KR100840686B1 - 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를유효성분으로 함유하는 ｂａｆｆ 매개성 질환의 예방 및치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체는 BAFF(B cell activating factor)와 BAFF 수용체 간의 결합 및 역할을 저해함으로써, BAFF와 BAFF 수용체와의 결합에 의한 B 임파구의 생존 유지효과를 저해하는 작용을 나타내므로, 본 발명의 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 BAFF 매개성 질환인 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 건선, 염증성 장질환 등의 자가면역질환 및 알러지성 비염과 천식의 치료제 등으로 사용될 수 있다.

[화학식 1]

(상기 식에서, A, R¹ 및 R²는 명세서에 정의한 바와 같음).

카보닐구아니딘 유도체, BAFF 수용체, BAFF 매개성 질환

Description

헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 ＢＡＦＦ 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of the BAFF mediate diseases containing carbonylguanidine derivatives including heterocycles as an active ingredient}

도 1은 본 발명의 유도체 화합물을 5 μM 및 50 μM의 농도로 처리시에 WIL2-NS 세포의 생존율을 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명의 유도체 화합물을 세포독성이 없는 적합한 농도로 처리시에 WIL2-NS 세포의 생존율을 나타낸 그래프이고,

도 3은 BAFF-R 및 TACI를 발현시킨 WIL2-NS 세포에서 발현된 각 수용체에 대한 세포수 대 형광강도를 나타낸 그래프이고,

도 4는 BAFF를 WIL2-NS 세포표면에 결합시키고 형광현미경(Fluorescence microscopy)법으로 확인한 형광 사진이고,

도 5는 BAFF와 BAFF 수용체를 반응시킬 때 본 발명의 유도체를 30분간 처리하여 BAFF 수용체에 대한 세포수 대 형광강도를 나타낸 그래프이고,

도 6은 본 발명의 유도체를 BAFF 보다 먼저 첨가하여 배양한 후 BAFF 수용체에 대한 세포수 대 형광강도를 나타낸 그래프이고,

도 7은 BAFF와 본 발명의 유도체를 먼저 반응시키고, 세포와 배양하여 BAFF 수용체에 대한 세포수 대 형광강도를 나타낸 그래프이며,

도 8은 본 발명의 유도체에 따른 B 임파구 세포사멸 증가율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 BAFF (B cell activating factor) 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

최근 면역계에 대한 이해가 높아짐에 따라, 난치성 질환인 만성 자가면역질환 및 염증성 질환에 대한 새로운 치료법 연구가 다양하게 진행되고 있다. 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE) 등의 자가면역질환에 대한 병리 연구는 T 세포를 중심으로 이루어져 왔으나, 실험동물모델 연구 결과로부터 B 세포 및 항체의 중요성이 부각되고 있다(Sutherland, A.P.R. et. al., Pharmacol. & Ther., 112, 774-786, 2006). B 세포는 병원성 자가항체의 생성, Fc 수용체, 사이토카인 및 키모카인의 발현, T 임파구 활성화, 항원표현(antigen presentation) 기능 등을 통해 인체 자가면역질환의 발병 및 진행에 중요한 역할을 한다(Cope, A. P. and Feldmannn M., Curr. opin. in Immunol., 16, 780-786, 2004). 1997년, 비호지킨 림프종 치료제로서 CD20에 대한 항체인 제넨텍(Genentech)사의 리툭시맵(rituximab)이 치료용 단일클론 항체로는 처음으로 미국 식약청의 승인을 얻은 이래, B 임파구를 고갈시키는 면역질환 치료제에 대한 관심이 증폭되었다(Reff, M.E. et. al., Blood, 83, 435-445, 1994). B 임파구 고갈과 관련된 표적으로는 CD20 이외에 CD22, CD40, B7, BAFF(B cell activating factor) 등이 있다.

BAFF는 1990년대 말 여러 연구팀에 의해 발견된 TNF족 리간드(tumor necrosis factor superfamily ligand)이며, BLys(B 림프구 유사체), THANK(세포사멸을 활성화 시키는 TNF 동족인자), TALL-1(TNF와 ApoL 연관성 백혈구 발현 리간드-1), zTNF40 등으로도 명명된다(Mackay, F. Browning, J.L, Nat . Rev . Immunol ., 2, 465-475, 2002). II형 세포막 결합 단백질인 BAFF는 삼중체(trimer)로 존재하며, 인터페론 감마와 같은 외부자극에 의하여 활성화된 퓨린 컨버터아제(furin convertase)에 의해 수용성 형태(soluble form)로 세포막으로부터 유리될 수 있다(Litinskiy, M.B. et. al., Nat. Immunol., 3, 822-9, 2002).

BAFF는 3 종류의 TNF족 수용체와 작용하는 것으로 알려져 있다: 1) TACI(transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophine ligand interactor 전이막 활성제와 CAML-상호인자), 2) BCMA(B cell maturation antigen, B 세포 화농 항원), 3) BAFF-R(BAFF receptor)이 있으며, 모두 기본적으로 B 세포에 의해 발현된다(Yan, M. et. al., Curr. Biol., 11, 1547-1552 2001; Mak, T.W., Yeh, W.C., Arthritis Res. 4, Suppl., 3, S243-252, 2002). BAFF는 BAFF-R의 유일한 내인성 리간드이며, APRIL(a proliferation-inducing ligand)은 TACI 및 BCMA의 또다른 내인성 리간드이다(Mackay, F. et . al., Annu . Rev . Immunol ., 21, 231-264, 2003).

BAFF는 B 세포의 생존과 성숙을 조절하며, 항체 형성 및 클라스 전환(class switching) 재조합 등 면역활동에 주요한 역할을 한다(Schiemann, B. et. al., Science, 293, 2111-2114, 2001; Zouali, M., Mol . Immunol ., 38, 895-901, 2002). Bcl-2의 상향조절(upregulation) 또는 Blk의 하향조절(negative regulation)로 B 세포의 생존을 촉진하며, 또한 CD21과 CD19의 발현 및 인산화에 대한 작용을 통해 B 세포 수용체의 신호전달 역치(threshold)에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. BAFF는 특히 미성숙 과도기 2 형(T2) B 세포의 생존을 증진시키며, BCR 자극과 함께 T2 B 세포가 성숙 B 세포로의 분화를 촉진한다. T 세포에도 BAFF 수용체가 존재하며, BAFF는 분열촉진 자극에 의해 T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 증진시킨다. BAFF 형질전환(transgenic) 마우스는 말초 B 세포의 증가에 따라 비장 및 림프절의 비대가 관찰되고, 주령이 증가되면서 신부전에 의한 단백뇨 및 중증의 신장염등 사람의 전신성 홍반성 낭창을 반영하는 증상을 나타냈다(Mackay, F. et. al., J. Exp. Med., 190, 1697-1710, 1999). 또한 류머티즘 관절 환자에서도 혈중 BAFF 단백질의 농도가 증가된 보고가 있다(Mackay, F. et. al., Curr. Dir. Autoimmun., 8, 243-265). BAFF의 과다 생성이 자가면역질환의 원인인지 결과인지는 명확하지 않지만, B 세포 또는 T 세포 활성의 비정상적 자극을 통해 질환을 악화시킨다. 따 라서 BAFF의 역할을 차단하여 B 세포를 고갈시킴으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 치료하고자 하는 시도가 생명공학 및 제약회사에서 진행되고 있다. 항-BAFF 단일클론 항체인 벨리무맵(belimumab; Lymphostat-B, Human Genome Sciences/Glaxo Smithline)은 전신선 홍반성 난창에 대해 임상 3 상, 류마티스 관절염에 대해 임상 2 상 연구 중에 있으며(Baker, K.P. et. al., Arthritis Rheum., 48, 3253-3265, 2003), TACI-Ig(Gross, J.A. et. al., immunity, 15, 289-302, 2001) 및 BAFF-R-Ig(Pelletier, M. et. al., J. Biol. Chem., 278, 33127-33133, 2003) 융합 단백질이 현재 전임상 연구 중에 있다.

BAFF에 대한 인간 단일클론 항체인 벨리무맵이 효과적이라는 예비 데이타에도 불구하고 임상 2 상 시험에서의 결과는 만족스럽지 못하였다. 아마도 그 원인은 리툭시맵과 같이 약동력학적인 문제 때문인 것으로 사료된다(Watier, H., Expert. Opin . Biol . Ther ., 5, S29-36, 2005). 리툭시맵의 단독투여효과는 환자에 따라 차이가 많이 나는데, 약효는 유효 혈중농도의 유지에 의존한다. 단백질 약물에 비하여 저분자 유기화합물은 혈중농도를 유지하기에 유리하다고 여기는 것이 일반적이며, 경구투여가 가능하여 복용의 편리성이 있다.

이에 본 발명자들은 BAFF를 조절하는 저분자 유기화합물을 연구하던 중 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체가 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합을 길항하여 B cell을 고갈시키는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 BAFF 및 BAFF 수용체 간의 결합을 길항하는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를 유효성분으로 함유하는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 식에서, A는 5원의 헤테로고리로, R³로 치환된 퓨란(

) 또는 옥사졸(

)이고,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 원자, C₁~C₄ 직쇄 또는 측쇄의 알콕시기이고,

R³은 수소, 아미노기 또는 C₁~C₄의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.

바람직하게는,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, F, Cl 또는 메톡시기이고,

R³은 아미노기 또는 메틸기이다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체의 바람직한 화합물은 하기와 같다.

1) (3-아미노-5-(3-플루오로페닐)퓨란-2-일카보닐)구아니딘;

2) (3-아미노-5-(2-메톡시-5-클로로페닐)퓨란-2-일카보닐)구아니딘; 및

3) (5-메틸-2-(3-클로로페닐)옥사졸-4-일카르보닐)구아니딘.

본 발명의 따른 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 상기 염으 로는 약학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카복실산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등을 사용할 수 있고, 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 등의 할로겐산 또는 인산 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체는 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

상기 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체는 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이, 간단한 합성과정을 거쳐 합성될 수 있다. 이를 개략적으로 살펴보면 다음과 같다.

(상기 반응식 1에서,

R¹, R² 및 R³은 화학식 1에서 정의한 바와 같고, L은 이탈기이다.)

이탈기(leaving group, L)를 갖는 화학식 2의 카복시산 유도체를 구아니딘(3)과 반응시켜 화학식 1의 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체를 얻을 수 있다. 상기 카복시산 유도체(2)는 구아니딘에 의해 쉽게 이탈될 수 있는 이탈기(L)를 가지고 있기 때문에, 구아니딘과의 반응시 용이하게 치환될 수 있다. 이러한 이탈기로는 할로겐 원소, 히드록시, 알콕시, 메실(mesylate)기, 토실(tosylate)기 등이 있다. 본 명세서에서 상기 이탈기란 상대적으로 안정된 약염기성 분자나 이온을 의미하며, 안정할수록 더 잘 이탈된다.

이때, 염기존재 시에는 카복시산에 대하여 동당량의 구아니딘을 사용하여 반응시키고 염기를 사용하지 않을 경우 정량 또는 과량의 구아니딘을 사용하여 반응시킬 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 BAFF 매개성 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하 이를 구체적으로 설명한다.

BAFF는 B 세포의 생존과 성숙을 조절하며, 항체 형성 및 클라스 전환 재조합 등 면역활동에 주요한 역할을 한다(Schiemann, B. et. al., Science, 293, 2111-2114, 2001; Zouali, M., Mol . Immunol ., 38, 895-901, 2002). Bcl-2의 상향조절 또는 Blk의 하향조절로 B 세포의 생존을 촉진하며, 또한 CD21과 CD19의 발현 및 인산화에 대한 작용을 통해 B 세포 수용체의 신호전달 역치에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. BAFF는 특히 미성숙 과도기 2 형(T2) B 세포의 생존을 증진시키며, BCR 자극과 함께 T2 B 세포가 성숙 B 세포로의 분화를 촉진한다. T 세포에도 BAFF 수용체가 존재하며, BAFF는 분열촉진 자극에 의해 T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 증진시킨다. BAFF 형질전환 마우스는 말초 B 세포의 증가에 따라 비장 및 림프절의 비대가 관찰되고, 주령이 증가되면서 신부전에 의한 단백뇨 및 중증의 신장염등 사람의 전신성 홍반성 낭창을 반영하는 증상을 나타냈다(Mackay, F. et. al., J. Exp. Med., 190, 1697-1710, 1999). 또한 류머티즘 관절 환자에서도 혈중 BAFF 단백질의 농도가 증가된 보고가 있다(Mackay, F. et. al., Curr. Dir. Autoimmun., 8, 243-265). BAFF의 과다 생성이 자가면역질환의 원인인지 결과인지는 명확하지 않지만, B 세포 또는 T 세포 활성의 비정상적 자극을 통해 질환을 악화시킨다. 따라서 BAFF의 역할을 차단하여 B 세포를 고갈시킴으로써 류마티스 관절염 등의 자가면역질환을 치료하고자 하는 시도가 생명공학 및 제약회사에서 진행되고 있다. 항-BAFF 단일클론 항체인 벨리무맵(belimumab; Lymphostat-B, Human Genome Sciences/Glaxo Smithline)은 전신선 홍반성 난창에 대해 임상 3 상, 류마티스 관절염에 대해 임상 2 상 연구 중에 있으며(Baker, K.P. et. al., Arthritis Rheum., 48, 3253-3265, 2003), TACI-Ig(Gross, J.A. et. al., immunity, 15, 289-302, 2001) 및 BAFF-R-Ig(Pelletier, M. et. al., J. Biol. Chem., 278, 33127-33133, 2003) 융합 단백질이 현재 전임상 연구 중에 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 BAFF의 수용체를 길항하는 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체가 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합을 길항하여 B 세포를 고갈시키는지를 알아보기 위해 수행한 실험에서, 본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체가 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합을 저해하는 효과를 나타내었는데, 이는 본 발명의 유도체가 BAFF의 수용체에 결합하여 BAFF의 결합을 저해하기 때문으로 확인되었다.

또한, 본 발명의 유도체의 B 임파구 사멸에 대한 효과를 확인하기 위한 실험에서, 본 발명의 유도체들이 B 임파구의 생존 유지효과를 저해하는 것으로 나타났는데, 이는 BAFF 수용체에 대한 BAFF의 역할이 길항되었음을 나타내는 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 BAFF 및 BAFF 수용체 간의 결합을 저해하고, B 임파구의 생존 유지효과를 저해하므로, BAFF 수용체 길항제로 이용될 수 있다. 그 결과, 본 발명의 약학적 조성물은 BAFF 수용체를 길항함으로써, 류마티스 관절염, 전신성 혼반성 낭창, 건선, 염증성 장질환 등을 포함하는 자가면역질환, 알러지성 비염 또는 천식 등과 같은 BAFF 매개성 질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 점막 투여, 정맥 투여, 근육 주사를 포함하는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비 수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제 등이 포함된다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트 등과 같이 주사투여가 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 목적하는 용도에 대하여 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 몸무게가 79 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 투여량은 0.1~1000 ㎎/일이고, 바람직하게는 1~500 ㎎/일이다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있고, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1 회 내지 수회로 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것인 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

MTT 분석( assay )을 이용한 세포독성 측정

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카르보닐구아니딘 유도체들이 WIL2-NS 세포(인간 B 림프구 세포주)에서 BAFF 결합을 길항하여 B 세포를 고갈시키는 효과를 측정하기 위한 화합물 농도를 결정하기 위해 세포독성을 하기와 같이 측정하였다. 96-웰 플레이트에 2 × 10⁴ WIL2-NS 세포를 분주하였으며, 화합물을 5 μM과 50 μM로 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 대조군은 화합물을 첨가하지 않고 다른 조작은 화합물 처리군과 동일하게 실시하였다. 25 ㎍/㎖의 2-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 가하여 2~3시간 동안 배양하고, 원심분리한 후 상층액은 버리고 남겨진 침전물에 디메틸설폭시드(DMSO)를 가하여 침전물이 완전히 용해된 후 흡광도를 측정하였다. 주어진 농도에서 세포독성은 대조군의 흡광도에 대한 본 발명의 화합물 처리군의 흡광도 백분율로 나타내었다. 그 측정결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이 화합물 1 및 3은 5 μM의 농도에서 각각 대조군과 비교하여 93%, 99%의 생존율을 나타내어 세포독성이 없었으므로 5 μM의 농도를 사용하기로 결정하였으며, 화합물 2는 5 μM에서 세포독성을 나타냈으므로 0.5 μM 농도로 사용하였기로 하였다.

또한, WIL2-NS에 무해한 농도인 화합물 1 및 3은 5 μM, 화합물 2는 0.5 μM를 사용하여 B 임파구에 대한 독성을 측정한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 세포독성 없이 무해한 것으로 나타났다.

<실시예 1> BAFF 수용체 길항효과 측정

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카르보닐구아니딘 유도체들이 WIL2-NS 세포에서 BAFF 결합을 길항하여 B 세포를 고갈시키는 효과를 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1-1. 세포배양

인간 B 임파구 세포주인 WIL2-NS(ATCC CRL8155)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, GIBCO), 2 mM의 L-글루타민, 100 Units/㎖의 페니실린 및 100 Units/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 DME 배지(Dulbecco's modified eagle's medium)에서 배양하였다. 도 3(a)에 나타난 바와 같이 B 세포 마커인 형광 표지 CD19 항체를 사용한 세포군은 CD19 항체를 사용하지 않은 대조군과 비교하여 세포수 대 형광강도로 나타낸 그래프에서 형광강도가 95% 이상 분리되었으므로 WIL2-NS가 B 세포주임을 알 수 있다. 또한, 도 3 (b)에 나타난 바와 같이 형광강도가 WIL2-NS는 BAFF 수용체(BAFF-R)를 고준위로 발현하고 있으며, TACI는 아주 낮은 준위로 발현되고 있음을 알 수 있다. 평균 형광강도(mean fluorescence intensity, MFI- 히스토그램사)는 BAFF-R과 TACI에 대한 항체를 처리하지 않은 대조군이 1.9 정도되며, TACI 항체 처리군은 약 3.0 정도, BAFF-R 항체 처리군은 약 30 정도였다. 또한 가로축의 형광강도 10 이하는 형광염색을 하지 않은 세포들이 나타나도록 조정하였는데 대조세포는 형광강도 10 이하에 다 들어와 있고, TACI 항체 처리 세포는 일부(5% 이하)가 10 이상이며, BAFF-R 항체 처리 세포는 100%가 10 이상에 있음을 알 수 있다.

2-2. 형광염색

BAFF가 WIL2-NS 세포에 잘 결합하는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험 을 수행하였다. WIL2-NS 세포표면에 WIL2-NS 세포를 원심분리하여 모은 후 1.0 × 10⁶ 세포를 BAFF 수용체에 결합하는 BAFF 단백질인 BAFF(trn)(human)-muCD8-비오틴(Ancell, San Diego, CA)과 함께 2% FBS(GIBCO)을 포함한 HBSS(Hank's balanced salt solution) 배지에서 반응시켰다. 이때, 대조군은 BAFF를 처리하지 않았으며, 양성 대조군은 BAFF와 함께 TACI:Fc(ALEXIS, San Diego, CA)를 첨가하여 반응시켰다. 45분간 얼음에서 반응시킨 후 2% FBS를 포함한 HBSS 배지를 이용하여 수세하였다. 스트렙타비딘-피코에리트린(Streptavidin-phycoerythrin, PE)을 가하여 30분간 얼음에서 배양하였다. 핵염색 시약인 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 10분간 핵을 염색한 후, 수용성 마운팅액(DAKO)을 이용하여 슬라이드 글라스에 세포를 부착시켰다. 형광현미경(Fluorescence microscopy)을 이용하여 세포에 결합한 BAFF를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 도 4(a)는 BAFF가 없는 대조군으로, 이와 비교하여 도 4(b)는 붉은 색의 형광을 띠는 것으로 보아 BAFF가 WIL2-NS 세포표면에 잘 결합하였음을 확인할 수 있었으며, 양성 대조군(도 4(c))으로 쓰인 TACI:Fc는 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합을 저해하는 것으로 나타났다.

2-3. 본 발명의 유도체의 BAFF 와 BAFF 수용체 간의 결합에 대한 길항효과

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카르보닐구아니딘 유도체의 WIL2-NS 세포에서 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합에 대한 길항효과를 알아보기 위하여 하기와 같 이 형광계수기(FACS analysis)를 활용하여 형광세포 분석(Fluorescent cytometry)을 수행하였다.

WIL2-NS 세포를 원심분리하여 모은 후, 1.0 × 10⁶ 세포를 BAFF 수용체에 결합하는 BAFF 단백질인 BAFF(trn)(human)-muCD8-비오틴(Ancell, San Diego, CA)과 함께 2% FBS를 포함한 HBSS 배지에서 반응시켰다. 이때, 본 발명의 화합물 또는 양성대조군인 TACI:Fc(ALEXIS, San Diego, CA)를 각각 첨가하여 반응시켰다. 실험예 1에서 확인한 세포독성에 따라, 화합물 1 및 3은 5 μM의 농도, 화합물 2는 0.5 μM의 농도로 사용하였다. 45분간 얼음에서 반응시킨 후 2% FBS를 포함한 HBSS 배지를 이용하여 수세하였다. 스트렙타비딘-피코에리트린(Streptavidin-phycoerythrin, PE)을 가하여 30분간 얼음에서 배양하였다. 2% FBS를 포함한 HBSS 배지를 이용하여 수세 후, 유식세포분석기(flow cytometer, Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였다. 그 분석 결과, 세포수 대 형광강도를 측정하여 도 5 내지 7에 나타내었다.

(1) 본 발명의 화합물과 BAFF 를 함께 첨가하여 배양한 실험 결과

BAFF와 BAFF 수용체를 반응시킬 때 본 발명의 화합물을 30분간 처리하였다. 대조군은 화합물을 첨가하지 않고 다른 조작은 화합물 첨가군과 동일하게 실시하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, BAFF가 BAFF 수용체에 결합할 경우 형광을 보이는 세포의 비율이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 본 발명의 화합물이 첨가된 경우, 형광강도가 감소함을 알 수 있는데, 이는 본 발명의 화합물이 BAFF의 BAFF 수용체에 대한 결합을 저해함을 의미한다.

(2) 화합물을 BAFF 보다 먼저 첨가하여 배양한 후 BAFF 를 첨가한 실험 결과

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카르보닐구아니딘 유도체가 세포의 BAFF 수용체와 결합하여 BAFF의 결합을 저해하였거나 BAFF 수용체의 발현이 저해되어 BAFF와의 결합이 저해되었는지 확인하기 위하여 세포를 화합물과 먼저 배양한 후, BAFF 단백질을 첨가하여 BAFF 수용체와의 결합을 분석하였으며 그 결과는 도 6에 나타내었다. 이때, 대조군은 화합물을 첨가하지 않고 다른 조작은 화합물 처리군과 동일하게 실시하였으며, 양성 대조군은 화합물 대신 TACI:Fc를 첨가하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, BAFF가 BAFF 수용체에 결합할 경우 형광을 보이는 세포의 비율이 증가하였으며, 양성 대조군인 TACI:Fc에 의하여 저해되는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 화합물 1, 2 및 3이 BAFF 수용체와 결합하여 BAFF의 결합을 저해하였거나 BAFF 수용체의 발현이 저해되어 BAFF와의 결합이 저해된 것으로 나타났다.

(3) BAFF 와 화합물을 먼저 반응시키고, 세포와 배양한 결과

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카르보닐구아니딘 유도체가 BAFF와 결합함으로써, BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합이 저해되었는지 확인하고자, BAFF와 화합물 을 먼저 배양한 후 세포를 각 실험그룹에 첨가하여, 배양하였다. 그 분석 결과는 도 7에 나타내었다. 대조군은 화합물을 처리하지 않고 다른 조작은 화합물 처리군과 동일하게 실시하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, BAFF와 화합물을 먼저 반응시키고, 세포와 배양한 경우에도 화합물 1, 2 및 3에 의해 세포의 형광강도가 감소되는데, 이는 본 발명의 화합물이 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합을 저해하는 것을 의미한다.

<실시예 2> B 임파구 사멸에 대한 효과 측정

본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카르보닐구아니딘 유도체의 B 임파구 사멸에 대한 효과를 측정하기 위하여 형광 계수기를 활용하여(FACS analysis) 하기와 같은 실험을 수행하였다.

WIL2-NS(1.0 × 10⁶) 세포를 24-웰 플레이트에 분주한 후 BAFF가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 각각 화합물과 함께 4일 동안 배양하였다. 이때, 대조군은 화합물을 처리하지 않고 다른 조작은 화합물 처리군과 동일하게 실시하였다. 40% 에탄올을 가하여 세포를 얼음에서 30분간 고정하였다. 인산 완충액으로 수세한 후 프로포듐 요오드(50 ㎎/㎖)와 RNase(25 ㎎/㎖)을 가하여 30분간 37 ℃에서 배양한 후 유식세포분석기를 이용하여 분석하였다. 세포주기의 Go/G1 피크 앞쪽에 있는 세포그룹을 사멸된 세포로 분석하였다. 그 분석 결과는 도 8에 나타내었으며 도 8(a)는 BAFF가 존재하지 않는 조건, 도 8(b)는 BAFF가 존재하는 조건의 결과이 다.

BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합은 B 임파구의 생존을 유지하므로, 본 발명의 화합물이 이들의 결합을 저해할 경우 세포의 사멸이 증가할 것으로 사료된다. 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물들이 B 임파구의 세포사멸을 증가시켰는데, 특히 화합물 3은 BAFF 존재 하에서 세포사멸을 가장 많이 증가시켰다. 이는 화합물 3으로 인하여 BAFF 수용체에 대한 BAFF의 역할이 길항된 결과임을 알 수 있다.

<제제예 1> 정제(직접 가압)의 제조

본 발명의 유도체 화합물 5.0 ㎎

락토오스 14.1 ㎎

크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎

스테아린산 마그네슘 0.1 ㎎

본 발명의 유도체 화합물을 체로 친 후, 락토오스, 크로스포비돈 USNF 및 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

<제제예 2> 정제(습식 조립)의 제조

본 발명의 유도체 화합물 5.0 ㎎

락토오스 16.0 ㎎

녹말 4.0 ㎎

폴리솔베이트 80 0.3 ㎎

콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎

스테아린산 마그네슘 2.0 ㎎

증류수 적량

본 발명의 유도체 화합물을 체로 친 후, 락오토스와 녹말을 혼합하였다. 폴리솔베이트 80을 증류수에 용해시킨 후, 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 및 스테아린산 마그네슘과 혼합하였다. 그 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

<제제예 3> 산제의 제조

본 발명의 유도체 화합물 5.0 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎

스테아린산 마그네슘 0.2 ㎎

본 발명의 유도체 화합물을 체로 친 후에, 락토오스, 폴리비닐 피롤리돈 및 스테아린산 마그네슘과 함께 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

본 발명의 유도체 화합물 5.0 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎

스테아린산 마그네슘 0.2 ㎎

본 발명의 유도체 화합물을 체로 친 후에, 락토오스, 폴리비닐 피롤리돈 및 스테아린산 마그네슘과 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 타정하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 젤라틴 캡슐을 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

본 발명의 유도체 화합물 100 ㎎

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O 26 ㎎

증류수 2974 ㎎

본 발명의 유도체 화합물을 만니톨 및 Na₂HPO₄·12H₂O와 함께 증류수에 용해시키고 pH를 약 7.5로 조절하여 멸균시킨 다음, 통상의 방법에 따라 주사제를 제조하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체는 BAFF와 BAFF 수용체 간의 결합 및 역할을 저해함으로써, BAFF와 BAFF 수용체와의 결합에 의한 B 임파구의 생존 유지효과를 저해하는 작용을 나타내므로, 본 발명의 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 BAFF 매개성 질환인 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 건선, 염증성 장질환 등의 자가면역질환 및 알러지성 비염과 천식의 치료제 등으로 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 헤테로고리를 포함하는 카보닐구아니딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염, 전신성 혼반성 낭창, 건선 및 염증성 장질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역질환; 알러지성 비염; 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물:

   [화학식 1]

   

   (상기 식 중,

   A는 5원의 헤테로고리로서, R³로 치환된 퓨란(

   

   ) 또는 옥사졸(

   

   )이고,

   R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 원자, C₁~C₄ 직쇄 또는 측쇄의 알콕시기이고,

   R³는 수소, 아미노기 또는 C₁~C₄의 직쇄 또는 측쇄 알킬기임).
2. 제1항에 있어서, 상기 R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, F, Cl 또는 메톡시기이고, R³은 아미노기 또는 메틸기인 것을 특징을 하는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 카보닐구아니딘 유도체는

   1) (3-아미노-5-(3-플루오로페닐)퓨란-2-일카보닐)구아니딘;

   2) (3-아미노-5-(2-메톡시-5-클로로페닐)퓨란-2-일카보닐)구아니딘; 및

   3) (5-메틸-2-(3-클로로페닐)옥사졸-4-일카르보닐)구아니딘

   으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 BAFF 매개성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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