신 0.5일로 하였다. 모든 절차는 “Guidelines for the Care and Use of Animals (Chungbuk National University Animal Care Committee according to NIH # 86-23)”에 따라 수행되었다.

실시예 1. 랫드 혈청 준비

랫드(Sprague-Dawley rat)의 배대동맥에서 채혈한 샘플은 즉시 3,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 시킨 후, 맑은 상층액만 새로운 튜브(tube)에 옮겼다. 다시 3,000 rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리 시켜서 완벽하게 혈구를 분리한 맑은 혈청 상층액을 모았다. 이를 항온조(water bath)에서 56℃, 30분간 열비동화(heat- inactivate)시킨 후, 바로 사용하거나 -70℃에서 보관하였다. 혈청은 배양에 사용하기 전에 37℃에서 인큐베이션한 후, 0.2㎛ 필터로 여과하였다.

실시예 2. 전 배아 배양(whole embryo culture)

전 배아 배양시스템은 이전에 확립된 모델을 기본으로 하였다(New, 1978). 임신 8.5일령의 마우스를 경추탈구시켜 자궁을 적출해 낸 후, 멸균된 타이로드용액(Tyrode′s solution, pH 7.2)이 담긴 페트리디쉬(petridish)에 옮겼다. 탈락막 (decidua)과 라이헤르트막(Reichert′s membrane)을 제거하여 손상되지 않은 내장의 난황주머니와 태반밖원뿔(ectoplacental cone)을 포함한 태아를 채취하였다. 채취한 태아를 3 ㎖의 배양용 배지가 담겨있는 배양병(태아 3개체 당 한병)에 임의로 넣었다.

3 ㎖의 혈청배양액과 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO; St. Louis, U.S.A.)로 각기 다른 농도(1× 10^-5와 1× 10^-4 ㎍/㎖)로 희석한 에모딘(emodin; Sigma, USA)을 준비하였다. 각 태아를 다음과 같은 실험군으로 배양하였다: 대조군(0.1% DMSO), 에탄올투여군(1.7㎕/㎖), 에탄올과 에모딘을 병용투여한 군. 배양기내 온도는 37± 0.5℃로, 회전속도는 25 rpm로 유지시켰다. 모든 태아는 48시간 동안 전배아배양기(Ikemoto Rika Kogyo, Japan)를 이용하였다. 배양병에 주입하는 혼합 가스는 150 ㎖/min 으로 공급하였다. 가스 교환은 처음 17시간은 5% O₂, 5% CO₂, 90% N₂조성으로, 그 후 7시간 동안은 20% O₂, 5% CO₂, 75% N₂의 조성으로 공급 하였으며, 이후 24시간 동안은 40% O₂, 5% CO₂, 55% N₂의 조성으로 공급하였다.

실시예 3. 알코올성 기형발생에서 에모딘의 억제 효과의 형태학적 평가

마우스 전태아배양에서 에모딘의 두 농도(1× 10^-5㎍/㎖, 1× 10^-4㎍/㎖)가 에탄올에 의해 유도된 성장지연을 예방하는지 알아보기 위해 실험하였다.

실시예 2에 따라 48시간의 배양이 끝난 후, 태아 특징을 G. Van Maele-Fabry 등(1990)의 형태학적 평가법에 따라 조사하였다. 난황주머니의 혈액순환과 심박동이 있는 살아있는 태아만 평가하였다. 구체적으로, 태아는 17가지 기준 항목과 난황주머니 직경, 머리엉덩이 길이와 머리길이, 체절수를 측정하였다. 형태학적 특징은 태아굽힘(embryonic flexion), 심장(heart), 신경관(neural tube), 대뇌소포[cerebral vesicles; 후뇌(hindbrain), 중뇌(midbrain), 전뇌(forebrain)], 귀(otic systems), 눈(optic systems), 후각기관(olfactory system), 인두굽이(branchial bar), 위턱(maxilla), 아래턱(mandible), 팔다리싹 (limb buds; 앞다리와 뒷다리싹), 난황주머니 순환(yolk sac circulation), 요막(allantois), 몸분절(somites)을 평가하였다.

[표 1]. 시험관 내에서 에탄올(EtOH) 또는 에모딘(E)을 투여한 후 마우스 태아의 성장에 미치는 영향

각 값은 평균±표준편차로 표시되었음.

#; 대조군(CON)과 비교(P < 0.05), *; 에탄올 투여군과 비교(P < 0.05).

[표 2]. 시험관 내에서 에탄올(EtOH) 또는 에모딘(E)을 투여한 후 마우스 태아의 기관발생에 미치는 영향

각 값은 평균±표준편차로 표시되었음.

#; 대조군(CON)과 비교 (P < 0.05), *; 에탄올 투여군과 비교 (P < 0.05).

표 1과 2에서, 총 형태학적 지표에서 대조군과 비교하여 에탄올에 노출된 태아에서 유의적인 차이가 나타났다(p<0.05). 에탄올에 노출된 태아에서는 모든 형태학적인 지표들이 정상적으로 발달하지 못하였다.

그러나 에탄올과 에모딘을 함께 처리하였을 경우 모든 형태학적인 지표가 회복되었다. 즉, 에탄올과 에모딘을 함께 처리한 태아에서 난황주머니직경(yolk sac diameter), 머리엉덩길이(crown-rump length), 머리길이(head length), 체절수(No. of somites)와 같은 태아 성장지표에 있어서 에탄올 단독투여군에 비해서 유의성있게 회복되었다(p<0.05). 또한, 난황주머니 혈액순환(yolk sac circulation), 요막(allantois), 구부러진 정도(flexion), 심장(heart), 후뇌(hindbrain), 중뇌(midbrain), 전뇌(forebrain), 귀 기관(otic system), 눈기관(optic system), 인두굽이(brachial bars), 위턱뼈돌기(maxillary process), 아래턱뼈돌기(mandibular process), 후각기관(olfactory system), 뒤쪽신경관(caudal neural tube), 뒷다리싹(hindlimb), 앞다리싹(forelimb), 및 체절의 지표치가 에탄올만을 처리한 태아와 비교하여 유의적으로 증가하였다(p<0.05).

또한 도 2에서 대조군(도 2의 A)과 비교할 때, 에탄올을 투여한 태아는 뇌가 닫히지 않았고, 심장발달 이상을 포함한 다양한 태아기형을 보였다(도 2의 B). 그러나, 에탄올 및 에모딘을 함께 투여한 태아에 있어서는 에탄올 투여로 유발된 성장지연과 기형상태가 개선되었다(도 2의 C와 D): (A) 대조군, (B) 에탄올투여군: 앞뇌와 마름뇌 열림, (C) 에탄올과 에모딘(1× 10^-5㎍/㎖) 투여군, (D) 에탄올과 에모딘(1× 10^-4㎍/㎖) 투여군.

실시예 4. 알코올성 기형발생에서 에모딘이 SOD1과 cGPx의 mRNA 발현에 미치는 영향

배양한 마우스 태아에서 전체 RNA를 Trizol reagent kit (Invitrogen,U.S.A.)를 이용하여 추출하였다. 전체 RNA농도는 UV 흡수량을 통해 측 정하였다. 전체 RNA의 2 ㎍을 역전사(reverse transcription)하여 cDNA로 합성하기 위해, cDNA synthesis kit (Bio-Rad,U.S.A.)를 사용하였다. cDNA는 PCR반응을 위한 주형으로 사용하였다. 정량 실시간-PCR 분석은 cDNA 25 ㎕를 TaqMan Universal PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems, U.S.A.)를 이용하여 반응시켰다. 반응은 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, U.S.A.)에서 수행되었다.

사용된 마우스 SOD1 프라이머 및 프로브는, 마우스 SOD1의 Taqman probe primers (forward primer: 5'-CTT CTC GTC TTG CTC TCT CTG G-3'; reverse primer: 5'-TCC TGT AAAT TTG TCC TGA CAA CAC-3'; TaqMan probe: 5'-ACT GGT TCA CCG CTT GCC TTC TGC)를 이용하였다.

또한, 마우스 cGPx의 Taqman probe primers (cGPx forward primer: 5’-CCC CAC TGC GCT CAT GA-3’; cGPx reverse primer: 5’-GGC ACA CCG GAG ACC AAA-3’; cGPx Taqman probe: 5’-CGA CCC CAA GTA CAT C-3’)는 Primer Express software (Applied Biosystems)를 이용하여 설계되었다. Taqman probes는 FAM(6-carboxyfluorescein)으로 표지되었다. 내부표준화 (internal standard) 지료로는 Beta-actin primer (Assay on demand # 4352933E, Applied Bioscience)를 표적전사 발현의 정상화를 위해 사용하였다. 측정 결과는 3번의 독립적인 실행을 3번 반복하여 Livak and Schmittgen (2001)에서 정립한 comparative Ct method를 이용하여 분석하였다.

도 3에서, 마우스 태아(8.5일령)를 에탄올(EtOH; 1.7㎕/㎖) 및 에모딘(E; 1 × 10^-5㎍/㎖ 또는 1× 10^-4㎍/㎖)을 투여하여 2일 동안 배양하여 glutathione peroxidases (GPx) mRNA의 Real-time PCR분석을 시행하였다. 에탄올투여군 (EtOH)의 cGPx mRNA는 대조군 (CON) 보다 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 반면에 에탄올과 에모딘을 함께 투여한 군에 있어서는 에탄올투여군보다 유의적으로 증가되었다 (p<0.05). 각 값(n=9)은 평균± 표준편차로 표시되었음: #; 대조군과 비교(p <0.05), *; 에탄올 투여군과 비교(p <0.05).

도 4에서, 마우스 태아(8.5일령)를 에탄올(EtOH: 1.7㎕/㎖)과 에모딘(E: 1× 10^-5㎍/㎖ 또는 1× 10^-4㎍/㎖)을 투여하여 2일 동안 배양한 후 Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) mRNA에 대한 Real-time PCR분석을 시행하였다. 에탄올투여군(EtOH)의 SOD1 mRNA는 대조군(CON) 보다 감소하였다. 반면에 에탄올과 에모딘을 함께 투여한 군은 에탄올 단독투여군보다 다소 증가되었다: 각 값 (n=9)은 평균± 표준편차로 표시되었음.

통계학적 분석

One-way ANOVA/tukey test를 이용하여 그룹 간 차이를 평가하였다. 모든 분석은 Statistical Package for Social Sciences for Windows software, version 10.0 (SPSS Inc., Illinois, U.S.A.)을 이용하여 수행하였다. 통계학적 유의성은 p〈0.05에서 평가하였고, 모든 결과는 평균± 표준편차로 나타내었다.

제제예 1 : 시럽제의 제조

본 발명에 따른 에모딘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 2 %(중량/부피) 함유하는 시럽을 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 에모딘, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

제제예 2 : 정제의 제조

에모딘 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 에모딘 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 3 : 주사액제의 제조

유효성분 1 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 에모딘 0.1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 멸균시켰다. 상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

제제예 4 : 음료의 제조

본 발명에 따른 에모딘 100㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 에모딘을 함유하는 본 발명의 조성물이 알코올에 의한 기형발생으로부터 효과적으로 태아를 보호할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 에모딘을 유효성분으로 함유하는 약학적 또는 식품학적 조성물은 항산화적 활성을 통해 알코올에 의해 유도된 기형발생을 예방할 수 있으며, 태아알코올증후군의 치료제로서도 사용될 수 있다.

[참고문헌]

도 1은 에탄올과 에모딘을 처리한 마우스 배양태아에서 전체 형태학적 지표의 변화를 나타낸 결과이다.

도 2는 마우스 태아 발달과정에서 에탄올에 의해 유발된 태아기형에 있어서 에모딘의 예방 및 치료효과를 나타낸다.

도 3은 에탄올과 에모딘을 처리한 배양태아에서 cGPx mRNA의 발현양상을 나타낸다.

도 4는 에탄올과 에모딘을 처리한 배양태아에서 SOD1 mRNA의 발현양상을 나타낸다.

Claims

에모딘(emodin)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 에모딘은 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.

[화학식]
제 1항에 있어서, 상기 에모딘은 알로에(aloe)로부터 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 알코올에 의해 감소된 태아의 성장 및 태아의 기관발생을 회복시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 알코올에 의해 감소된 과산화디스뮤타아제 및 글루타티온 과산화효소 mRNA의 발현을 회복시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
에모딘(emodin)을 유효성분으로 함유하는 알코올성 태아기형 예방 및 치료용 식품 조성물.