KR100864174B1 - Ｔｇｔ 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백및 피부 노화방지용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물은 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제 효과 및 TRP-1, 티로시나제, PKA 유전자의 발현 억제 효과를 나타내므로 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

복합생약추출물, 미백, 노화방지, 화장료 조성물

Description

ＴＧＴ 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising an extract of mixed herbal ＴＧＴ having skin whitening and anti-aging activity}

도 1은 B16F10 세포의 멜라닌 생성에 미치는 TGT 복합생약추출물의 영향을 나타낸 도이고,

도 2는 버섯에서 분리한 티로시나제 활성에 미치는 TGT 복합생약추출물의 영향을 나타낸 도이며,

도 3은 B16F10 세포의 티로시나제 활성에 미치는 TGT 복합생약추출물의 영향을 나타낸 도이고,

도 4는 B16F10 세포의 티로시나제 유전자 발현에 미치는 TGT 복합생약추출물의 영향을 나타낸 도이며,

도 5는 B16F10 세포의 TRP-1 유전자 발현에 미치는 TGT 복합생약추출물의 영향을 나타낸 도이고,

도 6는 B16F10 세포의 PKA(Protein Kinase A) 유전자 발현에 미치는 TGT 복합생약추출물의 영향을 나타낸 도이다.

본 발명은 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 의료 및 약학 분야의 비약적인 발전으로 인한 평균수명의 증가는 사회생활 기간연장을 필연적으로 가져오게 되었으며, 이에 따라 좀더 젊고 아름다운 피부를 유지하는 것은 인간의 단순한 욕망을 넘어 사회생활을 원활하게 하는 필수적 항목으로 여겨지고 있다. 인간의 피부는 연령이 증가함에 따라 호르몬 분비의 저하 및 면역세포 기능저하로 인해 피부 단백질의 합성 저하가 유발되며 이는 자연적인 피부노화로 이어지게 된다. 또한, 환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부각질세포(Keratinocyte)의 이상증식이나 세포상해를 유발한다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 두께를 얇아지게 하며, 탄력의 감소와 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 외부환경물질에 의한 세포기능의 변화는 피부 각질세포와 피부 진피세포로 부터 다양한 세포조절물질들인 사이토카인(cytokine)을 분비하게 되는데, TGFbeta(transforming growth factor), TNFalpha(tumor necrosis factor), PGE2(prostaglandin E2), alpha-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등은 케라티노사이트에서 분비되는 물질이다. α-MSH는 UV와 같은 외부 스트레스를 받으면 피부 각질세포로부터 유리되며 멜라노사이트에 존재하는 수용체에 결합하여 기능을 나타내는 성장 호르몬의 일종이다. 케라티노사이트에서 분비된 TGFbeta, PGE2, α-MSH는 멜라닌을 합성하는 멜라노사이트의 세포활성화를 자극하여 외부 스트레스로부터 피부를 방어하는 기전의 일환으로 멜라닌을 합성하며, 분비된 멜라닌은 수지상세포(dendrite)등을 통하여 케라티노사이트 등에 전해져서 스트레스에 의한 세포상해를 억제하는 작용을 나타내게 한다. 그러나, 멜라노사이트에서 생성된 갈색 색소와 흑색 색소는 피부미용뿐 만아니라 피부질환에도 부정적 영향을 주기 때문에 향장품산업분야에서는 피부질환백색 피부를 얻기 위한 연구의 일환으로 melanin 합성을 차단하기 위한 다양한 시도가 있었다(Tobin DJ, Shibahara S, Slominski A, Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation. J. Physiol Rev, 84(4), pp1155-228, 2004).

멜라닌 합성은 멜라노좀 내에 존재하는 티로시나제의 작용을 통해 이루어진다. 이 티로시나제는 L-타이로신을 산화시켜 L-DOPA를 만드는 타이로신 하이드록실레이즈로 작용하며 또한, DOPA를 산화시켜 DOPA 퀴논을 만드는 DOPA 산화제로 작용하여 멜라닌을 합성하는 중요한 효소로 알려져 있다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백제 개발에는 티로시나제의 활성을 억제하는 것이 필수적이다.

TRP-1(tyrosinase related protein-1)은 TRP-2에 의해 생성된 DHICA (5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 산화시켜 IQCA(indole-2- carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. 따라서, TRP-1 발현을 억제하면 미백효과를 기대할 수 있다.

TRP-2는 DOPA 크롬 타토머레이즈로 알려져 있는 효소로서 DOPA 크롬을 이용하여 DHICA(5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 생성한다. DHICA는 TRP-1에 의해 산화되어 IQCA(indole-2-carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. 따라서, TRP-2 발현이 억제되면 미백효과를 기대할 수 있다.

멜라노사이트가 활성화되어 멜라노제네시스가 진행될 때, 아데닐레이트 사이클레이즈의 활성이 증가하여 cAMP 농도가 증가한다. PKA(protein kinase A)는 cAMP에 의존적이며, 각종 효소의 활성을 조절하고, 세포 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다(Bertolotto C et al. Microphthalmia gene product as a signal transducer in cAMP - induced differentiation of melanocytes. J Cell Biol.,142(3), pp827-35, 1998). PKA의 활성 증가는 티로시나제의 인산화와 활성 증가를 유발하며 이러한 과정은 멜라닌 합성 증가로 이어진다. 따라서 PKA 발현을 억제하는 경우 티로시나제의 활성화를 방지를 통하여 멜라닌 생성을 억제하게 된다.

세포내 신호전달단백질의 일종인 AKT는 ERK, CREB, RSK-1등과 함께 세포 기능을 조절하는 신호전달 단백질로 유전자 발현을 조절하는 인자로 알려져 있으며, AKT의 발현이 증가하면 MITF(microphthalmia transcription factor)의 발현이 억제되어 티로시나제의 발현을 억제한다(Kim D.S. et al.,Sphingosine -1-phosphate decreases melanin synthesis via sustained ERK activation and subsequent MITF degradation . J Cell Sci., 116( Pt 9),pp1699-706,2003 ).

MITF(microphthalmia transcription factor)로서 티로시나제의 발현을 조절하며, MITF를 억제하면 티로시나제의 발현을 억제함으로써 멜라닌 색소 생성을 억제할 수있다. 따라서, MITF의 발현이 억제되면 색소 생성이 억제될 수 있다.

한편, 피부각질세포로 부터 분비된 TNF-α, IL-1등은 피부진피세포인 섬유아세포(Fibroblast)에 작용하여 MMP-1(martrix metalloproteinase), TIMP-1, 프로콜라겐 등의 생합성을 증가시킬 수 있다. 이러한, 단백질 분해효소는 진피조직인 콜라겐의 분해를 촉진하여 피부 두께를 얇게 하고 주름살을 생기게 하는 역할을 하게 된다.

본 발명자들은 한약재를 이용하여 피부노화를 억제하는 일환으로 멜라닌 색소 생성을 억제할 수 있는 다양한 물질에 대한 연구를 시도하였다.

인삼은 파낙스 (Panax)속에 속하는 다년생 식물로, 파낙스속 식물은 식물 분류학상 오가과 (Araliaceae)에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 십여 종이 알려져 있다. 대표적인 종으로 고려인삼 (Panax ginseng), 화기삼 (Panax quinquefolia), 전칠삼 (삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼 (Panax japonica), 삼엽삼 (Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis) 등이 있다 (고려삼의 이해, 고려인삼학회, p9, 1995; Advances in Ginseng Research, 고려인삼학회, pp127-137, 1998). 기타 파낙스속 식물로는 파낙스 엘레가티오르 (Panax elegatior), 파낙스 완지아누스 (Panax wangianus), 파낙스 비핀라티푸스 (Panax bipinratifidus) 등이 있다. 예로부터 인삼은 피로회복이나 정력증강에 유효하다고 알려져 있다. 실제적으로 인삼은 탐색활동의 증가, 자발 운동의 감소, 경련 역치의 상승, 기억력 증가, 진통효과 등이 있는 것으로 알려져 있다 (고려삼의 이해, 고려인삼학회, p9, 1995년). 또한 이러한 효과 외에도 불안신경증, 불면, 우울증상, 산전산후의 정신증상 개선에도 적용되어 왔다 (생 약학, 학창사, 2003년).

당귀는 산형과(傘形科;Umbeliferae)식물인 참당귀의 뿌리로 성질은 따뜻하고 맛은 달고 매우며 독이 없다. 모든 풍병(風病), 혈병(血病), 허로(虛勞)를 낫게 하며 궂은 피를 헤치고 피를 생겨나게 한다. 여러 가지 나쁜 창양(瘡瘍)과 쇠붙이에 다쳐서 어혈이 속에 뭉친 것을 낫게 한다. 이질로 배가 아픈 것을 멎게 하며 오장을 보(補)하며 살이 살아나게한다. 또한, 피부 진정, 소염, 미백 효과가 우수하다.(도해생약대사전, 영림사, p411, 1990).

감초(발행처:남산당 동의보감 p.1179 六 참조)는 속(내장)을 평온하게 하며 폐를 윤택하게 하고 해독작용이 있고, 모든 약을 조화롭게하며 비와 위의 허약을 다스리며 다섯가지 피곤함과 일곱가지 허손을 보하고 오장을 보한다(도해생약대사전, 영림사, p684-685, 1990).

작약은 신경통 류머티스 관절염 및 신경쇠약등에 사용되는데, 페놀성분이 진정, 해열, 진통작용에 사용된다(한약학, 대한약사회, p153, 1986).

건지황(학명:Radix Rehmanniae)은 현삼과에 속하는 다년생 초본인 지황 (학명:Rehmannia Glutinosa)의 덩이뿌리로서, 혈압상승작용, 혈당강하작용, 항균 및 항염작용, 이뇨작용, 지혈작용 등이 있어 해열제 제조에 사용되고, 체액을 생성시키므로 갈증을 해소시킨다(도해생약대사전, 영림사, p907, 1990).

독활은 독활의 뿌리줄기 및 뿌리로서, 신선한 뿌리에는 정유(essential oil) 0.07%가 함유되어 있고 정유 중에는 리모넨(limonen), 사비넨(sabinene), 알파-피넨(α-pinene), 감마-테르피넨, 미르센(myrcene), 후물렌(humulene, α-caryophyllene), 시스(cis) 및 트랜스(trans) 포수 사비넨, 알파 코패인(α-copaene), 테르피넨-4-올이 함유된 것으로 알려져 있으며, 과거로부터 독활의 뿌리는 거풍, 화혈, 감기, 두통, 류머티즘 신경통에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다( 정보섭 및 신민교 저, 도해생약대사전, 영림사, pp860-862, 1998).

두충은 두충나무(Eucommia ulmoidesOLIV.)의 수피로서, 중국원산의 약용식물로서 각지에서 재배되며, 한방에서는 고혈압, 잔뇨 등의 치료에 사용되어 왔으며, 임상에서는 혈압강하작용 및 이뇨작용 등이 보고되어 왔고, 거터-퍼르카(Gutta-percha) 알칼로이드 등이 분리 보고되었다(도해생약대사전, 영림사, p605, 1990).

우슬(牛膝)은 쇠무릎(Achyranthes japonica NAKAI)의 뿌리를 사용하며, 전국에 분포하며, 한방에서는 산후어혈에 의한 복통, 혈뇨, 월경불순 등의 치료에 사용되었으며, 임상에서는 자궁수축작용, 장관수축작용, 진통작용 등이 보고되었으며, 트리터페노이드(triterpenoid) 사포닌, 엑디스테론(ecdysterone) 등의 성분들이 보고된 바 있다(도해생약대사전, 영림사, p340, 1990).

세신(細辛)은 쥐방울덩굴과에 속한 다년생 초본인 독도리 아시아사럼 시에볼디(Asiasarum sieboldi)의 전초와 근을 건조한 것으로 5~7월에 뿌리째 캐서 미토를 제거하고 건조한다. 주성분은 메틸유게놀(methyleugenol)이 50%이고 그 외에 피넨(pinene), 아사릴케톤(asarylketone), 유카본(eucarvone), 사트롤(satrole)이 약 0.2%함유되어 있다. 심, 패, 현경등 치료 온폐화음, 치감위풍관, 풍습요통 등에 응용된다(도해생약대사전, 영림사, p746, 1990).

진교는 용담과에 속한 다년생 초본인 진교 젠티아나 매로필레 파리(Gentiana maerophyllae PALi)의 뿌리를 건조한 것으로 봄과 가을에 채취하여 주건한다. 진교에는 3종 알카로이드 인 지오티아니노(giotianino), 젠티암딘(gentiamdine), 젠티아닌 C(gentianin C)와 당류, 휘발유를 함유한다. 근맥주격, 일품조열, 치풍습토통에 치료된다(도해생약대사전, 영림사, p478, 1990).

복령(茯笭)은 구멍쟁이 버섯과에 속한 진균인 복령 포리아 코코스 울프(Poria cocos WOLF, Seuw)의 균핵을 건조한 것으로 야생 복령은 7월부터 다음해 3월 사이에 송림에서 채취하고 내부의 수분을 산실시킨 다음 유건한 것을 복령개라 한다. 백색이며, 심, 비, 폐, 견에 사용된다(도해생약대사전, 영림사, p40, 1990).

육계(肉桂)는 녹나무과에 속한 상록향목인 육계 시나모뮴 카시아(Cinnamomum cassia)의 수피를 건조한 것으로 8~10월 사이에 채취하여 음건한다. 신, 비, 방광경에 치유하고 통혈맥, 음담, 복통설사, 망양회탈 등에 사용된다(도해생약대사전, 영림사, p453, 1990).

방풍(防風)은 산형과에 속한 다년생 초본인 방풍 레데보리엘라 세세로데스(Ledebouriella seseloides)의 뿌리를 건조한 것으로 봄과 가을에 꽃대가 나오지 않은 것을 채취하여 발근과 미사를 제거하고 주건한다. 성분은 정유 만니톨(mannitol), 고미배당체 등을 함유하고 방광, 간, 비경의 치료에 지통, 치외감풍한, 두통, 골절산통 등에 응용된다(도해생약대사전, 영림사, p428, 1990).

천궁(川芎)은 산현과에 속한 다년생 호본인 천궁 시디움 오피스내일 마키노(Cnidium officinale MAKINO)의 근경을 건조한 것으로 9~10월에 채취하여 전열을 제거 한 것을 주건한다. 간, 암, 심포경을 치료하여 활혈행기, 착철겐불로, 정패통정, 풍습비통 등을 치료한다(도해생약대사전, 영림사, p418, 1990).

피부노화중 피부미백은 멜라닌 생성과 밀접한 관계를 갖고 있다는 사실은 매우 잘 알려져 있다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제하거나 멜라닌 생성에 관여하는 인자들을 평가하는 것은 피부미백 물질의 개발에 매우 중요한 일이라고 판단된다. 이와 함께 피부미용제는 장기간 피부 적용 또는 복용해야 한다는 점을 고려하면, 유효성과 더불어 안전성이 높은 한약재에 대한 연구는 매우 유익한 결과를 나타낼 것이다.

이에 본 발명자들은 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물의 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제 효과 및 TRP-1, 티로시나제, PKA 유전자의 발현 억제 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 헥산, 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르 또는 클로로포름, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 추출물은 인삼: 당귀: 감초: 작약: 건지황: 독활: 두충: 우슬: 세신: 진교: 복령: 육계: 방풍: 천궁이 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5, 바람직하게는 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2 : 1~2: 1~2: 1~2: 1~2의 중량비(w/w)로 배합된 복합생약추출물임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 복합생약추출물은 동일한 양의 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁을 세절하여 그것의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 15배에 달하는 부피의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 헥산, 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르 또는 클로로포름, 바람직하게는 물로, 실온에서 약 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 30시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 추출한 추출액을 감압 여과하여 얻은 추출물을 약 40 내지 80℃, 바람직하게는 약 60 내지 70℃에서 감압 농축한 후, 증류수를 가해 현탁하여 진공 동결건조, 열풍건조 또는 분사방식에 의한 건조, 바람직하게는 동결건조하여 본 발명의 복합생약추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

또한, 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 TGT 복합생약추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 자극 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 TGT 복합생약추출물을 포함하는 조성물은 피부 미백 및 노화방지 효과를 위한 화장품 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨, 에센스 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 팩, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스 틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴 산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합 체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테 르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살 리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 TGT 복합생약추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 헤어로션, 헤어토닉, 헤어에센스, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정 성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 복합생약추출물( TGT )의 제조

경원대학교 한방 병원에서 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁을 각각 4 g씩 구입하여 불순물을 제거하여 세절한 다음, 2 L의 증류수를 가한 후 환류냉각 추출방법을 이용하여 추출액을 추출하고 와트만지(whatman No.2)에 여과한 후 감압 농축하여 증류수를 가해 -44℃조건 하에서 2 ~ 3일 동안 동결 건조하여 최종적으로 분말 상태의 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천 궁의 복합생약추출물 10.5 g을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, TGT라 명명함).

참고예 1. 시약 및 재료

1-1. 세포

(주)한국세포주은행으로부터 B16F10 세포를 구입하여 사용하였다.

1-2. 실험용 검액 및 시약

실험용 검액은 상기 실시예 1에서 수득한 TGT 복합생약추출물을 DMSO에 녹인 후 0.22um 포어 사이즈(pore size)를 가지는 여과지를 이용하여 멸균하고 사용 시까지 냉장 보관하였고, 배양된 세포에 사용하기 직전에 실험농도에 맞도록 DMEM 배지로 조정한 후 사용하였다. 시약은 DMEM(Dulbeco's minimum essential medium, 깁코, 미국), 페니실린/스트렙토마이신(깁코, 미국), FBS(Fetal bovine serum, 깁코, 미국), 머쉬룸 티로시나제(시그마, 미국), 멜라닌(시그마, 미국), L-타이로신(시그마, 미국), α-MSH(melanocyte stimulating hormone, 시그마, 미국), 트립신-EDTA(시그마, 미국), PBS(phosphate buffered saline, 시그마, 미국), 트리톤-X100(시그마, 미국), 트리졸 리에이전트(인비트로젠, 미국), 올리고 (dT)12-18 (프로메가, 미국), dNTP (바이오툴스, 스페인), M-MLV-RT (모로니 뮤린 류케미아 바이러스 리벌스 트랜스크립테이즈, 프로메가), 텍 폴리머레이즈 (바이오툴스, 스페인)등을 사용하였다.

1-3. 기기

세포배양을 위하여 CO₂ 인큐베이터, 무균실험대(Clean bench, 수공양행), 역상현미경(Inverted Microscope, 올림푸스, 일본), 원심분리기(한일원심분리), 헤마토사이토미터, 셀 카운터, 초저온냉동고 (Deep freezer), 질소저장탱크, 반응수조(water bath), 펌프(pump)등을 사용하였으며, 면역형광판독기(ELISA reader, 테칸, 미국), PCR 기기(퍼킨 엘머, 미국), 겔드라이어(Gel-dryer, 바이오라드), 전기영동기(Electro phoresis apparatus, 바이오라드), 사진판독기, pH 미터기(ATI Orion model 370, 미국), 초음파 분쇄기(소니케이터, 브란슨), 초음파 균질기(Ultra sonic homogenizer, 4710 시리즈, 콜 파머, 미국)등을 사용하였으며, 실험에 사용한 정제수는 밀리-큐 시스템(mili-Q system, 밀리포어 사, 미국)으로 제조 했다.

참고예 2. 통계처리

통계처리는 스튜던트의 t-검정을 이용해 개별 비교를 하였으며 평균± 표준오차로 나타내었다. P값이 0.05미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

참고예 3. 세포주 및 세포배양

멜라노사이트는 서울대학교 한국 세포주은행에서 분양한 B16F10을 사용하였 고, 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 깁코 BRL 사. 미국) 배지를 사용하였으며 1일 1회 배지를 교환하였다. FBS는 잔존하는 보체성분을 불활성화시키기 위해 실온에서 녹인 후 56℃ 수조에서 30분간 가열하여 사용하였으며, 배지는 0.2 ㎛ 막 여과기로 여과 후 사용하였다. 세포에 각 조건 별로 96웰 플레이트에는 웰 당 100 ㎕, 24웰 플레이트에는 웰 당 500ul로 배지를 넣어주었고, 세포를 회수할 때는 트립신-EDTA 1 ml을 가하여 37℃에서 1분간 반응시킴으로써 부착된 세포를 분리하였고 배지 4 ml을 넣어 원심분리(1,000 rpm, 3분)를 하여 세척한 후 실험에 사용하거나 필요시 액체질소에서 냉동 보관하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 를 사용한 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 멜라닌 합성 억제 효과 측정

실시예 1의 TGT의 멜라닌 합성 억제 효과를 알아보기 위해 호세이 등의 방법(Hosei Hosoi J, et al. Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1, 25,-dehydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res 45, pp1474-78, 1985)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

참고예 3의 B16F10 세포를 24웰에 5x10⁴ cells/ml의 농도로 400ul를 넣고 3시간 배양하여 부착 시킨 다음, FBS 제거한 DMEM 배지를 넣고 12시간 동안 배양한 후, FBS 제거한 DMEM 배지를 씻어내고 FBS 포함된 배지를 400ul를 넣었고, 여기에 실시예 1의 TGT가 함유된 배지 50ul를 농도별로 처리하였고 100nM의 a-MSH를 50ul를 넣어 2일간 배양한 다음, 2일간 배양하여 PBS로 2회 씻은 후 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였고, 10% DMSO가 함유된 1N 수산화나트륨 300ul를 넣어 80℃에서 1시간 동안 처리하였으며, 이것을 식힌 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포내 생성된 멜라닌은 합성멜라닌을 표준품으로 사용하여 결정하였다.

세포 독성이 없는 농도인 37, 75, 150, 300ug/ml 농도로 실시예 1의 TGT 를 48시간 처리한 다음 세포 배양액에 유출되는 멜라닌을 측정하였고, 배양된 B16F10을 PBS로 씻은 후 원심분리하여 얻은 세포를 파괴하였다. 세포를 파괴하고 다시 원심분리하여 얻어진 세포내 용액으로부터 멜라닌을 정량하였으며, 합성 멜라닌을 표준폼으로 사용하였다. 수학식 1을 이용하여 멜라닌 생성 억제율을 구하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다(도 1 참조).

멜라닌 생성 억제율 (%) = {(대조군 멜라닌 생성량 - 시험군 멜라닌 생성량)/대조군 멜라닌 생성량} x100

실시예 1의 TGT 농도(ug/ml)	실시예 1의 TGT 투여군의 멜라닌 생성 억제율(%)
37	5.8
75	28.6
150	43.3
300	54.1

실험결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 TGT는 37, 75 ug/ml의 농도에서는 거의 영향을 주지 못했으며, TGT 를 150, 300ug/ml의 농도로 처리한 경우, TGT 투여군의 멜라닌 생성 억제 효과가 현저하게 높았다. 따라서 실시예 1의 TGT는 멜라닌 생성을 억제하는 데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 2. 티로시나제 활성 측정

2-1. 머쉬룸 티로시나제 활성 측정

실시예 1의 TGT의 머쉬룸 티로시나제 활성 억제 효과를 알아보기 위해 매슨 앤 피터슨 등의 방법(Mason HS, et al. Reaction between enzyme-generated quinones and amino acids. Biochem. Biophys. Acta 111, pp134-146, 1965)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

25, 50, 100 또는 200ug/ml의 실시예 1의 TGT 및 대조군(시료를 처리하지 않은 시험군)에 0.1M 포스페이트 버퍼(PH 6.8) 150 ul, 3 mM L-타이로신 수용액 20 ul 및 상기 참고예 1-2의 검액 20 ul을 차례대로 가한 다음, 2500 U/ml 머쉬룸 티로시나제 10 ul를 가하여 반응을 시작하였다. 반응은 37℃에서 30 분간 인큐베이션 시켰으며 10 분 간격으로 2 회 405 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 수학식 2를 이용하여 티로시나제 활성도를 구하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다(도 2 참조).

티로시나제 활성도 (%) = (B-B')/(A-A') x 100

A: 대조군 반응 액의 흡광도

A': 대조군의 티로시나제 대신 버퍼를 가한 반응액의 흡광도

B: 검액이 첨가된 반응 액의 흡광도

B': B 반응액 중 티로시나제 대신 버퍼를 가한 반응액의 흡광도

시험군	티로시나제 활성도(%)
대조군	100
25ug/ml 실시예 1의 TGT 투여군	99
50ug/ml 실시예 1의 TGT 투여군	79
100ug/ml 실시예 1의 TGT 투여군	67
200ug/ml 실시예 1의 TGT 투여군	55

실험결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 TGT 투여군은농도가 높아짐에 따라 티로시나제 활성이 낮아졌고, 대조군에 비해 티로시나제 활성 억제 효과가 탁월히 뛰어남을 알 수 있었다. 따라서 실시예 1의 TGT은 머쉬룸 티로시나제 활성을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

2-2. B16F10 세포 티로시나제 활성 측정

실시예 1의 TGT의 B16F10 세포 티로시나제 활성 억제 효과를 알아보기 위해 마르티네즈-에스파르자 등의 방법(Martinez-Esparaz M. et al. Mechanism of melanogenesis inhibition by tumor necrosis factor -a in B16/F10 mousw mwlanoma cells. Eur. J. Biochem. 255, pp139-146, 1998)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

참고예 3의 B16F10 세포에 실시예 1의 TGT를 처리한 후, 2일간 배양하였고 PBS로 씻어낸 후, 세포를 파괴하였고 다시 원심분리하여 얻어진 세포내 용액으로부터 티로시나제를 정량하였다. 실시예 1의 TGT를 25, 50, 100, 200ug/ml의 농도로 처리한 후 3일간 배양한 다음, 얻은 세포액을 이용하여 하기 수학식 3을 이용하여 티로시나제 활성도를 구하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다(도 3 참조).

티로시나제 활성도 (%) = (B-B')/(A-A') x 100

A: 대조군 세포 반응 액의 흡광도

A': 대조군의 세포내용물 대신 버퍼를 가한 반응액의 흡광도

B: 검액이 첨가된 세포 반응 액의 흡광도

B': B 반응액 중 세포내용물 대신 버퍼를 가한 반응액의 흡광도

실시예 1의 TGT 농도(ug/ml)	실시예 1의 TGT 15 투여군의 티로시나제 활성도(%)
대조군	100
25	93.0
50	80.1
100	67.3
200	51.6

실험결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 TGT 투여군은 농도가 높아짐에 따라 티로시나제 활성이 낮아졌고, 대조군에 비해 티로시나제 활성 억제 효과가 탁월히 뛰어남을 알 수 있었다. 따라서 실시예 1의 TGT는 B16F10 세포에서 티로시나제 활성을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. TRP-1, 티로시나제, PKA 유전자 발현에 대한 영향

실시예 1의 TGT의 TRP-1, 티로시나제 및 PKA 유전자 발현에 대한 영향을 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

3-1. 총 RNA 분리

실시예 1의 TGT를 처리한 M16F10 세포를 2일간 배양한 다음, 1 ml 트리졸 리에이전트 (인비트로젠, 미국)를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 100 ㎕ 페놀과 100 ㎕ 클로로폼 : 이소아밀알콜 (24:1)을 넣어 잘 섞은 후, 원심 분리하는 과정을 2번 반복함으로써 상층액을 분리하였다. 0.5 ml 이소프로필 알콜을 이용하여 RNA를 침전시킨 후 70% 에탄올로 세척하였고, 자연 건조시킨 다음, 알에네이즈 자유수(RNAase free water)에서 RNA를 녹인 후 알에네이즈-프리 디에네이즈(RNase-free DNase)를 첨가하고 -70℃에서 저장하였다.

3-2. cDNA 제조

상기 실험예 3-1에서 분리한 전체 RNA 액(13 ug RNA 함유)에 올리고dT 1 ㎕을 넣은 후 조심스럽게 혼합한 다음, 70^oC에서 5분간 인큐베이션하였다. 프라이머가 풀리도록 실온에서 약 10분간 방치한 다음, 시스크립트 버퍼(0.1M DTT, dUTP 뉴클레오타이드, dUTP 시다이-레이블드 뉴클레오타이드, 시스크립트 리벌스 트랜스크립테이즈)를 첨가한 후, 아주 조심스럽게 혼합한 후, 42℃에서 90분간 인큐베이션 하여 얼음 상에 방치하였고, 여기에 2.5M 수산화나트륨을 가한 후 37℃에서 15분간 인큐베이션 하였으며, 2M HEPES 버퍼를 가하여 중화시켜 cDNA를 제조하였다.

3-3. RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)

올리고 (dT)12-18 (프로메가, 미국), 반응버퍼 (50 mM 트리스-염산, 75 mM 염화칼륨, 3 mM 염화마그네슘, 10 mM DTT, pH 8.3), 1 mM dNTP (바이오툴스, 스페인) 및 200 유닛 M-MLV-RT (모로니 뮤린 류케미아 바이러스 리벌스 트렌스크립테이즈, 프로메가)를 실험예 3-1에서 분리된 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 전체 볼륨 15 ㎕에 10X PCR 버퍼, 0.2 mM dNTPs, 2 pmole의 하기 표 4의 프라이머를 넣은 혼합액에 cDNA와 1.25 유닛의 Taq 폴리머레이즈 (바이오툴스, 스페인)을 넣어 PCR을 시행하였다. 증폭된 PCR 산물을 2% 아가로즈 젤에 전기영동하였고, 전기영동 결과 나온 밴드를 밀도 분석 프로그램인 젤-프로 애널라이저 3.1(미디어 사이버네틱스, 미국)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

티로시나제	센스-프라이머	GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT (서열번호 1)
	안티센스-프라이머	TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC (서열번호 2)
TRP-1	센스-프라이머	GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC (서열번호 3)
	안티센스-프라이머	AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT (서열번호 4)
PKA	센스-프라이머	TCC CGT TCC TGG TCA AAC TT (서열번호 5)
	안티센스-프라이머	TATA GGC TGG TCA GCG AAG AA (서열번호 6)
GAPDH	센스-프라이머	CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA (서열번호 7)
	안티센스-프라이머	CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC (서열번호 8)
PCR 조건	94℃ 4분, 30회 반복 (94℃ 30초, 59℃ 30초, 72℃ 45초), 72℃ 10분(퍼킨 엘머, 미국)

실험결과, 도 4 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 TGT를 처리한 M16F10 세포에서 대조군과 비교하여 약 50 내지 60% 티로시나제 발현 억제 효과를 보였고, 약 35%의 TRP-1 발현 억제 효과를 보였으며, 약 40 내지 50%의 PKA 발현 억제 효과를 보였다. 따라서 실시예 1의 TGT는 티로시나제, TRP-1 및 PKA 유전자 발현을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 4. 피부 자극성 시험

실시예 1의 TGT의 피부 자극 정도를 알아보기 위하여 식품의약품안전청 고시1999-61호 "의약품의 독성 시험 기준"에 따라 본 연구소 내부적으로 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 수컷 토끼를 대상으로 피부자극시험을 실시하였다. 관찰은 첩포 24시간 후 첩포 부위에 대한 홍반, 가피형성, 부종형성 등의 피부자극 반응을 관찰하였다.

실시예 1의 TGT를 토끼의 피부에 적용한 결과, 이것에 따른 일반증상의 변화는 관찰되지 않았으며, 사망동물도 관찰되지 않았다. 또한 홍반, 가피 형성 등을 관찰한 결과 가벼운 홍조가 발견되었으나, 자극성을 평가한 결과 자극 지수가 약한 자극성 물질로 분류되어 자극성이 거의 없는 물질로 평가되어 안전하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

하기에 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제형예 1. 유연 화장수(스킨)

정제수에 부틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유, 베타인, 구연산, 구연산나트륨 및 방부제를 첨가하여 교반한 후 용해시킨 다음, 에탄올에 향료를 넣어 용해시킨 혼합물을 첨가하였다. 여기에 실시예 1의 TGT를 가하여 충분히 교반한 후, 숙성시켜 실시예 1의 TGT 함유 유연 화장수를 제조하였다. 하기 표 5에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	제형예 1 함량(w/w %)
실시예 1의 TGT	50.0
부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화 피마자유	0.2
에탄올	5.0
베타인	2.0
구연산	0.02
구연산 나트륨	0.06
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 2. 로션( 에멀젼 )

실시예 1의 TGT, 부티렌 글리콜, 글리세린, 카르복시비닐폴리머, 아르기닌, 방부제 및 정제수를 70 내지 75℃에서 교반하면서 가열하였다. 여기에 75 내지 80℃에서 교반하여 가열시킨 스쿠알란, 부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 소르비탄스테아레이트, 포리소르베이트 60, 글리세릴스테아레이트 및 스테아릴글리세레티네이트 혼합물을 가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45℃정도로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반한 다음, 30℃까지 냉각한 후 숙성시켜 실시예 1의 TGT 함유 로션을 제조하였다. 하기 표 6에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	제형예 2 함량(w/w %)
실시예 1의 TGT	40.0
부틸렌글리콜	8.0
글리세린	5.0
스쿠알란	10.0
부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트	5.0
소르비탄스테아레이트	1.5
폴리소르베이트 60	1.0
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 3. 에센스

시토 시테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 세테아레스-4 및 콜레스테롤을 교반하여 혼합한 다음, 실시예 1의 TGT, 디세틸포스페이트, 농글리세린 및 정제수 혼합 용액을 첨가하여 유화시킨 후, 교반하면서 45℃로 냉각되면 향료를 첨가하여 교반하고 30℃까지 냉각시켜 숙성시켰다. 여기에 카르복시비닐폴리머, 산탄검 및 방부제를 첨가하여 안정화시킨 후 숙성시켜 실시예 1의 TGT 함유 에센스를 제조하였다. 하기 표 7에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	제형예 3 함량(w/w %)
실시예 1의 TGT	10.0
시토 스테롤	1.70
폴리글리세릴 2-올레이트	1.50
세라마이드	0.7
세테아레스-4	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.2
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 4. 세안제(클렌징 폼)

정제수에 N-아실글루타민산 나트륨, 글리세린, PEG-400 및 프로필렌 글리콜을 첨가하여 혼합한 후, 실시예 1의 TGT을 소량씩 가하고 EDTA- 4Na를 첨가하여 교반하면서 80℃에서 가열하여 용해시켰다. 여기에 80℃에서 가열한 POE(15)올레일알코올 에테르, 라우린 유도체 및 메틸 파라벤 혼합용액을 첨가하여 교반한 다음, 향료를 가하여 서서히 냉각하여 실시예 1의 TGT 함유 세안제를 제조하였다. 하기 표 8에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	제형예 4 함량(w/w %)
실시예 1의 TGT	20.0
N-아실글루타민산 나트륨	20.0
글리세린	10.0
PEG-400	15.0
프로필렌 글리콜	10.0
POE(15)올레일알코올 에테르	3.0
라우린 유도체	2.0
메틸 파라벤	0.2
EDTA-4Na	0.03
향료	0.2
정제수	잔량

제형예 5. 샴푸

정제수에 글리세린 및 EDTA-4Na을 가하여 80 ℃에서 가열하여 용해시킨 후, TEA 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴에테르 설페이트, 라우릴 아미도프로필 베타인 및 라울릴산 디에탄올 아미드를 가하여 교반하였다. 여기에 구연산을 넣어 50 ℃에서 중화시킨 다음, 45 ℃에서 실시예 1의 TGT 및 아연(Zinc) 피리티온을 가하고 교반하여 실시예 1의 TGT 함유 샴푸를 제조하였다. 하기 표 9에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	제형예 5 함량(w/w %)
실시예 1의 TGT	20.0
TEA 라우릴 설페이트	20.0
소듐 라우릴에테르 설페이트	30.0
라우릴 아미도프로필 베타인	2.0
라우릴산 디에탄올 아미드	3.0
글리세린	3.0
EDTA-2Na	0.05
메틸 파라벤	0.2
구연산	0.03
아연 피리티온	0.02
향료	0.2
정제수	잔량

상술한 바와 같이, 본 발명의 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물은 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제 효과 및 TRP-1, 티로시나제, PKA 유전자의 발현 억 제 효과를 나타내므로 피부 미백 및 피부 노화방지용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> kyungwon university <120> cosmetic composition comprising an extract of mixted herbal TGT having skin whitening and anti-aging activity <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for tyrosinase <400> 1 ggccagcttt caggcagagg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for tyrosinase <400> 2 tggtgcttca tgggcaaaat c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TRP-1 <400> 3 gctgcaggag ccttctttct c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for TRP-1 <400> 4 aagacgctgc actgctggtc t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PKA <400> 5 tcccgttcct ggtcaaactt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for PKA <400> 6 tataggctgg tcagcgaaga a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for GAPDH <400> 7 cagcctcgtc ccgtagacaa a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for GAPDH <400> 8 cacgacatac tcagcaccgg c 21

Claims (5)

1. 인삼, 당귀, 감초, 작약, 건지황, 독활, 두충, 우슬, 세신, 진교, 복령, 육계, 방풍 및 천궁의 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 헥산, 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르 또는 클로로포름에 가용한 추출물인 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 인삼: 당귀: 감초: 작약: 건지황: 독활: 두충: 우슬: 세신: 진교: 복령: 육계: 방풍: 천궁이 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5 : 1~5의 중량비(w/w)로 배합된 복합생약추출물임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량% 로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형으로 구성된 그룹에서 선택된 제형임을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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