KR100868316B1 - 유방 조직에서 유래된 줄기 세포, 이의 제조방법 및이로부터 분화된 세포 - Google Patents

유방 조직에서 유래된 줄기 세포, 이의 제조방법 및이로부터 분화된 세포

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Abstract

본 발명은 유방 조직에서 유래된 다능성 줄기 세포 및 (a) 유방 조직으로부터 유방 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 유방 세포를 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양하는 단계; (c) 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계; 및 (d) 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포 및 (a) 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포를 목적 분화 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 배양 중에 목적 분화 세포의 마커를 발현하는 분화 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포는 상피 세포, 신경 세포 또는 골수 세포를 비롯하여 인체를 구성하는 여러 유형의 세포로 분화할 수 있다.

Description

유방 조직에서 유래된 줄기 세포, 이의 제조방법 및 이로부터 분화된 세포{Stem Cells Derived from Normal Breast Tissue and Breast Cancer Tissue, Preparation Method Thereof and Differentiated Cells from the Stem Cell}
본 발명은 줄기 세포에 관한 것으로 보다 자세하게는 유방 조직으로부터 유래된 줄기 세포 및 이의 제조방법 그리고 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포(embryonic stem cell)는 신체를 구성하는 모든 유형의 세포로 분화될 수 있는데 반하여 성체 줄기 세포(adult stem cell)는 배아 줄기세포보다 더욱 분화된 상태의 특정 전구 세포(progenitor cell)를 의미한다. 성체 줄기세포는 특정 세포조직에서 발견되는 것이 일반적으로 스스로 재생할 수 있는 기능을 가질 뿐만 아니라 다른 유형으로 분류되는 세포로도 분화할 수 있는 기능까지 보유하는 특성을 갖고 있다.
이와 같은 줄기 세포는 질병으로 인하여 조직 또는 장기가 손상되거나 본래의 기능을 발휘하지 못할 때 목적한 세포로 분화시켜서 원하는 부위에 이식시킴으로써 질병을 치료하는데 활용될 수 있다. 배아 줄기 세포는 모든 유형의 세포로 분화할 수 있기 때문에 다양한 질병을 치료하는데 이용될 수 있지만, 입수하기가 어렵고 윤리적인 문제가 있어 임상에서 사용되지 못하고 있다. 이를 대체하기 위하여 당업계에서는 성체 줄기 세포의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
국제특허공개 WO 2003/027281호는 골격근의 간질에서 유래하는 다능성 줄기 세포에 관한 것으로 상기 다능성 줄기 세포는 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 혈액 세포, 혈관내피 피소, 지방 세포, 골아 세포, 신경 세포, 간장 세포, 췌장 세포로 분화하는 능력을 가지며, 조직이나 세포의 재생, 심부전, 간부전, 신부전, 백혈병, 신경변성질환, 관절염, 당뇨병, 동맥경화 등의 치료에 이용될 수 있다는 것을 개시하고 있다.
대한민국특허공개 2003-0069115호는 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 전구세포의 분리배양방법 그리고 간엽조직으로의 분화 유도방법에 관한 것으로 제대혈을 피콜-하이팩 용액에 중첩시킨 후, 원심분리하여 단핵 세포층 침전을 얻고, 상기 단핵세포를 단층 배양하여 얻은 세포들을 간엽줄기세포 및 전구세포 특이 항원에 대한 항체와 일정시간 반응시키고, 세포분리기를 이용하여 해당 항체와 결합한 세포들만을 분리하여 배양함을 특징으로 하는 제대혈 유래 간엽줄기세포 및 전구세포의 분리배양방법을 개시하고 있다.
대한민국특허공개 2004-0068135호에는 타액성 선관상피 유래 줄기세포 및 그 용도에 관한 것으로 보다 자세하게는 타액선 선관상피에서 유래하고, 생체 외에서의 배양에 의해 A-페토프로테인 양성 세포, 알부민 양성 세포, 아밀라제 양성 세포, 인슐린 양성 세포 및 글루카곤 양성 세포로 분화할 수 있는 줄기 세포에 관한 것으로 상기 줄기 세포를 이식함으로써 간장 등의 장기를 재생할 수 있는 방법이 개시되어 있다.
이외에도, 여러 가지 유형의 세포로 분화할 수 있는 다능성을 보유하고 있는 것으로 알려진 성체 줄기 세포에는 (1) 신경세포(뉴론, 올리고덴트로사이트 및 에스트로사이트), 근육세포, 심근세포 및 간세포로 분화하는 조혈모세포(Hematopoietic stem cells), (2) 심근세포 및 근육세포로 분화하는 골수세포(Bone marrow stromal cells), (3) 혈구세포 및 근육세포로 분화하는 뇌줄기세포(Brain stem cells) 등이 포함된다. 현재까지 유방 조직으로부터 유래되어서 유방 조직을 구성하는 세포 이외의 세포로도 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포는 알려져 있지 않다.
본 발명은 유방 조직으로부터 유래된 다능성 줄기 세포를 제공한다.
다른 관점으로 (a) 유방 조직으로부터 유방 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 유방 세포를 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양하는 단계; (c) 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계; 및 (d) 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포의 제조방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서 상기 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포를 제공한다.
또 다른 관점으로서 (a) 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포를 목적 분화 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 배양 중에 목적 분화 세포의 마커를 발현하는 분화 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 분화된 유방 조직으로부터 유래된 다능성 줄기 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 "다능성 줄기 세포(또는 마모스페어)"는 성체 줄기 세포가 유래된 조직(즉, 유방 조직) 뿐만 아니라 그 이외 유형의 세포로도 분화할 수 있는 능력을 보유한 줄기 세포를 의미한다. 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 상피 세포, 신경 세포 또는 골수 세포로 분화할 수 있다.
본 발명에서 "마모스페어"는 유방 조직으로부터 분리된 유방 세포를 부유 배양 조건에서 계대 배양함으로써 수득한 상피세포로 이루어진 구 모양의 세포 덩어리를 의미하는 것이다. 구체적으로 유방 세포를 부유 배양 조건에서 계대 배양하면 대부분의 상피세포는 세포자연사(apoptosis)에 의해 사멸하지만 (이러한 과정은 아노이키스(anoikis)로 알려져 있다), 극히 상피세포는 생존하여 구 모양을 형성하는데 이들을 "마모스페어"라고 한다. 이러한 방법으로 적어도 1차례 이상 계대 배양된 마모스페어는 유방 줄기세포/전구세포로만 이루어지게 된다(Dontu, G. et al. 2003, Cell Prolif. "Stem cells in normal breast development and breast cancer", vol.36 Suppl 1, pp.59-72).
본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포는 (a) 유방 조직으로부터 유방 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 유방 세포를 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양하는 단계; (c) 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계; 및 (d) 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법의 단계 (a)는 유방 조직을 미세 절단하여 분리된 바람직하게는 단일(single) 유방 세포를 수득하는 단계이다. 상기 유방 세포는 분화된/미분화된 유방 세포가 혼합된 상태일 수 있다. 한 양태로서, 유방 조직은 호모지나이저, 막자사발, 블렌더, 외과용 매스, 주사기, 포르셉 또는 초음파 장치를 이용하는 물리적 수단에 의해 미세 절단될 수 있다. 다른 양태로서, 효소를 이용할 수도 있는데 이용 가능한 효소의 예로는 중성 프로테아제, 트립신, 키모트립신 및 써모리신을 포함하는 세핀 프로테아제, 엘라스타제 및 콜라게나제 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 양태로서 전술한 물리적 수단과 효소 처리를 병행할 수도 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (b)에서는 앞서 분리된 유방 세포를 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양한다. 상기 줄기 세포 배양용 배지로는 DMEM, F12, B27 supplement 및 성장 인자(예, EGF, PDGF, VEGF, FGF, IGF, LIF 등)로 이루어진 배지를 이용하는 것이 적합하다. 필요에 따라 상기 배지는 사이토카인(예, 인슐린, 에스트라디올, 인터루킨, 코르티코스테론 등) 및 항생제(예, 페니실린, 스트렙토마이신 등)로부터 선택된 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 S 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 "S 배지"는 DMEM, F12, B27 supplement, bFGF, hEGF, LIF 및 항생제를 포함한다. 상기 S 배지의 바람직한 양태는 DMEM 대 F12를 1 내지 5 대 1, 바람직하게는 2 내지 4 대 1로 포함하고, B27 supplement를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml, 바람직하게는 0.1㎕/ml 내지 100㎕/ml로 포함하며, bFGF를 0.1ng/ml 내지 1mg/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 100㎍/ml로 포함하고, hEGF를 0.1ng/ml 내지 100ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 50ng/ml로 포함하며, LIF를 0.1ng/ml 내지 1mg/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 100㎍/ml로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml, 바람직하게는 1㎕/ml 내지 100㎕/ml로 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (c)는 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계로 부유 상태의 세포는 일차 배양물을 원심분리하거나 세포 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 여과하는 등 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법의 단계 (d)는 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계로서, 상기 줄기 세포 배양용 배지는 단계 (a)에서 이용된 줄기 세포 배양용 배지와 동일하며 다능성 줄기 세포를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 따라 실시할 수 있다. 여기서, 계대 배양은 적어도 1차례 이상, 바람직하게는 5차례 이상, 보다 바람직하게는 7차례 이상 진행할 수 있다. 각 계대 배양시에는 이전 배양을 통하여 얻은 배양물 중 부유 상태의 세포를 수집하여 배양시킨다. 이러한 계대 배양을 통하여 실질적으로 순수한(약 95% 이상) 다능성 줄기 세포로 이루어진 마모스페어를 얻을 수 있다.
앞서 주지된 바와 같이 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 줄기 세포는 다능성이므로 인체를 구성하는 여러 유형의 세포로 분화시킬 수 있다.
줄기 세포를 특정한 유형의 세포로 분화시키는 방법은 당업계에 알려져 있으며 본 발명에서도 그러한 공지된 방법을 기초로 하여 본 발명에 따른 줄기 세포를 목적한 유형의 세포(이하, 목적 분화 세포라고 함)로 분화시킬 수 있다. 구체적으로 (a) 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포를 목적 분화 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 배양 중에 목적 분화 세포의 마커를 발현하는 목적 분화 세포를 분리하는 단계를 거쳐서 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포를 제조할 수 있다.
한편, 배양 중인 세포가 목적 분화 세포의 마커를 발현하는지 여부는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있는데 RT-PCR, 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), ELISA 방법 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 유방 조직 유래의 줄기 세포는 상피 세포로 분화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 한 측면은 상술한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화되고 상피 세포 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 상피 세포에 관한 것이다.
그러한 상피 세포는 한 양태로서 (a) 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포를 상피 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 배양 중에 상피 세포의 마커를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다. 상기 상피 세포 배양용 배지로는 DMEM, F12, 성장인자(예, EGF, PDGF, VEGF, FGF, IGF, LIF 등), 사이토카인(예, 인슐린, 에스트라디올, 인터루킨, 코르티코스테론 등) 및 미량 원소(예, 트랜스페린)로 이루어진 배지를 이용하는 것이 적합하다. 필요에 따라 상기 배지는 혈청(예, FBS) 및 항생제(예, 페니실린, 스트렙토마이신 등)로부터 선택된 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 SNU 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 "SNU" 배지는 DMEM, F12, EGF, 인슐린, 하이드로코르티손, 사람 트랜스페린, 17-베타에스트라디올 10 및 항생제를 포함한다. 상기 SNU 배지의 바람직한 양태는 DMEM 대 F12를 1 내지 3 대 1, 바람직하게는 3 대 1로 포함하고, EGF를 0.01ng/ml 내지 1mg/ml, 바람직하게는 0.1ng/ml 내지 100㎍/ml로 포함하며, 인슐린을 0.1ng/ml 내지 1mg/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 100㎍/ml로 포함하고, 사람 트랜스페린을 0.1ng/ml 내지 1mg/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 100㎍/ml로 포함하며, 17-베타에스트라디올 10을 10-12M/ml 내지 10-2M/ml, 바람직하게는 10-9M/ml 내지 10-3M/ml로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml, 바람직하게는 0.1㎕/ml 내지 10㎕/ml로 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포는 신경 세포 또는 골수 세포로 분화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 측면은 상술한 유방 조직 유래의 다능성 다능성 줄기 세포로부터 분화되고 신경 세포 마커 또는 골수 세포 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포 또는 골수 세포에 관한 것이다.
그러한 신경 세포 또는 골수 세포는 한 양태로서 (a) 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포를 신경 세포 또는 골수 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 이러한 배양 중에 신경 세포 마커 또는 골수 세포 마커를 발현하는 세포를 분리하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다. 상기 신경 세포 또는 골수 세포 배양용 배지로는 DMEM, F12, B27 supplement 및 혈청(예, FBS)으로 이루어진 배지를 이용하는 것이 적합하다. 필요에 따라 상기 배지는 성장 인자(예, EGF, PDGF, VEGF, FGF, IGF, LIF 등), 사이토카인(예, 인슐린, 에스트라디올, 인터루킨, 코르티코스테론 및 항생제(예, 페니실린, 스트렙토마이신 등)로부터 선택된 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 SD 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 "SD 배지"는 DMEM, F12, B27 supplement, 항생제 및 혈청을 포함한다. 전술한 구성 성분들은 당업계에 공지된 다른 대체물로 치환될 수도 있다. 상기 SD 배지의 바람직한 양태는 DMEM 대 F12를 1 내지 5 대 1로, 바람직하게는 2 내지 4 대 1로 포함하고, B27 supplement를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml, 바람직하게는 0.1㎕/ml 내지 100㎕/ml로 포함하며, 혈청을 0.1㎕/ml 내지 1ml/l, 바람직하게는 0.1㎕/ml 내지 100㎕/ml로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml, 바람직하게는 0.1㎕/ml 내지 10㎕/ml로 포함하는 것이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명은 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
본 발명에서 이용된 배지
마모스페어 배양 배지는 DMEM:F12 = 3:1, B27 supplement, 40ng/ml의 bFGF, 20ng/ml의 EGF, 10ng/ml의 LIF, 페니실린과 스트렙토마이신으로 이루어져 있다(S 배지). 유방 조직 유래의 줄기세포를 근상피세포(myoepithelial cells) 및 관상피세포(luminal cells)로 분화시키기 위한 SNU 배지는 DMEM:F12 = 1:1, 0.5ng/ml의 EGF, 5㎍/ml의 인슐린, 0.5㎍/ml의 하이드로코르티손, 4㎍/ml의 사람 트랜스페린, 17-에스트라디올 10-8M, 페니실린과 스트렙토마이신으로 이루어져 있다. 유방 조직 유래의 줄기세포를 신경 세포(neuronal cells) 또는 중간엽 세포(mesenchymal cells)로 분화시키기 위한 SD 배지는 DMEM:F12 = 3:1, B27 supplement, 페니실린과 스트렙토마이신 및 3% FBS가 이용되었다.
여기서, DMEM, F12, 트립신, B27 supplement, 페니실린, 스트렙토마이신, 트립신 및 0.4% 트리판 블루 염색 용액은 Gibco-BRL(Grand Island, NY)로부터 입수하였다. 폴리-L-리신, 타입 IV 콜라겐 및 래비트 항-피브로넥틴 항체는 Sigma(St. Louis, MO)로부터 입수하였다. 인슐린, EGF, bFGF, LIF, 하이드로코르티손, 사람의 트랜스페린, 17-베타에스트라디올-10은 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다. 콜라게나제는 Roche(Indianapolis, IN)로부터, FBS는 HyClone(Cramlington, Northumberland, UK)으로부터, 4',6'-diamidino-2-phenylindole hydrochloride(DAPI)가 적층된 Vectashield 배지는 Vector Laboratories (Burlingame, CA)로부터 구입하였다. 40㎛ 세포 스트레이너, 코팅되지 않은 조직 배양 디쉬 및 24 구판은 모두 Falcon(San Jose, CA)으로부터 구입하였다. 18mm 커버 슬립은 Marienfield(Germany)로부터 입수하였다.
<실시예 2>
유방 조직으로부터 유래된 줄기 세포의 배양
정상 유방 조직/암에 걸린 유방 조직을 떼어낸 후 그 조직을 1-2mm의 단편으로 잘게 자른 후 인산완충용액(PBS)으로 3차례 세정하였다. 그 다음 37℃에서 1시간 동안 콜라게나제로 소화시킨 후 FBS를 처리하여 상기 콜라게나제를 불활성화시켰다. 효소 처리 후에 실내 온도에서 수분 동안 볼텍싱(vortexing)하여 조직을 기계적으로 분쇄하였다. 이렇게 수득한 세포들을 2000RPM에서 5분 동안 원심분리하고 펠렛은 PBS로 2차례 세정하였다. 상기 펠렛을 S 배지에 피페팅(pipetting)을 통하여 재현탁시키고 40㎛의 세포 스트레이너로 여과시켰다. 이 때, 단일 세포 현탁액의 생존율은 0.4% 트리판 블루 용액을 사용하여 측정하였다. 상기 세포들을 코팅되지 않은 디쉬에 접종하고 S 배지로 5%의 CO2를 포함하는 습한 공기 중 37℃에서 일차 배양하였다. 상기 일차 배양물을 약 5분 원심 분리함으로써 일차 배양물 중 부유 상태의 세포들을 수집한 후 코팅되지 않은 디쉬에 접종하고 S 배지로 5%의 CO2를 포함하는 습한 공기 중 37℃에서 계대 배양하였다. 각 계대 배양시마다 생존 세포수는 0.4% 트리판 블루 염색으로 측정되었다. 최초 분리된 유방 세포는 10일 후에 계대 배양되었으며 그 이후의 세포들은 매 7일마다 계대 배양되었다.
도립 현미경(inverted system microscope)[DP50 camera system (Olympus, Tokyo, Japan)을 장착한 IX51 model (Olympus, Tokyo, Japan)]을 이용하여 각 계대 배양시마다 마모스페어를 사진 촬영하였고 PC에 저장한 후 포토샵 7.0 소프트웨어(Adobe Systems, San Jose, CA)로 처리하였다.
각 계대 배양시마다 생존 세포수를 Neubauer 카운팅 챔버에서 0.4% 트리판 블루 염료를 이용하여 측정하였다. 각 계대 배양시마다 측정된 생존 세포수는 최초 현탁 직전에 초기 생존 세포수와 비교하였다. 그 결과 생존 세포수가 1번째 계대 배양 이후에 급격하게 감소하여 초기 생존 세포수의 10% 이하로 감소하였으며, 그 이후에는 완만하게 감소하다가 7번째 계대배양 이후에는 초기 생존 세포수의 1% 이하로 감소하였다. 10번째 계대 배양 시까지 정상 조직 유래의 마모스페어와 암 조직 유래의 마모스페어 간의 차이는 없었으며(도 1), 10번째 계대 배양 시까지 이들로부터 유래된 다양한 형태의 마모스페어를 관찰할 수 있었다(도 2a 및 도 2b).
<실시예 3>
유방 조직으로부터 유래된 줄기 세포의 상피 세포로의 분화
상기 실시예 2를 통하여 10차례 계대 배양된 마모스페어를 회수하여 원심분리하고 PBS로 세정한 후 상기 마모스페어는 현탁시키고 24구판 중에 10㎍/ml의 타입 IV 콜라겐으로 코팅된 18mm 커버 슬립 상에 재접종하였다. 상기 세포들은 SNU 배지 중에서 3일 동안 배양된 후 상피 세포로의 분화 여부를 확인하였다.
마모스페어는 접종 후 1 시간 이내에 부착되었으며 상기 마모스페어의 하부에 위치한 초기 접착성의 세포들은 원심적으로 이동하고 그들의 형태를 분화된 세포로 변화시킨다. 부착 3일 후에 가장자리에 위치한 세포들의 급성장이 진행되지만 마모스페어의 둥근 형태는 부착된 정상 세포 유래 마모스페어와 암세포 유래 마모스페어에서 유지되었다(도 3).
추가로 유방 조직 유래의 줄기 세포가 상피 세포로 분화하는지 여부는 다음 면역염색화학분석법에 이용하여 확인되었다. 근상피세포로의 분화는 CK14 마우스 모노클로날 IgG3 항체(1:1000; Chemicon, Temecula, CA)로 검출하였고 관상피세포로의 분화는 CK18 래비트 폴리클로날 IgG 항체(1:1,000; Calbiochem, Darmstadt, Germany)로 동정하였다. 아울러, 이차 항체로는 로다민(TRITC)-콘쥬게이티드 고우트 안티-래비트 IgG 항체(1:400; ZYMED)와 플루오르세인(FITC)-콘쥬게이티드 고우트 안티-마우스 IgG 항체(1:500; Sigma)가 이용되었다.
면역화학분석법은 다음과 같이 진행되었다. 18mm 커버 슬립 상에 배양된 세포는 PBS로 세정하고 4% 포름알데히드 용액으로 실온에서 15분 동안 고정시켰다. PBS로 3차례 세정한 후 0.5% 트리톤 X-100으로 실온에서 15분 동안 침투를 실시한 후 PBS로 3차례 세정하였다. 5% FBS로 보충된 PBS를 이용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹한 후 여러 차례 PBS로 세정하였다. 세포들은 일차 항체로 1시간 동안 정치시켰다. PBS로 여러 차례 세정하고 이차 항체로 1시간 동안 정치시킨 후 PBS로 3차례 세정하였다. 그 다음 면역 염색된 세포들은 Vectashield mounting 배지에서 보관하였다.
현미경 검사법(Confocal microscopy)은 Axiovert LSM 510 현미경(Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 진행하였다. 수득한 이미지는 LSM Pascal 버전 3.1 및 포토샵 7.0 소프트웨어(Adobe Systems, San Jose, CA)를 이용하여 처리하였다. FITC- 및/또는 TRITC 콘쥬게이티드 이차 항체를 갖는 이중으로 표지된 샘플들은 동시에 또는 순차적으로 분석되었다. 각 경우에, FITC는 블루빔으로 여기시키고 interferential narrow band 필터(BP 505-550nm)를 이용하여 검출하는 반면에 TRITC는 레드빔으로 여기시키고 long pass 필터(LP 650nm)를 이용하여 검출하였다.
세포들은 항-CK14(녹색) 및 항-CK18(적색)로 표지되었다. 세포의 핵은 DAPI(청색)으로 염색되었다. CK14 및 CK18 동시 발현 세포는 접착성의 정상 조직 유래의 마모스페어에서 동정되었다(도 4). 암 조직 유래의 마모스페어에서 이능성의 간세포가 이와 동일한 방법으로 동정되었다(도 5). CK14 및 CK18 동시 발현 세포는 급생장하는 분화된 세포가 아니라 마모스페어에 위치하였다. 이상의 결과로부터 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포가 상피 세포로 분화할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
유방 조직으로부터 유래된 줄기 세포의 신경 및 골수 세포로의 분화
상기 실시예 2를 통하여 10차례 계대 배양된 마모스페어를 회수하여 원심분리하고 PBS로 세정한 후 상기 마모스페어는 현탁시키고 24구판 중에 10㎍/ml의 타입 IV 콜라겐으로 코팅된 18mm 커버 슬립 상에 재접종하였다. 상기 세포들은 SD 배지 중에서 3일 동안 배양된 후 상피 세포로의 분화 여부를 확인하였다.
마모스페어는 접종 후 1 시간 이내에 부착되었으며 상기 마모스페어의 하부에 위치한 초기 접착성의 세포들은 원심적으로 이동하고 그들의 형태를 분화된 세포로 변화시킨다. 부착 3일 후에 가장자리에 위치한 세포들의 급성장이 진행되지만 마모스페어의 둥근 형태는 부착된 정상 조직 유래 마모스페어와 암조직 유래 마모스페어에서 유지되었다(도 6).
추가로 유방 조직 유래의 줄기 세포가 신경 세포 또는 골수 세포로 분화하는지 여부는 다음 면역염색화학분석법에 이용하여 확인되었다. 신경 간세포/전구세포는 마우스의 모노클로날 IgG1 항-네스틴 항체(1:100; BD Pharmingen)를 이용하여 검출하였다. 중간엽세포는 래비트 항-피브로넥틴 폴리클로날 항체(1:500; Sigma)로 동정하였다. 이 때, 면역화학분석방법은 실시예 3과 동일한 절차에 따라 진행되었다.
세포들은 핵 염색 DAPI(청색), 항-네스틴(녹색), 항-피브로넥틴(적색)으로 표지되었다. 신경 세포의 줄기 세포 마커인 네스틴에 대한 녹색의 염색은 급생장하는 분화된 세포가 아니라 마모스페어의 중심부에 있는 미분화된 부분에서 관찰되었다. 골수 세포 마커인 피브로넥틴에 대한 적색의 염색은 중심부 뿐만 아니라 급생장하는 영역에서도 확인되었다. 이러한 패턴은 정상 조직 유래의 마모스페어(도 7)와 암 조직 유래의 마모스페어(도 8)에서 유사하였다. 이상의 결과로부터 본 발명에 따른 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포가 신경 세포 또는 골수 세포로 분화할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 유방 조직 유래의 줄기 세포는 다능성이므로 인체를 구성하는 여러 세포로 분화시킬 수 있으므로 궁극적으로는 여러 가지 질병을 치료하는데 이용될 수 있다.
도 1은 유방 세포를 계대 배양하면서 형태의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다(A-D: 정상 유방 조직에서 유래된 마모스페어, E-H: 유방 암조직으로부터 유래된 마모스페어).
도 2a는 정상 유방 세포의 계대 배양에 따른 생존 세포수의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 유방 암세포의 계대 배양에 따른 생존 세포수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 유방 조직 유래의 줄기 세포를 상피 세포로 분화시키면서 형태의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다(A: 정상 유방 조직 유래의 줄기 세포를 분화, B: 유방 암 조직 유래의 줄기 세포를 분화).
도 4는 정상 유방 조직 유래의 줄기 세포를 상피 세포로 분화시킨 결과 근상피세포와 관상피세포 마커가 발현됨을 나타낸 것이다.
도 5는 유방 암 조직 유래의 줄기 세포를 상피 세포로 분화시킨 결과 근상피세포와 관상피세포 마커가 발현됨을 나타낸 것이다.
도 6은 유방 조직 유래의 줄기 세포를 신경 세포 또는 골수 세포로 분화시키면서 형태에서의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다(A: 정상 유방 조직 유래의 줄기 세포, B: 유방 암 조직 유래의 줄기 세포).
도 7은 정상 유방 조직 유래의 줄기 세포를 신경 세포 또는 골수 세포로 분화시킨 결과 신경 세포 또는 골수 세포 마커가 발현됨을 나타낸 것이다.
도 8은 유방 암 조직 유래의 줄기 세포를 상피 세포로 분화시킨 결과 신경 세포 또는 골수 세포 마커가 발현됨을 나타낸 것이다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (a) 유방조직으로부터 분리한 유방 세포를 DMEM 대 F12를 1 내지 5 대 1로 포함하고, B27 supplement를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하며, bFGF를 0.1ng/ml 내지 1mg/ml 포함하고, hEGF를 0.11ng/ml 내지 100ng/ml로 포함하며, LIF를 0.1ng/ml 내지 1mg/ml로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함한 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양하는 단계;
    (b) 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계; 및
    (c) 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방조직 유래의 다능성 줄기 세포의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (a) 유방조직으로부터 분리한 유방 세포를 DMEM 대 F12를 1 내지 5 대 1로 포함하고, B27 supplement를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하며, bFGF를 0.1ng/ml 내지 1mg/ml 포함하고, hEGF를 0.11ng/ml 내지 100ng/ml로 포함하며, LIF를 0.1ng/ml 내지 1mg/ml로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함한 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양하는 단계;
    (b) 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계;
    (c) 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계;
    (d) 상기 다능성 줄기세포를 목적 분화 세포 배양용 배지에서 배양하는 단계; 및
    (e) 배양 중에 목적 분화 세포의 마커를 발현하는 목적 분화 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 목적 분화 세포는 상피 세포인 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 상피 세포 배양용 배지는 DMEM 대 F12를 1 내지 3 대 1로 포함하고, EGF를 0.01ng/ml 내지 1mg/ml로 포함하며, 인슐린을 0.1ng/ml 내지 1mg/ml로 포함하고, 사람 트랜스페린을 0.1ng/ml 내지 1mg/ml로 포함하며, 17-베타에스트라디올 10을 10-12M/ml 내지 10-2M/ml로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 목적 분화 세포는 신경 세포인 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 신경 세포 배양용 배지는 DMEM 대 F12를 1 내지 5 대 1로 포함하고, B27 supplement를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하며, 혈청을 0.1㎕/ml 내지 1ml/l로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 목적 분화 세포는 골수 세포인 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 골수 세포 배양용 배지는 MEM 대 F12를 1 내지 5 대 1로 포함하고, B27 supplement를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하며, 혈청을 0.1㎕/ml 내지 1ml/l로 포함하고, 항생제를 0.1㎕/ml 내지 1ml/ml로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포의 제조방법.
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