KR100850164B1 - 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산 - Google Patents

바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환하는 능력을 갖는 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 코드화하는 유전자로 형질전환시킨 재조합 미생물로부터 분리 정제한 효소를, 조 나프탈렌 디카르복실산과 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내에 함유된 불순물인 2-포밀-6-나프토산을 제거한 다음, 여기에 일정 조건에서 산성용액을 투입한 후 교반하면서 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화하고, 이를 세척하여 기타의 다른 불순물들을 제거한 후, 상기 세척물을 건조함으로써 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 것을 특징으로 하는 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고순도의 결정형 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 환경친화적으로 대량생산할 수 있는 이점이 있다.
효소, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 재조합 미생물, 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid), 2-포밀-6-나프토산(2-formyl-6-naphthoic acid), 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-naphthalene dicarboxylic acid), 결정화

Description

바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산{Purification method of crude naphthalene dicarboxylic acid using enzyme from Bacillus subtilis and 2,6-naphthalene dicarboxylic acid in crystalline form obtained by using the same}
도 1은 본 발명의 바실러스 섭틸리스 HSB-21 유래의 크산틴 디히드로게나제를 코드화하는 유전자 pucABCDE를 포함하는 재조합 발현벡터 pFOREXT-pucABCDE의 유전자 지도이고,
도 2는 본 발명의 바실러스 섭틸리스 HSB-21 유래의 알데히드 디히드로게나제를 코드화하는 유전자 aldX를 포함하는 재조합 발현벡터 ForexT-aldX의 유전자 지도이고,
도 3은 본 발명의 바실러스 섭틸리스 HSB-21 유래의 알데히드 디히드로게나제를 코드화하는 유전자 aldY를 포함하는 재조합 발현벡터 pHCEⅡB-aldY의 유전자 지도이고,
도 4는 본 발명의 실시예 1의 제 3단계에서 얻어진 결정화된 cNDA의 현미경 사진이고,
도 5는 본 발명에 따른 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법을 실시하기 위 한 정제 장치 시스템의 한 양상을 도시한 것이다.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*
A : 효소 정제 반응기 B : 불활성 효소 제거 장치
C : 결정화 반응기 D : 예비가열기
E : 용매가열공급장치 F : 여과 및 세정장치
G : 고압여과액회수장치 H : 고압슬러리회수장치
I : 파우더 분리장치 J : 건조장치
본 발명은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis HBS-21) 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산에 관한 것으로, 보다 상세하게는 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환하는 능력을 갖는 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 코드화하는 유전자로 형질전환시킨 재조합 미생물로부터 분리 정제한 효소를 조 나프탈렌 디카르복실산과 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내에 함유된 불순물인 2-포밀-6-나프토산을 제거한 다음, 여기에 일정 조건에서 산성용액을 투입한 후 교반하면서 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화하고, 이를 세 척하여 기타의 다른 불순물들을 제거한 후, 상기 세척물을 건조함으로써 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 것을 특징으로 하는 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법에 관한 것이다.
2,6-나프탈렌 디카르복실산과 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 디에스테르는 폴리에스테르 및 폴리아미드와 같은 여러 종류의 고분자 물질을 제조하는데 유용한 단량체이다. 예를 들면 2,6-나프탈렌 디카르복실산(이하, NDA)과 2,6-나프탈렌 디카르복실산의 디에스테르(이하, NDC)를 에틸렌 글리콜과 축합반응하여 고성능 폴리에스테르 물질인 폴리(에틸렌2,6-나프탈레이트)(이하, PEN)을 생성할 수 있다. PEN으로부터 제조된 섬유 및 필름은 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(이하, PET)에 비하여 강도가 높고 열적 성질이 우수하다. 이로 인해 PEN은 자기 녹음 테이프 및 전자 부품을 제조하는데 사용될 수 있는 박막과 같은 상용품을 제조하는데 사용되는 매우 우수한 물질이다. 또한 기체 확산, 특히 이산화탄소, 산소 및 수증기에 대한 우수한 저항성으로 인해 PEN으로 제조된 필름은 식품 용기, 특히 고온 충전물용 식품 용기를 제조하는데 유용하다. 또한 타이어 코드 제조에 유용한 강화 섬유를 제조하는데 사용될 수 있다.
현재 NDC는 2,6-디메틸나프탈렌(이하, 2,6-DMN)을 산화시켜 조 나프탈렌 디카르복실산(이하, cNDA)를 생산한 다음 이를 에스테르화하여 생산되고 있다. 현재 NDC가 PEN 합성시 주원료로 사용되고 있지만 NDA를 원료로 사용할 경우에 비해 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 첫째, NDA 축합반응 시에는 물이 생성되는데 비해 NDC의 경우 메탄올이 부산물로 생성되어 폭발성의 위험이 있으며, 둘째, NDC 제 조 공정 중 순수한 NDC를 얻기 위하여 NDA를 에스테르화하여 정제공정을 거쳐 NDC를 생산하므로 NDA에 비하여 한 단계의 공정이 더 필요하고, 셋째로 기존의 PET 생산설비를 가지고 있을 경우 기존 설비의 이용 차원에서 NDC의 사용이 적절치 못하다. 이러한 NDC의 단점에도 불구하고 PEN 제조시 NDA 대신 NDC가 사용되는 이유는 아직까지 중합에 필요한 순도를 가진 정제된 NDA의 제조가 어렵기 때문이다.
2,6-DMN의 산화시에는 2-포밀-6-나프토산(이하, FNA), 2-나프토산(이하, NA), 트리멜리트산(이하, TMLA) 등 각종 불순물이 포함되어 있는 cNDA가 생성된다. 이 중 특히 FNA가 존재하면 중합반응이 중간에서 멈추게 되어 중합도 저하의 원인이 되어 중합체의 물성에 나쁜 영향을 미치거나 폴리에스테르의 착색의 원인이 되므로 FNA를 제거해야 되나 이의 제거에는 어려운 문제가 존재한다.
따라서 cNDA에 존재하는 FNA를 제거하기 위하여 또는 NDA를 정제하기 위하여, 재결정법, 산화공정을 한번 더 거치는 방법, cNDA를 메탄올을 이용하여 NDC로 제조한 후 수화시켜 NDA를 제조하거나 수소화 공정에 의해 정제된 NDA를 제조하는 방법 등 여러 가지의 화학적 방법이 연구되어 왔으며, 그 외에도 용매 처리, 용융 결정, 고압 결정, 초임계 추출 등 다양한 정제방법이 사용되고 있다.
그 구체적인 예로 미국특허공보 제5,859,294호는 cNDA를 알리패틱 아민(aliphatic amine) 또는 알리사이클릭 아민(alicyclic amine)을 포함하는 수용액에 용해시키고, 그에 포함된 불순물인 중금속 성분을 100 ppm 이하가 될 때까지 제거한 다음, 상기 나프탈렌 디카르복실산 아민 염을 함유하는 수용액을 가열하여 아민 성분을 증류시킴으로써 나프탈렌 디카르복실산을 생산하는 방법에 대해 개시하 고 있고,
다른 미국특허공보 제6,255,525호는 불순물이 포함된 방향족 카르복실산(aromatic carboxylic acid)과 물의 혼합용액을 277 내지 316℃, 77-121 kg/cm2, 수소 가스의 존재 하에서 수소화 금속 성분(hydrogenation metal component)이 없는 탄소 촉매와 접촉시킨 다음, 상기 혼합용액을 냉각하여 상기 방향족 카르복실산을 결정화하고, 상기 냉각된 혼합용액으로부터 결정화된 방향족 카르복실산을 회수함으로써 고순도의 방향족 카르복실산을 제조하는 방법에 대해 개시하고 있다.
또한 NDA의 결정화 반응과 관련하여 미국특허공보 제6,087,531호는 폴리(알킬렌 나프탈렌 디카르복실레이트)[poly(alkylene naphthalene dicarboxylate)]를 125 내지 400℃에서 염기성 용액(알칼리 금속 염기성 용액, 하이드록사이드(hydroxide) 또는 알칼리의 금속의 카보네이트)에 용해시킨 다음 170 내지 240℃에서 산으로 중화시켜 NDA 결정을 회수하거나, 폴리에스테르 물질을 170 내지 240℃에서 NaOH 용액 또는 KOH 용액으로 용해시킨 다음 아세트산으로 중화하여 NDA 결정을 회수하는 방법을 공개하고 있으며,
미국특허공보 제6,426,431호는 K2-NDA 수용액을 0-50℃, 0-200 psi 조건에서 CO2로 처리하여 KH-NDA를 형성한 다음, 상기 KH-NDA를 물에 1:8 이상의 비율로 현탁하고, 100℃ 이상(140-160℃), 100 psi 이상(175-250 psi)의 조건에서 다시 CO2 로 처리하여 2,6-NDA의 정제 수율을 약 45%로 높이는 방법에 대해 공개하고 있다.
그러나 상기한 방법들은 고순도의 NDA 결정을 수득하기 위하여, 고온 및 고 압 조건, 장시간 처리, 다량의 고가 재료 등을 필요로 함으로써 경제성이 떨어진다는 문제점이 있으며, 정제 수율 및 순도가 매우 낮고, 얻어진 NDA 개별 결정 간에 응집 현상이 존재하여 실제 생산에 적용하기 곤란하다는 문제점이 있다.
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 FNA를 NDA로 전환하는 능력을 갖는 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 코드화하는 유전자로 형질전환시킨 재조합 미생물로부터 분리 정제한 효소를 이용하여 상온 및 상압 조건하에서 cNDA를 정제 및 결정화함으로써 고순도의 NDA 결정을 고수율로 수득하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 고순도의 균일한 크기를 갖는 NDA 결정을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 코드화하는 유전자로 형질전환시킨 재조합 미생물로부터 분리 정제한 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법에 관계한다.
보다 구체적으로, 본 발명은
(a) 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 크산틴 디히드로게나제 유전자 pucABCDE를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 크산틴 디히드로게나제;
서열번호 4로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldX를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 알데히드 디히드로게나제; 및
서열번호 7로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldY를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 알데히드 디히드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 조 나프탈렌 디카르복실산(crude naphthalene dimethylcarboxylic acid)과 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내의 2-포밀-6-나프토산을 제거하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 투입하여 pH를 조정한 다음 교반하면서 반응시킴으로써 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화하는 단계;
(c) 상기 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산을 세척하여 그에 포함된 불순물들을 제거하는 단계로서, 상기 단계는 결정화된 조 나프탈렌 디메틸카르복실산을 물에 분산시킨 후 압력 1 내지 60 kg/cm2, 온도 120 내지 270℃에서 10분 내지 2시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번 반복함으로써 수행하는 단계; 및
(d) 상기 세척물을 건조하여 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid)의 정제방법에 관계한다.
이하, 본 발명의 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법을 단계별로 상세히 설명한다.
(ⅰ) 제 1단계: 재조합 미생물 유래의 효소를 이용한 정제 공정
먼저, 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 크산틴 디히드로게나제 유전자 pucABCDE를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 크산틴 디히드로게나제; 서열번호 4로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldX를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 알데히드 디히드로게나제; 및 서열번호 7로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldY를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 알데히드 디히드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 조 나프탈렌 디카르복실산(crude naphthalene dimethylcarboxylic acid)과 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내의 2-포밀-6-나프토산을 제거한다.
본 단계는 구체적으로는 1) 상기 재조합 미생물을 액체배지에 접종하여 진탕배양한 후 원심분리를 통해 회수한 균체를 완충용액 또는 생리식염수로 현탁하고 초음파로 파괴한 뒤 다시 원심분리하여 얻은 상등액을 분리 정제하여 상기 효소를 수득하는 단계; 2) 기질인 조 나프탈렌 디카르복실산을 완충용액과 혼합한 다음 여기에 알칼리 용액을 첨가하여 혼합액의 pH를 조절하여 정제반응액을 만드는 단계; 및 3) 상기 1) 과정에서 수득한 효소와 상기 2) 과정에서 준비한 반응액을 반응시켜 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환함으로써 2,6-나프탈 렌 디카르복실산(2,6-Naphthalene dicarboxylic acid)의 순도를 높이는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명에서 사용되는 효소는, 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 크산틴 디히드로게나제 유전자 pucABCDE, 서열번호 4로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldX, 또는 서열번호 7로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldY를 각각 통상 알려져 있는 일반적인 방법에 따라 클로닝하고 발현벡터에 도입하여 재조합 발현벡터를 제조한 후, 이를 역시 종래 공지되어 있는 일반적인 방법에 따라 미생물 내에 도입하여 형질전환시켜 재조합 미생물을 얻은 다음, 상기 미생물로부터 통상의 방법에 따라 분리 정제함으로써 얻을 수 있다.
구체적으로는 다음과 같은 방법에 의해 얻을 수 있다:
즉, 먼저 상기 각각의 효소 유전자를 클로닝하기 위해, 상기 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221)로부터 분리한 각 지놈성 DNA(genomic DNA)를 주형으로 사용하고, 상기 각 유전자로부터 제작한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 상기 각 효소를 코드화하는 유전자를 수득한다.
이어서, 상기 클로닝된 각 유전자를 통상적인 방법으로 발현벡터의 프로모터에 작동 가능하도록 연결함으로써 재조합 발현벡터를 제조한다.
이 때, 상기 발현벡터로는 특별히 제한되지 않는데, 숙주에서 유전자의 최적 발현을 가능케하는 벡터를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 플라스미드, 파지 또는 다른 DNA에 삽입시키는 것이 가능하다. 상기 플라스미드의 예로는, 특별히 제한되는 것은 아니나, 대장균(E. coli)에서는 공지의 pForexT 벡터, pHCE 벡터, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC119, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III138-B1, λgt11 또는 pBDCl 등을 들 수 있고, 스트렙토마이세스에서는(Streptomyces)에서는 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361 등을 들 수 있으며, 바실러스(Bacillus)에서는 pUB110, pC194 또는 pBD214, 그리고 효모에서는 2μM, pAG-1. YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 등을 들 수 있다.
상기 프로모터로는 그램음성균에서 유익하게 사용되는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR 또는 λ-PL 프로모터 등을 이용할 수 있고, 그램양성프로모터 amy 및 SPO2, 또는 진균 또는 효모 프로모터 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH 프로모터등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 선별된 숙주 생물체 또는 유전자에 따라 최적의 발현을 증가시키기 위하여 3' 말단 및/또는 5' 말단에 조절서열을 추가로 포함시키는 것도 가능하다.
이와 관련하여 도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용한 바실러스 섭틸리스 HSB-21 유래의 크산틴 디히드로게나제를 코드화하는 유전자 pucABCDE를 포함하는 재조합 발현벡터 pFOREXT-pucABCDE의 유전자 지도를 보여주고, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에서 사용한 바실러스 섭틸리스 HSB-21 유래의 알데히드 디히드로게나제를 코드화하는 유전자 aldX를 포함하는 재조합 발현벡터 ForexT-aldX의 유전자 지도를 보여주며, 도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에서 사용한 바실러스 섭틸리스 HSB-21 유래의 알데히드 디히드로게나제를 코드화하는 유전자 aldY를 포함하는 재조합 발현벡터 pHCEⅡB-aldY의 유전자 지도를 보여준다.
이러한 재조합 발현벡터 내로의 효소 유전자의 클로닝은 제한효소 절단 및 염기서열 분석 등을 통해 확인할 수 있다.
그 다음, 제조된 재조합 발현벡터를 통상 알려져 있는 일반적인 방법에 따라 숙주 미생물에 도입하여 상기 미생물을 형질전환시킴으로써 재조합 미생물을 얻는다. 이 때, 상기 숙주 미생물로는 모든 원핵 또는 진핵 생물체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세균, 진균 또는 효모와 같은 미생물을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적인 예를 들면, 그램 양성균 또는 그램 음성균, 바람직하게는 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 또는 노르카디아세(Norcardiace)군의 세균을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 에쉐리아키아(Escherichia), 슈도모나스, 로도코코스, 바실러스 속의 세균을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 이콜라이(E. Coli) 속 또는 종을 사용할 수 있는데, 구체적으로는 MC1061(E. coli), JM109(E. coli), XL1-Blue(E.coli), DH5α(E. coli) 등을 예로 들 수 있다. 형질전환 방법으로는 열처리, 전기충격법, 미세주입법, 염화칼슘법, 염화루비듐법, 압력을 이용한 분사법 등을 이용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 상기 재조합 미생물을 충분히 배양한 후 통상의 방법으로 상기의 각 효소를 분리 정제한다. 이 때, 본 발명에서 재조합 미생물로부터 얻은 효소를 이용하여 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환시키기 위해서는 상기 재조합 미생물 내에서 각 효소가 고발현되는 것이 바람직하므로 진탕배양을 통해 각 효소의 발현을 유도한 후 이를 분리 정제하는 것이 좋다.
구체적으로는, 상기 재조합 미생물을 통상의 배양온도인 25 내지 45℃, 바람직하게는 37℃에서 충분히 전배양하고, 이를 다시 100 내지 200 ml의 액체배지(예: LB 배지 또는 LBA 배지)에 0.1 내지 1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃에서 충분한 시간 동안 진탕배양하여 효소의 발현을 유도한 후, 원심분리를 통해 균체를 회수하고, 회수한 균체를 완충용액 또는 생리식염수로 현탁한 다음, 상기 현탁액을 초음파로 파괴하여 다시 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 이를 이온교환수지 또는 Ni-NTA 컬럼 등으로 정제함으로써 효소를 수득할 수 있다. 이 때, 상기 이온교환수지로는 특별히 제한되는 것은 아니나, Q-세파로오스(Sepharose)를 함유한 컬럼을 사용하는 음이온 크로마토그라피를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기의 원심분리 및 균체의 현탁은 필요에 따라 1, 2회 정도 추가로 반복할 수 있다.
이러한 재조합 미생물의 배양, 단백질의 발현 및 정제 방법은 상기 방법에만 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 모든 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 효소는 재조합 미생물 내에서 고발현을 시킨 후 분리 정제하여 이용하기 때문에 고농도 배양이 가능하며 회수율이 높은 이점이 있다.
나아가 본 발명의 효소는 히스티딘 태깅을 이용하여 수득할 수 있다. 구체적으로, 각 효소 유전자에 히스티딘 태그를 붙여 제작한 리버스 프라이머(reverse primer)를 이용하여 수득한 효소 유전자로 재조합 발현벡터를 제조하고 형질전환 미생물을 얻은 후 그로부터 효소를 분리 정제할 수 있다. 이와 같이 히스티딘 태깅을 이용하면, 나중에 상기의 효소가 발현되었을 때, 이를 보다 용이하게 분리 정제할 수 있는 이점이 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 상기 완충용액으로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 물, 탄산나트륨 완충용액, 글리신 완충용액, 인산칼륨 완충용액, 인산나트륨 완충용액, 숙신산 완충용액, 아세트산나트륨 완충용액, 시트르산 완충용액, 피로인산나트륨 완충용액, 붕산 완충용액, 붕산나트륨 완충용액 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 pH 6.0 내지 9.0의 완충용액 범위를 가지는 칼륨 인산 완충용액 또는 붕산 완충용액을 사용하는 것이 좋다. 이 때, 상기 완충용액의 농도는 0.01 내지 100 mM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 알칼리 용액으로는 반드시 제한되는 것은 아니나 NaOH 용액 또는 KOH 용액을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 혼합액의 pH는 6 내지 10, 나아가 8 내지 10으로 조절하는 것이 바람직하다.
한편 상기 2)단계에서의 혼합액에는 cNDA를 용해시키기 위한 목적으로 유기용매가 추가로 첨가될 수 있다. 바람직한 유기용매의 예에는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, "DMSO"), 디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide, "DMF"), 디메틸아세트아미드(N,N-Dimethylacetamide, "DMA"), 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, "THF") 등이 포함되며, 그 중에서도 디메틸설폭사이드를 사용하는 것이 효소 활성 측면에서 가장 바람직하다. 이 때, 유기용매의 첨가농도는 0.01 내지 20중량%인 것이 바람직하며, 0.1 내지 10중량%인 것이 보다 바람직하다. 가장 바람직하게는 첨가하지 않는 것이 좋다. 한편, 상기 유기용매를 20중량%를 초과하여 첨가하면 미생물의 세포막을 용해시켜 반응을 저해하는 결과를 보인다.
상기 3)단계에서의 반응온도 및 반응시간은 각각 25 내지 60℃, 1분 내지 1시간인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 35 내지 50℃, 10분 내지 40분 동안 반응시키는 것이 좋다. 특히 반응온도가 25℃ 미만이거나 60℃를 초과할 경우에는 반응성이 현저하게 감소하여 부적당하다.
한편, cNDA 내의 FNA 함량, 반응액의 cNDA 농도, 그리고 FNA의 완전 제거를 위해 필요한 균체량 사이에는 밀접한 관계가 있는데, cNDA 내의 FNA 함량이 높을수록, 또한 반응액 내의 cNDA 농도가 높을수록 많은 양의 균체를 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 정제반응액 내의 cNDA 농도는 0.001 내지 20중량%인 것이 바람직하며, cNDA 내의 FNA 함량은 0.001 내지 10중량%, 바람직하게는 9중량%인 것을 사용하는 것이 좋다.
(ⅱ) 제 2단계: 결정화 공정
이 단계에서는 상기 (ⅰ) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 투입하여 pH를 조정한 다음 교반하면서 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화한다.
좀 더 구체적으로, FNA가 제거된 상태의 cNDA 정제반응 용액 내에 존재하는 비결정 상태의 cNDA를 결정화하기 위하여, 교반기가 장착된 반응기 내에서 상기 (ⅰ) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 적당량 투입하여 pH를 일정범위로 조정한 다음 계속 교반하면서 적절한 온도로 조절하여 유지 반응시킴으로써, 상온 및 상압 조건하에서 결정화가 이루어지도록 한다.
본 발명의 결정화 공정에 따르면, 상온 및 상압 조건 하에서 100 ㎛ 이상 크기의 균일한 cNDA 결정을 얻을 수 있으므로 제조비용 및 공정 면에서 경제적이며, 수득된 cNDA 개별 결정 간에 응집 현상이 존재하지 않아 실용성 및 회수율이 높은 효과가 있다.
이 때, 상기 산성용액으로는 황산, 염산, 빙초산, 질산 등을 사용할 수 있으며, cNDA 결정의 크기 및 수율 면에서 황산 또는 염산을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 즉, 황산 또는 염산을 투입하는 경우, 100 ㎛ 이상의 균일한 크기의 cNDA 결정을 고수율로 수득할 수 있다.
상기 pH 범위는 회수율 면에서 1 내지 3으로 조정하는 것이 바람직한데, pH가 낮을수록 회수율이 99.99%로 높아지는 경향을 보인다.
또한 결정화 온도는 약 5 내지 130℃, 바람직하게는 30 내지 110℃, 보다 바 람직하게는 60 내지 80℃인 것이 결정화 반응을 수행하는데 적절하며, 반응 시간은 약 1분 내지 10시간, 바람직하게는 2분 내지 5시간, 보다 바람직하게는 10분 내지 1시간 범위인 것이 연속 공정의 면에서 좋다. 가장 바람직한 결정화 온도 및 반응시간은 80℃, 20분 내지 30분간이다. 결정화 시간이 너무 짧으면 결정화도가 낮아 중합반응시 개별 결정 간에 응집이 일어날 수 있으며, 결정화 시간이 지나치게 길어지면 불필요한 에너지 손실을 초래할 수 있다.
결정화를 수행하는 적정 교반속도로는 0 rpm 초과 1000 rpm 이하, 바람직하게는 0 rpm 초과 400 rpm 이하, 보다 바람직하게는 50 내지 100 rpm에서 실시하는 것이 바람직하다.
(ⅲ) 제 3단계: 세척 공정
이 단계에서는 상기 (ⅱ) 단계를 통해 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산을 세척하여 그에 포함된 불순물들을 제거한다.
효소를 이용한 정제 반응 및 결정화 반응 후에도 FNA는 NDA로 전환되어 제거되지만, 기타 2-나프토산(NA), 메틸나프토산(MNA), 트리멜리트산 (TLMA)등의 불순물은 제거되지 않고 그대로 존재하게 된다. 따라서, 결정화된 cNDA를 물에 분산시킨 후 일정 조건 하에서 여러 번 세척하면 용해도 차이를 이용하여 상기의 기타 불순물들을 깨끗이 제거할 수 있다. 이 때, 상기의 불순물뿐만 아니라 cNDA를 정제하기 위해 사용된 효소도 함께 제거된다.
본 단계에서는 반응 부산물들이 용매에 용해되어 있으면서 최대한 많은 양의 NDA가 석출되는 상태에서 분리하는 것이 좋으며, 이러한 온도 범위는 120 내지 270 ℃, 바람직하게는 180 내지 240℃이다. 270℃를 초과하는 온도에서 용매를 분리할 경우에는 정제된 NDA의 손실량이 증가하여 수율이 현저히 떨어지는 문제점이 있으며, 120℃ 미만의 온도에서 분리할 경우에는 NA, MNA, TLMA등의 부산물이 잘 용해되지 않아 바람직하지 않다.
보다 구체적으로는, 결정화된 cNDA를 물에 분산시킨 후 압력 1 내지 60 kg/cm2, 온도 120 내지 270℃에서 10분 내지 2시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번 반복함으로써 불순물들을 제거할 수 있으며, 이 때 용매의 양은 NDA 중량대비 5 내지 20배를 사용하는 것이 바람직하다.
(ⅳ) 제 4단계: 건조 공정
마지막으로, 상기 세척공정을 통해 불순물이 제거된 NDA 결정을 일정 온도에서 건조함으로써 최종적인 순수한 NDA 결정을 수득한다. 이 때, 상기 건조 처리는 30 내지 200℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 건조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상의 건조방법을 제한없이 이용할 수 있다.
한편, 본 발명의 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법은 상기 (ⅰ)단계와 (ⅱ) 단계 사이에 상기 (ⅰ)단계에서 사용한 불활성된 효소를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같이, cNDA의 정제 후 미리 불활성된 효소를 제거하여 결정화 반응을 수행하면 NDA 결정의 순도 및 회수율을 보다 향상시킬 수 있다.
상기 효소를 제거하기 위한 방법으로는 통상의 공지된 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 구체적으로는 마이크로필터 시스템, 연속원심분리기 또는 디칸터(decanter) 등을 사용하여 제거할 수 있다. 이 때, 상기 마이크로필터 시스템의 경우에는 0.01 내지 0.30㎛의 포어 크기(pore size)를 가지며, 세라믹, 스테인레스, 폴리프로필렌, PET 등의 재질로 된 필터를 사용할 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양상은 본 발명의 정제방법에 의해 수득되는 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산에 관계한다.
본 발명이 제공하는 2,6-나프탈렌 디카르복실산은 상기한 본 발명의 정제방법에 따라 수득됨으로써 99.9% 이상의 고수율 및 고순도로 얻어지며, 용도 및 경우에 따라 처리조건을 조절함으로써 정형 또는 무정형의 결정 상태로 얻을 수 있다. 특히 정형의 경우에는 격자구조를 가질 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에서 생성된 2,6-나프탈렌 디카르복실산 결정은, 평균 입경이 100 ㎛ 이상으로 크고 균일한 입자 형태를 가지므로, PEN 중합 공정시 에틸렌 글리콜과 저점도 슬러리를 형성하기에 매우 적합한 결정형태이다. 평균 입경이 작으면 제품의 취급이 까다롭고 PEN 중합 공정에서 에틸렌 글리콜과 혼합해 슬러리를 조제할 때 슬러리 형성능력이 떨어지기 때문에 동력소모가 많은 문제점이 있다. 바람직하게는 본 발명의 2,6-나프탈렌 디카르복실산 결정은 100 내지 200 ㎛ 범위 의 평균입경을 가지며, 보다 바람직하게는 110 내지 180 ㎛ 범위의 평균입경을 갖는다.
한편, 도 5는 본 발명에 따른 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법을 실시하기 위한 정제 장치 시스템의 한 양상을 도시한 것이다. 상기 도 5에 근거하여 본 발명에 의한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법의 일 실시형태에 대하여 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.
먼저 효소 정제 반응기(A)에 일정량의 완충용액을 주입하고, 여기에 cNDA를 첨가하여 교반하면서 알칼리 용액을 첨가하여 반응액의 pH를 조절한 다음, 다시 일정량의 물을 첨가하여 정제반응액을 제조한다. 상기 반응액을 일정한 온도로 유지하면서 미리 준비한 반응용 효소를 투입하여 반응시킨다. 이러한 과정을 통해 상기 효소 정제 반응기(A)에서 cNDA 내의 FNA를 NDA로 전환시켜 FNA를 제거할 수 있다.
반응이 완료된 상기 정제 반응액을 불활성 효소 제거 장치(B)로 통과시켜 FNA를 제거하기 위해 사용한 불활성 효소를 제거한다. 이 불활성 효소 제거 장치(B)를 이용한 불활성 효소 제거 공정은 필요에 따라 생략할 수 있다. 불활성 효소 제거 공정을 생략하여도 후단의 여과 및 세정장치(F)에서 불활성된 효소 및 남아있는 효소를 제거할 수 있다.
불활성 효소가 제거된 정제반응액을 결정화 반응기(C)로 이송하고, 여기에 산성용액을 첨가하는 동시에 교반하면서 결정화 반응을 진행시킨다.
그 다음, 상기 결정화가 완료된 cNDA를 포함하는 슬러리를 예비가열기(D)에 의해 120 내지 270℃ 정도로 가열하여 여과 및 세정장치(F)에 투입한다. 상기 여과 및 세정장치(F)에는 상기 슬러리 용액의 온도를 120 내지 270℃로 유지시켜주기 위한 가열수단이 구비되어 있다. 또한 압력은 1 내지 60 kg/cm2로 유지되며, 여과를 위하여 10 내지 100㎛의 여과기가 구비되어 있다.
상기 여과 및 세정장치(F)는 고압여과액회수장치(G)와 연결되어 있어 상기 고압여과액회수장치(G)로 여과액을 방출하고 고상분을 여과기에 거른다.
여기에 다시 용매가열공급장치(E)로부터 120 내지 270℃로 미리 예열된 물을 여과 및 세정장치(D)에 투입하고, 일정시간 교반한 후, 고압여과액회수장치(G)로 2차 여과액을 방출한다. 필요한 경우 위의 세정단계를 동일하게 1, 2회 더 반복할 수 있다. 세정 후 남은 순수한 NDA는 용매가열공급장치(E)로부터 120 내지 270℃로 미리 예열된 물에 의해 슬러리를 형성하고, 슬러리 방출라인을 통해 고압슬러리회수장치(H)로 보내진다. 상기 고압슬러리회수장치(H)로 보내진 순수한 NDA 슬러리를, 압력을 상압까지 강하시키고 파우더 분리장치(I)를 통해 용매를 제거한 후 건조장치(J)에서 건조하면, 순수한 NDA를 회수할 수 있다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예에 의하여 설명하나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
[ 실시예 1]
제 1단계: 재조합 미생물로부터의 효소의 분리정제
(1) pucABCDE 유전자의 클로닝
바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KCTC 11221) 유래의 크산틴 디히드로게나제를 코딩하는 pucABCDE 유전자(서열번호 1)를 클로닝하기 위하여, 먼저 상기 pucABCDE 유전자 서열을 포함하는 지놈성 DNA를 분리하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 상기 분리한 지놈성 DNA를 주형 DNA로 하여, pucABCDE (참조: GenBank Sequence Database, BSUB0017) 유전자의 DNA 염기서열을 기초로 제작한 프라이머 1 (5'-ATGGGGAATTTTCACACGATGTTAGATGCG-3': 서열번호 2) 및 프라이머 2 (5'-TTAAAAGCCGGACTCCCGTCTACCCCCGTT-3': 서열번호 3)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
중합효소 연쇄반응은, 첫 번째 변성(denaturation) 단계를 94℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성 단계를 94℃에서 1분간, 교잡(annealing) 단계는 60℃에서 1분 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 7분간 수행하였으며, 이를 35회 반복하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 절편에서 서열 1로 표시되는 약 5.2kb 크기의 DNA 절편을 분리하고 이를 pFOREXT 벡터(Takara)에 클로닝하여 도 1에 나타나는 것과 같은 재조합 발현벡터 pFOREXT-pucABCDE를 제조하였다.
(2) 클로닝된 유전자 분석
상기 (1)에서 제조된 재조합 벡터(pFOREXT-pucABCDE)의 클로닝된 유전자의 염기서열 분석을 위하여, M13mp18과 M13mp19 두 벡터의 계열지도를 토대로 여러 가지 제한효소(EcoR I, Kpn I, BamH1, Pst I, Hind Ⅲ)를 이용하여 상기 재조합 벡터를 절단하고, 각각의 조각을 M13mp18과 M13mp19에 아클로닝(subcloning)하였으며, 이들을 AmpliTaq DNA 중합효소를 이용한 ABI PRISM BigDye primer cycle-sequencing kit(Perkin-Elmer, 미국)를 이용하여 서열분석하였다. 이 때, 두 가닥 DNA의 양쪽 방향을 다 읽기 위하여 부분적으로 합성 뉴클레오타이드를 만들었으며, 이를 통하여 클로닝된 DNA 절편 유전자의 염기서열을 분석하여, GenBank에 등록된 염기서열(GenBank Accession Number Z99120)과 비교해 본 결과, pucABCDE 유전자가 클로닝되었음이 확인되었다.
(3) 형질전환체의 제조
염화칼슘법을 이용하여(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 대장균 XL1-Blue를 ForexT-pucABCDE 벡터로 형질전환 시켰다. 이를 엠피실린(ampicillin, 100㎎/L)과 박토-아가(bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5g/L; 트립톤, 10g/L; NaCl, 10g/L)에서 배양하여 엠피실린에 대해 내성을 보이는 형질전환균주 XL1-Blue(FOREXT-pucABCDE)를 1차 선별하였다.
상기 1차 선별된 대장균을 엠피실린(ampicillin, 100mg/L)이 포함된 5 ml LB 액체배지에 접종한 다음, 37℃의 온도에서 충분한 시간동안 진탕배양하고, 5%의 크산틴과 엠피실린이 포함된 LB 고체배지에 상기의 배양액을 100㎕ 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 뒤에 콜로니 주변에 hollow의 형성여부를 관찰하였다. 그 결과 상기 대장균의 콜로니 주변에 hollow가 형성되는 것이 확인되었다.
(4) pucABCDE 유전자의 발현 및 효소의 분리 정제
pucABCDE 유전자를 형질전환 미생물에서 발현시키기 위해, 상기 (3)에서 수득한 대장균을 엠피실린(100mg/L)이 포함된 LB 배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 이를 다시 엠피실린(100mg/L)이 포함된 100 ㎖의 LB 배지에 1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 다음, 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 다시 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액으로부터 크산틴 디히드로게나제를, Q-세파로오스(Sepharose)를 함유한 컬럼을 사용하는 음이온 크로마토그라피를 이용하여 정제하였다. 단백질 분리를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 걸어본 결과, 약 190 kDa의 크산틴 디히드로게나제가 분리 정제되었음을 확인할 수 있었다.
(5) 효소 역가 측정
벤즈알데히드는 벤즈알데히드 디히드로게나제(Banzaldehyde dehydroenase) 존재하에서 NAD+(nicotinamide-adenine dinucleotide)에 의해 벤조익에시드로 전환된다. 이 때 생성되는 NADH의 양을 340 mm에서 흡광도를 측정하여 결정한다. 효소역가는 효소액 0.5 ml를 5 mM NAD+와 10 mM 벤즈알데히드를 포함하는 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH) 3 ml에 첨가한 후 20℃에서 5분간 반응시키고, 340 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 효소활성 1 unit은 분당 NDAH를 1 umole 생산하는 효소량으로 정의한다.
제 2단계: 재조합 미생물로부터 분리한 효소를 이용한 cNDA 의 정제
효소 정제 반응기(A)에 50 mM 칼륨 인산 완충용액 50 L를 주입하고, 여기에 cNDA 10 kg를 첨가하여 교반하면서 KOH 용액을 첨가하여 반응액의 pH를 8.0이 되도록 조절한 다음, 다시 물을 첨가하여 100 L의 정제반응액(cNDA 농도: 10%, cNDA 내의 FNA 함량: 0.58%)을 제조하였다.
상기 반응액을 40℃로 유지하면서 상기 제 1단계에서 얻어진 효소를 (500 units) 5 L를 투입한 다음 40℃에서 30분간 반응시켜 상기 cNDA 내의 FNA를 NDA로 전환시켜 제거하였다.
제 3단계: 정제된 cNDA 의 결정화
상기 제 2단계에서 얻어진 cNDA 정제용액 100 L를 교반장치가 부착된 결정화 반응기(C)로 이송하고 여기에 황산 용액을 첨가하여 pH가 3.0이 되도록 조정한 다음, 교반속도를 50 rpm, 온도를 80℃로 유지하면서 20분간 결정화 반응을 진행하였다.
결정화를 완료한 후 현미경과 입도분석기를 사용하여 결정을 분석한 결과, 결정화가 제대로 진행되었으며, 개별 결정 간에 서로 엉겨붙는 현상이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 결정화된 cNDA 의 평균결정크기는 약 163.1 ㎛ 로 분석되었다. 상기 결정화된 cNDA의 현미경 사진을 도 3에 도시하였다.
제 4단계: 결정화된 cNDA 의 세척 및 건조
상기 제 3단계에서 결정화된 cNDA 슬러리 용액을 예비가열기(D)를 통해 220℃ 이상으로 가열한 후, 여과 및 세정장치(F)에 투입하여 압력 35 kg/cm2, 온도 230℃에서 30분간 교반한 다음, 여과하여 고압여과액회수장치(G)로 물을 제거하였다. 여기에 다시 용매가열공급장치(E)로부터 230℃, 물 100L를 첨가한 후, 동일한 조건에서 30분간 교반한 다음 여과하여, 고압여과액회수장치(G)로 물을 제거하는 공정을 2회 반복하였다. 여기에 다시 상기 용매가열공급장치(E)로부터 230℃, 물 100L를 첨가한 후, 30분 이상 교반시켜 고르게 분산시킨 다음, 고압슬러지회수장치(H)로 이송하여 상압까지 감압하고, 파우더 분리장치(I)인 디칸터(decanter)를 이용하여 물을 제거한 후, 건조장치(J)에서 150℃ 건조하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.
[ 실시예 2]
제 1단계를 하기와 같이 실시한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.
(1) aldX 유전자의 클로닝
바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KCTC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 aldX 유전자(서열번호 4)를 클로닝하기 위하여, 먼저 상기 aldX 유전자 서열을 포함하는 지놈성 DNA를 분리하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 상기 분리한 지놈성 DNA를 주형 DNA로 하여, aldX (참조: GenBank Sequence Database, BSUB0021) 유전자의 DNA 염기서열을 기초로 제작한 프라이머 1 (5'-GAGGGGGATTTTCATATGGAACAGCAAGTA-3': 서열번호 5) 및 프라이머 2 (5'-GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACATGGAACAGCAAGTAAAGGACGACA-3': 서열번호 6)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
중합효소 연쇄반응은, 첫 번째 변성(denaturation) 단계를 94℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성 단계를 94℃에서 1분간, 교잡(annealing) 단계는 56℃에서 1분간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1.5분간 수행하였으며, 이를 40회 반복하고, 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장 단계를 1회 수행하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 절편에서 서열 4로 표시되는 약 1.33kb 크기의 DNA 절편을 분리하고 제한효소 Nde Ⅰ과 BamH Ⅰ으로 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단한 Forex-T 벡터(Takara)에 클로닝하여 도 2에 나타나는 것과 같은 재조합 발현벡터 ForexT-aldX를 제조하였다.
(2) 클로닝된 유전자 분석
상기 (1)에서 제조된 재조합 벡터(ForexT-aldX)의 클로닝된 유전자의 염기서열 분석을 위하여, M13mp18과 M13mp19 두 벡터의 계열지도를 토대로 여러 가지 제한효소(EcoR I, Kpn I, BamH1, Pst I, Nde I, Hind Ⅲ)를 이용하여 상기 재조합 벡터를 절단하고, 각각의 조각을 M13mp18과 M13mp19에 아클로닝(subcloning)하였으며, 이들을 AmpliTaq DNA 중합효소를 이용한 ABI PRISM BigDye primer cycle-sequencing kit(Perkin-Elmer, 미국)를 이용하여 서열분석하였다. 이 때, 두 가닥 DNA의 양쪽 방향을 다 읽기 위하여 부분적으로 합성 뉴클레오타이드를 만들었으며, 이를 통하여 클로닝된 DNA 절편 유전자의 염기서열을 분석하여, GenBank에 등록된 염기서열(GenBank Accession Number Z99124)과 비교해 본 결과, aldX 유전자가 클로닝되었음이 확인되었다.
(3) 형질전환체의 제조
염화칼슘법을 이용하여(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 대장균 XL1-Blue를 ForexT-aldX 벡터로 형질전환 시켰다. 이를 엠피실린(ampicillin, 100㎎/L)과 박토-아가(bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5g/L; 트립톤, 10g/L; NaCl, 10g/L)에서 배양하여 엠피실린에 대해 내성을 보이는 형질전환균주 XL1-Blue(ForexT-aldX)를 1차 선별하였다.
상기 1차 선별된 대장균을 엠피실린(ampicillin, 100mg/L)이 포함된 5 ml LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양한 다음, 0.1% 배양액을 다시 엠피실린이 포함된 200 ml LB 배지에 접종하여 16시간 동안 진탕배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 다시 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상기 상등액의 알데히드 디히드로게나제 효소 역가를 측정하여 활성을 보이는 균주를 알데히드 디히드로게나제 생성균주로 최종 선별하였다. 이 때, 효소 역가는 효소액 0.5 ml에 NAD 용액 3 ml와 1%(v/v)의 벤즈 알데히드 용액 0.5 ml를 넣어 25℃에서 10분간 반응시킨 후 상기 반응액을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
(4) aldX 유전자의 발현 및 효소의 분리 정제
aldX 유전자를 형질전환 미생물에서 발현시키기 위해, 상기 (3)에서 수득한 대장균을 엠피실린(100mg/L)이 포함된 LBA 배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 이를 다시 엠피실린(100mg/L)이 포함된 100 ㎖의 LBA 배지에 1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 다음, 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 pH 7.0의 50 mM 칼륨 인산 완충용액(KH2PO4-KOH)으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 다시 원심분리하여 상등액을 취하고, 얻어진 상등액을 Ni-NTA(QIAGEN) 컬럼으로 정제하여 알데히드 디히드로게나제 효소를 정제하였다. 단백질 분리를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 걸어본 결과, 약 49kDa의 알데히드 디히드로게나제가 분리 정제되었음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 3]
제 1단계를 하기와 같이 실시한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.
(1) aldY 유전자의 클로닝
바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KCTC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 aldY 유전자(서열번호 7)를 클로닝하기 위하여, 먼저 상기 aldY 유전자 서열을 포함하는 지놈성 DNA를 분리하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 상기 분리한 지놈성 DNA를 주형 DNA로 하여, 참조: GenBank Sequence Database, BSUB0020) 유전자의 DNA 염기서열을 기초로 제작한 프라이머 1 (5'-AAGGAGGGTCATATGAGTTTCGAAACG-3': 서열번호 8) 및 프라이머 2 (5'-CCCAAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGGTGGAACGGATATTTGCGGTATTGCTTC-3': 서열번호 9)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이 때, 상기 프라 이머 2는 aldY 유전자에 히스티딘 태그를 붙여서 제작하였다.
중합효소 연쇄반응은, 첫 번째 변성(denaturation) 단계를 94℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성 단계를 94℃에서 1분간, 교잡(annealing) 단계는 60℃에서 1분 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분간 수행하였으며, 이를 35회 반복하였다. 이와 같은 방법으로 얻어진 절편에서 서열 1로 표시되는 약 1.5kb 크기의 DNA 절편을 분리하고 제한효소 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pHCEⅡB(NdeⅠ)(Takara)에 클로닝하여 도 3에 나타나는 것과 같은 재조합 발현벡터 pHCEⅡB-aldY를 제조하였다.
(2) 클로닝된 유전자 분석
상기 (1)에서 제조된 재조합 벡터(pHCEⅡB-aldY)의 클로닝된 유전자의 염기서열 분석을 위하여, M13mp18과 M13mp19 두 벡터의 계열지도를 토대로 여러 가지 제한효소(EcoR I, Kpn I, BamH1, Pst I, Nde Ⅰ, Hind Ⅲ)를 이용하여 상기 재조합 벡터를 절단하고, 각각의 조각을 M13mp18과 M13mp19에 아클로닝(subcloning)하였으며, 이들을 AmpliTaq DNA 중합효소를 이용한 ABI PRISM BigDye primer cycle-sequencing kit(Perkin-Elmer, 미국)를 이용하여 서열분석하였다. 이 때, 두 가닥 DNA의 양쪽 방향을 다 읽기 위하여 부분적으로 합성 뉴클레오타이드를 만들었으며, 이를 통하여 클로닝된 DNA 절편 유전자의 염기서열을 분석하여, GenBank에 등록된 염기서열(GenBank Accession Number Z99123)과 비교해 본 결과, aldY 유전자가 클로닝되었음이 확인되었다.
(3) 형질전환체의 제조
염화칼슘법을 이용하여(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 대장균 XL1-Blue를 pHCEⅡB-aldY 벡터로 형질전환 시켰다. 이를 엠피실린(ampicillin, 100㎎/L)과 박토-아가(bacto-agar, 15g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5g/L; 트립톤, 10g/L; NaCl, 10g/L)에서 배양하여 엠피실린에 대해 내성을 보이는 형질전환균주 XL1-Blue(pHCEⅡB-aldY)를 선별하였다.
(4) aldY 유전자의 발현 및 효소의 분리 정제
aldY 유전자를 형질전환 미생물에서 발현시키기 위해, 상기 (3)에서 수득한 대장균을 엠피실린(100mg/L)이 포함된 LB 배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양한 후, 이를 다시 엠피실린(100mg/L)이 포함된 200 ㎖의 LB 배지에 0.1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 다음, 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 0.85% 생리식염수로 세척한 후, 다시 원심분리하여 균체를 얻고, 마지막으로 상기 균체를 20 ml 라이시스 버퍼로 현탁하였다. 이 현탁액을 초음파로 파쇄기를 이용하여 파쇄시킨 후, 원심분리를 통해 파쇄된 균체를 회수하고 라이시스 버퍼로 다시 현탁하였다. 단백질 정제를 위해 Ni-NTA superflow(QIAGEN)를 컬럼에 충진시킨 후, 상기 파쇄시킨 균체 현탁액을 컬럼에 넣고 워싱 버퍼와 일루션 버퍼를 이용하여 단백질을 분리 정제하였다. 단백질 분리를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 걸어본 결과, 약 55kDa의 알데히드 디히드로게나제가 분리 정제되었음을 확인할 수 있었다. 상기의 단백질 분리 정제과정에서 사용한 라이시스 버퍼, 워싱 버퍼, 일루션 버퍼의 조성은 하기 표 1과 같다.
Figure 112006084288077-pat00001
[ 실시예 4]
상기 실시예 1의 제 2단계와 제 3 단계 사이에서, 상기 제 2단계에서 얻어진 cNDA 정제용액을 0.10 ㎛의 폴리프로필렌 필터를 사용하여 효소 정제액을 제거한 후 결정화 반응에 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하여 순수한 결정 상태의 NDA를 수득하였다.
실험예 1: 성분 분석
상기 실시예 1 내지 3에서 사용된 최초의 cNDA, 제 2단계의 정제반응 후 얻어진 cNDA 정제용액, 그리고 제 4단계의 세척 및 건조공정 후 얻어진 순수한 결정 상태의 NDA에 대하여 각각 성분을 분석한 후 그 결과를 하기 표 2 내지 4에 나타내었다.
Figure 112006084288077-pat00002
Figure 112006084288077-pat00003
Figure 112006084288077-pat00004
상기 표 2 내지 4의 결과로부터 본 발명의 효소 정제액을 이용한 cNDA 정제방법을 사용할 경우 cNDA 내의 불순물들을 거의 완전히 제거할 수 있으며, 특히 FNA는 NDA로 100% 전환되어 99.99% 이상의 고순도의 2,6-나프탈렌 디카르복실산 결정을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편 본 발명의 효소 정제액을 이용한 cNDA의 정제단계 중 특히 cNDA 정제용액의 결정화 단계의 최적 반응조건을 찾기 위하여, 하기와 같이 반응조건을 여러 가지로 변화시켜 실험하고 그에 따른 결정화 반응 및 회수율을 비교 분석하였다.
실험예 2: 산 종류 및 교반속도에 따른 결정화 반응
상기 실시예 1 내지 3의 제 2단계에서 얻어진 각각의 cNDA 정제용액 100 ml를 교반장치가 부착된 반응기에 넣고, 여기에 황산, 염산, 빙초산, 질산 용액을 각각 첨가하여 pH가 3.0이 되도록 조정한 다음, 교반속도를 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 rpm으로 유지하였다. 온도는 80℃로 하였으며, 상기의 조건에서 각각 20분간 결정화 반응을 진행하였다.
결정화를 완료한 후 현미경과 입도분석기를 사용하여 결정을 분석한 결과, 모두 결정화된 것을 확인할 수 있었고, 개별 결정 간에 서로 엉겨붙는 현상이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 상기의 각 조건에서 얻어진 cNDA 결정의 평균크기를 각각 하기 표 5 내지 7에 나타내었다. 하기 표 5 내지 7의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 4가지의 산용액 중에서 황산과 염산이 결정화 반응에 가장 우수한 결과를 보였으며, 바람직한 교반속도는 0 rpm 초과 400 rpm 이하, 보다 바람직한 교반속도는 50 내지 100 rpm 정도인 것으로 판단되었다.
Figure 112006084288077-pat00005
Figure 112006084288077-pat00006
Figure 112006084288077-pat00007
실험예 3: 산 종류 및 온도조건에 따른 결정화 반응
교반속도를 50 rpm으로 하고, 반응 온도를 5, 30, 60, 80, 110, 130℃로 한 것을 제외하고는 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 실험하였다.
결정화를 완료한 후 현미경과 입도분석기를 사용하여 결정을 분석한 결과, 모두 결정화된 것을 확인할 수 있었으며, 개별 결정 간에 서로 엉겨붙는 현상이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다. 또한 상기의 각 조건에서 얻어진 cNDA 결정의 평균크기를 하기 표 8 내지 10에 나타내었다. 하기 표 8 내지 10의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 4가지의 산용액 중에서 황산과 염산이 결정화 반응에 가장 우수한 결과를 보였으며, 가장 바람직한 반응 온도는 80℃인 것으로 판단되었다.
Figure 112006084288077-pat00008
Figure 112006084288077-pat00009
Figure 112006084288077-pat00010
실험예 4: 산 종류 및 pH 조건에 따른 회수율
교반속도를 50 rpm, 반응 온도를 80℃, pH 범위를 1, 2, 3, 4, 5, 6으로 조정한 것을 제외하고는 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 실험하였다. 즉, 20분간 결정화 반응을 진행한 후 일정량을 취하여 회수율을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 11 내지 13에 나타내었다. 하기 표 11 내지 13의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 황산과 염산이 회수율에 가장 우수한 결과를 보였으며, pH 3 이하의 조건에서 회수율 99.9% 이상의 결과를 얻었다. 이 때, pH가 낮을수록 회수율이 높아지는 경향을 나타내었다.
Figure 112006084288077-pat00011
Figure 112006084288077-pat00012
Figure 112006084288077-pat00013
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 FNA를 NDA로 전환하는 재조합 미생물 유래의 효소 정제액을 이용하여 그에 적합한 조건 하에서 조 나프탈렌 디카르복실산을 정제 및 결정화함으로써 고순도의 결정형 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 환경친화적으로 대량생산할 수 있는 이점이 있다.
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Claims (21)

  1. (a) 서열번호 1로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 크산틴 디히드로게나제 유전자 pucABCDE를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 크산틴 디히드로게나제;
    서열번호 4로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldX를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 알데히드 디히드로게나제; 및
    서열번호 7로 표시되는 바실러스 섭틸리스 HSB-21(Bacillus subtilis HSB-21 KFCC 11221) 유래의 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldY를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시켜 얻은 재조합 미생물로부터 분리 정제한 알데히드 디히드로게나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 조 나프탈렌 디카르복실산(crude naphthalene dimethylcarboxylic acid)과 반응시켜 상기 조 나프탈렌 디카르복실산 내의 2-포밀-6-나프토산을 제거하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 반응용액에 산성용액을 투입하여 pH를 조정한 다음 교반하면서 반응시킴으로써 상기 조 나프탈렌 디카르복실산을 결정화하는 단계;
    (c) 상기 결정화된 조 나프탈렌 디카르복실산을 세척하여 그에 포함된 불순물들을 제거하는 단계로서, 상기 단계는 결정화된 조 나프탈렌 디메틸카르복실산을 물에 분산시킨 후 압력 1 내지 60 kg/cm2, 온도 120 내지 270℃에서 10분 내지 2시간 동안 교반한 다음 여과하여 물을 제거하는 과정을 여러 번 반복함으로써 수행하는 단계; 및
    (d) 상기 세척물을 건조하여 순수한 결정 상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산을 수득하는 단계를 포함하는 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산(crude Naphthalene dicarboxylic acid)의 정제방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계는
    1) 상기 재조합 미생물을 액체배지에 접종하여 진탕배양한 후 원심분리를 통해 회수한 균체를 완충용액 또는 생리식염수로 현탁하고 초음파로 파괴한 뒤 다시 원심분리하여 얻은 상등액을 분리 정제하여 상기 효소를 수득하는 단계;
    2) 기질인 조 나프탈렌 디카르복실산을 완충용액과 혼합한 다음 여기에 알칼리 용액을 첨가하여 혼합액의 pH를 조절하여 정제반응액을 만드는 단계; 및
    3) 상기 1) 과정에서 수득한 효소와 상기 2) 과정에서 준비한 반응액을 반응시켜 2-포밀-6-나프토산을 2,6-나프탈렌 디카르복실산으로 전환함으로써 2,6-나프탈렌 디카르복실산(2,6-Naphthalene dicarboxylic acid)의 순도를 높이는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 효소 를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 알데히드 디히드로게나제는 알데히드 디히드로게나제 유전자 aldX 또는 aldY에 히스티딘 태그를 붙여 제작한 리버스 프라이머(reverse primer)를 이용하여 수득한 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 효소의 상등액으로부터의 분리 정제는 이온교환수지 또는 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 완충용액은 물, 탄산나트륨 완충용액, 글리신 완충용액, 인산칼륨 완충용액, 인산나트륨 완충용액, 숙신산 완충용액, 아세트산나트륨 완충용액, 시트르산 완충용액, 피로인산나트륨 완충용액, 붕산 완충용액 및 붕산나트륨 완충용액으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 그 농도는 0.01 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 알칼리 용액은 NaOH 용액 또는 KOH 용액인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 2) 단계의 혼합액은 유기용매를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 유기용매는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide), 디메틸포름아미드(N,N-Dimethylformamide), 디메틸아세트아미드(N,N-Dimethylacetamide) 및 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이고, 그 첨가농도는 0.01 내지 20중량%인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 3) 단계에서 반응온도는 25 내지 60℃이고, 반응시간은 1분 내지 1시간인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 반응액 내의 조 나프탈렌 디카르복실산의 농도는 0.001 내지 20중량%인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 산성용액은 황산, 염산, 빙초산 및 질산으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 pH는 1 내지 3의 범위로 조정하는 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 반응 온도는 5 내지 130℃ 범위이고, 반응 시간은 1분 내지 10시간 범위인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 교반속도는 0 rpm 초과 1000 rpm 이하의 범위인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  16. 삭제
  17. 제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 건조 온도는 30 내지 200℃ 범위인 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 (a) 단계와 (b) 단계 사이에 상기 (a) 단계에서 사용한 불활성된 효소를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 불활성된 효소의 제거는 마이크로필터 시스템, 연속원심분리기 및 디칸터(decanter)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 마이크로필터 시스템은 0.01 내지 0.30㎛의 포어 크기(pore size)를 가지며, 세라믹, 스테인레스, 폴리프로필렌 및 PET로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 재질로 된 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 효소를 이용한 조 나프탈렌 디카르복실산의 정제방법.
  21. 삭제
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KR1020060113842A KR100850164B1 (ko) 2006-11-17 2006-11-17 바실러스 섭틸리스 유래의 효소를 이용한 조 나프탈렌디카르복실산의 정제방법 및 상기 방법에 의해 수득된 결정상태의 2,6-나프탈렌 디카르복실산

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050078684A (ko) * 2004-01-31 2005-08-08 주식회사 효성 슬러리로부터 2,6-나프탈렌디카르복실산의 여과 및 세정공정
KR20060078799A (ko) * 2004-12-31 2006-07-05 주식회사 효성 크산틴 디하이드로게나제를 발현하는 형질전환체의제조방법 및 이를 이용한 2,6-나프탈렌 디카르복실산의정제방법

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