KR101585914B1 - 각질세포성장인자를 이용한 유선지방체지방줄기세포의 유선상피세포로의 분화 유도 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 각질세포성장인자를 이용한 유선지방체지방줄기세포의 유선상피세포로의 분화 유도 방법, 이를 위한 조성물 및 이를 이용한 유방질환 치료용 조성물에 관한 것인데, 본 발명에서는 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor)가 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell)를 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로 분화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 유선상피세포의 비정상적 형질 전환 또는 괴사로 인하여 발생하는 각종 유방 질환에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

각질세포성장인자를 이용한 유선지방체지방줄기세포의 유선상피세포로의 분화 유도 방법 {Method for differentiation of mammary fat pad adipose stem cell to mammary epithelial cell with keratinocyte growth factor}

본 발명은 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor, KGF)를 이용한 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell)의 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로의 분화 유도 방법, 이를 위한 조성물 및 이를 이용한 유방질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

포유동물의 유선(mammary gland)은 젖이 분비되는 조직으로서 인체 내 중요 조직 중 하나이다. 정상적인 수유가 가능하려면 온전한 상태로 유선 조직이 유지되어야 하는데, 유선상피세포는 중요한 역할을 수행한다.

발암성 인자에 의해 유선상피세포가 암적 형질로 변환되거나, 병원균에 의해 감염되어 유선에 염증이 유발되고 유선상피세포가 괴사하면 정상적인 수유 기능이 불가능해 진다. 이와 같은 문제가 발생한 경우, 유선지방체지방줄기세포로부터 정상적인 유선상피세포로의 분화를 계속 유도하는 것은 중요한 치료 방법일 수 있다.

따라서, 유선지방체지방줄기세포로부터 유선상피세포로의 분화 연구는 절실히 필요한 것인데, 본 발명은 포유동물의 유선 발달과 관련되는 미결된 문제에 대하여 유선중간엽세포의 유선상피세포로의 분화에 관계된 메카니즘을 파악하고, 유선중간엽세포를 유선상피세포로 분화를 유도할 수 있는 물질을 발굴하기 위해 수행되었다.

상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT)와 그 반대 과정인 중간엽-상피 전이(mesenchymal-epithelial transition, MET)는 생체 내부에서의 기관 형성과 형태 형성에 필요한 두 과정이다.

상피세포의 중간엽세포로의 전환을 “EMT”라 하며, 그 반대는 “MET”로 정의한다. 유선암 진행과 EMT 간의 상관관계는 많은 문서에서 입증되었고, 현재는 기정사실화되어 있다.

EMT는 일반적으로 상피 내 세포 접합의 손실, 액틴세포골격의 변화, 상피-특이 유전자 발현의 하향조절(downregulation) 및 중간엽 마커(marker)의 후속적인 상향조절(upregulation)을 야기한다. 하지만, 초기에 전환분화된(transdifferentiated) 세포는 상피 계열로 다시 전환되는 유연성을 어느 정도 갖는다. 다만, 중간엽에서 상피 계열로 전이되는 역전이 과정, 즉 MET가 유선에서 일차 암종의 임상적 양상을 방지하는 방법을 찾는 데 기여할 수 있다는 가정과 가설은 제안된 바가 거의 없다.

예전에는, EMT의 메카니즘과 EMT의 상향조절 및 하향조절에 영향을 미치는 인자 (방사선, 호르몬 및 성장인자 포함)를 조사하고, EMT의 유선 형태 형성과 질환 전이에 미치는 영향을 파악하기 위한 연구가 많이 실시되었으나, 역전이 과정(MET)에 관한 연구는 많이 부족한 상태이다.

대한민국 특허공개번호 제10-2006-0110542호 (공개일자 2006년 10월 25일)에는, 유방 조직에서 유래된 다능성 줄기 세포 및 (a) 유방 조직으로부터 유방 세포를 분리하는 단계; (b) 상기 유방 세포를 줄기 세포 배양용 배지에서 일차 배양하는 단계; (c) 상기 일차 배양물로부터 부유 상태의 세포들을 수집하는 단계; 및 (d) 상기 부유 상태의 세포들을 줄기 세포 배양용 배지에서 계대 배양하여 다능성 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함한 유방 조직 유래의 다능성 줄기 세포의 제조방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2013-0109857호 (공개일자 2013년 10월 08일)에는, 레티노산을 유효성분으로 포함하는 유선상피세포의 분화 유도용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 유선상피세포의 유즙분비세포로의 분화 유도 방법이 기재되어 있다.

본 발명에서는 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell)가 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로 분화될 수 있음을 규명하고, 이와 같은 분화를 유도할 수 있는 물질을 발굴하여 제공하고자 한다.

본 발명은 제1형태로, 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 제1형태에 있어서, 상기 분화는 바람직하게 전환분화(transdifferentiation)일 수 있다.

본 발명의 제1형태에 있어서, 상기 유선상피세포는, 일 예로 소, 염소 및 양 중 선택되는 포유동물 중 어느 하나의 유선상피세포일 수 있다.

본 발명의 제1형태에 있어서, 상기 조성물은, 바람직하게 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell)를 유선상피세포로 분화 유도하는 것일 수 있다.

한편, 본 발명은 제2형태로, 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 유방 질환은, 일 예로 유방염, 유방암 및 유방비대증 중 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 이때, 유방비대증은 일 예로, 유방성숙기 또는 수유기에 발생하는 것일 수 있다. 또한, 상기 유방은, 일 예로 소, 염소 및 양 중 선택되는 포유동물 중 어느 하나의 유방일 수 있다.

본 발명에 의할 경우, 유선지방체지방줄기세포의 유선상피세포로의 분화가 확인되기 때문에, 유선상피세포의 괴사를 불러일으키는 유방염 또는 유선상피세포의 암화로 말미암은 유방암 등에 적용이 가능한 것이다. 또한, 유선지방체줄기세포의 유선상피세포로의 분화를 유도하기 때문에 유방조직 비대로 말미맘은 유방비대증에도 적용 가능한 것이다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 가축의 사료에 혼합하여 투여될 수도 있고, 투여 용량의 정확한 조절을 위하여 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 보조제와 혼합되어 여러 가지 제형으로 제제화될 수도 있다. 이러한 제형에는 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 드렌치 (drench) 등의 액제, 유제 및 현탁제 등의 경구용 제제와 비경구용 제제로서 주사제 등이 포함된다.

본 발명의 조성물을 포함하는 동물용 주사제는 약제학적으로 허용가능한 담체로서 증류수, 올레인산에칠, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등; 항산화제로서 아스코르브산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, 토코페롤 등; 보존제로서 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 파라옥시안식향산메칠, 벤질알코올 등을 이용하여 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물을 포함하는 동물용 산제 및 과립제는 통상적으로 사용되는 비타민류, 글루코스, 락토스 등의 당류, 전분, 말분, 질석 또는 각종 분말 및 액상효소를 사용량 범위로 함유시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서 제조된 조성물의 급여는 일 예로, 펠렛형 사료첨가제로서 통상적으로 동물에 적용할 수 있고, 산제 및 과립제는 음수 및 사료에 혼합하여 투여할 수 있다. 투여량은 활성성분인 각질세포성장인자 기준으로 하루에 동물의 체중당 '5μg 내지 500mg / kg체중'으로 급여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 증상 및 대상 동물의 상태에 따라 증감될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물의 급여는 일 예로, 유방염에 감염된 동물의 유두에 주사를 통하여 투여될 수 있다. 투여량은 분방 당 1일 1 내지 2회, 각질세포성장인자 함량으로 '5ng 내지 500μg / mL'으로 투여할 수 있으나, 치료하고자 하는 포유동물의 종류, 나이, 및 증상 등에 따라 투여량 및 투여 횟수는 달라질 수 있다.

한편, 본 발명은 제3형태로, 유선지방체지방줄기세포를 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor)를 유효성분으로 포함하는 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 제3형태에 있어서, 상기 분화는 바람직하게 전환분화(transdifferentiation)일 수 있다.

본 발명의 제3형태에 있어서, 상기 조성물은, 바람직하게 각질세포성장인자를 조성물 중 1~100 ng/mL의 농도로 함유하고 있는 것이 좋다.

본 발명에서는, 유선지방체 (mammary fat pad)로부터 지방줄기세포를 분리하였는데, 각질세포성장인자에 의해 상피세포계열로 분화됨을 확인할 수 있었다. 혼합물 (5 μg/ml의 인슐린, 1 μg/ml의 히드로코르티손 및 10 ng/ml의 표피성장인자)에서 배양한 후, 10 ng/ml의 각질세포성장인자로 처리하면, 유선지방체지방줄기세포가 상피세포계통으로 전환-분화 (trans-differentiating)될 수 있음이 확인되었다.

본 발명의 실험 2일 후부터 유선지방체지방줄기세포는 각질세포성장인자의 영향을 받아, 장방형(2-4일) 또는 입방형(8-10일)으로 형태가 변했고, Ayoub-Shklar 염색을 통해 적갈색으로 염색되었는데, 이는 상피세포계통으로 분화되었음을 의미한다. 이때, K8와 K18의 발현은 매우 유의적이었고 (p<0.01), 상피막 항원과 상피특이항원의 발현도 0일에 비해 유의적이었다 (p<0.05).

결론적으로, 본 발명에서는 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor)에 의해 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell)가 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로 분화 유도될 수 있음을 확인한 것이다.

따라서, 본 발명은 유선상피세포의 비정상적 형질 전환 또는 괴사로 인하여 발생하는 각종 유방 질환에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 실험을 위해 사용한 조직의 수득 부위, 세포 증식 및 배가 시간 계산 결과를 보여준다. A: 유방 지방체 지방 조직을 수득하기 위한 유두 하부로부터 약 5 cm 떨어진 지점의 수술 부위를 나타내는 사진 (백색 직선은 유두 하부로부터의 거리를 나타낸다). B: 세포의 초기 접종 5일 후 밀집된 콜로니의 형성을 나타내는 사진 (x10). C: 후속 계대시 MFPASC(mammary fat pad adipose stem cell)의 일관된 섬유모세포-유사 형태 사진(x10). D: 계대별 MFPASC의 세포 배가 시간(DT)을 나타내는 그래프, 막대는 평균 ± SEM을 나타냄. * p<0.05 및 ** p<0.01은 유의값을 나타냄.
도 2는 대한민국 흑염소에서 분리된 세포로서, 제2계대 MFPASC(mammary fat pad adipose stem cell) 세포의 줄기세포로서의 특징을 보여준다. A: MFPASC에서의 CD13 대비 상대적 유전자 발현, CD44(p<0.01) 및 비멘틴(p<0.05)의 유의적 발현은 나타났지만, CD13, CD34 및 CD106의 발현은 관찰되지 않았음. 표준화는 GAPDH를 이용하여 수행함. B: 면역블로팅에서 CD44(p<0.01), CD106(p<0.05) 및 비멘틴(p<0.05)의 발현율(%)은 CD13 발현에 비해 유의함. 이때, CD13 및 CD34는 검출되지 않았음. C: CD44, CD106 및 비멘틴의 양성 발현을 나타내는 동일 초점 현미경사진. 막대는 평균 ± SEM을 나타냄. *p<0.05 및 ** p<0.01은 유의값을 나타냄.
도 3은 유선지방체지방줄기세포(MFPASC)의 Oil-Red-O 염색 및 광학 현미경 사진이다. A: 분화 후 10일에도 대조군(무처리군)에서는 MFPASC에 지질/지방 액적이 형성되지 않았음. B: 대조 배지에 유지된 MFPASC의 불량한 Oil-Red-O 염색 결과. C: 10 μM TZD로 보충된 지방세포 유도 10일 후, 비산된 지방 액적 형성됨. D: 10 μM TZD로 처리된 MFPASC의 양성 Oil-Red-O 염색 결과. E: 10 μM TZD + 100 μM LA로 보충된 지방세포 유도 후 10일에 지방 액적 클러스터 형성됨. F: 10 μM TZD + 100 μM LA로 처리된 MFPASC의 양성 Oil-Red-O 염색 결과. 기준자(도 5에 기재된 것과 일치)는 ×20배 배율을 나타낸다.
도 4는 티아졸리딘디온(TZD) 단독 및 TZD와 리놀렌산(LA)의 혼합물을 이용한 MFPASC의 분화 단계에서 상대적 유전자 발현의 정량적 결과를 보여준다. Adipo-Q(A), PPAR γ(B), C/EBP α(C), LPL(D) 및 레시스틴(E). 표준화는 관리(housekeeping) 유전자인 GAPDH로 수행함. 다양한 보충제로 처리된 MFPASC의 배양일 별 Oil-Red-O 용출지수(mg/ml) (F). 막대(bar)는 평균 ± SEM을 나타냄. * p<0.05 및 ** p<0.01은 각 군에서 분화되지 않은 0일 세포에 비해 유의적인 값을 나타냄.
도 5는 유방지방체지방줄기세포(MFPASC)의 내강 상피세포계열 분화를 보여준다. A: 상피화 유도 0일에는 Ayoub-Shklar 염색이 나타나지 않았음 (적갈색 세포질/핵을 나타내는 세포는 없었음). B: 분화 10일 후, 양성 Ayoub-Shklar 염색 결과(세포는 적갈색을 나타내어 분화된 것으로 판단됨). C: 분화 시간(일)별 Ayoub-Shklar 염색도 (%). D: 상피화 유도와 그 후의 10 ng/ml KG으로의 노출시 MFPASC의 분화 중 상피화 일수에 따른 유방 상피-특이 유전자 발현의 상대적 정량화 결과. 표준화에는 GAPDGH 유전자가 사용됨. 기준자(scale bar)은 ×40배 배율을 나타낸다. 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. * p<0.05 및 ** p<0.01는 0일 분화되지 않은 세포 대비 유의적인 값을 나타낸다.

중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)는 간질에서 유래하고 지방 조직, 태반, 골수 등의 별개의 기관과 조직에서 유도된다. 지방 조직은 기본적으로 풍부하여 입수하기 쉽고, 수득이 용이하므로 MSC의 우수한 공급원이다. 지방 조직에서 얻은 MSC는 지방에서 유도된 줄기세포 (adopose-derived stem cell, ASC)라 칭한다. ASC는 1960년대에 Robdell과 그의 동료에 의해 분리되어 최초로 보고되었고, 그 이후에도 많이 변형되어 양질과 다량의 ASC가 보고되었다.

본 발명에서는 ASC의 상피세포계통으로의 분화를 조사하고, 중간엽-상피 전이(mesenchymal-epithelial transition, MET)가 유선에서의 많은 질병의 임상적 발현을 방지할 수 있을 것이라는 가정하에, 유방 지방체에서 중간엽 세포를 분리하는 것을 선택하였다.

Bunnel et al.(2008)에 의해 설계되고 공개된 규정에 따라 대한민국 미성숙 흑염소에서 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell, MFPASC)를 분리하고자 하였는데, 1,660×g의 원심력에서는 MFPASC를 높은 수득률로 획득할 수 있었다.

수득된 MFPASC는 일관적으로 섬유모세포-유사 형태를 나타내었는데, MFPASC가 섬유모세포-유사 형태를 유지하는 것은 종에 관계없이 매우 전형적인 지방 줄기세포로서의 특징을 갖는 것을 의미한다.

또한, MFPASC의 세포배가시간 (cell doubling time)은 정상 범위인 24시간으로 나타났고, 배가 시간은 계대 수에 따라 증가하는 경향이 있었다. 이는 상기 세포가 성숙한 줄기세포이고, 계대마다 계속 분화하고 있음을 나타내었다.

한편,α-리놀렌산(LA)은 지방세포 분화를 촉진하는 것으로 나타났다. TZD(thiazolidinedione) 단독 첨가는 배양에서 MFPASC의 형태를 지방모세포로 변화시킨 것으로 나타났지만, MFPASC는 분화 초기 또는 말기에 아디포넥틴(adiponenctin)을 생성하지 않는 것으로 나타났다. TZD만으로는 MFPASC에서 Adipo-Q, CEBP-α 및 LPL 유전자를 상향조절할 수 없었지만, TZD와 함께 LA를 함께 이용하면, MFPASC에서 Adipo-Q의 발현을 개시하거나 회복할 수 있었다. Adipo-Q는 지방 조직에서 분비되는 아디포넥틴 단백질을 암호화하는 역할을 하는데, TZD와 LA를 함께 처리하면, MFPASC는 아디포넥틴을 생성할 수 있는 것이다. 또한, LA는 지질 흡수와 지방세포 유도를 촉진하는 것으로 알려져 있는 PPAR-γ 유전자의 발현을 유도하는 것으로도 나타났다.

한편, 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor, KGF)는 유선상피세포로의 분화를 유도하는 것으로 나타났다. 유선은 다른 종류의 세포의 조합으로 이루어진 복잡한 기관이고, 상피세포는 여러 종류로 분류될 수도 있다. 그 중 내강상피세포는 우유의 합성과 형성에 특히 관련되며, EMA, ESA, K8 및 K18 등의 표면 항원은 유선내강상피세포에 매우 특이적인 것으로 보고되었다. 인슐린, 히드로코르티손 및 EGF로 구성된 혼합물로 유도한 후, 본 발명의 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor, KGF)를 처리하면, K8, K18, EMA 및 ESA 발현이 상향조절되는 것이 관찰되었다. 형태 변화는 강한 Ayoub-Shklar 염색으로 동정되었다. 결국, KGF는 상피세포로의 분화에 기여하는 것으로 입증되었다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 제조예, 실험예 또는 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 제조예, 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

하기 여러 실험에서 사용한 세포배양배지 (culture media), 항체, 프라이머 및 실험에 사용된 기타 시약은 여러 회사에서 구입하였다. Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), 소태아혈청(FBS), 말 혈청(HS) 및 페니실린(100 IU/M1)-스트렙토마이신(100 mg/mL) (P/S)은 HyClone (Thermo Scientific, South Logan, UT)사 제품을 이용하였다. 본 실험에 이용된 배지와 FBS는 단일 로트(single lot)에서 얻었다.

CD34, CD13, 유도 세포 부착 분자 (homing cell adhesion Molecule, CD44), VCAM-1(혈관 세포 부착 분자-1, vascular cell adhesion molecule-1)/CD106, 비멘틴, 당나귀 항-염소 IgG-FITC (donkey anti-goat IgG-FITC) 및 바이오틴 처리한 당나귀 항-염소 IgG (donkey anti-goat IgG-biotinylated) 등 일차 및 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology사 (Dallas, TX)의 제품이고, Opti 4 CN 기질 키트는 Bio-Rad (Hercules, CA)사의 제품이고, cDNA 합성 키트는 iNtRON Bio-technology (대한민국, 성남시)사의 제품이고, 프라이머는 Macrogen (대한민국, 서울) 제품이었다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드 (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)와 기타 분석용 화학물질은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO)사 제품을 이용하였다.

[ 제조예 1: 유선지방체지방줄기세포 ( mammary fat pad adipose stem cell , MFPASC )의 분리]

생후 3개월 된 대한민국 흑염소 (체중: 약 13 kg)를 입수하여 대한민국 강원대학교 동물생명과학부 내 동물 집에 두었다. 고지방 식이요법을 통해 총 8 마리의 염소에서 유선지방체 (mammary fat pad)를 상대적으로 빠르게 얻고, 대한민국 강원대학교의 동물 실험 윤리 관련 가이드라인과 규정에 따라 MFPASC를 분리하고자 하였다.

적합한 마취와 수술 후, 실험 염소에서 유선지방체 조직을 수득하고자 하였다. 이때, 염소는 수술 전 12시간 금식하였고, 자일라진과 케타민을 경막 외 주입하여 마취하였다 (도 1의 A). 수의사의 감수 하에 1주일간 수술 후 치료 및 관리를 수행하였다. 유두 하부에서 약 6 cm 떨어진 부분의 피변(skin flap)을 개복 수술하였다. 피부 바로 아래의 지방 조직을 얻고 무균 상태하에 배지 (DMEM + 5% P/S)로 옮겼다.

Bunnel et al.(Bunnell, B. A.; Flaat, M.; Gagliardi, C.; Patel, B.; Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45:115-120; 2008)의 방법을 약간 변형하여 MFPASC를 분리하였다. 요약하자면, 주변의 연결 조직을 적절하게 트리밍하여 제거하고, 5% P/S를 함유하는 인산 완충 식염수(PBS)로 지방 조직을 수차례 세척하였다. 그 후, 조직 샘플을 0.075% 콜라겐분해효소 I 타입과 2% P/S를 함유하는 무혈청 배지에 옮기고, 살균된 수술용 칼과 가위를 이용하여 미세입자 형태로 절단하였다.

이어서, 지방조직 입자를 함유하는 콜라겐분해효소 용액을 37℃, CO₂ 배양기에서 1시간 배양하였다. 배양 후, 세포 현탁액을 50mL 원심분리관에 넣고 5분간 1,660×g로 원심분리한 후에, 격렬하게 진탕(shaking)하여 세포 펠릿을 파쇄하고 동일한 조건하에 다시 원심분리하였다. 이후, 상등액을 제거하고 남은 펠릿은 20% FBS를 함유하는 3 ml DMEM 배지에 재현탁시켰다. 70 ㎛ 세포 여과기(strainer)를 이용하여 세포 용액을 더 여과하였다.

마지막으로, 1.1% P/S를 함유하는 배지(DMEM과 FBS의 1:1 혼합물)에 세포를 넣었다. 접종 2시간 후에 거대한 세포를 트립신처리(trypsinization)하고, 정제된 MFPASC로서, 작은 세포를 확보하였다.

[ 실시예 1: 분리된 MFPASC 의 세포 형태 ( morphology ) 및 세포배가시간 ( cell doubling time ) 확인]

(1) 분리된 MFPASC 의 세포 형태 확인

정제된 MFPASC는 작고 둥근 구형이었고, 트립신처리 후 배양판과 강한 부착을 확인하는데 수 시간이 소요되었다. 24시간이 지나서야 비로소 90% 이상 부착됨이 확인되었다. 이틀째부터, 세포는 새로 형성된 세포의 신장 덕분에 연장되고 늘어났다. 증식과정이 지속함에 따라, 세포들은 연장된 핵을 갖는 방추 형상 지녔다. 일부 세포는 핵소체(nucleolus)를 갖는 뚜렷한(distinct) 핵과 많은 세포질을 포함하였다.

각 증식 단계에서 세포의 생존율은 90% 이상이었는데, 5일 내에 밀도가 높은 콜로니를 형성하기 시작하였다 (도 1의 B). 세포 콜로니를 제거하고 균일하게 더 분배하였고, 그 후에 세포는 상대적으로 빠르게 성장하여 섬유모세포와 유사한 형태를 나타냈으며, 2-3일 내에 80-90%의 밀집(confluent) 상태에 이르렀다. 세포의 섬유모세포 유사 형태는 후속 계대 전반에 걸쳐 남아있었다 (도 1의 C).

(2) 세포배가시간 ( cell doubling time ) 확인

1) 실험방법

세포배가시간은 Vidal et al.(Vidal, M.; Kilroy, G.; Johnson, J.; Lopez, M.; Moore, R.; Gimble, J. Cell growth characteristics and differentiation frequency of adherent equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity. Vet Surg 35: 601-610; 2006 )의 방법을 약간 변형하여 계산되었다. 요약 설명하자면, 최초 접종한 후 수거된 세포를 제1계대로 정하였다.

세포를 5×10³ cells/cm²의 농도로 60mm 배양 접시에 접종하고, 20% FBS와 1.1% P/S를 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 그 후, 세포에 72시간 주기마다 배지를 새로 공급하였다. 세포 밀집도(confluence)가 80-90%에 이르면, 트립신 처리하여 세포를 수거하고, 혈구계산법으로 계수하였다. DT 및 세포 배가수 (CD)는 하기 수학식 1에 의거하여 각 계대마다 수거한 세포의 수와 계대 간 시차(time interval)를 이용하여 계산하였다.

[수학식 1]

CD = ln ( N _f / Ni ₎ / ln (2)

DT = CT / CD

(상기 식에서, DT는 세포 배가시간을 나타내고, CT는 세포 배양시간을 나타내고, CD는 세포 배가수를 나타내고, N_f는 최종 세포수를 나타내고, N_i는 초기 세포수를 나타냄)

2) 실험결과

세포배가시간 (cell doubling time)은 처음 두 계대에서는 약 24 시간이었으며, 그 다음 두 계대 (3번 및 4번)에서는 다소 증가하였다. 그러나, 세포배가시간은 제1계대에 비해서 그 이후 다섯 계대 (도 1의 D)까지 유의적으로 계속 증가하였다 (p<0.01).

[ 실시예 2: 정제된 MFPASC 의 줄기세포 특성 확인]

(1) 실험방법

1) 면역염색

공초점 현미경 분석을 위해, 살균처리된 유리 커버슬립에서 성장된 세포를 실온에서 30분간 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 그 후, 고정된 세포를 PBS 중 0.1% Triton X-100에 15분간 침지시킨 후, 2% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 세척하였다. 이어서, 세포를 블로킹 완충액(blocking buffer)으로 2시간 동안 배양한 다음, 2% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로, 다양한 일차 항체 (CD13, CD34, CD44, CD106 및 비멘틴)와 함께 냉장 온도에서 2시간 동안 세포를 더 배양하였다. 그 후, 모든 세포를 FITC가 결합된 이차 항체와 함께 4℃에서 2시간 동안 더 배양하였다.

마지막으로, 모든 시료를 DAPI으로 30분간 처리한 후, PBS-BSA로 2회 세척하고, 장착 겔을 이용하여 처리된 모든 커버슬립을 글라스 슬라이드에 고정한 다음, 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하였다. 이후, 공초점 현미경 (Olympus FluoView^TM FV 1000) 사진을 촬영하였다.

2) 면역 블로팅 ( Immunoblotting )

세포 스크레퍼(scraper)를 이용하여 플레이트에서 세포를 제거하고 수거한 다음, 차가운 PBS로 세척하였다. 세포를 400 ㎕의 Pro-prep^TM 단백질 추출용액(iNtRON Biotechnology, 대한민국 성남시)에 재현탁한 후, 세포 용해를 유도하기 위해 세포 현탁액을 -20℃에서 배양하였다.

냉장 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하고, 상등액을 새로운 1.5mL 에펜도르프 시약병으로 옮겼다. 이후, 브래드포드(Bradford) 단백질 분석법으로 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 시료를 100℃에서 5분간 가열한 후, 로딩(loading) 염료 (5×)를 이용하여 10% SDS 겔에 로딩하였다.

SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 분자량이 다른 단백질을 분리하였고, 마지막으로 단백질 밴드를 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막 (Life Sciences: Grand Island, NY)으로 옮겼다. 80V에서 30분 후, 120V에서 140분간 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 트리스-글리신 전개(running) 완충액 (0.025 M Tris 염기, 0.192 M 글리신; 1% SDS, pH 8.3)을 사용하여 분자량이 상이한 단백질을 분리하였다.

그 후, 0.025 M Tris 염기, 0.192 M 글리신 및 0.1% SDS를 함유하는 pH 8.3의 이동 완충액을 사용하여 전기영동(100V, 4℃에서 하룻밤)에 의해 단백질 밴드를 PVDF 막으로 옮겼다. PVDF막을 PBS-tween 20(PBST)으로 세척한 후, 3% 블로커(blocker)로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다.

1% BSA를 함유하는 PBST에 1:500의 비로 희석된 CD13, CD34, CD44. CD106 및 비멘틴에 대한 항체를 실온에서 1시간 동안 PVDF막과 함께 배양하였다. 그 후, 1% BSA를 함유하는 PBST에 1:2,000의 비로 희석된 비오틴 처리 당나귀 항-염소 항체와 함께 1시간 동안 시료를 배양한 다음, 30분간 스트렙타비딘-HRP 처리하였다.

마지막으로, 제조사의 설명대로 Opti 4 CN 기질 키트(Bio-Rad)를 이용하여 양고추냉이 과산화효소 활성(horseradish peroxidase activity)을 검출한 후 실험하였다.

3) 역전사효소 PCR

제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen; Life Technologies Inc., Grand Island, NY)을 이용하여 모든 세포 샘플에서 mRNA를 분리하였다. NanoDrop^TM 2,000 UV-Vis 분광광도계(Thermo Scientific, Wilmington, DE, 260 nm에서 흡광)를 이용하여 RNA 농도를 측정하였다.

파워 cDNA 합성 키트(kNtRON biotechnology)를 이용하여 제1가닥 cDNA를 합성하였다. 총 RNA 2 μg, 1 ㎕ oligo DT, 1 ㎕ RNAse 억제제 (10 U/㎕), 4 ㎕ 5x RT 완충액, 2 ㎕ dNTP, 2 ㎕ DTT 및 0.5 ㎕ AMV RT 효소(10 U/㎕)를 함유하는 최종 부피 20 ㎕로 하여 반응을 수행하였다. 합성된 제1가닥 cDNA 시료는 50 ㎕의 DEPC액을 첨가하여 희석하였다.

MFPASC의 줄기 세포성과, 지방세포로의 분화와 상피계열로의 전환분화를 판단하기 위해 다양한 유전자 발현을 검출하였는데, 1% 아가로오스 겔 상에서 특정 프라이머를 이용한 역전사효소-PCR 및 겔 문서기록 시스템에 의해 정량화하였다. 사용된 프라이머의 목록을 표 1에 나타내었다.

Gene	Accession number	5' sequence	3' sequence
CD 13	AJ426050 .1	5'- GCCGTGTGCACAATCATCGCACT -3'	5'- CACCAGGGAGCCCTTGAGGTG -3'
CD34	BC006607	5'- ATGCAGGTCCACAGGGACACG -3'	5'- CTGTCCTGAAGATCAAGTAG -3'
CD44	NM _174013.3	5'- CAGACCTGCCCAATGCCTTTGATGGACC -3'	5'- CAAAGCCAAGGCCAAGAGGGATGCC -3'
CD 106	M60335 .1	5'- GGAAGTGGAATTAATTATCCAA -3'	5'- CTACACTTTTGATTTCTGTG -3'
Vimentin	NM _003380.3	5'- AGGAAATGGCTCGTCACCTTCGTGAATA -3'	5'- GGAGTGTCGGTTGTTAAGAACTAGAGCT -3'
Adipo Q	BC140488	5'- GATCCAGGTCTTGTTGGTCCTAA -3'	5'- GAGCGGTATACATAGGCACTTTCTC -3'
LPL	M16966	5'- TACCCTGCCTGAAGTTTCCAC -3'	5'- CCCAGTTTCAGCCAGACTTTC -3'
UCP1	NM _012682.2	5'- AACACTGTGGAAAGGGACGAC -3'	5'- CATGGTCATTGCACAGCTG -3'
Resistin	NM _183362.1	5'- AGTCCACAGAGAGGCACCTG -3'	5'- TGGTGACCTCCTGGATCTTC -3'
PPAR γ	NM _001100921.1	5'- ACG GGA AAG ACG ACA GAC AAA -3'	5'- GAC GGA GCG AAA CTG ACA CC -3'
C/ EBP α	BC149006 .1	5'- AGT CCG TGG ACA AGA ACA GC -3'	5'- GGT CAT TGT CAC TGG TCA GC -3'
ap2	NM 024406	5'- CCG CAG ACG ACA GGA -3'	5'- CTC ATG CCC TTT CAT AAA CT -3'
EMA	AF399757	5'- CGC AGA ACT ACG CCA GTT TCC -3'	5'- AGA GCG GGT GGT CAT GGA TG -3'
ESA	BC014785 .1	5'- CACTCATTTTCTTCCCAAGAG -3'	5'- GAACTGGATAGAGGAACGTG -3'
K8	NM _001256293.1	5'- GCGGCAGCTGCGTGAGTA -3'	5'- GCTGAGGCCGGGGCTTGTGAG -3'
K18	NG _008351.1	5'- CCTGTCCTTTCTCTCTCCCC -3'	5'- TCCCTCCTACCCCTTACCTG -3'
GAPDH	NG _006129.5	5'- TGAACGGGAAGCTCACTGG -3'	5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'

(2) 실험결과

역전사효소 PCR을 통해 정제된 MFPASC에서 비멘틴의 발현은 유의하게(p<0.05) 나타났다. CD44는 CD13보다 매우 유의한(p<0.01) 것으로 확인되었다 (도 2의 A). 하지만, CD13, CD34 및 CD106의 유전적 발현은 관찰되지 않았다.

그런데, 면역염색과 면역블롯팅 분석을 통해 CD44, CD106과 비멘틴은 CD13에 비해 유의적(p<0.01/p<0.05)으로 존재함을 확인하였다 (도 2의 B, 도 2의 C). 다만, CD13와 CD34의 발현은 유전학적으로나 면역학적으로 MFPASC에서 확인되지 않았다.

이상의 결과로부터 MFPASC에 줄기세포능이 있음을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3: 정제된 MFPASC 의 지방세포 분화 확인]

(1) 실험방법

1) MFPASC 의 지방세포 분화

백만 개의 세포를 60mm 배양 접시에 접종하고, 10% FBS와 1.1% P/S가 첨가된 DMEM으로 구성된 증식 배지에서 성장시켰다. 세포는 5%, CO₂ 조건의 가습 배양기에서 37℃ 하에 정치하였다. 디메틸설폭사이드의 영향을 배제하는 대조 실험을 실시하였다.

세포가 밀집 상태 (confluent stage, 약 100% 근접)에 도달하면, 2% HS, 1.1% P/S, 50 μM 아스코르브산, 33 μM 비오틴, 10 μM 아세트산, 17 μM 판토텐산, 0.5 μM IBMX, 1 μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린 및 10 μM 티아졸리딘디온(TZD)을 함유하는 DMEM 배지로 구성되는 유도 배지(induction medium)에서 세포를 48시간 동안 배양하였다.

2일 후, TZD (10 μM)만을 함유하는 분화 배지 또는 TZD(10 μM)와 α-리놀렌산(LA; 100 μM)을 함유하는 분화 배지에서 세포를 배양한 다음, 48시간 주기로 10일간 배지를 교체하였다. 분화 배지(2% HS를 함유하는 DMEM 배지)에서만 대조군을 배양하였고, 전체 실험은 3회 실시하였다.

2) oil - red -O에 의한 MFPASC 의 지방세포 분화의 판단

지방모세포(adipoblast)에 축적된 염료를 측정하여 지방모세포의 수 또는 크기의 증가를 판단하였다. 포르말린으로 고정된 세포를 60% 이소프로판올로 세척한 후 자연 건조하였다. 새로 희석된 oil-red-O (oil-red-O 원액 6부 및 증류수 4부, 여기서, oil-red-O 원액은 아소프로판올 중 0.5% Oil-red-O 용액임)로 10분간 세포를 염색하였고, 과량의 염료는 작은 전용 피펫을 이용하여 증류수로 4회 내지 5회 세척하여 제거하였다.

그 후, 세포를 건조하고 남은 oil-red-O는 100% 이소프로판올을 가하고, 10분간 배양하여 용출하였다. 용출된 염료의 광 밀도 (용출된 염료 지수)는 1.5 mL 에펜도르프 시약병 (McNeil 2005)에서 공 시험군(blank)으로서 100% 이소프로판올 사용하여 500 nm에서 측정되었다.

Oil-red-O 염색은 Green 및 Kehinde (Green, H.; Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell 1:113-116; 1974)에 기술된 과정을 약간 변형하여 수행하였다. 요약하자면, 포르말린으로 고정된 세포는 PBS로 15분간 2회 세척된 후, 새로 희석된 oil-red-O로 1시간 동안 염색하였다. 그 후, 염료를 제거하고, 대조 염료(Gill's 헤마톡실린, 5분간)을 사용하거나, 사용하지 않고, 세포를 증류수로 5분간 2회 세척한 후, 광학현미경으로 조사하였다.

(2) 실험결과

지방세포 유도 배지에서 MFPASC 세포를 배양한 후, 10 μM TZD를 첨가하여 MFPASC의 지방세포 분화를 유도하였는데, 유의적으로 (p<0.05) 유도됨이 확인되었다. 그러나, 10 μM의 TZD을 단독으로 이용하는 경우, 지방세포 유도가 60%에 이르는 데 통상적으로 4일 이상 소요되었다.

그런데, 10 μM의 TZD와 100 μM의 LA를 함께 이용하면 형질전환 가능성이 증가되고, 형질전환 시간이 48시간 단축되는 것으로 나타났다. TZD와 LA의 동시 사용은 분화되지 않은 0일 세포에 비해 지방세포 분화를 유의적으로(p<0.01) 증가시켰다.

MFPASC가 지방세포 계열로 형질전환되면 전형적인 지방모세포-유사세포와 유사한데, 지질 성분의 증가 때문에 한 모서리가 형질막에 의해 찌그러진 매우 특이한 핵 형태를 보인다. 본 발명에서도 이와 같이 나타났다. 이러한 지질 성분의 증가는 지방세포 유도 배지의 생합성 또는 흡수 증가 때문이다.

한편, 분화 중 지방세포에 의한 염료 흡수는 TZD를 단독으로 이용하거나 LA와 병용함에 따라 증가하였다 (p<0.05). 하지만, 용출 지수는 TZD와 LA를 함께 이용하는 경우에 매우 높았다 (p<0.01)(도 3).

한편, 역전사효소 PCR를 통해, MFPASC를 TZD로 처리하면 퍼옥시좀증식인자-활성화수용체-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)(p<0.05) 및 레시스틴(p<0.01)의 유의적 발현이 확인되었다.

그런데, MFPASC에서의 PPAR-γ와 레시스틴의 전사 발현은 TZD, LA의 병용 처리시 매우 현저하였다. PPAR-γ 및 레시스틴의 전사 발현은 MFPASC에 두 종류의 처리시 매우 현저하게 나타났다. PPAR-γ 전사 인자의 발현은 0일에 비해 2일부터 5일까지 유의적으로 우수하고 (p<0.05/p<0.01), 그 이후에는 감소되었다. 하지만, 레시스틴은 TZD뿐만 아니라 LA로 처리된 세포에서 실험 기간 전반에 걸쳐 현저하게 발현되었다.

한편, MFPASC가 LA와 함께 TZD에 노출되면, Adipo-Q, CCAAT-촉진제-결합 단백질-α(CAAT-enhancer-binding proteins-α, CEBP-α), PPAR-γ, 지질단백질 리파아제 (LPL) 및 레시스틴의 상향조절(p<0.01)이 관찰되었다 (도 4). 하지만, 지방세포 단백질-2(ap2)와 MFPASC의 비결합 단백질-1(UPC1) 발현은 발견되지 았았고, TZD 단독 처리나 LA와 함께 처리 모두 MFPASC 세포가 ap2와 UPC1을 발현하는데에는 영향을 미치지 못하였다.

[ 실시예 4: 정제된 MFPASC 의 내강 상피세포 계열 분화 확인]

(1) 실험방법

1) MFPASC 의 내강 상피계열 분화

상피세포 분화를 위해 세포 백만 개를 60mm 배양 접시에 접종하고, 증식 배지에서 성장시켰다. 세포가 밀집 상태에 가까워지면, 상피세포 유도 배지 (2% HS, 1.1% P/S, 5 μg/ml 인슐린, 1 μg/ml 히드로코르티손, 및 10 ng/ml EGF를 함유하는 DMEM 배지)에서 세포를 48시간 동안 배양하였다.

그 후, 각질세포성장인자(KGF; 10 ng/ml)를 함유하는 분화 배지를 상피세포계열 분화 처리에 이용하였다. 배지는 48시간 주기로 새로 제공하고, 10일간 배양을 지속하였다. 대조군은 분화 배지(2% HS를 함유하는 DMEM 배지)에서만 배양하고, 전체 실험은 3회 실시하였다.

2) Ayoub - Shklar 염색에 의한 MFPASC 의 상피화 판단

4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고, Ayoub-Shklar 염료 (푹신산+아닐린 블루+오렌지 G)로 염색하여, 지방줄기세포가 상피세포 계열로 분화되었음을 확인하고자 하였다 (Ouji, Y.; Yoshikawa, M.; Shirol, A.; Ishizaka, S. Wnt-10b secreted from lymphocytes promotes differentiation of skin epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 342:1063-1069; 2006).

요약하자면, 접시에서 배지를 흡인한 후, 세포를 1×PBS로 3회 세척(rinsing)하였다. 그 후, 실온에서 30분간 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 수차례 더 세척한 후에, 푹신산(fuchsin)으로 3분간 염색하였다. 이어서, 아닐린 블루와 오렌지 G로 45분간 염색하였다.

95% 에탄올로 세척하고 접시를 건조한 후 현미경 사진을 촬영하였다. 소정의 기준을 이용하여 현미경 사진에서 적갈색으로 염색된 영역을 선택하여 상피세포계열로 분화된 세포를 확인하였다.

디지털 비디오 카메라(JVC KY-F55B; Imaging Associates, Thame, UK)를 이용하여 얻은 반정량화된 데이터를 퍼센트로 환산하여 중대한 비교를 도출하는 히스토그램을 얻었다.

(2) 실험결과

상피세포 유도 배지에 초기 48시간 노출되면, 세포는 변함없이 볼록한 형태를 나타내었다. 그러나, 그 후 10 ng/ml KGF로 처리하면 모든 세포는 분화 기간이 종료할 때까지 편평한 형태이거나 입방형 또는 원주형을 나타내었다.

그런데, 10 ng/ml KGF로 완전히 처리된 세포는 약 4-5일에 콜로니 또는 클러스터(cluster)를 형성하였다. 이러한 콜로니와 클러스터는 시간이 경과하고, 처리시간이 연장됨에 따라 밀도가 증가하였다.

또한, Ayoub-Shlkar 염색을 통해 입방형 또는 원주형을 갖는 세포의 세포질 내에서 적갈색 착색이 현저하고, 상피세포 계열로 전환분화되었음이 확인되었다. 분화 후 8일부터 진한 적갈색 착색이 관찰되었는데, 이는 상피세포 계열로의 형질전환에 조금 긴 시간이 소요됨을 의미한다 (도 5의 B).

한편, 세포가 상피 계열로 완전히 전환분화되었음을 설명하고, 구체적으로 규명하는 유전자(K8, K18, EMA 및 ESA)의 상향조절(p<0.01/(p<0.05)은 처리하지 않은 세포에 비해 10 ng/ml KGF로 처리된 MFPASC에서 2일 후부터 계속 관찰되었다 (도 5의 D).

Claims (11)

1. 각질세포성장인자 (keratinocyte growth factor)를 유효성분으로 포함하며, 유선지방체지방줄기세포 (mammary fat pad adipose stem cell)를 유선상피세포로 분화 유도하는 것을 특징으로 하는 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로의 분화 유도용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 분화는,
   전환분화(transdifferentiation)인 것을 특징으로 하는 유선상피세포로의 분화 유도용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 유선상피세포는,
   소, 염소 및 양 중 선택되는 포유동물 중 어느 하나의 유선상피세포인 것을 특징으로 하는 유선상피세포로의 분화 유도용 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 유선지방체지방줄기세포를 각질세포성장인자(keratinocyte growth factor)를 유효성분으로 포함하는 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유선상피세포 (mammary epithelial cell)로의 분화 유도 방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 분화는,
    전환분화(transdifferentiation)인 것을 특징으로 하는 유선상피세포로의 분화 유도 방법.
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은,
    각질세포성장인자를 조성물 중 1~100 ng/mL의 농도로 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 유선상피세포로의 분화 유도 방법.
    
    
    
    
    

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