KR100858169B1 - 오리 간염바이러스 1형의 감별진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 오리 간염바이러스 1형(duck hepatitis virus type 1) 유전자의 감별진단방법(differential diagnostic method)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자를 표적(target)하는 특이 프라이머를 사용하여 RT-PCR 방법으로 오리 간염바이러스 1형과 유전자형이 다른 오리 간염바이러스 유전자를 감별 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에 따른 감별진단방법은 조류 유래의 다른 병원성 RNA 바이러스들과도 신속하고 정확하게 감별적으로 진단하는데 유용하다.
오리 간염바이러스 1형 및 아형, PCR, 5′-UTR 유전자, 캡시트 유전자, 3D 유전자
Description
도 1은 본 발명에 사용된 오리 간염바이러스 감별진단법(differential diagnostic method)에 사용된 바이러스의 종류를 나타낸다.
도 2는 어린 오리의 간 조직에서 분리한 오리 간염바이러스 1형의 2C 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 보여주는 도면이다.
도 3은 어린 오리의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 캡시드(capsid) 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 보여주는 도면이다.
도 4는 어린 오리의 간 조직에서 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스의 5'-UTR(untranslated region) 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 보여주는 도면이다.
도 5는 어린 오리의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리간염 바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주, 국내 오리 간염바이러스 백신주 및 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주의 유전자를 본 발명에 따른 multiplex PCR을 이용하여 감별적으로 증폭한 산물을 나타낸다.
도 6은 계태아의 간 조직에서 분리한 오리 간염바이러스 1형의 공통 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 7은 계태아의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 8은 계태아의 간 조직에서 최근 분리한 국내 오리간염 바이러스 균주의 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 9는 계태아의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리간염 바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주, 국내 오리 간염바이러스 백신주 및 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주의 유전자를 본 발명에 따른 multiplex PCR을 이용하여 감별적으로 증폭한 산물을 나타낸다.
본 발명은 오리 간염바이러스 1형(duck hepatitis virus type 1) 유전자의 감별진단방법(differential diagnostic method)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자를 표적(target)하는 특이 프라이머를 사용하는 RT-PCR법으로 오리 간염바이러스 1형 유 전자를 감별 진단하는 방법에 관한 것이다.
오리 간염은 어린 오리에서 95% 이상의 치사율을 나타내는 매우 치명적이고 빠르게 전파되는 바이러스성 질병으로서, 오리 간염바이러스 1형, 2형, 3형이라 불려지는 서로 다른 바이러스에 의해서 일어나는 질병으로 알려져 있다. 오리 간염바이러스 1형은 출혈 반점을 동반한 급성 간 괴사를 일으키는 급성의 질병으로서 1945년 미국에서 처음 보고된 이후 세계 각지에서 발생되고 있으며, 최근에는 가까운 중국과 일본에서도 발생하였다. 오리 간염바이러스 2형은 1965년에 영국에서 처음 발병하였고 1969년에 사라진 것으로 발표되었다가 1983-1984년에 영국 내에서만 다시 발병하였다. 오리 간염바이러스 3형은 1969년부터 미국에서만 발생하는 것으로 알려져 있다. 제3형 오리 간염바이러스는 수정된 오리종란에서 쉽게 증식하지만 수정된 닭의 태아에서는 증식하지 않는 것으로 알려져 있다. 오리간염은 국내에서 1985년 전남지역에서 처음 보고된 이후 현재까지 오리농장에 많은 피해를 끼치고 있다. 또한 국내분리 오리 간염바이러스는 수정된 닭의 태아에서 쉽게 증식할 수 있을 뿐 아니라 계태아 접종시에 현저하게 병변을 일으키는 것으로 알려졌다. 1998년 국내에서 처음으로 오리 간염바이러스의 백신을 생산하였으며 1일령 오리에 백신을 접종하는 경우에 상당한 효과를 나타내었다. 그렇지만 최근 오리 간염바이러스 백신을 맞은 어린 오리에서도 오리간염이 발생하고 있어 추가적인 원인 분석이 필요로 한다.
오리 간염바이러스 1형의 발병과 전파는 매우 빨라서 발병 후 3-4일 이내에 모든 오리가 폐사한다. 이때, 감염된 오리는 그들의 무리에서 떨어져 있으며 짧은 시간 이내에 움직임이 둔해지고 눈을 감고 웅크린다. 폐사 직전에는 옆으로 누워있으며 발작적으로 두발을 차다가 머리를 뒤로 젖힌 채 죽는다. 폐사는 임상증상이 나타난 이후 한 시간 이내에 일어난다. 이병율(morbidity rate)은 100%이고 폐사율(death rate)은 감염된 어린 오리의 주령에 따라 다양하다. 보통 1주령 이하의 어린 오리에서는 폐사율은 95%에 이르고 1-3주령의 어린 오리에서는 폐사율은 50% 정도이며, 4-5주령의 어린 오리에서는 이병율과 폐사율은 매우 낮거나 무시할 수 있는 정도다.
최근 미국에서는 혈청중화 반응과 교차병원성 실험을 통해 오리 간염바이러스 1형의 아형이 발견되었다고 보고되어 있지만, 오리 간염바이러스 1형 뿐만 아니라 오리 간염바이러스 1형의 아형의 유전자도 아직까지 보고된 바 없어 오리 간염바이러스 1형과 오리 간염바이러스 1형의 아형의 유전자의 차이를 전혀 모르고 있는 실정이다. 과거 국내에서 개발된 오리 간염바이러스의 백신은 국내 오리 간염바이러스 질병에 상당한 효과를 나타내었지만, 최근에는 오리 간염바이러스 백신에 대한 효능이 의심이 되어서 최근 국내에서 발생한 오리 간염바이러스의 유전자 특징을 추가적으로 알기 위해 노력하고 있는 실정이다. 국내에서도 현재까지 국내 발생 오리 간염바이러스의 정확한 유전자형이 밝혀져 있지 않으며, 또한 오리 간염바이러스의 진단법과 관련하여 오리 간염바이러스 유전자 감별진단기법은 국내뿐만 아니라 외국에서도 아직 개발이 되어있지 않는 실정이다.
현재 오리 간염바이러스 1형의 진단법으로는 폐사된 오리의 부검소견, 조직 검사, 및 오리 간염바이러스 1형의 분리 및 확인 등을 통해 진단이 이루어지고 있다. 상기 오리 간염바이러스 1형을 분리 및 확인하는 방법으로, 첫째 1-7일령 오리 간염바이러스 1형에 민감한 어린 오리의 피하 또는 근육내로 오리 간염바이러스 1형에 감염된 간 유제액을 접종하여 24시간 이내에 임상증상과 폐사가 일어나는지 관찰하고, 폐사하는 경우에 이로부터 바이러스를 재 분리하는 방법이다. 둘째, 오리 간염바이러스 1형에 노출되지 않은 수정된 오리 태아 (10-14일령) 또는 수정된 계(닭) 태아 (8-10일령)를 사용하여 뇨막강(allantoic sac)에 간 유제액을 접종한 후에 수정된 오리 태아의 폐사를 확인하는 방법으로서, 오리의 태아는 24-72시간 이내에 죽고 수정된 계 태아는 죽는 형태가 다양하지만 감염후 5-8일 정도에 폐사하는 경우에 확인되는 오리 간염바이러스 1형의 진단 방법이다. 셋째, 오리태아 간세포를 세포 배양하여 그 배양된 세포에 간 유제액을 접종하고 세포의 변성효과를 관찰하는 방법을 이용하여 오리 간염바이러스 1형을 진단하는 방법이다. 이러한 오리 간염바이러스 1형의 분리법 및 확인법을 이용하면 오리 간염바이러스를 진단하는데 5일 이상의 시간이 소요되고 그 과정이 번거롭다는 문제가 있다. 무엇보다 중요한 것은 현재 오리 간염바이러스 1형과 오리 간염바이러스 1형의 아형은 죽은 오리의 부검소견, 조직검사, 및 오리 간염바이러스의 분리 및 이의 형태학적 확인에 의해서도 감별적으로 진단하는 것이 어려운 실정에 있다. 따라서, 오리 간염바이러스를 보다 신속하고 정확하게 감별적으로 진단할 수 있는 유전자 진단방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
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상기와 같은 문제점을 극복하기 위한 본 발명은, 오리 간염바이러스의 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR 유전자를 표적하는 특이 프라이머를 제작하고, PCR법을 이용하여 오리 간염바이러스 1형에 감염된 어린 오리에서 분리한 간 조직에서 오리 간염바이러스 1형의 공통 유전자 및 서로 다른 유전자를 효과적으로 진단할 수 있으며 조류에서 유래한 다른 RNA 바이러스성 질병의 원인체들도 또한 감별적으로 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하도록 하는 목적이 있다.
따라서, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 수행된 것으로, 본 발명은 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 오리 간염바이러스 1형 유전자를 감별 진단(differential diagnosis)하는 방법으로서, (1) 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 단계; (2) RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 (1) 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 단계; (3) 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 상기 (2) 단계에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 제작하여 통상적인 PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 PCR 산물을 EtBr이 첨가된 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동(electrophoresis)하여 상기 증폭 PCR 산물을 UV(자외선) 하에서 증폭산물의 크기에 따라 확인하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 감별진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위한 본 발명은, 오리 간염바이러스의 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR 유전자를 표적하는 특이 프라이머를 제작하고, PCR법을 이용하여 오리 간염바이러스 1형에 감염된 어린 오리에서 분리한 간 조직에서 오리 간염바이러스 1형의 공통 유전자 및 서로 다른 유전자를 효과적으로 진단할 수 있으며 조류에서 유래한 다른 RNA 바이러스성 질병의 원인체들도 또한 감별적으로 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하도록 하는 목적이 있다.
따라서, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 수행된 것으로, 본 발명은 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
따라서, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 수행된 것으로, 본 발명은 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 오리 간염바이러스 1형 유전자를 감별 진단(differential diagnosis)하는 방법으로서, (1) 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 단계; (2) RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 (1) 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 단계; (3) 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 상기 (2) 단계에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 제작하여 통상적인 PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 PCR 산물을 EtBr이 첨가된 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동(electrophoresis)하여 상기 증폭 PCR 산물을 UV(자외선) 하에서 증폭산물의 크기에 따라 확인하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 감별진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위한 본 발명은, 오리 간염바이러스의 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR 유전자를 표적하는 특이 프라이머를 제작하고, PCR법을 이용하여 오리 간염바이러스 1형에 감염된 어린 오리에서 분리한 간 조직에서 오리 간염바이러스 1형의 공통 유전자 및 서로 다른 유전자를 효과적으로 진단할 수 있으며 조류에서 유래한 다른 RNA 바이러스성 질병의 원인체들도 또한 감별적으로 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하도록 하는 목적이 있다.
따라서, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 수행된 것으로, 본 발명은 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 오리 간염바이러스 1형 유전자를 감별 진단(differential diagnosis)하는 방법으로서, (1) 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 단계; (2) RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 (1) 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 단계; (3) 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 상기 (2) 단계에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 제작하여 통상적인 PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔(agarose gell)에서 전기영동(electrophoresis)하여 상기 증폭 PCR 산물의 발현을 확인하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 감별진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
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본 발명은 하기 도면을 참고하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 본 발명에 사용된 오리 간염바이러스 감별진단법(differential diagnostic method)에 사용된 바이러스의 종류를 나타낸다.
도 2는 어린 오리의 간 조직에서 분리한 오리 간염바이러스 1형의 2C 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물(461bp)을 보여주는 도면이다. 상기 도면에서, 레인 M은 100-bp DNA marker; 레인 1은 DHV-HS; 레인 2는 DHV-HSS; 레인 3은 국내 백신 균주(Korean vaccine strain); 레인 4는 AP-03337; 레인 5는 AP-04009; 레인 6은 AP-04114; 레인 7은 AP-04203; 레인 8은 AP-05Q109; 레인 9는 DRL-62; 레인 10은 R85952; 레인 11은 AEV; 레인 12는 AIV; 레인 13은 IBV; 레인 14는 IBDV; 레인 15는 NDV; 레인 16은 Reovirus; 레인 17은 대조군을 각각 나타낸다.
도 3은 어린 오리의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 캡시드(capsid) 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물(229bp)을 보여주는 도면이다. 상기 도면에서, 레인 M은 100-bp DNA marker; 레인 1은 DHV-HS; 레인 2는 DHV-HSS; 레인 3은 국내 백신 균주; 레인 4는 AP-03337; 레인 5는 AP-04009; 레인 6은 AP-04114; 레인 7은 AP-04203; 레인 8은 AP-05Q109; 레인 9는 DRL-62; 레인 10은 R85952; 레인 11은 AEV; 레인 12는 AIV; 레인 13은 IBV; 레인 14는 IBDV; 레인 15는 NDV; 레인 16은 Reovirus; 레인 17은 대조군을 각각 나타낸다.
도 4는 어린 오리의 간 조직에서 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스의 5'-UTR(untranslated region) 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물(311bp)을 보여주는 도면이다. 상기 도면에서, 레인 M은 100-bp DNA marker; 레인 1은 DHV-HS; 레인 2는 DHV-HSS; 레인 3은 국내 백신 균주; 레인 4는 AP-03337; 레인 5는 AP-04009; 레인 6은 AP-04114; 레인 7은 AP-04203; 레인 8은 AP-05Q109; 레인 9는 DRL-62; 레인 10은 R85952; 레인 11은 AEV; 레인 12는 AIV; 레인 13은 IBV; 레인 14는 IBDV; 레인 15는 NDV; 레인 16은 Reovirus; 레인 17은 대조군을 각각 나타낸다.
도 5는 어린 오리의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주, 국내 오리 간염바이러스 백신주 및 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주의 유전자를 본 발명에 따른 multiplex PCR을 이용하여 감별적으로 증폭한 산물을 보여주는 도면이다.
도 6은 계태아의 간 조직에서 분리한 오리 간염바이러스 1형의 공통 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 7은 계태아의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 8은 계태아의 간 조직에서 최근 분리한 국내 오리간염 바이러스 균주의 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 9는 계태아의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리간염 바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주, 국내 오리 간염바이러스 백신주 및 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주의 유전자를 본 발명에 따른 multiplex PCR을 이용하여 감별적으로 증폭한 산물을 나타낸다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 수행된 것으로, 본 발명은 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자를 제공한다.
도 1은 본 발명에 사용된 오리 간염바이러스 감별진단법(differential diagnostic method)에 사용된 바이러스의 종류를 나타낸다.
도 2는 어린 오리의 간 조직에서 분리한 오리 간염바이러스 1형의 2C 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물(461bp)을 보여주는 도면이다. 상기 도면에서, 레인 M은 100-bp DNA marker; 레인 1은 DHV-HS; 레인 2는 DHV-HSS; 레인 3은 국내 백신 균주(Korean vaccine strain); 레인 4는 AP-03337; 레인 5는 AP-04009; 레인 6은 AP-04114; 레인 7은 AP-04203; 레인 8은 AP-05Q109; 레인 9는 DRL-62; 레인 10은 R85952; 레인 11은 AEV; 레인 12는 AIV; 레인 13은 IBV; 레인 14는 IBDV; 레인 15는 NDV; 레인 16은 Reovirus; 레인 17은 대조군을 각각 나타낸다.
도 3은 어린 오리의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 캡시드(capsid) 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물(229bp)을 보여주는 도면이다. 상기 도면에서, 레인 M은 100-bp DNA marker; 레인 1은 DHV-HS; 레인 2는 DHV-HSS; 레인 3은 국내 백신 균주; 레인 4는 AP-03337; 레인 5는 AP-04009; 레인 6은 AP-04114; 레인 7은 AP-04203; 레인 8은 AP-05Q109; 레인 9는 DRL-62; 레인 10은 R85952; 레인 11은 AEV; 레인 12는 AIV; 레인 13은 IBV; 레인 14는 IBDV; 레인 15는 NDV; 레인 16은 Reovirus; 레인 17은 대조군을 각각 나타낸다.
도 4는 어린 오리의 간 조직에서 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스의 5'-UTR(untranslated region) 유전자를 본 발명에 따른 PCR법을 이용하여 증폭한 PCR 산물(311bp)을 보여주는 도면이다. 상기 도면에서, 레인 M은 100-bp DNA marker; 레인 1은 DHV-HS; 레인 2는 DHV-HSS; 레인 3은 국내 백신 균주; 레인 4는 AP-03337; 레인 5는 AP-04009; 레인 6은 AP-04114; 레인 7은 AP-04203; 레인 8은 AP-05Q109; 레인 9는 DRL-62; 레인 10은 R85952; 레인 11은 AEV; 레인 12는 AIV; 레인 13은 IBV; 레인 14는 IBDV; 레인 15는 NDV; 레인 16은 Reovirus; 레인 17은 대조군을 각각 나타낸다.
도 5는 어린 오리의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주, 국내 오리 간염바이러스 백신주 및 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주의 유전자를 본 발명에 따른 multiplex PCR을 이용하여 감별적으로 증폭한 산물을 보여주는 도면이다.
도 6은 계태아의 간 조직에서 분리한 오리 간염바이러스 1형의 공통 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 7은 계태아의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 8은 계태아의 간 조직에서 최근 분리한 국내 오리간염 바이러스 균주의 특이 유전자를 본 발명에 따른 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물을 나타낸다.
도 9는 계태아의 간 조직에서 분리한 표준 균주 오리간염 바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주, 국내 오리 간염바이러스 백신주 및 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 균주의 유전자를 본 발명에 따른 multiplex PCR을 이용하여 감별적으로 증폭한 산물을 나타낸다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해 수행된 것으로, 본 발명은 2C 유전자, 캡시드(capsid) 유전자 및 5'-UTR(untranslated region) 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자를 제공한다.
본원에서 사용된 상기 2C 유전자는 서열번호: 1, 서열번호: 4, 서열번호: 7, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 16, 서열번호: 19, 서열번호: 22 및 서열번호: 25로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 상기 캡시드 유전자는 서열번호: 2, 서열번호: 5, 서열번 호: 8, 서열번호: 11, 서열번호: 14, 서열번호: 17, 서열번호: 20, 서열번호: 23 및 서열번호: 26로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 상기 5'-UTR 유전자는 서열번호: 3, 서열번호: 9, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 15, 서열번호: 18, 서열번호: 21, 서열번호: 24 및 서열번호: 27로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인 것이 바람직하다.
또한, 본원에서 사용된 상기 오리 간염바이러스 1형은 DHV-HS (94년 국내분리주), DHV-HSS(95년 국내분리주), DHV 백신주(국내 백신주), DHV-AP-03337(2003년 국내 분리 균주), DHV-AP-04009(2004년 국내 분리 균주), DHV-AP-04114(2004년 국내 분리 균주), DHV-AP-04203(2004년 국내 분리 균주), DHV-AP-05Q109(2005년 국내 분리 균주), DRL-62(ATCC 표준 균주, duck hepatitis virus type 1)와 R85952(ATCC 표준 균주, duck hepatitis virus) 그리고 조류 유래의 다른 RNA virus인 AEV(Avian encephalitis virus, 백신주), AIV(Avian influenza virus, field isolate 06-Q-009), IBV(Infectious bronchitis virus, field isolate 06-D-021), IBDV(Infectious bursal disease virus, field isolate 05-Q-107), NDV (Newcastle disease virus, field isolate 05-Q-084) 및 Reovirus (vaccine strain S1113)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다.
여기에 사용된 상기의 오리 간염바이러스 균주 및 백신 등은 도 1에서와 같이, 국내에서 오리 간염바리어스에 감염된 오리에서 분리한 바이러스로, 현재 국립수의과학검역원에서 보관하고 있다. 그리고 DRL-62와 R85952는 미국 ATCC사에서 균독주를 수입한 것이다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 오리 간염바이러스 1형 유전자의 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자를 표적으로 하는 서열 번호: 28 내지 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 특이 프라이머가 제공되며, 상기 오리 간염바이러스에 특이한 프라이머를 이용하여 오리 간염바이러스 1형 및 기타 오리 간염바이러스 유전자를 진단할 수 있으며, 상기 프라이머를 혼합한 후에 multiplex PCR법을 수행함으로써 상기 오리 간염바이러스 1형 및 기타 오리 간염바이러스 유전자를 감별적으로 진단할 수 있다.
또한 본 발명은 오리 간염바이러스 1형 유전자를 진단하는 방법으로서, (1) 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 단계; (2) RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 (1) 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 단계; (3) 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 상기 (2) 단계에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 제작하여 통상적인 PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 PCR 산물을 EtBr인 첨가된 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 상기 증폭 PCR 산물(461bp)을 UV(자외선) 하에서 확인하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 진단방법을 제공한다.
또한, 본원에서 사용된 상기 오리 간염바이러스 1형은 DHV-HS (94년 국내분리주), DHV-HSS(95년 국내분리주), DHV 백신주(국내 백신주), DHV-AP-03337(2003년 국내 분리 균주), DHV-AP-04009(2004년 국내 분리 균주), DHV-AP-04114(2004년 국내 분리 균주), DHV-AP-04203(2004년 국내 분리 균주), DHV-AP-05Q109(2005년 국내 분리 균주), DRL-62(ATCC 표준 균주, duck hepatitis virus type 1)와 R85952(ATCC 표준 균주, duck hepatitis virus) 그리고 조류 유래의 다른 RNA virus인 AEV(Avian encephalitis virus, 백신주), AIV(Avian influenza virus, field isolate 06-Q-009), IBV(Infectious bronchitis virus, field isolate 06-D-021), IBDV(Infectious bursal disease virus, field isolate 05-Q-107), NDV (Newcastle disease virus, field isolate 05-Q-084) 및 Reovirus (vaccine strain S1113)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다.
여기에 사용된 상기의 오리 간염바이러스 균주 및 백신 등은 도 1에서와 같이, 국내에서 오리 간염바리어스에 감염된 오리에서 분리한 바이러스로, 현재 국립수의과학검역원에서 보관하고 있다. 그리고 DRL-62와 R85952는 미국 ATCC사에서 균독주를 수입한 것이다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 오리 간염바이러스 1형 유전자의 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자를 표적으로 하는 서열 번호: 28 내지 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 특이 프라이머가 제공되며, 상기 오리 간염바이러스에 특이한 프라이머를 이용하여 오리 간염바이러스 1형 및 기타 오리 간염바이러스 유전자를 진단할 수 있으며, 상기 프라이머를 혼합한 후에 multiplex PCR법을 수행함으로써 상기 오리 간염바이러스 1형 및 기타 오리 간염바이러스 유전자를 감별적으로 진단할 수 있다.
또한 본 발명은 오리 간염바이러스 1형 유전자를 진단하는 방법으로서, (1) 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 단계; (2) RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 (1) 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 단계; (3) 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 상기 (2) 단계에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 제작하여 통상적인 PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 PCR 산물을 EtBr인 첨가된 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 상기 증폭 PCR 산물(461bp)을 UV(자외선) 하에서 확인하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 진단방법을 제공한다.
또한 본 발명은 오리 간염바이러스 1형 유전자를 감별 진단(differential diagnosis)하는 방법으로서, (1) 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 단계; (2) RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 (1) 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 단계; (3) 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 상기 (2) 단계에서 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 단계 (3)에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 혼합하여 multiplex PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 PCR 산물을 EtBr이 첨가된 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 상기 증폭 PCR 산물을 UV(자외선) 하에서 증폭산물의 크기에 따라 확인하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 감별진단방법을 제공한다.
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이하, 본 발명의 구성을 실시예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.
(
실시예
1)
(오리 간염바이러스 1형에 감염된 오리 간 조직으로부터의
RNA
분리)
오리 바이러스성 간염 1형에 감염된 오리 간 조직을 유제에서 충분히 균질화하여 10X PBS(phosphate-buffered saline)에 부유시킨 후, RNA 추출시약인 트리졸 LS 시약(Invitrogen)을 사용하여 시약 제조사의 RNA 추출방법에 따라 총 RNA를 분리하였다.
(오리 간염바이러스 1형 유전자의
cDNA
합성)
상기에서 얻어진 부유된 총 RNA 6ul, 무작위 육량체(random hexamer, 20pmol/ul) 2ul 및 DEPC DW 5ul를 200ul PCR 튜브에 넣고, 70℃에서 5분 동안 반응시킨 후 바로 얼음에서 냉각시켰다.
상기 PCR 튜브에 5X MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소 완충액(reverse transcriptase buffer)(250mM 트리스-HCl, pH8.3, 25℃), 375mM KCl, 15mM MgCl2 및 50nM DTT, Promega) 4ul, dNTP 혼합물(각 2.5mM, Promega) 2ul, MMLV 역전사효소(200units, Promega) 1ul를 추가로 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 70 ℃에서 MMLV 역전사효소를 10분 동안 불활성화시켰다.
(오리 간염바이러스 1형의 유전자 증폭)
(오리 간염바이러스 1형의 감별진단)
하기에 기술된 바와 같이, 오리 간염바이러스 1형의 2C 유전자를 이용한 공통 프라이머, 5'-UTR 유전자를 이용한 최근 분리한 국내 오리 간염바이러스 유전자의 특이 프라이머, 및 캡시드(capsid) 유전자를 이용한 오리 간염바이러스 1형의 표준 균주, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 유전자 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 특이 프라이머를 제작한 후, 상기에서 합성된 cDNA를 사용하여 다음 과 같이 PCR을 수행하였다. 오리 간염바이러스 1형을 진단하는데 사용된 프라이머 및 PCR의 조건을 하기 표 1 및 2에 각각 나타냈다.
- 오리 간염바이러스 1형의 진단에 사용된 공통 2C 유전자의 특이 프라이머
DHV 2C-comF: 5'-TGGCTWAAAGAAAAAGTGTTTCC-3'(서열번호: 28)
DHV 2C-comR: 5'-TGTGAMACATACCCATCCATATG-3'(서열번호: 29)
상기 염기서열에서, M은 A 또는 C이고, W는 A 또는 T이다.
- 오리 간염바이러스 1형, 과거에 분리한 국내 오리 간염바이러스 및 국내 오리 간염바이러스 백신주의 진단에 사용된 캡시드 유전자의 특이 프라이머
DHV capsid F: 5'-GTTCCAAATGATGATTATTATG-3'(서열번호: 30)
DHV capsid R: 5'-GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3'(서열번호: 31)
- 최근에 분리한 국내 오리 간염바이러스의 진단에 사용된 5'-UTR (untranslated region) 유전자의 특이 프라이머
DHV 5'-URT F: 5'-CCCAYGTCTAAGTCTTAATGGAT-3'(서열번호: 32)
DHV 5'-URT R: 5'-CTAAAGGTGTCTGTATCCAAGC-3'(서열번호“ 33)
상기 염기서열에서, Y는 C 또는 T이다.
| 반응 혼합물 | |
| 주형 DNA (합성된 cDNA) | 1.5ul |
| 전방향 프라이머(F) | 1ul (10pmol/1ul의 프라이머) |
| 후방향 프라이머(R) | 1ul (10pmol/1ul의 프라이머) |
| dNTP 혼합물 (각 2.5mM) | 1ul |
| 10X PCR 완충액 | 2ul |
| Tag 중합효소 | 1 unit |
| 증류수 | up to 20ul |
| PCR 반응조건 | |||
| PCR 단계 | 온도 | 시간 | |
| 1회 | 예비변성단계 | 94℃ | 5분 |
| 35회 | 변성단계 | 94℃ | 20초 |
| 어닐링 단계 | 48℃ | 30초 | |
| 연장 단계 | 72℃ | 30초 | |
| 1회 | 최종연장단계 | 72℃ | 5분 |
상기 조건에 따라 PCR을 수행한 후 EtBr이 첨가된 1.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 오리 간염바이러스 1형 유전자가 증폭되었는지를 확인하였다(도 1 참조).
(
시험예
1)
(감염된 오리의 간 조직액에서의 오리 간염바이러스 1형의 감별진단)
상기 서열번호: 28 및 29, 서열번호: 30 및 31, 서열번호: 32 및 33, 및 서열번호: 28 내지 33로 이루어진 프라이머를 각각 혼합하여 오리 간염바이러스 1형 및 조류 유래의 RNA 바이러스성 질병의 원인체들의 유전자와 감별진단을 시도하였다. 상기 오리 간염바이러스 1형 및 조류 유래의 RNA 바이러스성 질병의 원인체들로부터 RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출방법을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이어, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 상기 방법에 따라 추출된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하고 PCR법으로 합성된 cDNA를 증폭하였다(도 2 내지 도 5 참조).
도 2 내지 5에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 서열번호: 28 및 29, 서열번호: 30 및 31, 서열번호: 32 및 33, 및 서열번호: 28 내지 33으로 이루어진 프라이머를 각각 혼합한 후, 이를 이용하여 오리 간염바이러스 1형의 유전자뿐만 아니라 다른 조류 유래 RNA바이러스성 질병들의 원인체들도 또한 감별적으로 진단할 수 있다는 것을 확인하였다.
(
시험예
2)
(
계태아
유제액에서의
오리 간염바이러스 1형의 감별진단)
먼저, 오리 간염바이러스에 감염된 오리의 간 조직을 균질화한 후, PBS를 사용하여 10% 유제액으로 만들어 0.45um의 필트(Minisart, Sartorious)를 사용하여 8-10일령의 수정된 계태아의 뇨막강액에 접종하였다. 접종 후 5일 동안 37℃의 배양기에서 계태아를 배양하였으며, 접종 후 3-4일 정도 지나서 죽은 계태아는 4℃의 냉장고에서 바로 냉각시키고, 살아남은 계태아는 접종 5일후 4℃의 냉장고에서 냉각하였다. 냉각된 계태아의 간조직을 채취하여 바이러스의 감염 여부를 확인하였으며, 이때 RNA 추출시약을 사용하는 RNA 추출방법에 따라 계태아의 간조직 유제액을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 또한, cDNA의 합성과 PCR법은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다(도 6 내지 도 9 참조).
도 6 내지 9에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 서열번호: 28 및 29, 서열번호: 30 및 31, 서열번호: 32 및 33, 및 서열번호: 28 내지 33으로 이루어진 프라이머를 각각 혼합한 후, 이를 이용하여 계태아의 간조직에서도 간염바이러스 1형의 유전자뿐만 아니라 다른 조류 유래 RNA바이러스성 질병들의 원인체들도 또한 감별적으로 진단할 수 있다는 것을 확인하였다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 오리 간염바이러스에서 분리한 2C 유전자, 5′-UTR 유전자 및 캡시드 유전자를 표적(target)으로 하는 특이 프라이머를 제작하고, 상기 특이 프라이머를 RT-PCR에 사용하여 어린 오리에서 오리 간염바이러스 1형을 신속하고 정확하게 감별진단 할 수 있는 등의 효과가 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management: Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research)
<120> Method for differentially diagnosing duck hepatitis virus type 1
<160> 33
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C gene of duck hepatitis virus type 1 DRL-62
<400> 1
tctggcaaaa ccacttctcc taagtctttt aatgattgga caacctgtgc aaaaaatgta 60
caatggtggc ttgaatcatt tgttaaagtt gtaaattggc ttaaagaaaa agtgtttcct 120
tcaaaaactg acccaactct tcagtggctc caggatcatg aagaacatat agctattatg 180
ttggcattgt gtgatgagca cctttgtatg ctaagaactg aaaaagatta catttgtgag 240
cacaacactc gtccaaaaca tcagcgtttg gttgaaatgg tctctggcac actgaaccaa 300
ctccaaggta tttcaagtgc tcgtgaattg gcagccagac tacagcatgt gttgaacaaa 360
ctccaccaag tcaattttga gcctgaactg gagtggacac accgtcctga acctcttggt 420
atatggatat ctggtggccc tggtgttggg aagagctttt tgtcaaacta tattgttaaa 480
gaaatagcca aattaaagca ttggaagagt tatgccaacc caactggaag taagcatatg 540
gatgggtatg tgtcacagga gattcatgtc tttgatgatt ttggtcaaaa tcgggaagag 600
gaagactact ctttaatttg taatctcatt tctagtgttc cattcatcac tccaaaggca 660
agtgtagagg ctaagggcac ccaatacaga ggacgccttg ttgttgtcac aaccaataga 720
cgggatttca cttcttgtaa gttgactgac ccagatgcac tggaaaggcg cttccctatt 780
cgccttaata tccggccatt gcaaaaatac aaccacaagg gccgtttgga cgtggcaaca 840
gccatgagag atggaagctt gcagggagga acttgctggg aaagggatat aggccagtta 900
ggccttgaat gttggaatcc cataaatggc caaaccttga ttgatgaaat tatgagtgag 960
ttgcaggtta ggcaagaagt agcttccttt atgaaccag 999
<210> 2
<211> 2193
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capsid gene of duck hepatitis virus type 1 DRL-62
<400> 2
atggatactc ttaccaaaaa cattgaggat gcaacagtca acatcattgg atcttgtgca 60
gaaaaggtgg aggaagcaat ttcaggccta ggggcagtgg aaagtgtggc atctaccaat 120
tcagccattg ccactgccaa tgcaacaact acacagacaa taccagaccc aacggagggt 180
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tcaaccctaa ctcccagtgt tcgaatcaat cgctatcaat tgattttcag taatattcca 1080
acattctccc tcttctttga caaatttcaa tactggagag ggtcattgga ggttaaattc 1140
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gatggtgaac aaagcttggc acaatgccag aattcagtgt ttgtaactgg ggatgtatgt 1260
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<211> 626
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'-UTR gene of duck hepatitis virus type 1 DRL-62
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C gene of duck hepatitis virus R85952
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<213> Artificial Sequence
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<223> 2C gene of duck hepatitis virus DHV-HSS
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<223> 5'-UTR gene of duck hepatitis virus DHV-HSS
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ctaaattgga ttatccttta cttgtggtgg ttagccaacc atgctctggt gcaatgattc 240
catatgttca cctggctaag tgccgactta ggaggtggtg ctgaaatatt gcaagccact 300
aatgtcgtta cacttagcct ctggatacgt gggattaatt gcattctgta cagaggaagg 360
ctagtctatg ccttgggctc atggtcttcg ttgtgaaacg gataaccggt agtagcatct 420
taggccacca aggttgtagg tgagtgtgtg gtctagagta ggcacacatc tgtccaggca 480
catgcacatt gttgcgattg ctccagacta gttcctgagg gacagatgtt gtggggggct 540
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<211> 2193
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capside gene of duck hepatitis virus (domestic vaccine strain)
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<223> 5'-UTR gene of duck hepatitis virus (domestic vaccine strain)
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ccacggcgga ggccaatcca taaaccaaag agccctcctc aggaatctcg catcatcatc 840
cagcctgggc caggagctgc aaatctatcc aattccagtg tggtcaccat ggctgagagt 900
gtggctctag ctaatgaagg tactgcagtt gactattcaa cagctgggtg tgcatcatct 960
gtcgatgata tagtcatggt gcttagacgc tggcagattg tgggtgattt tcagtgggct 1020
aacacagtga cccctggcaa caggattagt aggtttcagg tggtttttaa tcgaatgcca 1080
acttttgctc tcttttttga taagttccaa tattggagag ggtccctgga ggttaaatta 1140
ttgacctttg gaagccagtt taatactggc cgctatcaaa tgtcatggta ccctgtctct 1200
aatggagaac aaactcttgc ccagtgccag aattctgtgt ttgtcacctg tgatgtctgt 1260
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gaaaattatg gctatataac ctggcatgtt gtgaatcgcc tgacagtcaa ctcaacatcc 1380
ccatccacaa ttagctgtgt cattttgatg cgagttggta aggattttca gtttacagct 1440
cccctgtatg ggaacctgca gatggccgcc aatgatcagg gtgattccaa tcagcttggt 1500
gatgatgaac cagtgtgttt tctcaatttt gagactgcaa atgtgccaat acaaggggag 1560
tcgcacacct tggtgaaaca tttttttggc cgtcaatggc tggttcgtac tgttcaacat 1620
actggtgagg tacaagagat ggatttgcca gtgcctgacc ggggtcatgc atctctgttg 1680
cgcttctttg cctatttctc tggagaagtg attctgacca ttgtcaataa tggaacaaca 1740
ccctgcatgg ttgcacactc ttatacaaca gacaatctca cttctgaata tgctgtcact 1800
gccatggggg gtattcttat cccagcgaac tctgccaaga atattagtat tccattttat 1860
tctgtcacac ctctacgccc cacccgaccc atgccagcat ctcagggggg tggcttgact 1920
tttggcaggt tgtatatctg gacacaatct gggagcattt ctgtttttat gggcctccac 1980
aagccagctt tgttttttcc actgcccgca tcaacttaca cagcacctac gcggtcgaat 2040
gcgcttgaaa ttatgaatct gcatgaacaa tcagaccagc cagactgcca tctgtgtaag 2100
atatgcagga aaatgaagaa atggtctcgc aaccttcgcc catttcgctt ctgtttgaga 2160
cttaaaacac ttgcctttga gctccatttg gaaattgaa 2199
<210> 24
<211> 652
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'-UTR gene of duck hepatitis virus AP-04114
<400> 24
tttgaaagcg gctgtggtgt agatcatttt ctggcgcttg gttcagccag tatgatctca 60
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aggaccccct atccatttgt tttaccttca ccctccacta tatagtctgt tgcctggcta 180
ttgactttgg cttttgtttt tgacccacgt ctaagtctta atggattttg tagtggttag 240
cctaccaccc cttggccact aattcttggc tttctgtttg gggatccacc atatcttgga 300
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ggtgcagtgg ttttggacaa ggaaaggcta gtgtttggtc tgggtacaaa cccttgttgt 420
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<210> 25
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2C gene of duck hepatitis virus AP-04203
<400> 25
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gatgggtatg tttcacagga aatccatgtt tttgatgatt ttggccagaa tcgtgaagag 600
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cgactcaata ttaggcccct tcagaaatac aatcataaag gtaggttgga tgttgctact 840
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ctgcaggtta gacatgaagt ggctaatttt atgaatcag 999
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<213> Artificial Sequence
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ccacggcgga ggccaatcca taaaccaaag agccctcctc aggaatctcg catcattatc 840
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gtggctctag ctaatgaagg tactgcagtt gactattcaa cagctgggtg tgcatcatct 960
gtggatgata tagtcatggt gctcagacgc tggcagattg tgggtgattt tctgtgggct 1020
aacacagtga cccctggcaa caggattagt aggtttcagg tggtttttaa tcgaatgcca 1080
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<212> DNA
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<220>
<223> Specific forward primer DHV 2C-comF for 2C gene of duck hepatitis
virus type 1
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virus type 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Specific forward primer DHV capsid F for capsid genes of various
duck hepatitis viruses
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gttccaaatg atgattatta tg 22
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<212> DNA
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<220>
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duck hepatitis viruses
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duck hepatitis viruses
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<220>
<223> Specific reverse primer DHV 5'-URT R for 5'-UTR genes of domestic
duck hepatitis viruses
<400> 33
ctaaaggtgt ctgtatccaa gc 22
Claims (9)
- 서열번호: 1, 서열번호: 4, 서열번호: 7, 서열번호: 10, 서열번호: 13, 서열번호: 16, 서열번호: 19, 서열번호: 22 및 서열번호: 25로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인 2C 유전자와;서열번호: 2, 서열번호: 5, 서열번호: 8, 서열번호: 11, 서열번호: 14, 서열번호: 17, 서열번호: 20, 서열번호: 23 및 서열번호: 26로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인 캡시드 유전자;서열번호: 3, 서열번호: 6, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 15, 서열번호: 18, 서열번호: 21, 서열번호: 24 및 서열번호: 27로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인 5'-UTR 유전자로 이루어진 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 1형 (duck hepatitis virus type 1) 유전자.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 오리 간염바이러스 1형 유전자의 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5'-UTR 유전자를 표적으로 하는 서열 번호: 28 내지 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 특이 프라이머.
- 삭제
- 오리 간염바이러스 1형인 DHV-HS, DHV-HSS, DHV 국내 백신주, DHV-AP-03337, DHV-AP-04009, DHV-AP-04114, DHV-AP-04203, DHV-AP-05Q109, DRL-62 그리고 R85952와 조류 유래의 RNA바이러스인 AEV (Avian encephalitis virus), AIV (Avian influenza virus), IBV (Infectious bronchitis virus), IBDV (Infectious bursal disease virus), NDV (Newcastle disease virus) 그리고 Reovirus (vaccine strain S1113)로 이루어진 군에서 특징적으로 오리 간염바이러스 1형을 감별진단(differential diagnosis)하는 방법으로,상기 오리 간염바이러스(duck hepatitis virus)에 감염된 오리에서 분리된 간 조직을 균질화하여 10% PBS에 부유시키는 제1 단계와;RNA 추출 시약을 사용하는 RNA 추출 방법에 따라 상기 제1 단계에서 얻어진 상층액으로부터 RNA를 분리하는 제2 단계와;상기 제2 단계에서 분리된 RNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase; MMLV)를 사용하는 역전사법(reverse transcription method)을 이용하여 cDNA를 합성하는 제3 단계와;상기 제 3단계에서 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 2C 유전자, 캡시드 유전자 및 5′-UTR 유전자를 표적으로 하는 서열 번호: 28 내지 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 오리 간염바이러스 특이 프라이머를 혼합하여 multiplex PCR법으로 상기 각각의 유전자를 증폭시키는 제 4단계; 및상기 제4 단계에 의해 증폭된 PCR 산물을 EtBr이 첨가된 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 상기 증폭 PCR 산물을 UV(자외선) 하에서 증폭산물의 크기에 따라 확인하는 제 5단계;를 포함하여 이루어지는 오리 간염바이러스 1형의 감별진단방법.
- 삭제
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Cited By (1)
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