KR100943754B1 - 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용조성물 - Google Patents
장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물은 과도한 면역반응인 수동 피부 아나필락시스 반응 (passive cutaneous anaphylaxis reaction)억제효과, 비만세포주로부터 베타-헥소사미니데이즈 (β-hexosaminidase) 및 히스타민 (histamine)의 방출 억제량 효과 및 알러지 유발인자인 IL-4 (interleukin-4) 및 IgE (Immunoglobulin E)의 생성량억제효과를 나타내므로, 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
장생도라지 조추출물, 장생도라지 정제 분획물, 알러지 질환, IgE, IL-4
Description
본 발명은 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
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알러지란 선천적 또는 후천적으로 면역기능에 이상이 있어 무해한 항원, 즉알러지원에 대해 과민한 반응을 나타내는 것으로, 이에 대한 질환으로는 과민증 (anaphylaxis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 곤충 알러지, 식품 알러지, 약품 알러지 및 두드러기 (urticaria)등이 있다 (Wuthrich B., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 90 , 3-10, 1989).
알러지 반응은 항체의 종류 중 하나인 IgE에 의해 매개되며, 이것은 비만세포에 의해 생산된다. IgE 생성에 이르게 하는 면역반응기작은 하기와 같다. 일단, 우리의 몸이 알러지원에 노출되면, 알러지원은 순환하는 항원제시세포에 의해 인지되며, 이 항원제시세포는 IL-4 존재 환경 속에서 알러지원 제시를 통해 Th0를 Th2 세포로 분화시킨다. 이렇게 분화된 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-13와 같은 사이토카인을 분비하는데, IL-4 및 IL-5는 골수에서의 산성백혈구의 발달을 촉진시켜 염증이 발생한 조직으로 산성백혈구를 유도할 뿐만 아니라, B세포에 작용하여 IgE 및 IgG1의 생성을 유도한다. IL-13은 IL-4와 밀접하게 관련되어 있는 사이토카인으로, IL-4 수용체의 알파(α)사슬에 결합하여 IL-4, IgE 또는 산성백혈구와 무관하게 알러지 표현형을 유도한다 (Wills- Karp M., et al., Science, 282, pp2258 -61, 1998; Grunig G., et al., Science, 282 , pp2261 -2263, 1998).
상기의 작용기전으로 생산된 IgE는 조직에서 FcεRⅠ이라 불리는 고친화성표면 IgE 수용체를 매개로 비만세포에 강하게 결합한다 (친화성 IgE 수용체 (FcεRI)는 비만세포 및 염기성백혈구의 표면에 존재하고, 저친화성 IgE 수용체 (FcεRⅡ 또는 CD23)는 림프구, 산성 백혈구, 혈소판 및 대식세포의 표면에 존재 한다). 이후 동일한 알러지원에 재차 노출되어 알러지원이 비만세포에 결합된 IgE에 결합하면 이들 수용체들이 교차결합하게 되고 이는 비만세포로부터 히스타민, 프로스타글란딘, 헤파린, 프로테아제 및 자유 라디칼을 분비시키는데, 이들은 혈관확장, 장관내 및 기관지 평활근 수축, 점액분비 및 국소 단백질 분비와 같은 다양한 생물학적 효과를 매개한다. 비만세포의 초기매개 반응에 따라 산성백혈구, 염기성백혈구 및 림프구의 유입이 6-24시간 후에 발생한다. 이 후기단계의 반응은 끊임없이 항원에 노출된 조직의 만성적 염증을 유도한다.
현재 일반적으로 상용되는 대표적인 알러지 치료제로는 항히스타민, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증용 의약품등이 있는데, 이들은 주로 증후성에 치료 효과가 있고, 과도한 체액성 면역을 완화하거나 IgE 생산을 억제시키는 알러지의 근본적인 원인을 치료하는 효과는 없는 것으로 나타났다. 한편, IgE 항체(CGP-51901)와 재조합 인간화 단일 클론항체의 임상 실험을 통하여 IgE 생산 억 제가 알러지의 증상을 개선시킴이 증명되었고 ( Fahy JV . et al., Am. J. Respir . Crit . Care. Med ., 155 , pp1828 -1834,1997), IgE 합성 및 분비 억제자로 디아실 벤지미다졸 동족체(US 특허 6,369,091호)와 세균성 폴리사카라이드(US 특허출원공개 20020041885호)가 밝혀졌다.
한방에서는 대표적으로 진득찰 (Siegesbeckia glabrescens)이 IgE 생산억제 효과가 있음이 확인된바 있다(Kim HM . et al., Phytother Res., 15 , pp572 -576, 2001).
도라지(길경, Platycodon grandiflorum A. DC)는 도라지과(Campanulaceae)에 속하며, 한국, 일본, 중국등지에 분포하는 것으로, 이에 대한 성분으로는 테르펜계 사포닌이 알려져 있고, 그 약리작용으로는 진해, 거담작용, 중추신경억제작용, 급만성 염증에 대한 항염증작용, 항궤양작용, 위액분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용 및 콜레스테롤 대사 개선작용 등이 알려져 있다(Tada A. et al., Chem. Pharm . Bull., 23 , 2965, 1975). 이외에도 도라지의 열수 및 에탄올 추출물은 곰팡이의 아플라톡신을 억제하며, 이눌린 분획은 식균 작용과 고형암 및 복수암에 대한 강력한 항종양효능이 있고, 40% 도라지엑기스는 알코올흡수 억제작용이 있는 것으로 알려져 있다(Hitokoto H, Morozumi S, Wauke T, Sakai S, Ueno I., Mycopathologia, 66 , p.161, 1979 ; Naga , T., Matsuda, H., Makata , K., Namba and Kubo , M., Shoyakugaku Zasshi , 40 , p.378, 1986 ; Nagao , T., Matsuda, H., Nambo , K. and Kubo , M., Shoyakugaku Zasshi, 40 , p.367, 1986 ; JP 平3-264534 1991).
이러한 도라지의 다양한 약리작용에도 불구하고 장기간 재배에 어려움이 있어 개발이 쉽지 않았으나 최근에는 20년 이상의 도라지를 재배할 수 있는 기술이 개발되어 다량 생산이 가능해졌기에 (이성호, “다년생도라지재배법”, 대한민국 특허 제 045731호) 이를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재까지 장생도라지의 항당뇨, 고지혈증 예방, 항암, 간 예방 및 손상억제효과 확인에 대한 연구가 진행되었으나(Choi C.Y. et al., International Immunopharmacology , 1(6) , pp.1141-1151, 2001 ; Choi C.Y. et al., Cancer Letters, 166(1) , pp.17-25, 2002; Lee K.J. et al., Cancer Letters, 174 , pp.73-81, 2001 ;Lee K.J. et al., Food and Chemical Toxicology, 40(4) , pp.517-525, 2002), 상기 문헌 어디에서도 본 발명의 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제분획물이 항알러지 효과를 유도하여 알러지 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 사용 가능하다고 교시되거나 개시된 바 없다.
따라서, 본 발명에서는 장생도라지의 항알러지 효과를 알아보기 위한 연구를 통하여, 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제분획물의 과도한 면역반응인 수동 피부 아나필락시스 반응(passive cutaneous anaphylaxis reaction)억제효과, 비만세포주로부터 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 및 히스타민 (histamine)의 방출 억제효과 및 알러지 유발인자인 IL-4(interleukin-4) 및 IgE(Immunoglobulin E)의 생성량억제효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 의미한다.
본원에서 정의되는 정제 분획물은 장생도라지 추출물을 이온교환수지를 통하여 얻어지는 올리고당이 다량 함유된 (1) 올리고당 정제 분획물; (2) 이눌린 정제 분획물; (3) 사포닌 성분이 다량 함유된 조사포닌 정제 분획물을 포함하며, 바람직하게는 (3) 사포닌 성분이 다량 함유된 조사포닌 정제 분획물, 보다 바람직하게는 본원에 개시된 제조방법으로 제조되는 정제분획물을 포함한다.
상기 알러지 질환은 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품 알러지 또는 약품 알러지, 바람직하게는 알러지성 비염, 천식, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 식품 알러지 또는 약품 알러지, 보다 바람직하게는 아토피성 피부염 또는 천식을 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제분획물은 하기와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 조추출물은 장생도라지의 지하부를 음건하여 마쇄한 후, 건조된 시료의 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 10 내지 20배에 달하는 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물로, 0 내지 120℃ 온도, 바람직하게는 20 내지 100℃ 온도에서 약 0.5 내지 20시간, 바람직하게는 1 내지 10시간 동안 교반추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7 회 반복 추출한 후 수득한 추출액을 냉각 후에 여과하고 여과액을 동결 건조하여 얻을 수 있다.
또한 본 발명의 장생도라지로부터 분리된 정제 분획물은 상기 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 HP-20 컬럼과 같은 이온교환수지를 통과시켜, 당 성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 바람직하게는 메탄올로 탈착시켜, 물 및 저급 알코올 가용 분획물을 각각 제조한 후, 이 물 가용 분획물로부터 각각 올리고당이 다량 함유된 (1) 올리고당 정제 분획물 및 (2) 이눌린 정제 분획물을 얻고, 이 저급 알코올 가용분획물에 에틸에테르 등과 같은 비극성 용매를 가하여 침전된 침전물로부터 사포닌 성분이 다량 함유된 (3) 조사포닌 정제 분획물을 얻을 수 있다.
또한 본 발명의 장생도라지는 20년근 이상의 다년생 도라지임을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 분획물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함된다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 포함하는 조성물은 알러지 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물은 알러지 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조추출 물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 장생도라지 조추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물의 과도한 면역반응인 수동 피부 아나필락시스 반응(passive cutaneous anaphylaxis reaction) 억제효과, 비만세포주로부터 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 및 히스타민 (histamine)의 방출량 억제효과 및 알러지 유발인자인 IL-4(interleukin-4) 및 IgE(Immunoglobulin E)의 생성량억제효과를 나타내어 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
장생도라지
조추출물
및 이로부터 분리된
조사포닌
분획물
분리
1-1. 장생도라지 조추출물 제조
(주)장생도라지로부터 구입한 장생도라지 지하부를 수분의 함량이 5% 이하가 되도록 건조하고 이를 분쇄한 후, 장생도라지 분말 0.25㎏에 증류수 4ℓ를 가하여 90 내지 95 ℃에서 5시간 동안 2회 열수추출한 후 여과하고 이를 동결 건조하여 장생도라지 추출물 99.5 g를 수득하였다(수득율: 39.8%, 이하, “CKT”라 명명함).
1-2. 조사포닌 분획물의 분리
상기 실시예 1-1에서 수득한 장생도라지 조추출물 100g을 증류수에 녹여 여과한 여액을 HP-20(Diaion사 제품) 컬럼에 통과시켰다. 이때 당 성분을 제외한 HP-20 컬럼에 흡착된 유기물 성분들을 당 성분이 용출되지 않을 때까지 충분히 물로 씻어준 후 나머지는 100% 메탄올로 탈착시켜 물과 메탄올에 용해되는 성분으로 각각 분리하였다. 메탄올에 용출된 성분들은 메탄올을 감압농축시키고 나머지를 다시 소량의 메탄올에 녹여 충분히 저어주면서 에틸에테르를 가하여 침전이 형성되도록 하고 이를 여과하고 건조시켜 플라티코딘 A(platycodin A), 플라티코딘 C(platycodin C), 플라티코딘 D(platycodin D), 폴리갈락신 D(polygalacin D), 디아피오플라티코딘 D(deapioplatycodin D)및 플라티코시드 E(platycoside E)를 함유한 조사포닌 분획물 약 2.3 g을 수득하였다(도 1 참조, 이하 CKS라 명명함).
참고예
1. 시약 준비
DNP(dinitrophenyl)-IgE 항체, 에반스 블루(Evans blue), p-니트로페닐(nitrophenyl)-N-아세틸(acetyl)-β-D-글루코사미드(glucosamide), o-프탈알데하이드(phthalaldehyde), DNP-BSA, DMEM 배양액, 트립신(Trypsin) 및 소혈청(fetal bovine serum)은 시그마사 (Sigma chemical co)에서 구입하였으며, IL-4-루시퍼라제 리포터 유전자(luciferase reporter gene)는 존 홉킨스 천식 & 알러지 센터 (Johns Hopkins Asthma and Allergy Center)의 Dr. Steve N. Georas에게서 받았다(도 5 참조).
참고예
2. 실험동물 준비
실험동물은 샘타코 바이오 코리아사에서 구입하였으며, 생후 10주령의 ICR 마우스(25~30g)를 사용하였고, 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21~24℃, 상대습도는 40~80%로 유지하였다. 또한 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장 내 빛을 조절하였다.
참고예
3. 세포배양 방법
비만세포주인 RBL-2H3(Korean Cell Line Bank: KCLB, #22256, 한국)는 한국 세포주 은행에서 구입하였으며, 세포는 10% 소 태아혈청이 들어간 DMEM 배양액으로 계대 배양하였다.
실험예
1. 수동 피부
아나필락시스
반응 (passive cutaneous anaphylaxis reaction) 시험을 통한
알러지
활성 억제효과 측정
상기 실시예 1-1의 장생도라지 조추출물(CKT) 및 상기 실시예 1-2의 장생도라지 조사포닌 분획물(CKS)에 의한 알러지 활성억제 효과를 측정하기 위해서, 수동 피부 아나팔락시스 반응법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다( Knoops L. et al., Journal of Immunology, 175 , pp. 335-341, 2005).
생후 10주령의 ICR 마우스(25~30g)의 귀의 표피에 DNP-IgE 항체(10ng/ml)를 10μl씩 피내 주사하여 감작시켰고 24시간 후 CKT(50, 100 및 200 mg/kg)와 CKS(0.5, 2 및 4 mg/kg)를 마우스에 구강투여 하였다. 한 시간 후, 마우스의 꼬리 의 정맥내로 에반스 블루(evans blue)와 DNP-BSA(10 μg/ml)의 혼합물을 100 μl씩 정맥주사 하였고, 30분 후 마우스의 귀에 생긴 에반스 블루(evans blue)에 의한 푸른 반점을 확인한 다음 그 귀를 잘라서 1ml의 포르마이드(formamide)에 넣고 80℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 조직을 갈아 12,000 rpm으로 원심분리 하였고 색소침착정도를 조사하기 위해서 분리된 상층액을 620nm에서 흡광도를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
| 구분 | 농도(mg/kg) | Anti DNP-IgE + DNP-BSA | Leakage of dye (% of control) |
| 양성 대조군 | - | + | 100 ± 3.4 |
| 실시예 1-1의 CKT (장생도라지 조추출물) | 50 | + | 79.1 ± 3.1 |
| 100 | + | 61.7 ± 4.8 | |
| 200 | + | 50.9 ± 4.2 | |
| 실시예 1-2의 CKS (장생도라지 조사포닌 분획물) | 0.5 | + | 70.5 ± 2.9 |
| 2 | + | 43.3 ± 2.9 | |
| 4 | + | 36.9 ± 3.8 |
에반스 블루(evans blue) 염색시약을 이용한 색소침착억제 효과를 확인한 결과, 상기 표 1에 나타나는 바와 같이, CKT 및 CKS는 모두 강력한 색소침착억제 효과를 나타내었으며, CKT는 50mg/ml 농도에서 79.5%로 가장 우수한 색소침착억제 효과를 보였으며, CKS는 0.5mg/kg 농도에서 70.5%로 가장 우수한 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 CKT 및 CKS가 DNP-BSA에 의해 발생되는 알러지 반응을 억제시킴을 확인할 수 있었다(표 1 참조).
실험예
2. 비만세포로부터 베타-
헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase)의
방출량 억제효과 측정
CKT 및 CKS에 의한 비만세포로부터 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase)의 방출량 억제효과를 측정하기 위해서, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Matsubara S. et al., Am. J. Respir . Crit . Care Med ., 173 , pp. 55-63, 2006).
참고예 3의 방법으로 배양한 RBL-2H3 세포에 DNP-IgE 항체(10 ng/ml)를 첨가하여 18시간 동안 감작시킨 후 CKT 및 CKS를 첨가하여 1시간 동안 전 처리하였고 이후 DNP-BSA(10 μg/ml)를 첨가한 다음 10분 후에 상층액을 수집하였다. 수집된 상층액 50 μl와 0.1 M 시트레트 완충액(citrate buffer, pH 4.5)에 녹인 1 mM p-니트로페닐(nitrophenyl)-N-아세틸(acetyl)-β-D-글루코사미드(glucosamide) 50μl를 30분 동안 세포 배양기(37℃, 5% CO2)에서 반응시켰고 반응을 정지시키기 위해 1N HCl을 첨가하였다. 이후 베타-헥소사미니데이즈 (β-hexosaminidase) 효소의 양을 조사하기 위해서 405 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
| 구분 | 농도(μg/ml) | 베타-헥소사미니데이즈 억제율 (%) | IC50 (μg/ml) |
| 실시예 1-1의 CKT (장생도라지 조추출물) | 50 | 32.9 ± 1.9 | 116.7± 2.9 |
| 100 | 52.1 ± 2.8 | ||
| 200 | 72.2 ± 3.6 | ||
| 실시예 1-2의 CKS (장생도라지 조사포닌 분획물) | 0.5 | 52.3 ± 2.8 | 1.52 ± 3.2 |
| 2 | 73.3 ± 4.5 | ||
| 4 | 81.3 ± 3.5 |
상기 표 2에 나타난 바와 같이, CKT의 농도가 50, 100, 200 μg/ml일 때 각각의 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출의 억제효과가 32.9±1.9%, 52.1±2.8%, 72.2±3.6%로 나타났고, IC50 값은 116.7 μg/ml로 나타났으며 CKS의 농도가 0.5, 2, 4 μg/ml일 때 또한 각각의 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출의 억제효과가 52.3±2.8%, 73.3±4.5%, 81.3±3.5%로 나타났으며, IC50 값은 1.52 μg/ml로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 CKT 및 CKS가 DNP-BSA에 의한 알러지 유발로 인해서 비만세포로부터 방출되는 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase)의 방출량을 억제시킴을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
실험예
3. 비만세포로부터 히스타민 (histamine)의 방출량 억제 효과 측정
CKT 및 CKS에 의한 비만세포로부터 히스타민 (histamine)의 방출량 억제 효과를 측정하기 위해서, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hosono H. et al., J. Biol . Chem ., 276 , pp. 29664-29670, 2001).
RBL-2H3 세포에 DNP-IgE 항체(10 ng/ml)를 첨가하여 1시간 동안 감작시킨 후 CKT 및 CKS를 첨가하여 30분간 전 처리하였고 이후 DNP-BSA(10 μg/ml)를 첨가한 다음 10분 후에 상층을 수집하였다. 수집된 상층액 50 μl와 메탄올에 녹인 1% o-프탈알데하이드(phthalaldehyde) 50μl를 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 반응을 정지시키기 위해 1N HCl을 첨가하였고, 이후 히스타민의 양을 조사하기 위해서 자극(excitation) 360nm, 방출(emission) 450nm에서 흡광도를 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
| 구분 | 농도(μg/ml) | 히스타민 방출량 억제율 (%) | IC50 (μg/ml) |
| 실시예 1-1의 CKT (장생도라지 조추출물) | 50 | 39.8 ± 3.2 | 102.4± 3.1 |
| 100 | 58.5 ± 2.8 | ||
| 200 | 79.5 ± 4.2 | ||
| 실시예 1-2의 CKS (장생도라지 조사포닌 분획물) | 0.5 | 43.8 ± 3.6 | 1.61± 3.8 |
| 2 | 68.5 ± 3.9 | ||
| 4 | 89.2 ± 4.1 |
상기 표 3에 나타난 바와 같이, CKT(200μg/ml)는 베타-헥소사미니데이즈(β-hexosaminidase) 방출량의 억제효과가 79.5±4.2%로 나타났으며, CKS(4μg/ml)는 89.2±4.1%로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 CKT 및 CKS가 DNP-BSA에 의한 알러지 유발로 인해서 비만세포로부터 방출되는 히스타민의 방출량을 억제시킴을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
실험예
4. 비만세포로부터
IgE
의 생성량 억제효과 측정
CKT 및 CKS에 의한 비만세포로부터 IgE의 생성량 억제효과를 측정하기 위해서, ELISA 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Cho T. H. et al., Clin Exp Immunol ., 143 , pp. 203-208, 2006).
RBL-2H3 세포에 DNP-IgE 항체(10 ng/ml)를 첨가하여 18시간 동안 감작시킨 후 CKT 및 CKS를 첨가하여 1시간동안 전 처리하였고 이후 DNP-BSA(10 μg/ml)를 첨가한 다음 24시간 후에 상층을 수집하였다.
96 웰 플레이트(well plate)에 IgE의 캡쳐 항체(capture antibody)를 첨가하여 12시간동안 코팅시킨 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세 번 세척한 다음 상기 상층액을 첨가하여 두 시간 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 세 번 세척하였고 감지 항체(detection antibody)를 첨가하여 한 시간 동안 반응시킨 다음 PBS로 3 회 세척하였다. HRP-퍼옥시다아제(peroxidase)와 30분 동안 반응시킨 후 PBS로 세 번 세척하였고 TMB 용액을 50 μl 첨가하여 암소에서 반응시켰다. 이후 파란색이 띨 때 반응정지 용액인 1M H2SO4를 200 μl 첨가하였고, IgE의 양을 조사하기 위해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 DNP-BSA에 의한 알러지 유발로 인해서 생성되는 IgE의 생성량이 13.2pg/ml인 반면에, CKT(200μg/ml)는 4.6pg/ml로 나타났으며, CKS(4μg/ml)에서는 3.1pg/ml로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해, CKT 및 CKS에 의해서 알러지 유발인자인 IgE 생성량이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
실험예
5. 비만세포로부터 IL-4의 생성량 억제효과 측정
CKT 및 CKS에 의한 비만세포로부터 IL-4의 생성량 억제효과를 측정하기 위해서, ELISA 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Matsubara M. et al., Biochem Pharmacol ., 67 , pp. 1315-1326, 2004).
RBL-2H3 세포에 DNP-IgE 항체(10 ng/ml)를 첨가하여 18시간 동안 감작시킨 후 CKT 및 CKS를 첨가하여 1시간 동안 전 처리하였고 이후 DNP-BSA(10 μg/ml)를 첨가한 다음 24시간 후에 상층을 수집하였다.
96 웰 세포 배양 플레이트(96-well cell culture plate)에 IL-4의 캡쳐 항체(capture antibody)를 첨가하여 12시간 동안 코팅시킨 후 PBS(phosphate buffered saline)로 세 번 세척한 다음 상기 상층액을 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 PBS로 세 번 세척하였고 감지 항체(detection antibody)를 첨가하여 한 시간 동안 반응시킨 다음 PBS로 3회 세척하였다. HRP-퍼옥시다아제(peroxidase)와 30분 동안 반응시킨 후 PBS로 세 번 세척하였고 TMB 용액을 50 μl 첨가하여 암소에서 반응시켰다. 이후 파란색이 띨 때 반응정지 용액인 1M H2SO4를 200 μl 첨가하였고, IgE의 양을 조사하기 위해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 DNP-BSA에 의한 알러지 유발로 인해서 생성되는 IL-4의 생성량이 17.9pg/ml인 반면에, CKT(200μg/ml)는 6.6pg/ml로 나타났으며, CKS(4μg/ml)에서는 3.9pg/ml로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해, CKT 및 CKS에 의해서 알러지 유발인자인 IL-4 생성량이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
실험예
6. IL-4의 유전자 발현 억제효과 측정
CKT 및 CKS에 의한 IL-4의 유전자 발현 억제효과를 조사하기 위해서, RT- PCR 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 진행하였다(Matsubara M. et al., Biochem Pharmacol ., 67 , pp. 1315-1326, 2004).
RBL-2H3 세포에 DNP-IgE 항체(10 ng/ml)를 첨가하여 18시간 동안 감작시킨 후 CKT 및 CKS를 첨가하여 1시간 동안 전 처리하였고 이후 DNP-BSA(10 μg/ml)를 첨가한 다음 6시간 후에 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 장 CKT 및 CKS에 의해서 DNP-BSA에 의해 증가된 IL-4의 유전자 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
실험예
7. IL-4 유전자의 프로모터(promoter)의 활성 억제효과 측정
CKT 및 CKS에 의한 IL-4 유전자의 프로모터 (promoter)의 활성 억제효과를 조사하기 위해서, IL-4-프로모터 루시페라제 리포터 유전자 어세이(promoter luciferase reporter gene assay)를 이용하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
RBL-2H3 세포에 IL-4-루시페라제 리포터 프로모터(도 5 참조)를 형질전환 (transfection)시키고 CKT, CKS 및 IL-4유전자의 프로모터 활성을 증가시키는 DNP-BSA(10μg/ml)를 각각 첨가시킨 후 IL-4 유전자의 프로모터(promoter)의 활성정도를 조사하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 DNP-BSA에 의한 IL-4 루시페라제의 활성도는 무처리군에 비하여 4.2배 증가하였지만, CKT는 농도 의존적으로 DNP-BSA에 의해 증가된 IL-4의 루시페라제 활성도를 감소시켰으며, CKS도 또한 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해, CKT 및 CKS가 DNP-BSA에 의한 알러지 유발로 인해서 증가되는 IL-4 프로모터의 루시페라제 활성도를 억제시킴을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
이와 같이 본 발명의 안전하고 독성이 없는 천연물인 CKT 및 CKS가 외부 물질이나 오염원에 의해 발생되는 알러지에 대한 과도한 면역반응인 알러지 반응을 억제시키는 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예
1.
산제의
제조
CKT (실시예 1-1) 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예
2. 정제의 제조
CKS (실시예 1-2) 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예
3. 캅셀제의 제조
CKT (실시예 1-1) 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예
4. 주사제의 제조
CKS (실시예 1-2) 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예
5.
액제의
제조
CKT (실시예 1-1) 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예
6. 건강 식품의 제조
CKS (실시예 1-2) 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예
7. 건강 음료의 제조
CKT(실시예 1-1) 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
도 1은 장생도라지 조추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 분획물들을 나타낸 모식도(가) 및 장생도라지 조사포닌 분획물에 대한 HPLC 그림(나)을 나타낸 것이며,
도 2는 장생도라지 조추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 조사포닌 분획물(CKS)의 면역글로블린 E (Immunoglobulin E; IgE) 생성량 억제 효과를 나타낸 도이고,
도 3는 장생도라지 조추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 조사포닌 분획물(CKS)의 IL-4의 생성량 억제 효과를 나타낸 도이고,
도 4는 장생도라지 조추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 조사포닌 분획물(CKS)의 IL-4의 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 5은 인터루킨-4 (interleukin-4; IL-4)의 프로모터를 모식화한 도이며,
도 6은 장생도라지 조추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 조사포닌 분획물(CKS)의 IL-4 프로모터의 루시페라제 억제 효과를 나타낸 도이다.
Claims (7)
- 장생도라지 물 조추출물 또는 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 HP-20 컬럼을 통과시켜, 당 성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 탈착시켜, 물 및 저급 알코올 가용 분획물을 각각 제조한 후, 상기 물 가용 분획물로부터 수득한 올리고당이 함유된 (1) 올리고당 정제 분획물 및 (2) 이눌린 정제 분획물 또는 상기 저급 알코올 가용 분획물에 에틸에테르를 가하여 침전된 침전물로부터 수득한 사포닌 성분이 함유된 (3) 조사포닌 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염의 예방 및 치료용 약학 조성물.
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- 장생도라지 물 조추출물 또는 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 HP-20 컬럼을 통과시켜, 당 성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 탈착시켜, 물 및 저급 알코올 가용 분획물을 각각 제조한 후, 상기 물 가용 분획물로부터 수득한 올리고당이 함유된 (1) 올리고당 정제 분획물 및 (2) 이눌린 정제 분획물 또는 상기 저급 알코올 가용 분획물에 에틸에테르를 가하여 침전된 침전물로부터 수득한 사포닌 성분이 함유된 (3) 조사포닌 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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