KR101602921B1 - 구제역 sat 3형 sez 지역형의 방어항원 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 - Google Patents

구제역 sat 3형 sez 지역형의 방어항원 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드, 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스 및 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 함유하는 구제역 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스의 방어항원인 P1 단백질을 발현하는 효과가 우수하므로, 구제역 SAT 3형(SAT3/2sa57/59 [SAT3/SA/57/59])을 비롯한 구제역의 백신용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 발현하는 재조합 바이러스{Recombinant virus expressing protective antigen protein of foot-and-mouth disease SAT3-SEZ topotype}
본 발명은 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드, 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스 및 상기 재조합 바이러스를 유효성분으로 함유하는 구제역 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로, 빠른 질병 전파력을 가진다. 구제역은 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 국가간 전파가 가능한 질병으로 분류되고 있으며, 이로 인한 경제적 손실이 커 매우 중요한 질병이다. 이러한 특성 때문에, 축산물의 국가간 교역에 있어 구제역은 발생유무가 매우 중요한 점검요소로 여겨지고 있다. 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스 형태이며, 피코나비리데(Piconaviridae)과 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하는 것으로 알려져 있다. 또한, 구제역은 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT 2, SAT 3)에 따라 분류되는 것으로 알려져 있다.
구제역 혈청형 중 하나인 구제역 SAT형은 구제역 바이러스가 지역적 특성에 맞게 진화된 것으로, SAT형은 다른 혈청형에 비해 항원적 특이성이 큰 것으로 알려져 있다. SAT형은 수차례 야생동물에 대한 감염 능력을 확보한 것으로 알려져 있다. 또한, SAT형 구제역 바이러스는 아프리카 들소를 감염시켜 지속감염을 유발하였으며, 가축의 감염에 중요한 전파요소로 작용할 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 2000년 이후, 남아프리카의 백신 접종군에서 최초로 SAT형의 구제역 바이러스가 기록된 바 있으며, 사하라 사막 이남 아프리카에서는 소에서 발생하는 대부분의 구제역이 SAT 2형에 의한 것으로 알려져 있다. 구제역 SAT 1형의 경우 넓은 지역에 두루 퍼져있고, 대부분의 아프리카 지역에 서식하는 버팔로의 55%에서 지속감염이 있는 것으로 알려져 있다. 반면, 구제역 SAT 3형은 가장 낮은 빈도로 발병하는 것으로 보고되어 있다.
구제역 SAT 2형은 1~14(Ⅰ~ⅩⅣ)까지의 지역형이 있다. 완전한 구제역 백신을 제공하기 위해서는, 이러한 지역형들에 대한 백신을 모두 개발해야 하지만, 이를 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 부여해야 하므로, 시간이 많이 소요되고 결과를 장담할 수 없다는 문제점이 있다.
반면, 구제역 SAT 3형은 가장 낮은 빈도로 발병하는 것으로 보고되어 있다. 구제역 SAT 3형은 I~Ⅵ의 6가지의 지역형이 있다. I(SEZ) 지역형은 남아프리카, 남 짐바브웨, Ⅱ 지역형(WZ)은 나미비아, 보스와나, 서부 짐바브웨, Ⅲ 지역형(NWZ)은 말라위, 북 짐바브웨, Ⅵ 지역형은 잠비아, Ⅴ, Ⅵ 지역형은 우간다에서 주로 발생한다. 엄격하게 개발한다면 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신주로 사용하여야 하지만, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주를 지속적으로 세포에 배양하여 적절한 증식력을 지녀야 한다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 결과가 좋으리라는 보장도 없다.
구제역 바이러스 SAT 3형 SEZ지역형의 SAT3/2sa57/59주는 SEZ 지역형에 대한 바이러스에 대해 방어가 가능하다. SAT3/2sa57/59주는 한국 정부가 구제역 발생시를 대비하여 항원뱅크로 비축하고 있는 남아프리카 바이러스주 중 하나로 알려져 있다. 한국 주변지역에서 아직 구제역 발생이 확인되지 않고 있으나, 추후 발생될 가능성이 농후한 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 구제역 SAT 3형을 항원뱅크에 미리 준비해 놓을 경우, 급작스러운 구제역 SAT 3형 발병에 보다 신속하게 대응할 수 있다는 장점이 있고, 특히 SEZ 지역형의 발생에 대비한 백신 종독주로 매우 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있어 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 구제역 바이러스는 대부분의 동물에 대한 병원성을 보유하고 있다. 바이러스의 병원성을 약화 또는 제거하기 위하여 여러번의 계대배양 등을 이용하는 등 연구자들의 노력에도 불구하고, 그 결과가 미미하여 현재까지 구제역 바이러스에 대한 병원성이 줄어든 약독화된 백신을 사용하는 것은 국제적으로 금기시되고 있는 실정이다. 더욱이, 구제역에 대해 약독화 바이러스를 사용하는 것은 병원성의 회복에 대한 문제점을 가지고 있고, 생독백신을 사용할 경우 야외 감염된 구제역 바이러스와 구분이 어렵다는 단점이 있어 구제역 발생시 효과적으로 접종하여 방역하는 체계를 구축하기 어렵다는 문제점이 있다. 따라서, 구제역 백신 바이러스를 신속하고 정확하게 방어할 수 있는 백신주의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 구제역 SAT 3형을 효과적으로 방어할 수 있는 백신주를 개발하기 위해 연구하던 중, 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 발현하는 재조합 구제역 바이러스를 제조하였고, 상기 재조합 구제역 바이러스가 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스의 방어항원인 P1 단백질을 우수하게 발현시켜 구제역 SAT 3형 바이러스의 백신으로 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 KR 10-0737446 한국등록특허 KR 10-1236203
PLoS one, Vol.8, Issue.1, e55228 (2013) van rensburg H.G., masom, P.W. 2002. Ann N Y Acad Sci. 2002 Oct; 969:83-7.
본 발명의 목적은 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 함유하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 구제역 바이러스를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 구제역의 예방 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명은 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 제공한다.
상기 재조합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 재조합 플라스미드는 도 3의 개열지도로 표시되는 pOm-SAT3-SA인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 플라스미드는 P1 단백질을 코딩하는 유전자가 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스(SAT3/2sa57/59 [SAT3/SA/57/59])의 방어항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열;을 가지는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드인 것이 바람직하다.
상기 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스는 GenBank 등록 번호 AY593850의 염기서열로 등록된 것이 바람직하며, 상기 구제역 O형 Manisa 바이러스는 GenBank 등록 번호 AY593823.1의 염기서열로 등록된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "구제역 바이러스 O형 Manisa 주"는 O형 백신에서 가장 널리 쓰이는 백신 바이러스로서, O형 중 ME-SA(중동-남아시아형, PanAsia 지역형을 포함)에 대한 바이러스에 대한 방어가 가능한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명의 재조합 플라스미드 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자 조작법, 형질전환법에 의해 제작될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포 배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.
본 발명에서는 상기 재조합 플라스미드를 하기와 같은 과정을 통해 수득하였다.
a) 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 P1 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계; b) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pO-Manisa)를 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머를 이용하여 Manisa의 전체 유전자 중 P1 유전자가 제거된 플라스미드를 제작한 후, 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭시키는 단계; 및 c) 상기 a)에서 증폭된 P1 유전자 및 상기 b)에서 증폭된 플라스미드에 대한 결찰반응을 유도하는 단계;를 포함하는 재조합 플라스미드(pOm-SAT3-SA)의 제조방법에 따라 제조한다.
본 발명에서 "프라이머(primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.
본 발명에서는 상기 재조합 구제역 바이러스를 하기와 같은 과정을 통해 수득하였다.
1) 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pO-Manisa)를 제작하는 단계; 2) 상기 1)의 재조합 플라스미드의 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자 염기서열 중에서, P1 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열을 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스의 방어항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열로 치환시켜, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 제작하는 단계; 3) 상기 2)의 재조합 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계;를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 따라 제작한다.
상기 P1 유전자는 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 3)의 세포는 염소태아 혀세포(ZZ-R), 어린 햄스터 신장세포(BHK21), 소 신장세포주 (LFBK), 돼지 신장세포주 (IBRS-2) 또는 흑염소 신장세포(BGK) 등을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 당업자의 판단에 따라 적절한 진핵세포를 선별하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 표적 염기서열은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 증폭하였다. 본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)" 은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다.
본 발명의 표적 염기서열의 증폭을 위해 사용된 중합효소 연쇄반응(PCR)은 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소 연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소 연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)등의 방법을 이용하여 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)과 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사를 수행하였으나, 통상의 당업자의 판단에 의해 상황에 맞추어 여러 종류의 PCR 또는 염기서열 증폭 반응을 응용할 수 있음으로 해석함이 자명할 것이다.
또한, 본 발명은 재조합 구제역 바이러스를 유효성분으로 함유하는 구제역 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스의 방어항원인 P1 단백질을 발현하는 효과가 우수하므로, 구제역 SAT 3형(SAT3/2sa57/59 [SAT3/SA/57/59])을 비롯한 구제역의 감염을 예방하기 위해 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 백신은 생백신, 약독화된 백신 또는 사백신을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 바이러스 O Manisa의 유전자 일부를 조작하여 작성하여 제작하는 원리이기 때문에 동물에 병원성을 약화시킴으로써, 소독제 실험 또는 항바이러스 실험 등 실험실 내에서 다루기에 병원성 바이러스보다 더욱 안전하게 사용 가능할 수 있고, 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 아프리카 등지에서 발생되는 구제역 바이러스를 방어하는 항원으로 작동이 가능하며 SAT 3형 야외주를 중화가능성이 입증되어 백신으로 사용 가능하다.
본 발명의 조성물은 재조합 구제역 바이러스와 함께 구제역 감염의 예방 효과가 우수한 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 재조합 구제역 바이러스의 투여량은 개체 1두당 약 1×100 내지 1×1020 cells, 바람직하게는 약 1×101 내지 1×1015 cells로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 구제역 감염을 예방하기 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 개체에 투여하는 단계를 포함하는; 구제역의 예방 방법을 제공한다.
상기 개체는 발굽이 둘로 갈라지는 포유류를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 포유류는 소, 돼지, 염소, 양, 사슴을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스의 방어항원인 P1 단백질을 발현하는 효과가 우수하므로, 구제역 SAT 3형(SAT3/2sa57/59 [SAT3/SA/57/59])을 비롯한 구제역의 백신용으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 백신주의 방어항원 단백질을 발현하는 본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 백신주의 방어항원 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열이 삽입된 본 발명의 재조합 플라스미드(pOm-SAT3-SA)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 염소태아 혀세포(ZZ-R)에 본 발명의 구제역 바이러스를 주입한 후, 형성된 플라크를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 재조합 구제역 바이러스가 발현하는 단백질의 구제역 항원에 대한 양성 반응을 간이항원키트(Svanova Co. Ltd)로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 재조합 구제역 바이러스를 어린 햄스터 신장세포(BHK-21), 흑염소 신장세포(BGK), 돼지 신장세포(IBRS-2), 염소태아 혀세포(ZZ-R) 및 소 신장세포(LF-BK)에 처리한 후, 바이러스의 역가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1. 재조합 플라스미드(pOm-SAT3-SA의 제작]
1. 구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자 서열을 가지는 재조합 플라스미드(pO-Manisa)의 제작
구제역 O-Manisa 바이러스 전체 유전자(GenBank Accession No. AY593823.1)를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 O-Manisa 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pO-Manisa를 제작하였다.
구제척으로는, 일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 O-Manisa 바이러스에 대한 cDNA를 작성한 후, 이를 이용하여 O-Manisa 바이러스 유전자 정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. AY593823.1를 기초로 5'- 및 3'- 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였다. 이때, 상기 PCR은 5X 완충용액(FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs(1㎕), 퓨전 효소(Phusion enzyme) (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균 증류수(35.5㎕)를 포함하는 혼합물을 98℃의 온도에서 30초 처리한 후, 98℃의 온도에서 10초, 65℃의 온도에서 30초, 72℃의 온도에서 2분 30초 동안 각각 순차적으로 25회(cycle) 반복 처리한 다음, 최종 72℃의 온도에서 10분간 반응시키는 과정을 통해 수행하였으며, 그 결과로 재조합 플라스미드를 제작하였다. 상기 과정을 통해 제조한 구제역 O형 백신주 Manisa의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pO-Manisa)의 구조 및 모식도를 각각 도 1 및 2에 나타내었다.
2. 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원 단백질을 코딩하는 재조합 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드(pOm-SAT3-SA)의 제작
상기 1에서 제작한 재조합 플라스미드 pO-Manisa에서 구제역 바이러스 O형 백신주의 방어항원인 P1 단백질을 코딩하는 유전자를 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형의 방어항원인 P1 단백질(GenBank 등록 번호 AY593850)을 코딩하는 유전자로 치환하여, 서열번호 1의 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드(pOm-SAT3-SA)를 제작하였다.
구체적으로는, 서열번호 2의 정방향 프라이머(5'-GGA GCG GGT CAG TCG TCC CCT-3') 및 서열번호 3의 역방향 프라이머(5'-TTG TTT GTC AGG TGC CAC CAG TTT G-3')를 이용하여, 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형(GenBank 등록 번호 AY593850)의 P1 유전자를 합성한 후, 이를 주형으로 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 상기 PCR은 5X 완충용액(FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs(1㎕), 퓨전 효소(Phusion enzyme) (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균 증류수(35.5㎕)를 포함하는 혼합물을 98℃의 온도에서 30초 반응한 후, 98℃의 온도에서 10초, 65℃의 온도에서 30초, 72℃의 온도에서 60초 동안 각각 순차적으로 25회(cycle) 반복 처리한 다음, 최종 72℃의 온도에서 10분 동안 반응시키는 과정을 통해 수행하였다. 서열번호 4의 정방향 프라이머(5'-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCG-3') 및 서열번호 5의 역방향 프라이머(5'-CTTGAGCCTTTTCTGGACCTTTGTTTTCCA-3')를 이용하여, O-manisa 유전자에서 P1 유전자가 제거된 플라스미드를 PCR로 증폭시켰다. 이때, 상기 PCR은 5X 완충용액(FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs(1㎕), 퓨전 효소(Phusion enzyme) (2U/㎕, 0.5㎕) 및 멸균 증류수(35.5㎕)를 포함하는 혼합물을 98℃의 온도에서 30초 반응한 후, 98℃의 온도에서 10초, 65℃의 온도에서 30초, 72℃의 온도에서 2분 30초 동안 각각 순차적으로 25회 반복 처리한 다음, 최종 72℃의 온도에서 10분 동안 반응시키는 과정을 통해 수행하였다. 이후, 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응(TAKARA Long Ligation kit)을 유도하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 수행하여, 본 발명의 재조합 플라스미드(pOm-SAT3-SA)가 클로닝되었음을 확인하였다. 제작된 재조합 플라스미드의 구조 및 모식도를 각각 도 1 및 3에 나타내었다.
[실시예 2. 본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 회복 평가]
본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 세포 회복 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 1의 2에서 제작된 재조합 플라스미드(pOm-SAT3-SA)를 제한효소 Spe I으로 반응시켜 유전자를 단일 조각편으로 작성하고, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에 리포펙타민 형질전환 시약(라이프 테크놀로지)을 이용하여 정제된 DNA를 형질도입하여 2-3일 배양후 새로 형성된 재조합 바이러스를 확보하였다. 이후, ZZ-R(염소 태아 혀) 세포 및 BHK21(어린 햄스터 신장) 세포에 연속계대를 통해 접종하여 바이러스를 많은 양으로 증식시키고, BHK21 세포 및 IBRS-2(돼지 신장) 세포에 주입하여 본 발명의 재조합 구제역 바이러스에 의한 세포 변성 효과를 확인하였다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 플라스미드로부터 회복된 바이러스의 염소 태아 혀세포(ZZ-R)에서 플라크가 형성된 것을 확인하였다.
또한, 간이항원키트(Svanova Co. Ltd)에 회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕를 분주하여, 본 발명의 구제역 바이러스에서 SAT 3형에 대한 방어 단백질의 발현을 측정하였으며, 이의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스에 의해 발현되는 방어항원 단백질이 구제역 항원의 구조 단백질(SP)에 대해 양성 반응을 보이는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 진핵세포에 삽입된 후, 자체 증식하여 구제역 항원에 방어활성을 가지는 구제역 바이러스의 방어항원 단백질 부위를 합성하므로, 구제역을 예방하는 효과를 보이는 것을 표준 혈청을 이용한 교차 중화시험을 통하여 간접적으로 확인할 수 있었다.
[실시예 3. 본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 역가 측정]
본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 세포 특이성 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 구제역 바이러스의 어린 햄스터 신장세포(BHK-21), BGK, 돼지 신장세포(IBRS-2), 염소태아 혀세포(ZZ-R) 및 소 신장세포(LF-BK)에 대한 바이러스 역가를 측정하였다.
구체적으로는, 상기 햄스터 신장세포(BHK-21), BGK, 돼지 신장세포(IBRS-2), 염소태아 혀세포(ZZ-R) 및 소 신장세포(LF-BK)에 대한 바이러스 역가를 10배 계단희석을 통해 정량적 실시간 유전자 증폭법을 이용하여 바이러스 증식성을 측정하였다. 바이러스 RNA는 one step Primescript RT-PCR kit (TAKARA, Japan)를 통해서 추출되었고, 실시간 유전자 증폭법을 프라이머 5'-GGAACYGGGTTTTAYAAACCTGTRAT-3'와 5'-CCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGA-3'를 이용하여 증폭하고 탐침서열로는 5'-CCCADCGCAGGTAAAGYGATCTGTA-3'을 이용하였다. 증폭은 ABI7500 실시간 유전자 검출시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 BHK-21, BGK, IBRS-2, ZZ-R 및 LF-BK 세포에서 모두 생장하여 바이러스 역가를 형성함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 다양한 진핵세포에 대해 바이러스 활성을 가지는 것을 알 수 있다.
[실시예 4. 본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 중화 작용 및 바이러스 상호간의 역가 측정]
본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 구제역 방어 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 구제역 바이러스와 표준 항혈청 간의 중화 정도를 바이러스 중성화 검사(Virus neutralization test; VNT)를 이용하여 측정하였으며, 바이러스 상호간의 역가(reciprocal arithmetic titers)를 측정 및 분석하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
하기 균주에 대한 기준-항 혈청(생산된 종) VNT1 교차에 사용된 바이러스 및 산출된 상호 역가(reciprocal arithmetic titers)
O Manisa-FG Om-SAT2-SAU Om-SAT3-SA
O1Manisa(돼지) 724 -2 -
A22(염소) 16 - -
Asia-Shamir(염소) - - -
C-Resende(염소) 16 - 16
SAT1-BOT 1/68(염소) 64 - -
SAT2-ZIM 5/81(염소) - 1448 -
SAT3-ZIM 9/80(염소) - - 362
(1 VNT: 바이러스 중성화 검사(Virus neutralization test)
2 - : 상호간 적정농도(reciprocal titer of) <16)
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 SAT 3형 표준 항혈청을 특이적으로 중화하였음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 구제역 SAT 3형에 대해 특이적으로 예방 가능한 중화반응 효과를 보여 방어가 가능함을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 구제역 O형 Manisa 유전체의 P1 유전자가 구제역 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스의 P1 유전자로 치환된, 구제역 O형 Manisa 유전체 염기서열을 갖는 SAT 3형 SEZ 지역형 바이러스 제조용 재조합 플라스미드.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 하기 개열지도로 표시되는 pOm-SAT3-SA인 것을 특징으로 하는, 재조합 플라스미드.
    Figure 112013084016681-pat00001

  4. 삭제
  5. 제 1항의 재조합 플라스미드를 이용하여 제조한 재조합 SAT 3형 SEZ 지역형 구제역 바이러스.
  6. 삭제
  7. 제 5항의 재조합 SAT 3형 SEZ 지역형 구제역 바이러스를 유효성분으로 함유하는 SAT 3형 SEZ 지역형 구제역 예방용 백신 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신인 것을 특징으로 하는, SAT 3형 SEZ 지역형 구제역 예방용 백신 조성물.
  9. 제 5항의 재조합 SAT 3형 SEZ 지역형 구제역 바이러스를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 SAT 3형 SEZ 지역형 구제역의 예방 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 개체는 소, 돼지, 염소, 양 및 사슴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 개체인 것을 특징으로 하는, SAT 3형 SEZ 지역형 구제역의 예방 방법.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Genbank accession No. AY593823.1 (공개일 : 2005.04.28.)*
Genbank accession No. AY593850 (공개일 : 2005.04.28.)*
PLoS one, Vol.8, Issue.1, e55228 (2013)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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