NO20130955A1 - Metode for detektering av varianter av infeksiøs pankreas nekrosevirus i akvatiske dyr, assosiert deteksjonskit og anvendelse av metoden for akvatiske dyr - Google Patents
Metode for detektering av varianter av infeksiøs pankreas nekrosevirus i akvatiske dyr, assosiert deteksjonskit og anvendelse av metoden for akvatiske dyr Download PDFInfo
- Publication number
- NO20130955A1 NO20130955A1 NO20130955A NO20130955A NO20130955A1 NO 20130955 A1 NO20130955 A1 NO 20130955A1 NO 20130955 A NO20130955 A NO 20130955A NO 20130955 A NO20130955 A NO 20130955A NO 20130955 A1 NO20130955 A1 NO 20130955A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- virus
- cells
- ipnv
- pancreatic necrosis
- fragment
- Prior art date
Links
- 241000710921 Infectious pancreatic necrosis virus Species 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 claims description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 20
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 claims description 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 claims description 2
- 241001280377 Oncorhynchus tshawytscha Species 0.000 claims description 2
- 241000277263 Salmo Species 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims 9
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims 2
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 102100033127 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Human genes 0.000 claims 1
- 101710164337 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Proteins 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 13
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000009663 Acute Necrotizing Pancreatitis Diseases 0.000 description 3
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010058096 Pancreatic necrosis Diseases 0.000 description 3
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241001533425 Aquabirnavirus Species 0.000 description 2
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000546112 Infectious salmon anemia virus Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000277288 Salmo trutta Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 241001545522 Aguacate virus Species 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101000653197 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Movement protein TGB3 Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000621107 Enterobacteria phage N4 Probable portal protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 101800003658 Protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 1
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000003126 immunogold labeling Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- WTGQALLALWYDJH-AKTDCHNFSA-N scopolamine hydrobromide Chemical compound Br.C1([C@@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@@H](C2)[C@H]2[C@@H]3O2)C)=CC=CC=C1 WTGQALLALWYDJH-AKTDCHNFSA-N 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229940055835 triptone Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en rimelig, rask, spesifikk, sensitiv og egnet for rutinebruk ved overvåkning av aktiviteter, fremgangsmåte for bestemmelse av varianter av infeksiøs pankreasnekrose-virus (IPNV) i prøver med ulik opprinnelse; og assosiert sett.
Description
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å bestemme varianter av infeksiøs pankreasnekrose-virus (IPNV) for bekjempelse av virusinfeksjoner i akvatiske dyr, spesielt med tanke på fisk, og nærmere bestemt en fremgangsmåte for å bestemme IPNV-variantene i en blanding, for eksempel en vaksine, en cellekultur eller en feltprøve. Oppfinnelsen omfatter settet og en operativ fremgangsmåte for detektering av IPNV, som er viktig i utviklingen innenfor internasjonal havbruksnæring. Oppfinnelsen har stor sensitivitet og spesifisitet, er enkel og rask å anvende og har stor effektivitet.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Økende betydning av akvakultur i den globale matforsyningen Med den stadige befolkningsøkningen over hele verden har den globale matforsyningen fra akvakultursektoren hatt en økning. Dette representerer en utfordring for sektoren, og det er derfor nødvendig å se på behovet for forbedring av havbruksnæringens produktivitet over hele verden. En av de viktige faktorene for å oppnå bærekraftig utvikling i denne sektoren er sykdomshåndtering. Sykdommer hos fisk skyldes ulike faktorer, og sykdommer som skyldes virus, er de sykdommene som er særlig viktig for havbruksnæringen over hele verden.
Viktigheten av sykdomshåndtering ved sykdommer som skyldes virus i akvakultur Infeksjonssykdommer truer stadig bærekraften innen havbruksnæringen, siden sykdommer med virusopprinnelse er vanskeligst å håndtere. For eksempel fører sykdommer som skyldes pankreassykdomsviruset (PDV), infeksiøs lakseanemi-viruset (ISAV) og infeksiøs pankreasnekrose-viruset (IPDV) til store tap for havbruksnæringen i Chile samt i resten av verden.
Betydningen av infeksiøs pankreasnekrose-virus i akvakultur
Det ble først rapportert om infeksiøs pankreasnekrose i et oppdrettsanlegg for bekkerøye i 1941 (McGonigle, Trans. Am. Fish. Soc. 70: 297, 1941), og i 1960 ble det bekreftet at det skyldtes et virus (Wolf et al, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 104: 105-110, 1960).
Infeksiøs pankreasnekrose-virus (IPNV) forårsaker infeksiøs pankreasnekrose (IPN), en svært smittsom og ødeleggende sykdom, som fremkaller nekrose og betennelse i bukspyttkjertelen, og som påvirker en variert gruppe verter over hele verden, slik som regnbueørret, bekkerøye, atlanterhavslaks, karper, bløtdyr og krepsdyr (Pilcher and Fryer, Crit. Rev. Microbiol. 7: 287-364, 1980; Wolf, Fish vimses andfish viral diseases, 1988; Hill and Way, Annu. Rev. Fish Dis. 5, 55- 77, 1995). Kliniske tegn på syk fisk inkluderer utspilt buk, unormal svømming, mørkere pigmentering i skinnet og lokale neokritiske skader i eksokrint pankreasvev, og ved undersøkelse av innsiden av en berørt fisk, er hvitt mukus observert i patognomisk mage av sykdommen (McKnight and Roberts, Br. Vet. J. 132:76-86,1976). Ungfisk, fra to til fire måneder gammel, ser ut til å være mer ømfintlig overfor en IPNV-infeksjon, noe som resulterer i høy dødelighet (Wolf et al, U. S. Dept. Int. Bur. Sport Fish and Wildlife; Fish Disease Leaflet 1:14, 1966; Frantsi and Savan,J. Wildlife Dis. 7:249-255, 1971). Når det gjelder ørret, angriper IPNV yngre fisk rundt fem til seks uker etter startforing.
IPNV kan forårsake store utbrudd i produksjonssystemer, der smittsomme stammer av IPNV kan forårsake en dødelighet på mer enn 90 % for fisk som er yngre enn fire måneder, og kan forårsake en alvorlig forsinkelse i veksten til fisk som overlever infeksjonen, som forblir asymptomatiske bærere/verter for resten av livet, og som på den måten fungerer som smittereservoarer og sprer IPNV i mediet (Mangunwiryo and Aguis, J. Fish Dis. 11,125- 132, 1988; Reno et al, J. Fish. Res. Board Can. 35, 145-1456,1978; McAllister et al, Dis. Aquat. Org. 2: 235-237,1987; McKnight and Roberts, Br. Ven. J. 132: 76-86,1976 ; Billi and Wolf, J. Fish. Res. Bd. Can. 26:1459-1465, 1969; Yamamoto, Can. J. Micro. 21:1343-1347, 1975; Hedrick, Ph.D. Doktoravhandling, " Persistent Infections of Salmonid Cell Lines With Infectious Pancreatic Necrosis Virus: A Model for the Carrier State in Trout," Oregon steg University, 1980).
Syk fisk samt asymptomatisk IPNV-bærerfisk representerer derfor et alvorlig problem i havbruksnæringen, siden den eneste nåværende tilgjengelige bekjempelsesmetoden for viruseliminering i bærer-/vertsfisk, er eliminering av disse fiskene. Følgelig er IPNV-virus en sykdomsagens av stor økonomisk betydning for havbruksnæringen i Chile og i resten av verden.
Klassifisering av IPNV
IPNV tilhører Aquabirnavims-genuset fra Birnaviridae-familien (Dobos, Ann. Rev. Fish Dis. 5: 24-54, 1995; Van Regenmortel et al, Virus Taxonomy, Vllth Report of the /C7T:481-486, 2000).
Klassifisering av IPNV-serogrupper og -genogrupper
Aquabirnavirus, slik som IPNV, kan klassifiseres i to serogrupper, kalt A og B, basert på resultatene av kryss-nøytralisering med antistoffer (Hill and Way, Annu. Rev. Fish Dis. 5, 55- 77, 1995). Serogruppe A har 9 serotyper, inkludert flertallet av IPNV-isolater assosiert med sykdom i salmonider og serogruppe B med bare én serotype (Hill and Way, Annu. Rev. Fish Dis. 5, 55- 77, 1995).
Bortsett fra tradisjonell serologisk klassifisering, finnes det en nyere klassifisering av Aquabirnavirus på et genetisk nivå, basert på den fylogenetiske analysen av hovedkapsidproteinet fra viruset (VP2) (Blake et al, Dis. Aquat. Org. 45, 89-102,2001; Cutrin et al, Applied and Environmental Microbiology 70,1059-1067,2004; Zhang and Suzuki, Journal of Fish Diseases 27, 633-643, 2004; Nishizawa et al, Journal of General Virology 86, 1973-1978, 2005; Bain et al, Journal of Fish Diseases, 31, 37-47, 2008).
IPNV-virion
IPNV-virionet er cirka 60 nm i diameter, har ingen kappe og har et enkelt ikosaedrisk kapsid (Dobos, Nucl Acids Res. 3:1903-1919,1976; Dobos, J Virol. 21:242-258, 1977; Fauquet et al, Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Vimses: Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Vimses, 561-569, 2005). De strukturelle hovedproteinene i virionet er klassifisert som VP1 (4 % av den totale mengden virion), VP2 (62 %), VP3 (28 %) og VP3a (6 %) (Dobos, Annu. Rev. Fish Dis. 5:24-54,1995).
IPNV-genom
IPNV er prototypeviruset for Birnaviridae- familien, som er en dobbelt-trådet, bisegmentert RNA-genomfamilie (Dobos, Nucl. Acids Res. 3:1903-1919, 1976; Dobos, J. Virol. 21:242-258, 1977; Van Regenmortel et al, Vims Taxonomy, Vllth Report of the ICTVASl- 486,2000). Det minste genomiske segmentet, kalt segment B av 2784 bp, er monocistronisk og koder for et 94 kDa-protein kalt VP1, som er den putative RNA-avhengige RNA-polymerasen (figur IB) (Duncan et al, Virology 181, 541- 552,1991; Duncan et al, J. Virol. 61, 3655- 3664, 1987; Dobos, Virology 208: 19-25,1995). Det lange genomiske segmentet, kalt segment A av 3097 bp, er bicistronisk. En stor åpen leseramme finnes i dette segmentet, og det koder for et 107 kDa-polyprotein (NH2-preVP2-VP4-VP3-COOH) som er kuttet på en kotranslasjonell måte for proteaseaktiviteten til protein VP4 (27.5 kDa), som frembringer kapsideproteinene VP2 (54 kDa) og VP3 (31 kDa) (figur IA) (Chang et al, Can. J. Microbiol. 24:19-27,1978; Huang et al, J. Virol. 60:1002-1011, 1986; Dobos,./. Virol. 21: 242-258, 1977; Duncan et al, J. Virol. 61: 3655-3664, 1987). Polyproteinet presenterer kutteseter for proteasen mellom aminosyre 508 og 509 i sammenføyningen mellom VP2 og VP4 og mellom aminosyre 734 og 735 i sammenføyningen mellom VP4 og VP3 (Dobos, J. Virol. 21:242-258,1977; Duncan et al, J. Virol. 61,3655- 3664,1987; Petit et al, J. Virol. 74:2057-2066,2000). Den andre åpne leserammen i segment A går forut for og overlapper delvis den i det første polyproteinet og koder for et ikke-strukturelt, arginin-rikt 15 kDa-protein kalt VP5 (figur IA). Selv om dette proteinet ikke er til stede i virionet, er det oppdaget i infiserte celler (Heppell et al, J. Gen. Virol. 76, 2091- 2096, 1995; Magyar and Dobos, Virology 204: 580-589, 1994).
Virulensdeterminanter for IPNV og VP2-kapsidprotein
IPNV-genom har stor variasjon når det sammenlignes med andre virus (Heppell et al, Virology 214, 40—49, 1995) og har ulike grader av virulens i isolater fra den samme serotypen (Bruslind and Reno, J. Aquat. Anim. Health 12, 301-315, 2000; Shivappa et al, Dis. Aquat Org. 61:23-32, 2003).
Genet som koder for VP2, hovedproteinbestanddelen av eksternt viralt kapsid, har to hypervariable korte segmenter i midten av kodeområdet. Endringer i nukleotider i disse variable genetiske områdene korrelerer med forskjeller i virulensen til IPNV observert i kontrollerte forhold og i virulente og avirulente isolater som finnes i villfisk. På et proteinnivå har VP2 flertallet av epitoper av nøytraliserende antistoffer. (Frost et al, J. Gen. Virol. 76, 1165- 1172, 1995; Tarrab et al, J. Gen. Virol. 76, 551-558,1995; Heppell et al, Virology 214,40-49, 1995). I denne korresponderer mer variable rester med posisjonene 217,221,247 og 500 (Blake et al, Dis. Aquat. Org. 45, 89-102,2001), der posisjonene 217 og 221 er ansvarlig for forskjeller i virulens i stammer av IPNV av samme serotype, spesielt resten i posisjon 221. Høyvirulente isolater har treoninrester i posisjon 217 og alanin i posisjon 221, og avirulente isolater har i stedet treonin i posisjon 221 (Bruslind and Reno, J. Aquat. Anim. Health 12, 301-315, 2000; Santi et al, Virology 322:31^0, 2003; Shivappa et al, Dis. Aquat Org. 61:23-32, 2003; Santi et al, Virology 322:31^10,2004; Song et al, J. Virology, Aug: 10289-10299,2005). Endring av aminosyre i posisjon 221 fra treonin til alanin er korrelert i forhold til endringen i den virulente fenotypen til svekket i feltisolater holdt i kultur i CHSE-214-celler, og den samme svekkelsen og endringen i aminosyre forekommer i bærerfisk (Munro et al, J. Fish Dis., 29, 43^18, 2006).
Nåværende diagnostiske metoder for IPNV-infeksjon
Siden IPNV kan være opphav til store utbrudd i ørret- og lakseoppdrettsanlegg, noe som fører til høy morbiditet og dødelighet i kulturer og som en konsekvens, store økonomiske tap for akvakultursektoren, er det nødvendig med en hurtig storskalaovervåkning for å redusere sannsynligheten for utbrudd. På bakgrunn av dette er det blitt utviklet ulike metoder for detektering av IPNV-virus (Winton, Ann Rev Fish Dis:S3- 93, 1991). Disse fremgangsmåtene inkluderer isolering av virus fra utvalgt fisk i etablerte CHSE-214-cellelinjer og bekrefter virusets identitet. Dette gjøres ved serumnøytralisering, ELISA-assayer, in situ hybridiseirngsassayer ved hjelp av biotinylerte primere, immunogullmerkingsassayer og immunohistokjemi og konvensjonelle eller sanntids RT-PCR-assayer. Av disse metodene er sanntids RT-PCR den raskeste og mest sensitive metoden for detektering.
IPNV-variantanalyse
Alle metodene som beskrives ovenfor, er nyttige ved diagnostisering av IPNV, men ingen av dem er i stand til å fastslå egenskapene til en IPNV-variant funnet i en prøve. Nå for tiden gjøres IPNV-variantanalysen gjennom cDNA- eller RT-PCR-produktsekvensering, som oppnås fra det ekstraherte RNA fra ulike prøvekilder, der formålet er å oppnå nukleotidsekvensen og dedusere VP2-aminosyresekvensen. Variantanalyse gjennom sekvensering av VP2-gensoner har operative ulemper ved anvendelse som en rutineanalyse for vaksine- eller diagnostikk-kontroll. Metoden er svært kostbar og forutsetter et langt tidsperspektiv for å oppnå resultater. Videre kan sekvensering frembringe tvetydige resultater avhengig av størrelsen på prøven. Fremgangsmåten som foreslås heri, er den første som tillater diagnostisering og variantanalyse i det samme settet. En RT-PCR og videre restriksjonsanalyse er en analyse som er rimelig, rask, spesifikk og har god sensitivitet, som kan benyttes i rutineform for kontroll av immunologiske produkter eller diagnostisering av IPNV, og hovedsaklig ved bestemmelse av hvilke IPNV-varianter som finnes. Tillater overvåkning i vaksineutviklingsanlegg og har stor nytteverdi ved validering av stammen som anvendes for viral spredning i cellekulturer, og som på grunn av de lave kostnadene knyttet til implementering, tillater rutineanvendelse i havbruksnæringen.
GENERELL BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en rimelig, rask, spesifikk, sensitiv og rutinemessig anvendelse av overvåkningsfremgangsmåte for bestemmelse av IPNV-varianter i prøver av ulik opprinnelse. Fremgangsmåten tar for seg infeksjonen av CHSE-214 konfluente celler med IPN-virusisolater og ytterligere kultur derav. Deretter ekstraheres RNA fra infiserte celler og anvendes i en omvendt transkripsjonsreaksjon for syntese av cDNA som vil anvendes som templat under amplifikasjon av et fragment av VP2-protein. Fragmentet er renset og klonet i en vektor som er ytterligere anvendt i transformering av kjemokompetente celler. Koloniene med interessante innskudd, som er positive for et VP2-fragment under amplifikasjon ved hjelp av PCR, er dyrket i flytende medium og utsatt for rensing av plasmid-DNA. Til slutt utsettes DNA-fragmentet amplifisert fra VP2 for en restriksjonsanalyse for evalering av en sekvenskoding for aminosyrer i posisjon 217 og 221 for protein VP2.
Følgelig tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bestemme virusvarianter av infeksiøs pankreasnekrose i vaksiner, cellekulturer og/eller isolatfeltprøver, omfattende de nødvendige bestanddelene for å utføre fremgangsmåten.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Den foreliggende oppfinnelsen beskriver en fremgangsmåte for å bestemme varianter av infeksiøs pankreasnekrose-virus i prøver av ulik opprinnelse, slik som vaksiner, cellekulturer og feltprøver. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: A. VIRUSSPREDNING. Chinook salmon embryo 214-celler (CHSE-214) klargjøres til de når 100 % konfluens. Disse cellene dyrkes ved 18 °C i plastflasker med 25 cm<2>overflate i MEM (Gibco) medium, supplementert med 0,08 % natriumbikarbonat, 0,238 % HEPES, 1 % fungizone (amfotericin B) (HyClone) og 10 % føtalt bovinserum (HyClone). Celler dyrkes i plastflasker med 25 cm2 overflate.
Konfluente celler infiseres med dyrkingsampuller av IPN-virus fra virulente og avirulente stammer. 1 ampulle for hver 25cm2 av kultur med CHSE-214. Kulturen holdes ved 18 °C til den når 100 % cytopatsk effekt, som oppnås på 5-6 dager.
B. RNA-ekstrahering. 600 ul supernatant fra cellekulturen tas opp og 600 ul TRIzol (Invitrogen) eller TRI Reagent (Ambion) tilsettes. Rysting i 10 sekunder. Deretter tilsettes 200 ul kloroform og rysting i 20 sekunder. Inkubering ved romtemperatur i 10 minutter. Sentrifugering ved 12,000g i 15 minutter ved 4 °C og supernatanten er gjenopprettet. 800 ul isopropanol tilsettes og settes til å presipitere i 15 minutter ved romtemperatur. Sentrifugering ved 16,000g i 15 minutter ved 4aC. Supernatanten er forkastet og presipitatet vaskes med 600 ul 70 % etanol, klargjort med nukleasefritt vann. Precipitatet settes til å tørke i maksimalt 20 minutter og resuspenderes i 50 ul nukleasefritt vann. C. RT-PCR. En omvendt transkripsjon utføres ved hjelp av Improm-II-settet (Promega) i henhold til følgende protokoll: en blanding i 0,2 ml rør av 2 ul viral RNA, 2 ul nukleasefritt vann og 1 ul Random Primers (Promega) 4 u.g/ul. Inkubering ved 70 °C i 5 minutter og avkjøling ved 4 °C i 5 minutter. Reaksjonen stanses og 4 ul RT buffer 5x, 2,4 ul MgCl225 mM, 1 ul dNTPs 10 uM (Promega), 1 ul RT, lul RNAse-inhibitor (RNasin®, Promega), 6,1 ul nukleasefritt vann tilsettes. Deretter følges programmet: 5 minutter ved 25 °C, 1 time ved 45°C, 15 minutter ved 70 °C.
Etterpå utføres PCR-programmet for amplifisering av et VP2-fragment. Til et 0,2 ml rør 4 ul viraltemplat cDNA, 25 ul GoTaq Green Master Mix (Promega), 3 ul oligo VirVp2-R (Sekvens: 5'-TTGTCATTTGTGGCCAGCACGGAGCTGA-3'), 2,3 ul oligo VirVp2-F (Sekvens: 5 '-GTCCTGAATCTACCAACAGGGTTCGAC-3') 16 ul nukleasefritt vann tilsettes. Følgende PCR-program anvendes: initiell denaturering: 3 minutter ved 94 °C, 35 sykluser av: 30 sekunder ved 94 °C, 30 sekunder ved 56 °C, 30 sekunder ved 72 °C og en endelig forlengelse i 5 minutter ved 72 °C.
rensing og kloning. Det amplifiserte produktet kontrolleres ved hjelp av visualisering av amplifikatet i en agarosegel. Etterpå klargjøres en DNA-rensing fra geleen ved å legge hele volumet i en 1 % agarosegel. Geleen kjøres i 35 minutter ved 90 volt. En rensing utføres fra geleen ved hjelp av SV Gel Clean-Up System kit (Promega) eluerende i et endelig volum på 30 ul.
Det amplifiserte fragmentet er innskutt i pGem-T Easy-vektor (Promega) i henhold til produsentens foreslåtte protokoll. Kjemokompetente E. coli JM110-celler klargjøres ved hjelp av kalsiumkloirdmetoden. Cellene transformeres med pGem-T Easy-vektoren inneholdende det klonede fragmentet fra VP2 fra enten den virulente eller avirulente stammen. Cellene sås på LB-agarplater og inkuberes ved 37 °C i 15-18 timer eller til kolonier oppnås.
KONTROLL AV KOLONIER. Et utvalg av transformerte E. coli-kolonier dannes og inokuleres i 5 ml LB medium (1 % Triptone, 0,5 % NaCl, 0,5 % gjærekstrakt, 100 ug/ml ampicillin) inkubering i 20 cirka timer, en PCR utføres for å kontrollere innskuddet anvendt i protokollen og programmet tidligere beskrevet, og som templat anvendes 2 ul av kulturbuljong.
Koloniene med innskuddet, utsettes for plasmid-DNA-ekstrahering ved hjelp av Miniprep-settet (Axygen) og sendes videre til sekvensering.
Hvert av plasmidene sendt til sekvensering utsettes for PCR for amplifisering av det innskutte fragmentet ved hjelp av programmet beskrevet tidligere, og deretter utsettes PCR-produktet for nedbryting (eng.: digestion) med restriksjonsenzymer.
D.-restriksjonsassay.
To restriksjonsassayer utføres, for å kontrollere de to korresponderende setene til aminosyre 217 og 221 av VP2. En direkte nedbryting ved hjelp av 10 ul av PCR-produktet og enzymene Mae III (Roche) for aminosyre 217 og Banll (New England Biolabs) eller dets isoschizomer Eco24 (Fermentas) for aminosyre 221. Nedbrytingen utføres i henhold til protokollene beskrevet av produsenten for hvert enzym og resultatet kontrolleres i en 5 % agarosegel med høy oppløsning ved 70 volt i 1 time.
BESKRIVELSE AV FIGURENE
FIGUR 1 Skjematisk fremstilling av RNA-genom av IPNV, segment A og V og dets proteiner. FIGUR 2 Flytdiagram som viser fremgangsmåtens trinn ifølge oppfinnelsen for å bestemme IPNV-varianter. FIGUR 3 Restriksjonsanalyse av to vaksiner. Nedbryting av et PCR-produkt amplifisert fra cDNA fra vaksinene SRS-IPN SI-22260901 og kvadruppel CU-22290901.1 ett tilfelle er en større mengde IPNV SpThr (spor 2, blandingsvaksine) observert og i det andre en større åpenbar mengde IPNV SpAla (spor 3, kvadruppelvaksine). Det første sporet viser molekylvektmarkøren i basepar (bp). FIGUR 4 Restriksjonsanalyse fra supernatant av en cellekultur infisert med virulent IPN fra ADL Laboratories, passert i CHSE-214 5 ganger (5. passering). Nedbryting genererer kun ett fragment av 365 basepar, som indikerer at IPN-viruset i cellekulturen er svekket. Prøvene ble amplifisert med tilfeldige og spesifikke primere. Det første sporet viser molekylvektmarkøren i basepar (bp). FIGUR 5 Restriksjonsanalyse fra alikvot fra ampulle IPN PM-24619 IPNv Sp-virulent fra ADL Laboratories. Nedbryting genererte to fragmenter (i bildet vises bare det ene siden begge er av lignende størrelse) av cirka 200 basepar, som indikerer at IPN-viruset som er til stede i ampullen, er virulent. cDNA-prøvene anvendt som templat for VirVP2-fragmentsyntesen ble amplifisert med tilfeldige og spesifikke primere. Det første og siste sporet viser molekylvektmarkøren i basepar (bp). FIGUR 6 Analyse av IPN-varianter i fiskeisolater. CM og VQ korresponderer med fisk isolert fra ulike oppdrettsanlegg. SP:Fiskekultur; +R: Kontroll av restriksjonsenzymnedbryting; Ca+ kontroll av alaninnedbryting; Ct+: kontroll av treoninnedbryting. Nedbryting viser nærværet av begge IPN-varianter, virulente og svekkede, siden to størrelser av bånd er til stede, ett av 365 basepar og det andre av cirka 200 basepar. Det første og siste sporet viser molekylvektstandarden (std) i basepar (bp).
ANVENDELSESEKSEMPLER
EKSEMPEL 1
RFLP for validering av svekkede og virulente IPNv- stammer i vaksinepreparat. Restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme ( RFLP) ble anvendt til evaluering av nærvær av svekkede og virulente stammer i et preparat med kommersiell vaksine. Direkte RNA-ekstrahering ble utført fra det immunologiske produktet korresponderende med to inaktiverte injiserbare vaksiner (virina) mot IPNV i monovalente formuleringer (SRS-IPN SI-22260901), i tillegg til polyvalente (kvadruppel CU-22290901s) kommersielt tilgjengelige hos Centrovet Ltd. Etterpå ble en DNA-fragmentsekvenskoding for VP2-protein amplifisert, som presenterer molekylære determinanter av virulens, gjennom en RT-PCR-reaksjon. Følgelig ble cDNA-fragmentet amplifisert for en nøkkelregion i VP2 som ble utsatt for restriksjonsenzymnedbryting som tidligere indikert (1 enzymenhet per 1 ug DNA i 60 minutter ved 37 °C), nedbrytingsproduktet ble ytterligere analysert i en 3 % agarosegel ved hjelp av BrEt. Migreringsmønsteret var karakteristisk avhengig av virusstammen, enten virulent (alanin) eller avirulent (treonin), som observert i figur 3.
EKSEMPLER 2,3 og 4.
I likhet med betingelsene i eksempel 1 ble fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendt på prøver fra en cellekultur, en ampulle og en vevsprøve fra fisk. Detaljer om disse prøvene av ulik opprinnelse er oppsummert i tabell 1. Fremgangsmåten har vist seg å være sensitiv og effektiv for detektering av IPNV-varianter fra prøver av ulik opprinnelse. Som observert fra restriksjons-/nedbrytingsanalysen i figur 3 til 6.
Claims (15)
1.
Fremgangsmåte for detektering av infeksiøs pankreasnekrosevirus (IPNV), omfattende følgende trinn: infisering av vertsceller med virusisolater, inkubering av vertscellene i en dyrkingsmedium, ekstrahering av viralt genetisk materiale fra vertsceller, amplifisering av et cDNA-fragment, rensing av det amplifiserte cDNA-fragmentet, kloning av cDNA-fragmentet i en vektor, transformering av kompetente celler med vektoren omfattende det ønskede innskuddet, screening av transformerte kolonier med vektoren for positiv PCR-amplifikasjon av ønsket innskudd, flytende kultur av utvalgte kolonier positive for PCR-reaksjon av ønsket innskudd, ekstrahering av plasmid-DNA fra kolonier positive for PCR-reaksjonskultur, amplifisering av ønsket DNA-fragment gjennom PCR, nedbryting av amplifisert DNA med restriksjonsenzymer, og utsetting av produktene for elektroforese i nedbrytingen.
2.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori vertscellene er avledet fra cellekulturene som kan tåle replikering av IPNV-virus, inkludert Chinook Salmon Embryo-celler (CHSE-214), Salmon Head Kidney-celler (SHK-1-celler), Atlantic Salmon Kidney-celler (ASK-1-celler) eller celler fra Epiteliom Papulosum Cyprini (EPC).
3.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori virusisolatene er hentet fra vaksiner, feltisolater og/eller cellekulturer.
4.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori amplifiseringen av et virusfragment er utført ved hjelp av VirVP2-F- og VirVP2-R-primere.
5.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori VirVP2-R-primeren har følgende sekvens: - 5 '-TTGTCATTTGTGGCCAGCACGGAGCTGA-3'
6.
Fremgangsmåten ifølge krav 4, hvori VirVP2-F-primeren har følgende sekvens: - 5 '-GTCCTGAATCTACCAACAGGGTTCGAC-3'
7.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori det amplifiserte cDNA- eller DNA-fragmentet er avledet fra uliker stammer av infeksiøs pankreasnekrose-viruset.
8.
Fremgangsmåten ifølge krav 7, hvori virulente og avirulente stammer er inkludert.
9.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori det i nedbrytingen av det amplifiserte DNA-fragmentet er anvendt et spesifikt restriksjonsenzym som kutter nukleotidsekvensen som korresponderer med posisjon 217 av protein VP2.
10.
Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori det i nedbrytingen av det amplifiserte DNA-fragmentet et spesifikt restriksjonsenzym som kutter nukleotidsekvensen som korresponderer med posisjon 221 av protein VP2.
11.
Fremgangsmåten ifølge krav 9, hvori restriksjonsenzymet Maelll eller isoschizomere derav er anvendt.
12.
Fremgangsmåten ifølge krav 10, hvori restriksjonsenzymet Banll, Eco24 eller isoschizomere derav er anvendt.
13.
Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 for diagnostisering av nærværet av infeksiøs pankreasnekrose-virus og bestemmelse av varianter derav i akvatiske dyr.
14.
Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 13, hvori fisk, bløtdyr og krepsdyr anses som akvatiske dyr.
15.
Sett for detektering av infeksiøs pankreasnekrose-virus, omfattende elementer nødvendig for utførelse av fremgangsmåten ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 12.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CL2010001400A CL2010001400A1 (es) | 2010-12-10 | 2010-12-10 | Procedimiento para detectar el virus de la necrosis pancreatica infecciosa (ipnv) que comprende la amplificacion de fragmento codificante de vp2 mediante rt-pcr y digestion con enzimas de restriccion con el fin de detectar cepas atenuadas y virulentas de ipnv. |
| PCT/IB2011/055593 WO2012077089A2 (es) | 2010-12-10 | 2011-12-09 | Procedimiento de determinación de variantes del virus de la necrosis pancreática infecciosa en animales acuáticos; kit de detección asociado; y uso del procedimiento en animales acuáticos |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20130955A1 true NO20130955A1 (no) | 2013-08-27 |
Family
ID=46207552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20130955A NO20130955A1 (no) | 2010-12-10 | 2013-07-10 | Metode for detektering av varianter av infeksiøs pankreas nekrosevirus i akvatiske dyr, assosiert deteksjonskit og anvendelse av metoden for akvatiske dyr |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20130266933A1 (no) |
| CA (1) | CA2823673A1 (no) |
| CL (1) | CL2010001400A1 (no) |
| GB (1) | GB2500157A (no) |
| NO (1) | NO20130955A1 (no) |
| WO (1) | WO2012077089A2 (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732726C1 (ru) * | 2019-09-03 | 2020-09-22 | Александр Юрьевич Михайлов | Способ диагностики острого инфицированного панкреонекроза |
| CN112322789B (zh) * | 2020-11-25 | 2023-04-18 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种检测大口黑鲈双rna病毒巢式pcr试剂盒及方法 |
| CN113583968A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-02 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法 |
| CN118196705B (zh) * | 2024-03-15 | 2024-10-29 | 浙江大学 | 鱼类疫苗注射效果动态评估方法，系统与存储介质 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5165925A (en) * | 1989-05-02 | 1992-11-24 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Vaccine for immunizing fish against infectious pancreatic necrosis virus |
-
2010
- 2010-12-10 CL CL2010001400A patent/CL2010001400A1/es unknown
-
2011
- 2011-12-09 US US13/992,887 patent/US20130266933A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-09 CA CA2823673A patent/CA2823673A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-09 WO PCT/IB2011/055593 patent/WO2012077089A2/es active Application Filing
- 2011-12-09 GB GB1311968.0A patent/GB2500157A/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-07-10 NO NO20130955A patent/NO20130955A1/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2823673A1 (en) | 2012-06-14 |
| WO2012077089A3 (es) | 2012-08-02 |
| US20130266933A1 (en) | 2013-10-10 |
| CL2010001400A1 (es) | 2011-09-16 |
| GB201311968D0 (en) | 2013-08-21 |
| WO2012077089A2 (es) | 2012-06-14 |
| GB2500157A (en) | 2013-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Batten et al. | A European field strain of bluetongue virus derived from two parental vaccine strains by genome segment reassortment | |
| Niu et al. | Novel goose astrovirus associated gout in Gosling, China | |
| Maan et al. | Full genome characterisation of bluetongue virus serotype 6 from the Netherlands 2008 and comparison to other field and vaccine strains | |
| Mahmood et al. | Isolation and molecular characterization of Sul/01/09 avian infectious bronchitis virus, indicates the emergence of a new genotype in the Middle East | |
| Cook et al. | The long view: 40 years of infectious bronchitis research | |
| Pepin et al. | Rift Valley fever virus (Bunyaviridae: Phlebovirus): an update on pathogenesis, molecular epidemiology, vectors, diagnostics and prevention | |
| Cook et al. | Detection and differentiation of avian pneumoviruses (metapneumoviruses) | |
| RU2519210C2 (ru) | Вакцины, содержащие генетические варианты парвовируса собак | |
| Maclachlan et al. | Epizootic haemorrhagic disease | |
| Monaco et al. | Differentiation between field and vaccine strain of bluetongue virus serotype 16 | |
| Viarouge et al. | Identification of bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus serotypes in French Guiana in 2011 and 2012 | |
| Brnić et al. | Porcine astrovirus viremia and high genetic variability in pigs on large holdings in Croatia | |
| Deperasińska et al. | Salmonid alphavirus (SAV) | |
| DK179920B1 (en) | Nucleic acid sequences of a fish virus and its use | |
| Van Rijn et al. | Bluetongue virus with mutated genome segment 10 to differentiate infected from vaccinated animals: a genetic DIVA approach | |
| Falcone et al. | Experimental infection of calves with bovine viral diarrhoea virus type-2 (BVDV-2) isolated from a contaminated vaccine | |
| Gao et al. | Identification of structure proteins of cyprinid herpesvirus 2 | |
| Arias et al. | Genetic heterogeneity of bovine viral diarrhoea viruses from Spain | |
| NO20130955A1 (no) | Metode for detektering av varianter av infeksiøs pankreas nekrosevirus i akvatiske dyr, assosiert deteksjonskit og anvendelse av metoden for akvatiske dyr | |
| Shi et al. | Rapid and sensitive detection of salmonid alphavirus using TaqMan real-time PCR | |
| Bigarré et al. | Ranaviruses associated with high mortalities in catfish in France | |
| Hewson et al. | The presence of viral subpopulations in an infectious bronchitis virus vaccine with differing pathogenicity–a preliminary study | |
| Mor et al. | Phylogenetic analysis, genomic diversity and classification of M class gene segments of turkey reoviruses | |
| Van Rijn et al. | Diagnostic DIVA tests accompanying the Disabled Infectious Single Animal (DISA) vaccine platform for African horse sickness | |
| Mittal et al. | Detection of infectious bursal disease virus in field outbreaks in broiler chickens by reverse transcription-polymerase chain reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application |