KR100825038B1 - Anti-oxidative and skin-aging protective functional food containing the extract of Cercis chinensis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항산화용 및 노화 억제용 기능성 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자원확보가 용이하고 기존에 항산화 활성 및 피부세포 노화 억제활성에 관한 보고가 없었던 박태기나무의 알코올 조추출물을 용매 분획한 후, 항산화 활성을 보이는 에틸아세테이트 분획과 부탄올 분획으로부터 분리한 항산화 활성, 노화 억제 활성을 갖는 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물을 포함하는 박태기나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 및 노화 억제용 기능성 식품에 관한 것이다. 박태기나무 추출물은 산화적 스트레스를 억제하는 기능이 우수할 뿐 만 아니라 노화와 관련된 텔로미어 길이의 단축 속도를 늦춤으로써 세포의 수명을 연장시킬 수 있으므로, 박태기나무 추출물을 포함하는 본 발명의 기능성 식품은 노화 및 활성 산소에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to functional foods for antioxidant and anti-aging, and more particularly, after solvent fractionation of crude alcohol extract of Park Ki-gi, which is easy to secure resources and has not been previously reported on antioxidant activity and anti-aging activity of skin cells. Antioxidant and Anti-aging Functionality Including Antioxidant Activity, Isolated from Ethyl Acetate Fraction and Butanol Fraction Exhibiting Antioxidant Activity, and Extracted from Strawberries Containing Compounds of Formula 1 to Formula 20 Having Aging Inhibitory Activity as Active Ingredients It is about food. The extract of Park Tae-gi is not only excellent in inhibiting oxidative stress, but also extends the lifespan of cells by slowing the shortening of the telomeres associated with aging. And the preparation of functional foods for preventing or treating diseases caused by free radicals.
Description
도 1은 박태기나무로부터 에탄올 조추출물을 얻고, 이를 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 추출하는 과정을 나타낸 모식도이다. Figure 1 is a schematic diagram showing a process of extracting the crude ethanol extract from Park Tae-gi, hexane, ethyl acetate, butanol in order.
도 2는 박태기나무로부터 에탄올 0%부터 순차적으로 10%씩 늘여 100% 농도까지 추출한 에탄올 조추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 그래프이다. Figure 2 is a graph measuring the DPPH radical scavenging activity of ethanol crude extract extracted from 0% ethanol from 10% ethanol from 100% to 100% concentration.
도 3은 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획 및 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 그래프이다. 3 is a graph measuring DPPH radical scavenging activity of hexane, ethyl acetate, butanol, water fraction and ethanol extract.
도 4는 에틸아세테이트 분획으로부터 항산화 활성을 나타내는 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다. Figure 4 is a schematic diagram showing the process of separating the compound showing the antioxidant activity from the ethyl acetate fraction.
도 5는 부탄올 분획으로부터 항산화 활성을 나타내는 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다. 5 is a schematic diagram illustrating a process of separating a compound exhibiting antioxidant activity from a butanol fraction.
도 6a는 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 화합물의 UV 조사에 대한 세포 보호 효과를 나타낸 DNA 손상 정도를 보여주는 세포 사진이다. Figure 6a is a cell photograph showing the degree of DNA damage showing the cell protective effect on UV irradiation of the extract of Park Tae Ki and compounds isolated therefrom.
도 6b는 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 화합물의 UV 조사 에 대한 세포 보호 효과를 나타낸 DNA 손상 정도를 보여주는 형광 세기를 나타내는 그래프이다. Figure 6b is a graph showing the fluorescence intensity showing the degree of DNA damage showing the cytoprotective effect on UV irradiation of the extract of Park Tae Ki and compounds of the present invention.
도 7은 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 UV 조사에 대해 보호효과를 나타내는지 확인한 무모쥐의 피부손상 사진이다. 7 is It is a photograph of skin damage of hairless rats, which confirmed that the extract of Park Tae Ki of the present invention and the compound isolated therefrom show a protective effect against UV irradiation.
도 8은 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 세포수명을 연장시키는 것을 나타낸 그래프이다. 8 is This is a graph showing that the extract of Park Tae-gi and the compounds isolated therefrom prolong cell life.
도 9은 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 텔로미어 길이 연장 작용을 하는 것을 나타낸 텔로미어 길이의 서던블롯 사진이다. 9 is It is a photograph of the southern blot of the telomeres length showing that the extract of the extract of the present invention and the compound separated therefrom have a telomere length extension action.
도 10은 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 텔로미어 길이 연장 작용을 하는 것을 나타낸 텔로미어 단축 속도 그래프이다. 10 is It is a telomeres shortening rate graph showing that the extract of the extract of the present invention and the compound separated therefrom have a telomere length extension action.
도 11은 박태기나무의 꽃, 잎, 줄기 및 열매를 나타낸 사진이다. 11 is a photograph showing flowers, leaves, stems, and fruit of Park Tae-gi.
본 발명은 항산화 활성 및 노화 억제 활성을 갖는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 노화 억제용 기능성 식품에 관한 것이다.The present invention relates to an antioxidant and anti-aging functional food comprising a plant extract having antioxidant and anti-aging activity as an active ingredient.
노화란 시간이 지남에 따라 일어나는 신체의 모든 생리적 변화를 통칭하는 것으로 개체에 따라 수많은 요인에 의해 매우 다양하게 일어나는 생명 현상이다. 노화는 개체마다 그 양상과 속도가 다르고, 한 개체 내에서도 각 조직마다 그 양상이 다르므로 노화를 개체 수준에서 연구하는 것은 많은 어려움이 있다. 한편, 노화 현상을 구체적으로 살펴보면 각 구성 기관 및 조직의 기능 변화가 일어나는 것으로, 이는 구성단위인 세포들의 기능 변화에 기인한다. 즉, 뇌의 신경세포 소실로 인해 인지기능이 저하된다든지, 피하 지방 세포의 소실로 피부의 탄력이 감소한다든지, 모근 멜라닌 세포가 멜라닌 색소 생성 능력을 소실함으로써 머리가 희어지는 등, 개체의 노화는 결국 그 개체를 구성하는 세포들의 노화에 기인한다. 그러므로 최근에는 노화의 연구도 세포수준에서 많이 이루어지고 있다. 지난 수십년 동안 수많은 과학자들이 세포의 노화에 관하여 연구해 왔지만, 노화의 다양한 현상과 복합적인 특징으로 인해 아직 정확한 기전은 규명되지 못하고 있다. 다만, 수많은 현상학적 연구를 통해 노화에 관한 여러 가지 가설이 제기되었는데, 이 중 정상적인 대사과정에서 발생하는 활성산소에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)가 축적되어 노화의 원인이 된다는 노화의 활성산소설과 염색체 말단부분에 있는 텔로미어(telomere)가 세포분열을 거듭함에 따라 점차 소실되어 세포분열이 정지되고 결국 사멸에 이른다는 노화의 텔로미어설이 중요하게 받아들여지고 있다. 이외에도 여러 가지 가설이 있지만 이러한 가설은 서로 상반된 것이 아니라 서로 보완적으로 노화를 설명하고 있다. 노화의 활성산소설이란, 정상적인 대사과정에서 부수적으로 생성되는 활성산소들은 반응성이 강해 세포 구성성분인 지질, 단백질, 당, 또는 DNA 등을 비선택적, 비가역적으로 파괴하여 세포나 조직의 산화적 스트레스를 유발시킴으로써, 암을 비롯하여 뇌졸중 및 죽상 동맥경화와 같은 심혈관 계 질환, 류마티스 같은 만성염증 질환, 호흡기 질환 또는 자가면역질환 등 각종 질병을 유발할 뿐만 아니라(Halliwell, B and Gutteridge, J.M.C, Biochem. J., 1984, 219, 1-14; Freeman, B. A. and Grapo, J. D., Lab Invest, 1982, 47, 412-426; Ames, B. N., Science, 1983, 221, 1256-1264; Fridovich, I., Arch. Biochem. Biophys., 1986, 247, 1-11; Vishwanath, M. S., Nutrition in Clinical Practice, 1995, 10, 19-25), 이러한 산화적 손상들이 오랜 시간 축적되어 노화와 죽음에 이르게 된다는 것이다. 이러한 노화의 활성 산소설은 1956년 하르만(Harman)에 의하여 처음 제안되었고(Harman, D., Free radical theory of aging, Alan R Liss, New York, 1986, 3-49), 이후 여러 실험결과들이 상기 가설을 뒷받침 해주고 있다. 실험조건을 달리해 식이를 제한하거나 운동량을 감소시키는 등 기초대사율, 즉, 산소소비량을 감소시킴으로서 수명이 연장되는 것이 관찰되었다(Medvedev, Z. A., Biol. Rev., 1990, 65, 375-398; Loe, J., Northrop, J.H., J. Biol. Chem., 1971, 32, 103-121; Sohal, R. S., Insect aging, Springer-Verlag, Heidelberg, 1986, 23-44; Sohal, R. S., Aging, 1982, 5, 21-24).Aging refers to all the physiological changes in the body that occur over time, and is a life phenomenon that is caused by a variety of factors depending on the individual. Aging differs in its aspect and speed from individual to individual, and even in an individual, its pattern is different, and thus, aging at the individual level has many difficulties. On the other hand, if you look specifically at the aging phenomenon, changes in the function of each component organ and tissue occurs, which is due to the change in the function of the cells as a structural unit. In other words, the aging of the individual may be caused by the loss of nerve cells in the brain, the loss of cognitive function, the loss of elasticity of the skin due to the loss of subcutaneous fat cells, or the whitening of hair root melanocytes due to loss of melanin pigment production. This is due to the aging of the cells that make up the individual. Therefore, in recent years, many studies of aging have been made at the cellular level. Numerous scientists have studied cell aging over the last few decades, but the exact mechanisms are still unknown due to the various phenomena and complexities of aging. However, numerous phenomenological studies have raised various hypotheses about aging, among which oxidative stress caused by free radicals generated during normal metabolic processes accumulates and causes aging. The telomeres of aging that the telomere at the end of the chromosome end up dividing and gradually cease to cease cell division and eventually die. There are many other hypotheses, but these hypotheses do not contradict each other but complement each other and explain aging. Active oxygen theory of aging means that reactive oxygen, which is generated as a result of normal metabolism, is highly reactive and thus irreversibly destroys cell components such as lipids, proteins, sugars, or DNA, resulting in oxidative stress of cells or tissues. thereby causing, including cancer, stroke, and cardiovascular system diseases, such as atherosclerosis, rheumatoid, such as chronic inflammatory diseases, respiratory diseases, or self, as well as cause a variety of diseases, including autoimmune diseases (Halliwell, B and Gutteridge, JMC , Biochem. J. , 1984, 219, 1-14; Freeman , BA and Grapo, JD, Lab Invest, 1982, 47, 412-426; Ames, BN, Science, 1983, 221, 1256-1264;. Fridovich, I., Arch Biochem Biophys ., 1986, 247, 1-11; Vishwanath, MS, Nutrition in Clinical Practice , 1995, 10, 19-25). These oxidative damages accumulate over time, leading to aging and death. This active oxygen theory of aging was first proposed by Harman in 1956 (Harman, D., Free radical theory of aging , Alan R Liss, New York , 1986, 3-49). It supports the hypothesis. It has been observed that lifespan is extended by reducing basal metabolic rate, i.e. oxygen consumption, by limiting diet or reducing momentum under different experimental conditions (Medvedev, ZA, Biol. Rev. , 1990, 65, 375-398; Loe , J., Northrop, JH, J. Biol. Chem ., 1971, 32, 103-121; Sohal, RS, Insect aging , Springer-Verlag, Heidelberg , 1986, 23-44; Sohal, RS, Aging , 1982, 5, 21-24).
한편, 생체내에는 산화적 손상으로부터 방어하기 위한 항산화 물질들과 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, 이하 'SOD'라 약칭함), 카탈라제(catalase) 또는 퍼옥시다제(peroxidase)와 같은 항산화 효소들이 존재하는데, 나이가 들어 늙어감에 따라 활성 산소에 대한 방어 능력이 감소한다는 사실이 보고되었다(Orr, W. C. and Sohal, R. S., Science, 1994, 263, 1128-1130; Sohal, R. S. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 15671-15674). 즉, 늙은 쥐의 간에서 분리된 SOD는 어린 쥐의 SOD 보다 활성이 낮았으며, 특히 초파리에 항산화 효소인 SOD와 카탈라제의 활성을 높여주면 수명이 30% 이상 증가하여 활성산소와 노화가 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다. 따라서, 활성 산소를 소거할 수 있는 물질이나 지질 과산화 억제 물질과 같은 항산화제는 활성산소에 의해 유발되는 각종 질환 치료제 및 노화예방을 위한 억제제로서 기대를 모으고 있다.Meanwhile, antioxidants such as superoxide dismutase (hereinafter referred to as SOD), catalase or peroxidase to protect against oxidative damage are found in vivo. It has been reported that the protective ability against free radicals decreases with age (Orr, WC and Sohal, RS, Science , 1994, 263, 1128-1130; Sohal, RS et al ., J . Biol. Chem., 1995, 270, 15671-15674). In other words, SOD isolated from livers of old rats was lower than that of young rats. Especially, increasing the activity of antioxidant enzymes SOD and catalase in fruit flies increased lifespan by more than 30%, which is closely related to active oxygen and aging. It can be seen that. Therefore, antioxidants such as substances capable of scavenging active oxygen and lipid peroxidation inhibitors are expected to be used as therapeutic agents for preventing various diseases caused by active oxygen and as inhibitors for aging prevention.
또한, 대기오염, 자외선 노출, 스트레스 또는 질병 등의 유해환경으로부터 산화적 스트레스(oxidative stress)에 계속적으로 노출되면, 체내에 라디칼이 증가되고 진피의 결합조직인 콜라겐(Collagen), 엘라스틴(Elastin), 히아루론산(Hyaluronic aicd) 등을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하 현상(주름)을 일으킬 수 으며, 또한 세포막의 지질 부분을 산화시켜 세포의 파괴 현상을 일으켜 피부염, 여드름 또는 피부암 등의 질병을 유발할 수 있다. 이외에도 라디칼은 멜라닌 형성과정에 관여하여 기미, 주근깨 및 주름생성의 원인이 되기도 한다. 기존에는 아스코르브산, α-토코페롤 또는 SOD 등이 자유 라디칼 소거 기능 물질로 화장료나 의약품에 배합되어 주름 및 기타 피부 질환을 방지하기 위하여 이용되어 왔으나, 이들은 가격이 고가일 뿐만 아니라 배합시 화학적 안정성이 좋지 못하여 실질적인 효과를 기대하기가 어려운 문제점이 있었다. 이러한 이유로 보다 안전하면서 자유라디칼 소거 효과가 높은 물질을 개발하는 것이 의약품이나 식품 분야 뿐 만 아니라 화장품 산업 분야에서도 중요한 과제로 대두되어 많은 연구가 진행되고 있다.In addition, continuous exposure to oxidative stress from harmful environments such as air pollution, UV exposure, stress, or disease causes increased radicals in the body and collagen, elastin, hyaluronic acid, which are the connective tissues of the dermis. It can destroy hyaluronic aicd and cause subsidence of the skin (wrinkle), and also oxidize the lipid part of the cell membrane and cause cell destruction, leading to diseases such as dermatitis, acne or skin cancer. In addition, radicals are involved in the process of melanin formation, causing spots, freckles and wrinkles. Conventionally, ascorbic acid, α-tocopherol, or SOD has been used as a free radical scavenging substance in cosmetics and medicines to prevent wrinkles and other skin diseases, but they are expensive and have poor chemical stability when formulated. There was a problem that it was difficult to expect a practical effect. For this reason, a lot of research is being conducted to develop a safer and high free radical scavenging material as an important task not only in the pharmaceutical and food sectors but also in the cosmetics industry.
노화현상을 이해하기 위한 또 하나의 이론으로 노화의 텔로미어 가설이 있다. 사람의 정상세포는 생체외(in vitro)에서 정해진 횟수만큼만 세포분열을 하고 더 이상 분열하지 않는다. 이것을 복제노화라 하는데, 이러한 현상이 왜 일어나는지를 설명해주는 것이 바로 텔로미어 가설이다(Kim, S.H., et al., Oncogene 21: 503-511 (2002); Harley, C.B., et al., Nature 345: 458-460 (1990); Olovnikov, A.M. J. Theoret. Biol. 41: 181-190 (1973); Harley, C.B., Exp. Gerontol. 27: 375-382 (1992); Allsopp, R.C., Weissman, I.L., Oncogene, 21: 3270-3273 (2002)). 텔로미어는 진핵세포 선형 염색체의 말단 부분으로 TTAGGG 염기서열이 반복되는 특이한 구조로 이루어져 있는데, 특히 구아닌(G)은 수소결합을 통해 매우 안정한 G-사분체(quartet) 구조를 형성함으로써 염색체를 안정화 시켜 염색체를 보호하는데 중요한 역할을 한다(Moyzis, R.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6622-6626 (1988)). 하지만, 사람의 체세포는 세포분열을 할 때마다 텔로미어 길이가 점점 감소되는 것으로 밝혀졌다(Harley, C.B., Futcher, A.B., Greider, C.W., Nature 345: 458-460 (1990); Harley, C.B. et al., Exp. Gerontol. 27: 375-382 (1992); Allsopp, R.C., Weissman, I.L., Oncogene 21: 3270-3273 (2002)). 이러한 현상은 DNA가 복제될 때 3'-말단의 프라이머 부분이 복제되지 못하는 소위 "말단 복제 문제(End replication problem)" 때문에 일어난다(Olovnikov, A.M. J. Theoret. Biol. 41: 181-190 (1973)). 그러므로, 세포는 한번 분열할 때마다 프라이머 부분만큼 짧은 DNA가 복제되며, 분열을 거듭함에 따라 염색체의 텔로미어 길이가 짧아져 임계 길이 이하가 되면 DNA의 단일가닥 과 이중가닥이 끊어지게 되고 결국, 사이클린 의존 키나제(cyclin dependent kinase)의 억제제들을 유도시켜 세포분열이 G1기에 정체된다(Harley, C.B., et al., Exp. Gerontol, 27: 375-382 (1992)). 최근 연구에 의하면 텔로미어 길이는 산화적 스트레스의 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. 즉, 산화적 스트레스는 텔로미어 단축 속도를 증가시키는데, 이것은 산화적 손상이 염색체의 다른 부분에 비해 텔로머릭 DNA 부분이 덜 복구되기 때문으로 생각되어지고 있다 (Saretzki, G., von Zglinicki, T., Ann. New York Acad. Sci. 959: 24-29 (2002); von Zglinicki, T., Ann. New York Acad. Sci. 908: 99-110 (2000); von Zglinicki, T., TRENDS Biochem. Sci. 27: 339-344 (2002); Lorenz, M., et al., Free Radic. Biol. Med. 31: 824-831 (2001)).Another theory for understanding aging is the telomeres hypothesis of aging. Human normal cells divide only a certain number of times in vitro and no longer divide. This is called replication aging, and it is the telomer hypothesis that explains why this phenomenon occurs (Kim, SH, et al ., Oncogene 21: 503-511 (2002); Harley, CB, et al ., Nature 345: 458). -460 (1990); Olovnikov, AM J. Theoret. Biol. 41: 181-190 (1973); Harley, CB, Exp. Gerontol. 27: 375-382 (1992); Allsopp, RC, Weissman, IL, Oncogene , 21: 3270-3273 (2002)). Telomeres consist of a unique structure in which the TTAGGG sequence is repeated as a terminal part of a eukaryotic linear chromosome. In particular, guanine (G) forms a very stable G-quartet structure through hydrogen bonding to stabilize the chromosome. Plays an important role in the protection (Moyzis, RK, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6622-6626 (1988)). However, human somatic cells have been found to decrease in telomere length with each cell division (Harley, CB, Futcher, AB, Greider, CW, Nature 345: 458-460 (1990); Harley, CB et al . , Exp. Gerontol. 27: 375-382 (1992); Allsopp, RC, Weissman, IL, Oncogene 21: 3270-3273 (2002)). This phenomenon occurs because of the so-called "end replication problem" where the 3'-terminal primer portion is not replicated when DNA is replicated (Olovnikov, AM J. Theoret. Biol. 41: 181-190 (1973) ). Therefore, every time a cell divides, DNA that is as short as the primer is replicated, and as the cell divides, the telomeres of chromosomes become shorter and become shorter than the critical length, resulting in breakage of single and double strands of DNA. Induction of inhibitors of cyclin dependent kinase causes cell division to stagnate in G1 phase (Harley, CB, et al ., Exp. Gerontol, 27: 375-382 (1992)). Recent studies have shown that telomere length is affected by oxidative stress. That is, oxidative stress increases the rate of telomere shortening, which is thought to be due to oxidative damage that the telomeric DNA portion is less repaired than other parts of the chromosome (Saretzki, G., von Zglinicki, T. , Ann.New York Acad. Sci. 959: 24-29 (2002); von Zglinicki, T., Ann.New York Acad.Sci . 908: 99-110 (2000); von Zglinicki, T., TRENDS Biochem. Sci. 27: 339-344 (2002); Lorenz, M., et al ., Free Radic. Biol. Med. 31: 824-831 (2001).
이와 같은 노화의 이론에 근거하여 식물로부터 피부노화를 억제 시킬 수 있는 물질을 찾고자 하였다. 식물은 광합성 과정에서 부산물로서 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)을 비롯한 여러 활성산소들이 생성되기 때문에 이러한 산화적 스트레스로부터 스스로를 보호할 수 있는 방어체계가 잘 발달되어 있을 것으로 여겨진다. 그러므로, 식물은 그 자체가 항산화 물질을 함유하고 있는 중요한 자원이 될 수 있다. 이에, 350여 종의 식물을 대상으로 라디칼 소거활성 및 지질과산화 억제활성을 조사하여 항산화 활성이 있는 몇 가지 후보식물을 선정하였다. 문헌 고찰 및 자원 확보의 용이성 등을 고려하여 비교적 성분 및 활성에 관한 보고가 없었고 자원 확보가 용이한 박태기나무 (Cercis chinensis)를 최종 후보식물로 선정하였다.Based on this theory of aging, we tried to find a substance that can suppress skin aging from plants. Plants are thought to have well developed defenses to protect themselves from these oxidative stresses, since many free radicals, including superoxide radicals, are produced as a by-product of photosynthesis. Therefore, plants can themselves be an important source of antioxidants. Thus, some candidate plants with antioxidant activity were selected by examining the radical scavenging activity and lipid peroxidation inhibitory activity in 350 plant species. Considering the literature review and the availability of resources, Cercis chinensis was selected as the final candidate plant.
박태기나무(Cercis chinensis)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 낙엽관목으로서 중국이 원산이다. 높이는 3 내지 5 m이고 작은 가지에는 털이 없으며, 여러 개의 껍질 눈이 있다. 잎은 호생하며, 단엽이고, 모양은 둥근 심장형으로, 지름은 6 내지 11 ㎝로서 털은 없으며 가장자리가 밋밋하다. 잎의 윗면은 짙은 녹색이며, 윤기가 나고, 뒷면은 연두빛이다. 턱잎은 사각형이고, 일찍 진다. 꽃은 길이가 1 내지 2 ㎝이고, 잎겨드랑이가 여러송이 붙으며, 화척이 없어 꽃자루만 있다. 꽃 받침은 종모양이고, 위쪽 가장자리에 5개의 무딘 톱니가 있다. 화관은 나비모양이고 자홍색이며, 꽃잎은 5개인데 크기가 일정치 않다. 수술은 10개이고 분리되어 있으며, 기부는 꽃받침 속에 붙어 있고, 꽃실은 가늘고 길다. 암술은 1개이며, 씨방은 광택이 있고, 털은 없으며, 자루가 있다. 암술대 윗부분은 구부러져 있고, 암술머리는 짧고 작으며, 눌려 편평하게 된 모양이다. 개화기는 4월경으로 잎보다 먼저 핀다. 열매는 협과로서 편평한 띠모양이고, 끝은 조금 오그라들어 짧은 주둥이 모양이다. 꼬투리는 길이 7 내지 12 ㎝로 8, 9월에 익으며, 종자는 둥글고 편평하며 흑색에 가깝다(李永魯, 原色韓國植物圖鑑, 敎學社, 서울, 1996, 362-363). 한방에서는 박태기나무의 수피, 근피, 목질부, 열매, 꽃 등을 각각 자형피(紫荊皮), 자형근피(紫荊根皮), 자형목(紫荊木), 자형과(紫荊果), 자형화(紫荊花)라하며, 풍한습비(風寒濕痺), 통경(通經), 생리통, 후비(喉痺), 임질, 혈액순환 촉진 등에 사용하고 있다(金昌玟 外., 完譯中藥大辭典, 圖書出版 鼎談, 서울, 1997, 3631-3634). Cercis chinensis is a deciduous shrub belonging to legumes (Leguminosae), native to China. Its height is 3 to 5 m and the twigs have no hairs and several shell eyes. The leaves are regenerated, single-leafed, shaped like a round heart, 6-11 cm in diameter, without hair, and flat at the edges. The upper side of the leaf is dark green, glossy, and the back side is light green. Chin leaves are square and lose early. Flowers are 1 to 2 cm in length, leaf axilla is attached several times, there is no flower stalk, only peduncle. Calyxes are bell-shaped, with five dull teeth on the upper edge. Corollas are butterfly-shaped, magenta, with 5 petals, but the size is not constant. The stamens are 10, separated, the base is attached to the calyx, and the flower thread is thin and long. There is one pistil, the ovary is glossy, there is no hair, and there is a bag. The top of the style is bent, the style is short, small and pressed flat. Blooms bloom in April before leaves. Fruits are stalks, flat, band-shaped, with a slightly rounded tip, with a short snout. The pod is 7-12cm long and ripens in August and September, and the seed is round, flat and close to black (李 永 魯, 原色 韓國 植物 圖鑑, 敎 學 社, Seoul, 1996, 362-363). In oriental medicine, bark, root bark, woody part, fruit, flower, etc. of Korean cabbage are divided into the bark of the bark, the bark of the bark, the bark, the bark, and the bark. It is called 花, and it is used for wind, rain, pain, dysmenorrhea, fertilization, gonorrhea, and blood circulation (金昌玟 外., 完 譯 中藥 大 辭典, 圖書 出版) Wong, Seoul, 1997, 3631-3634).
이에, 본 발명자들은 박태기나무로부터 분리한 추출물이 합성 항산화제와는 달리 인체에 무해하고, 다른 천연 항산화제에 비하여 산화적 스트레스에 대한 세포보호활성이 우수할 뿐 만 아니라 텔로미어 길이의 단축속도를 늦춤으로써 세포수명을 연장 시킬 수 있으므로, 박태기나무로부터 분리한 추출물이 항산화 및 피부노화 억제용 약학적 조성물과 기능성 식품에 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Thus, the inventors of the present invention, unlike the synthetic antioxidants, the extract is harmless to the human body, and compared to other natural antioxidants, as well as excellent cytoprotective activity against oxidative stress as well as slow the shortening of the telomeres length By extending the life of the cell, the present invention has been completed by revealing that the extract isolated from the baktaegi tree can be usefully used in the pharmaceutical composition and functional food for inhibiting antioxidant and skin aging.
본 발명은 박태기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 노화 억제용 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
It is an object of the present invention to provide a functional food for antioxidant and anti-aging, which contains the extract of P. chinensis as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 박태기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 노화 억제용 기능성 식품을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a functional food for antioxidant and anti-aging containing the extract of P. loccus as an active ingredient.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 박태기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 노화 억제용 기능성 식품을 제공한다.The present invention provides a functional food for antioxidant and anti-aging, containing the extract of Park Seonggi as an active ingredient.
본 발명자들은 노화의 활성산소설에 근거하여 140 여 종의 생약과 전국에서 채집한 250 여 종의 식물을 대상으로 항산화 활성을 검색하여 몇 가지 후보 식물을 선정하고, 그 중 자원확보가 용이하고 항산화 활성에 관한 보고가 없었던 박태기나무의 추출물로부터 항산화 활성을 확인하였다. 본 발명에 사용한 박태기나무는 2001년 9월 중순 대덕 연구 단지 및 충남대학교에서 채집한 것을 식물도감과 비교하여 확증하였으며, 확증 표본은 (주)한국신약 자광연구소에 보관되어 있다.The present inventors selected several candidate plants by searching for antioxidant activity based on more than 140 herbal medicines and 250 plants collected from all over the country based on the aging of free radicals of aging. Antioxidant activity was confirmed from the extract of Park Tae-gi, which had no report on the activity. The Park Tae-gi tree used in the present invention was confirmed in mid-September 2001 from Daedeok Research Complex and Chungnam National University compared to the plant illustration, and the confirmed sample is stored in the Korea New Drug Research Institute.
본 발명의 기능성 식품에 포함되는 박태기나무 추출물에 있어서, 상기 추출물은 알코올 수용액을 이용하여 추출하는 것을 특징으로 한다. 상기 알코올 수용액은 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액 및 부탄올 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 알코올 수용액은 에탄올 수용액인 것이 바람직하며, 에탄올 수용액은 50 내지 80% 에탄올 수용액인 것이 바람직하고, 60% 에탄올 수용액인 것이 더욱 바람직하다.In the extract of Park Tae Ki included in the functional food of the present invention, the extract is characterized in that the extraction using an aqueous alcohol solution. The alcohol aqueous solution is preferably selected from the group consisting of an aqueous methanol solution, an aqueous ethanol solution, an aqueous propanol solution and an aqueous butanol solution. In addition, the aqueous alcohol solution is preferably an ethanol aqueous solution, the ethanol aqueous solution is preferably 50 to 80% ethanol aqueous solution, more preferably 60% ethanol aqueous solution.
본 발명에 있어서, 박태기나무 추출물은 상기한 박태기나무의 알코올 조추출물, 바람직하게는 에탄올(EtOH) 조추출물을 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate, EtOAc) 및 부탄올(butanol, BuOH)로 추출하여 각각의 분획을 수득한 뒤, 항산화 활성을 나타내는 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획으로부터 크로마토그래피 과정을 거쳐 제조되며, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획으로부터 하기 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물을 포함하는 추출물이 수득된다(도 4 및 도 5 참조). 또한, 구조 분석 결과, 본 발명에서 수득한 화학식 15로 기재되는 화합물(syringetin-3-O-(2"-O-galloyl)-rutinoside)은 현재까지 알려지지 않은 신규한 화합물임을 확인하였다.In the present invention, the extract of the extract from the above-mentioned alcoholic crude extract, preferably ethanol (EtOH) crude extract of the above extract with hexane (hexane), ethyl acetate (ethyl acetate, EtOAc) and butanol (butanol, BuOH) After the respective fractions were obtained, a chromatographic process was prepared from the ethyl acetate fraction and the butanol fraction showing antioxidant activity, and the extract comprising the compounds represented by the following
상기 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 본 발명의 화합물의 경우 박태기나무 추출물 총 중량에 대해 화학식 6으로 표시되는 화합물은 0.01 내지 1.00 중량%, 화학식 12로 표시되는 화합물은 0.01 내지 1.00 중량%, 화학식 5로 표시되는 화합물은 0.01 내지 0.5 중량%로 함유하는 것이 바람직하다.In the case of the compound of the present invention represented by
상기 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 본 발명의 화합물은 DPPH 라디칼 소거 활성(1,1-Diphenyl-2-Pycryl-Hydrazyl radical scavenging activity)(표 3참조), 지질 과산화 억제 활성(Lipid peroxidation inhibitory activity)(표 4 참조), 하이드록실 라디칼 소거 활성(Hydroxyl radical scavenging activity)과 나이트릭 옥사이드 소거 활성(nitric oxide scavenging activity)(표 6 참조) 및 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성(Superoxide radical scavenging activity)(표 5 참조) 등의 항산화 활성을 가진다.Compounds of the present invention represented by
호기성 생물체는 산소를 이용하여 에너지 대사를 진행하고 있으나 생체내 산소가 각종 물리적, 화학적 및 생물학적인 스트레스를 받으면 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical), 과산화수소(H2O2) 및 하이드록시 라디칼(hydroxy radical)등의 유해한 활성산소종(active oxygen species)으로 변하여 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으킨다. 상기와 같은 활성 산소종은 세포생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으키고 이로 인해 생체내 축적된 과산화지질은 노화와 각종 질병의 원인이 될 수 있다. 본 발명에서는 상기한 활성산소종의 소거 기능 및 지질 과산화 억제 능력을 조사함으로써, 박태기나무 추출물의 항산화 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기 박태기나무 추출물은 기존에 항산화 물질로 알려진 비타민 E 및 합성 항산화제인 BHA(tert-butyl-4-hydroxyanisole)와 활성이 비슷하거나 높게 나타났으며, 상기 결과로부터 박태기나무 추출물은 항산화 활성이 우수한 추출물임을 확인할 수 있다.Aerobic organisms use oxygen to metabolize energy, but when oxygen in vivo is subjected to various physical, chemical and biological stresses, superoxide anion radicals, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), and hydroxy radicals (hydroxy) It turns into harmful active oxygen species such as radicals and causes fatal physiological disorders. The reactive oxygen species as described above attack the unsaturated fatty acid which is a component of the cell biofilm and cause a peroxidation reaction, and the lipid peroxide accumulated in the living body may cause aging and various diseases. In the present invention, by examining the scavenging function and the ability to inhibit lipid peroxidation of the reactive oxygen species, the antioxidant activity of the extract of Park Tae-gi was measured. As a result, the extract was similar or higher in activity than vitamin E and BHA (tert-butyl-4-hydroxyanisole), a synthetic antioxidant known as an antioxidant, and from the results, the extract was It can be confirmed that it is an excellent extract.
또한, 화학식 1 내지 화학식 20으로 기재되는 본 발명의 화합물은 t-부탄올로 유도되는 산화적 손상에 대한 세포보호 활성(표 7 참조), UV 조사에 대한 세포보호 효과(도 6a 및 도 6b 참조), 무모 생쥐에서의 UV 조사에 대한 보호 효과(도 7 참조), UV 조사에 의한 지질 과산화의 생성 억제 활성(표 8 참조), 세포 수명 연장 효과(도 8 참조), 텔로미어 길이 연장 효과(도 9 및 도 10 참조)를 나타낸다. 즉, 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 활성성분은 항산화 활성을 나타낼 뿐만 아니라 세포 노화 억제 효과도 뛰어남을 알 수 있다.In addition, the compounds of the present invention represented by
따라서, 본 발명의 항산화 및 노화 억제용 기능성 식품에 포함되는 박태기나 무 추출물은 화학식 1(isoliquiritigenin), 화학식 2(2',4'-dihydroxy-4-methoxychalcone), 화학식 3(liquiritigenin), 화학식 4(resveratrol), 화학식 5(piceatannol), 화학식 6(gallic acid), 화학식 7(methyl gallate), 화학식 8(ethyl gallate), 화학식 9(myricetin), 화학식 10(afzelin), 화학식 11(quercitrin), 화학식 12(myricitrin), 화학식 13(myricetin-3-O-(2"-O-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside), 화학식 14(syringetin-3-O-rutinoside), 화학식 15(syringetin-3-O-2"-O-galloyl)-rutinoside), 화학식 16((+)-catechin), 화학식 17((-)-epicatechin-3-O-gallate), 화학식 18((-)-epigallocatechin-3-O-gallate), 화학식 19((-)-lyoniresinol 3a-O-β-D-xylopyranoside) 및 화학식 20((+)-lyoniresiol 3a-O-β-D-glucopyranoside)로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는 것이 바람직하다.Therefore, the extract of Park Tae-gi or radish contained in the antioxidant and anti-aging functional food of the present invention is formula 1 (isoliquiritigenin), formula 2 (2 ', 4'-dihydroxy-4-methoxychalcone), formula 3 (liquiritigenin), formula 4 (resveratrol), formula 5 (piceatannol), formula 6 (gallic acid), formula 7 (methyl gallate), formula 8 (ethyl gallate), formula 9 (myricetin), formula 10 (afzelin), formula 11 (quercitrin), formula 12 (myricitrin), formula 13 (myricetin-3-O- (2 "-O-galloyl) -α-L-rhamnopyranoside), formula 14 (syringetin-3-O-rutinoside), formula 15 (syringetin-3-O -2 "-O-galloyl) -rutinoside), formula 16 ((+)-catechin), formula 17 ((-)-epicatechin-3-O-gallate), formula 18 ((-)-epigallocatechin-3-O -gallate), formula 19 ((-)-lyoniresinol 3a-O-β-D-xylopyranoside) and formula 20 ((+)-lyoniresiol 3a-O-β-D-glucopyranoside) It is preferable to include a compound.
본 발명의 기능성 식품에 있어서, 박태기나무 추출물 또는 이로부터 분리한 활성 성분은 과산화 저해 활성 및 라디칼 제거 활성이 우수하여 높은 항산화 활성을 가지며, 세포보호 효과, 세포수명 연장효과 등이 뛰어나 피부 노화 억제, 피부 탄력 유지 또는 주름 개선을 위한 기능성 식품의 시료로서 이용될 수 있다.In the functional food of the present invention, the extract of Park Tae-gi or the active ingredient isolated therefrom has high antioxidant activity due to its excellent peroxidation inhibitory activity and radical scavenging activity, and has excellent cell protective effect, cell life extension effect, inhibiting skin aging, It can be used as a sample of functional food for maintaining skin elasticity or improving wrinkles.
본 발명의 박태기나무 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 박태기나무 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 박태기나무 추출물이 원료에 대하여 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.When the extract of the present invention is used as a food additive, the extract can be added as it is or used together with other food or food ingredients, and can be appropriately used according to a conventional method. The blending amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of its use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, during the preparation of food or beverage, the extract of the cauliflower of the present invention is added in an amount of 0.1 to 15% by weight, preferably 0.2 to 10% by weight based on the raw materials. However, in the case of long-term intake for health and hygiene or health control, the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. Is sure.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the kind of food. Examples of foods to which the above substances can be added include dairy products, including drinks, meat, sausages, breads, chocolates, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, beverages, alcoholic beverages. And vitamin complexes and the like, and include all of the functional foods in the conventional sense.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 박태기나무로부터의 유효성분의 추출Example 1 Extraction of Active Ingredient from Park Tae-Ki
<1-1> 제 1차 항산화 활성분획 분리<1-1> Primary Antioxidant Activity Fractions
박태기나무로부터 항산화 활성을 나타내는 유효성분을 추출하기 위해 도 1의 모식도에 나타낸 순서로 실험을 진행하였다. 구체적으로, 음건한 박태기나무의 잎과 줄기 1 ㎏을 마쇄기로 갈아서 분말로 만들고 에탄올(EtOH)로 실온에서 2주간씩 2회 추출하였다. 이때 에탄올의 농도를 0%에서부터 순차적으로 10%씩 늘여 최종으 로 100% 에탄올을 조제한 후 이를 이용해 추출하였다. 에탄올의 농도에 따른 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH(1,1-Diphenyl-2-Pycryl-Hydrazyl, 이하 'DPPH'라 칭함) 방법을 수행하여 항산화 활성을 측정하였다(Taco, T. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1994, 58, 1780-1783; Na, M.K. et al., Nat. Prod. Sci., 2002, 8, 26-29). DPPH는 비교적 안정한 자유 라디칼로서, 라디칼 상태로 존재시 517 nm에서 최대 흡광도를 보이며 소거되면 흡광성을 잃기 때문에 이러한 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법이다. 구체적으로, 박태기나무의 농도별 에탄올 추출물을 취해, DMSO(Sigma)를 이용하여 3.125, 6.25, 12.25, 25 및 50 ㎍/㎖로 희석한 후, 96 웰 플레이트에 상기 용액 10 ㎕씩을 각각 넣고 2 ×10-4 M/㎖ 에탄올 농도의 DPPH(Sigma, St. Louis, Mo, USA) 용액 190 ㎕를 넣어 실온에서 30분간 방치한 후, 517 nm에서 O.D값을 측정하였다. 대조구로는 시료 대신 DMSO를 가해 시료의 흡광도 감소 정도를 조사하였다. DPPH 라디칼 소거활성을 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며, DPPH 라디칼을 50% 소거시키는 시료의 농도를 IC50으로 정하였다.To extract the effective ingredients having the antioxidant activity from baktaegi tree was an experiment in the order shown in the schematic diagram of FIG. Specifically, 1 kg of dry leaves and stems of the dried Paktaegi tree were ground with a mill, and powdered and extracted twice with ethanol (EtOH) for 2 weeks at room temperature. At this time, the concentration of ethanol was sequentially increased from 0% to 10%, and finally 100% ethanol was prepared and extracted using the same. In order to confirm the antioxidant activity of the extract according to the concentration of ethanol, DPPH (1,1-Diphenyl-2-Pycryl-Hydrazyl, hereinafter referred to as 'DPPH') method was performed to measure the antioxidant activity (Taco, T. et al. , Biosci. Biotech.Biochem. , 1994, 58, 1780-1783; Na, MK et al ., Nat. Prod. Sci ., 2002, 8, 26-29). DPPH is a relatively stable free radical, which exhibits maximum absorbance at 517 nm when it is in radical state, and loses absorbance when it is eliminated. Specifically, the ethanol extracts of the persimmons were taken, diluted to 3.125, 6.25, 12.25, 25, and 50 ㎍ / ml using DMSO (Sigma), and then each 10 μl of the solution was added to a 96 well plate and 2 × 190 μl of a DPPH (Sigma, St. Louis, Mo, USA) solution at a concentration of 10 −4 M / ml ethanol was added thereto, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the OD value was measured at 517 nm. As a control, DMSO was added instead of the sample to investigate the degree of absorbance reduction of the sample. DPPH radical scavenging activity was calculated according to
<수학식 1><
Acontrol: 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도A control : Absorbance of the control without added sample
Asample: 시료를 첨가한 반응구의 흡광도A sample : absorbance of the reaction sphere
그 결과, 추출시 사용한 에탄올의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성은 증가했으며, 0%, 10%, 20% 및 90% 에탄올 추출물은 라디칼 소거활성이 낮은 반면 정도의 차이는 있지만 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 100% 에탄올 추출물의 경우 대체적으로 라디칼 소거활성이 높았다. 특히, 60% 에탄올 추출물의 경우 추출물의 농도 증가에 따른 라디칼 소거활성이 가장 높았으며, IC50 값이 26.6으로 가장 낮아 에탄올 추출물 중에서 가장 높은 항산화 활성을 보이는 추출물임을 알 수 있었다(표 1 및 도 2).As a result, DPPH radical scavenging activity increased as the concentration of ethanol used for extraction increased, while 0%, 10%, 20% and 90% ethanol extracts had low radical scavenging activity, but the degree was 30%, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80% and 100% ethanol extracts were generally high in radical scavenging activity. In particular, in the case of 60% ethanol extract, the radical scavenging activity was the highest with increasing the concentration of the extract, and the IC 50 value was 26.6, which was the lowest, showing the highest antioxidant activity among the ethanol extracts ( Table 1 and FIG. 2). ).
상기에서 60% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 높음을 확인한 후 이로부터 용매별 추출물을 수득하였다. 구체적으로, 60% 에탄올 추출물을 증류수로 현탁시킨 후, 헥산(hexane)으로 3회 추출하고 감압 농축하여 헥산 분획(Fraction, 이하 'Fr'이라 약칭함) 11 g을 얻었고, 남은 현탁액을 에틸 아세테이트(ethyl acetate, EtOAc)로 3 회 추출하고 감압 농축하여 에틸아세테이트 분획(이하 'EtOAc Fr'이라 칭함) 25 g을 얻었으며, 남은 현탁액을 다시 수포화시킨 부탄올(butanol, BuOH)로 3 회 추출하고 감압 농축하여 부탄올 분획(이하 'BuOH Fr'이라 칭함) 19 g을 얻었다. 그리고 남은 분획 20 g은 물 분획으로 간주하였다(도 1).After confirming that the DPPH radical scavenging activity of the 60% ethanol extract is the highest, an extract for each solvent was obtained therefrom. Specifically, 60% ethanol extract was suspended in distilled water, extracted three times with hexane and concentrated under reduced pressure to obtain 11 g of a hexane fraction (hereinafter referred to as 'Fr'), and the remaining suspension was ethyl acetate ( ethyl acetate, EtOAc) was extracted three times and concentrated under reduced pressure to give 25 g of ethyl acetate fraction (hereinafter referred to as 'EtOAc Fr'). The remaining suspension was extracted three times with saturated butanol (BuOH) and decompressed. Concentration gave 19 g of butanol fraction (hereinafter referred to as 'BuOH Fr'). And the remaining fraction 20 g was considered to be the water fraction ( FIG. 1 ).
상기에서 용매 추출한 헥산 Fr, EtOAc Fr 및 BuOH Fr으로부터 항산화 활성이 있는 분획을 찾기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 각 분획별 추출물을 이용하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 이때, DPPH 라디칼 소거 활성이 높다고 알려져 있는 비타민 E를 비교군으로 사용하였다.In order to find the fractions having antioxidant activity from the solvent-extracted hexane Fr, EtOAc Fr and BuOH Fr, DPPH radical scavenging activity was measured using the extract of each fraction in the same manner as described above. At this time, vitamin E which is known to have high DPPH radical scavenging activity was used as a comparison group.
그 결과, EtOAc Fr과 BuOH Fr의 경우 IC50 값이 각각 24.0과 27.0 ㎍/㎖로 나타나 비교군으로 사용했던 비타민 E(IC50 24.9 ㎍/㎖)와 비슷한 정도의 강한 활성을 보였으나, 다른 분획물은 활성이 미약했다(도 3).As a result, EtOAc Fr and for BuOH Fr or IC 50 values are showed, respectively 24.0 and a strong activity of a similar degree and 27.0 ㎍ / ㎖ as vitamin E (IC 50 24.9 ㎍ / ㎖ ) was used as a control group shown, the other fraction Was poorly active ( FIG. 3 ).
<1-2> 제 2차 항산화 활성분획 분리<1-2> Secondary Antioxidant Active Fraction Separation
상기 실시예 <1-1>의 결과에 따라, 활성이 강한 EtOAc Fr 및 BuOH Fr에 대하 여 하기와 같이 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시하고, 그 결과 수득된 각각의 분획에 대하여 다시 항산화 활성 실험을 수행하여 높은 활성을 보이는 분획만을 선택하였다.According to the result of Example <1-1>, column chromatography was performed on the highly active EtOAc Fr and BuOH Fr as follows, and the antioxidant activity was again obtained for each fraction obtained as a result. Experiments were performed to select only fractions with high activity.
먼저, EtOAC Fr(25 g)에 대하여 메탄올:물(1:4 →1:0)을 이동상으로 YMC 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 5 ×30 ㎝)를 실시하여 11개의 소분획(Fr.1∼Fr.11)을 얻었다. 상기 11개의 소분획중 Fr.1(3.6 g)을 다시 YMC 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 3 ×30 ㎝)를 수행하여 5개의 소분획(Fr.1-1∼Fr.1-5)을 얻었다. 이 중 Fr.1-1(450 ㎎)에 HPLC[컬럼: μBondapakTMC18(3.9 × 300 mm, Waters), 이동상: ACN:0.1% TCA(16:18), 유속: 1 ㎖/분, UV: 280 nm]를 실시하여 체류시간(retention time, 이하 'tR'이라 칭함)이 각각 11.1분과 6.2분인 화합물 18 ㎎ 및 21 ㎎의 화합물을 얻었으며 각각을 'CCEA111' 및 'CCEA112'라 명명하였다.First, EtOAC Fr (25 g) was subjected to YMC column chromatography (column size: 5 x 30 cm) with methanol: water (1: 4-> 1: 0) as a mobile phase to eleven small fractions (Fr. Fr.11). Fr. 1 (3.6 g) in the 11 small fractions was further subjected to YMC column chromatography (column size: 3 × 30 cm) to obtain 5 small fractions (Fr.1-1 to Fr.1-5). . Among them, Fr.1-1 (450 mg) was purified by HPLC [column: μBondapak TM C 18 (3.9 x 300 mm, Waters), mobile phase: ACN: 0.1% TCA (16:18), flow rate: 1 ml / min, UV 280 nm] was used to obtain compounds of 18 mg and 21 mg having a retention time (hereinafter referred to as 't R ') of 11.1 and 6.2 minutes, respectively, and were named 'CCEA111' and 'CCEA112', respectively. .
다음으로, Fr.1-2(500 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC [YMC-Pack ODS-A 컬럼(20 × 250 ㎜), 이동상: 메탄올:물(3:7), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 16분인 화합물 77 ㎎ 및 tR이 24분인 화합물 19 ㎎을 얻어 각각을 'CCEA1211' 및 'CCEA1212'라 명명하였다.Next, preparative HPLC [YMC-Pack ODS-A column (20 × 250 mm), mobile phase: methanol: water (3: 7), flow rate: 6 ml / min was performed on Fr. 1-2 (500 mg). UV: 254 nm] to give 77 mg of a compound having t R of 16 minutes and 19 mg of a compound having t R of 24 minutes, respectively, and named 'CCEA1211' and 'CCEA1212', respectively.
다음으로, Fr.3(4.8 g)에 대하여 분취용 HPLC [YMC-Pack ODS-A 컬럼(20 × 250 ㎜), 이동상: ACN:0.1% TCA(25:75), 유속: 6 ㎖/분, detector: UV(280 nm)]를 실시하여 tR이 24.5분인 화합물 19 ㎎을 얻어 'CCEA33'이라 명명하였다.Next, preparative HPLC [YMC-Pack ODS-A column (20 × 250 mm), mobile phase: ACN: 0.1% TCA (25:75), flow rate: 6 mL / min on Fr. 3 (4.8 g), detector: UV (280 nm)] to give 19 mg of a compound having a t R of 24.5 minutes was named 'CCEA33'.
다음으로, Fr.4(4.0 g)는 이동상 클로로포름:메탄올(85:15)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(4 × 25 ㎝, 230-400 메쉬)를 실시하여 다시 6개의 소분획(Fr.4-1∼Fr.4-6)으로 나누었으며, 이 중 Fr.4-1(320 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC [이동상: 메탄올:물(35:65), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 25분인 화합물 30 ㎎을 얻어 이를 'CCEA413'이라 명명하고, Fr.4-4(1 g) 또한 분취용 HPLC[이동상: 메탄올:물(1:1), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 15분인 화합물 57 ㎎을 얻어 'CCEA442'라 명명하였다.Next, Fr.4 (4.0 g) was subjected to silica gel column chromatography (4 × 25 cm, 230-400 mesh) with mobile phase chloroform: methanol (85:15), and further 6 small fractions (Fr.4-1) were used. ~ Fr.4-6), of which preparative HPLC [Mobile phase: methanol: water (35:65), flow rate: 6 ml / min, UV: 254 nm was used for preparative HPLC. ] To obtain 30 mg of a compound having a t R of 25 minutes, named 'CCEA413', and Fr.4-4 (1 g) was also prepared for preparative HPLC [mobile phase: methanol: water (1: 1), flow rate: 6 Ml / min, UV: 254 nm] to obtain 57 mg of a compound having a t R of 15 minutes, and name it 'CCEA442'.
다음으로, Fr.6(2.2 g)은 이동상 클로로포름:메탄올(10:1)로 실리카겔 크로마토그래피(3 ×30 ㎝, 230-400 메쉬)를 실시하여 3개의 소분획(Fr.6-1∼Fr.6-3)으로 나누었고, 이 중 Fr.6-2(200 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC [이동상: 메탄올:물(1:1), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 20분인 화합물 25 ㎎을 얻어 이를'CCEA622'라 명명하였다.Next, Fr. 6 (2.2 g) was subjected to silica gel chromatography (3 × 30 cm, 230-400 mesh) with mobile phase chloroform: methanol (10: 1) to obtain three small fractions (Fr. 6-1 to Fr). .6-3), preparative HPLC [mobile phase: methanol: water (1: 1), flow rate: 6 ml / min, UV: 254 nm] was performed on Fr.6-2 (200 mg). Thus, 25 mg of a compound having a t R of 20 minutes was named 'CCEA622'.
다음으로, Fr.8(2.1 g)에 대하여 이동상 용매로 클로로포름:메탄올(10:1)을 사용한 실리카겔 크로마토그래피를 실시하여 화합물 20 ㎎을 얻어 이를 'CCEA82'라 명명하였다. 상기 CCEA82를 분리하고 남은 분획물을 메탄올에 녹여 재결정하여 수득한 화합물 10 ㎎을 'CCEA83'이라 명명하였다.Next, Fr. 8 (2.1 g) was subjected to silica gel chromatography using chloroform: methanol (10: 1) as a mobile phase solvent to obtain 20 mg of the compound, which was named 'CCEA82'. CCEA82 was separated and the remaining fractions were dissolved in methanol and recrystallized, and 10 mg of the compound obtained was named 'CCEA83'.
다음으로, Fr.9(2.8 g)에 대하여 이동상 클로로포름:메탄올(15:1)로 실리카겔 크로마토그래피를 실시하여 2개의 소분획(Fr.9.1∼Fr.9-2)로 나누었고, 이 중 Fr.9-1(220 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC[이동상: 메탄올:물(4:1), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 25분인 화합물 32 ㎎을 얻고 이를 'CCEA913'이라 명명하였다(도 4).Next, Fr. 9 (2.8 g) was subjected to silica gel chromatography with mobile phase chloroform: methanol (15: 1), and divided into two small fractions (Fr.9.1 to Fr.9-2), of which Fr. 9-1 (220 mg) was subjected to preparative HPLC [mobile phase: methanol: water (4: 1), flow rate: 6 ml / min, UV: 254 nm] to obtain 32 mg of a compound having a t R of 25 minutes. It was named 'CCEA913' ( FIG. 4 ).
BuOH Fr(19 g)에 대해서도 메탄올:물(0:1→1:0)을 이동상으로 하여 YMC 젤 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 5 ×30 ㎝)를 실시하여 8개의 소분획(Fr.1∼Fr.8)을 얻었다.For BuOH Fr (19 g), YMC gel column chromatography (column size: 5 x 30 cm) was carried out using methanol: water (0: 1 → 1: 0) as a mobile phase, and eight small fractions (Fr. Fr.8) was obtained.
Fr.2(3.8 g)를 이동상 클로로포름:메탄올:물(70:30:5)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(3 ×30 ㎝, 230-400 mesh)를 실시하여 다시 5개의 소분획(Fr.2-1∼Fr.2-5)으로 나누었으며, 이 중 Fr.2-3(420 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC[이동상: 아세토니트릴:물(18:82), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 Fr.2-3-1 및 2-3-2를 얻고, 이중 Fr.2-3-1에 대하여 다시 분취용 HPLC[이동상: 아세토니트릴:물(10:90). 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 15분인 화합물 32 ㎎을 얻고 이를 'CCBt231'이라 명명하였다.Fr.2 (3.8 g) was subjected to silica gel column chromatography (3 x 30 cm, 230-400 mesh) with mobile phase chloroform: methanol: water (70: 30: 5). 1 to Fr.2-5), of which preparative HPLC [mobile phase: acetonitrile: water (18:82), flow rate: 6 ml / min, UV: was compared to Fr.2-3 (420 mg). 254 nm] to give Fr.2-3-1 and 2-3-2, again preparative HPLC [mobile phase: acetonitrile: water (10:90). Flow rate: 6 mL / min, UV: 254 nm] to give 32 mg of a compound having a t R of 15 minutes, and name it 'CCBt231'.
다음으로, Fr.5(3 g)를 이동상 클로로포름:메탄올:물(70:30:5)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(3 ×30 ㎝, 230-400 메쉬)를 실시하여 다시 4개의 소분획(Fr.5-1∼Fr.5-4)으로 나누었으며, 이 중 Fr.5-2(300 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC [이동상: 메탄올:물(35:65), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 25분인 화합물 20 ㎎ 및 tR이 30분인 화합물 13 ㎎을 얻어 이를 각각 'CCBt521 및 'CCBt522'이라 명명하였다. 또한, Fr.5-3(600 ㎎)에 대하여 30% 메탄올을 이동상으로 사용하고 YMC 젤 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 3 ×30 ㎝)를 실시하여 다시 4개의 소분획(Fr.5-3-1 ~ Fr. 5-3-4)으로 분리하였으며, 이중 Fr.5-3-3으로부터 침전으로 생기는 물질을 정제하여 화합물 29 ㎎을 얻고, 이를 'CCBt533'이라 명명하였다.Subsequently, Fr. 5 (3 g) was subjected to silica gel column chromatography (3 × 30 cm, 230-400 mesh) with mobile phase chloroform: methanol: water (70: 30: 5), and further four small fractions (Fr) were obtained. .5-1 to Fr.5-4), preparative HPLC [Mobile phase: methanol: water (35:65), flow rate: 6 ml / min, for Fr.5-2 (300 mg); UV: 254 nm] to give 20 mg of a compound having a t R of 25 minutes and 13 mg of a compound having a t R of 30 minutes, which were named 'CCBt521' and 'CCBt522', respectively. Further, Fr. 5-3 (600 mg) was subjected to YMC gel column chromatography (column size: 3 x 30 cm) using 30% methanol as the mobile phase, and further four small fractions (Fr. 5-3- 1 to Fr. 5-3-4), of which the precipitate-producing material was purified to obtain 29 mg of the compound, which was named 'CCBt533'.
다음으로, Fr.6(3.2 g)을 다시 YMC 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 3×30 ㎝)를 실시하여 4개의 소분획(Fr.6-1∼Fr.6-4)을 얻었고, 이 중 Fr.6-2(370 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC [이동상: 메탄올:물(3:7), 유속: 6 ㎖/분, UV: 254 nm]를 실시하여 tR이 26분인 화합물 9 ㎎ 및 tR이 28분인 화합물 16 ㎎을 얻어 이를 각각 'CCBt622 및 'CCBt623'이라 명명하였다. 또한, Fr.6-4(200 ㎎)에 대하여 분취용 HPLC(이동상: 메탄올:물(4:6), 유속: 6 ㎖/분)를 실시하여 tR이 18 분인 화합물 5 ㎎을 얻고 이를 'CCBt641'이라 명명하였다.Next, Fr. 6 (3.2 g) was further subjected to YMC column chromatography (column size: 3 x 30 cm) to obtain four small fractions (Fr. 6-1 to Fr. 6-4). Preparative HPLC [Mobile phase: methanol: water (3: 7), flow rate: 6 mL / min, UV: 254 nm] was carried out on Fr. 6-2 (370 mg) to 9 mg of a compound having a t R of 26 minutes; and 16 mg of a compound having a t R of 28 minutes were obtained and named as 'CCBt622' and 'CCBt623', respectively. In addition, preparative HPLC (mobile phase: methanol: water (4: 6), flow rate: 6 ml / min) was performed on Fr.6-4 (200 mg) to obtain 5 mg of a compound having a t R of 18 minutes. CCBt641 '.
다음으로, Fr.7(1.9 g)을 이동상 클로로포름:메탄올(4:1)로 실리카겔 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 3 ×30 ㎝)를 실시하여 4개의 소분획(Fr.7-1∼Fr.7-4)을 얻었다. Fr.7-2(50 ㎎)을 다시 이동상 80% 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 3 ×30 ㎝)를 실시하여 5개의 소분획(Fr.7-2-1 ~ Fr.7-2-5)으로 나누었고, 이중 Fr.7-2-2를 메탄올로 재결정하여 화합물 9 ㎎을 얻고 이를 'CCBt722'라 명명하였다. 또한, 침전으로 석출된 Fr.7-2-4를 정제하여 화합물 10 ㎎을 얻고 이를 'CCBt724'라 명명하였다(도 5).Next, Fr.7 (1.9 g) was subjected to silica gel chromatography (column size: 3 x 30 cm) with mobile phase chloroform: methanol (4: 1) to give four small fractions (Fr.7-1 to Fr.7). -4) was obtained. Fr.7-2 (50 mg) was subjected to Sephadex LH-20 column chromatography (column size: 3 x 30 cm) again with 80% methanol in mobile phase to give five small fractions (Fr.7-2-1 to Fr). .7-2-5), of which Fr.7-2-2 was recrystallized from methanol to obtain 9 mg of compound, which was named 'CCBt722'. In addition, the purified Fr.7-2-4 precipitated to obtain a 10 mg compound was named 'CCBt724' ( Fig. 5 ).
<1-3> 분리된 화합물의 구조 분석<1-3> Structural Analysis of Isolated Compound
상기 실시예 <1-2>에서 분리된 21가지의 분획물의 구조를 분석하였다. 구체적으로, 분리된 화합물의 융점은 전기적 온도 융점 분석기(electrothermal melting point apparatus)(Electrothermal Eng. Ltd., AZ 9003)를 사용하고, 선광도는 DIP-370 디지털 폴라리미터(polarimeter)(JASCO)를 사용하고, IR 스펙트럼은 IR 레포트-100 스펙트로포토미터(JASCO)를 사용하고, 질량분석은 탠덤 매스 스펙트로미터(Jeol, JMS HX-110/110A)를 사용하며, NMR 분석은 NMR 스펙트로포토미터(Bruker, NMR AMX-600 spectrometer)를 사용하고, 가스 크로마토그래피는 STAR 3400CX GC(Varian)을 사용하여 제조사의 방침에 따라 분석하였다. 분석된 융점, 선광도, IR 스펙트럼, 질량, NMR 분석 결과를 이용해 각 화합물의 구조를 결정하였다.The structure of 21 fractions separated in Example <1-2> was analyzed. Specifically, the melting point of the separated compound is used by an electrothermal melting point apparatus (Electrothermal Eng. Ltd., AZ 9003), and the optical intensity is used by a DIP-370 digital polarimeter (JASCO). IR spectra are used for the IR Report-100 Spectrophotometer (JASCO), mass spectrometry uses a Tandem Mass Spectrometer (Jeol, JMS HX-110 / 110A), and NMR analysis is performed using an NMR spectrophotometer (Bruker, NMR AMX-600 spectrometer) and gas chromatography were analyzed according to the manufacturer's policy using STAR 3400CX GC (Varian). The structure of each compound was determined using the analyzed melting point, optical intensity, IR spectrum, mass, and NMR analysis results.
그 결과, 구조 분석된 화합물은 하기 표 2에서 보는 바와 같이 찰콘계, 스틸벤계, 페놀릭계, 플라보놀계, 플라바놀계 및 리그난계로 표시되는 그룹으로 특정지어졌으며, 각각은 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물임을 알 수 있었다. 또한, 분석한 화합물 중에 화학식 15로 표시되는 화합물(syringetin-3-O-(2"-O-galloyl)-rutinoside)은 하기와 같은 특성을 가지며, 이를 통해 상기 화합물은 신규 화합물임을 알 수 있었다.As a result, the structurally analyzed compound was specified as a group represented by a chalcone-based, stilbene-based, phenolic, flavonol-based, flavanol-based and lignan-based, as shown in Table 2 , each of the formulas (1) to (20) It was found that the compound represented by. In addition, the compound represented by Formula 15 (syringetin-3-O- (2 "-O-galloyl) -rutinoside) in the analyzed compound has the following characteristics, and it was found that the compound was a novel compound.
<화학식 15의 특성><Characteristics of
엷은 노랑색 파우더,Pale yellow powder,
FeCl3, Mg-HCl, Zn-HCl 테스트: 양성, FeCl 3 , Mg-HCl, Zn-HCl test: positive,
양성 FAB-MS: m/z 823[M + H]+ Positive FAB-MS: m / z 823 [M + H] +
[α]D -80 (c 0.1, MeOH)[α] D -80 ( c 0.1, MeOH)
IR νmax cm-1: 3400 (-OH), 1650 (C=O), 1610, 1500, 1455 (aromatic C=C), 1200, 1020 (glycosidic C-O)IR ν max cm -1 : 3400 (-OH), 1650 (C = O), 1610, 1500, 1455 (aromatic C = C), 1200, 1020 (glycosidic CO)
UV λmax nm (log ε): 257 (3.60), 360 (3.82)UV λ max nm (log ε): 257 (3.60), 360 (3.82)
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) : 7.46 (2H, s, H-2, 6), 6.91 (2H, s, galloyl-2, 6), 6.48 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 5.48 (1H, d, J=7.2 Hz, glc-1), 4.49 (1H, s, rham-1), 3.84 (6H, s, OMe-3, 5), 3.70 (1H, d, J=10.2 Hz, glc-6), 3.38 (1H, d, J=10.2 Hz, glc-6), 1.00 (3H, d, J=5.0 Hz, rham-6) 1 H-NMR (600 MHz, DMSO- d6 ): 7.46 (2H, s, H-2, 6), 6.91 (2H, s, galloyl-2, 6), 6.48 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6), 5.48 (1H, d, J = 7.2 Hz, glc-1), 4.49 (1H, s, rham-1), 3.84 ( 6H, s, OMe-3, 5), 3.70 (1H, d, J = 10.2 Hz, glc-6), 3.38 (1H, d, J = 10.2 Hz, glc-6), 1.00 (3H, d, J = 5.0 Hz, rham-6)
13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) : 156.3 (C-2), 133.1 (C-3), 177.3 (C-4), 161.1(C-5), 98.6 (C-6), 164.0 (C-7), 93.9 (C-8), 156.4 (C-9), 104.0 (C-10), 119.7 (C-1), 106.9 (C-2, 6), 147.4 (C-3, 5), 138.6 (C-4), 100.8 (glc-1), 76.4 (glc-2), 74.9 (glc-3), 70.1 (glc-4), 74.3 (glc-5), 66.7 (glc-6), 101.0 (rha-1), 70.2 (rha-2), 70.5 (rha-3), 71.7 (rha-4), 68.3 (rha-5), 17.6 (rha-6), 165.3 (C=O),120.4 (galloyl-1), 108.7 (galloyl-2, 6), 145.3 (galloyl-3, 5), 137.9 (galloyl-4). 13 C-NMR (150 MHz, DMSO- d6 ): 156.3 (C-2), 133.1 (C-3), 177.3 (C-4), 161.1 (C-5), 98.6 (C-6), 164.0 ( C-7), 93.9 (C-8), 156.4 (C-9), 104.0 (C-10), 119.7 (C-1), 106.9 (C-2, 6), 147.4 (C-3, 5) , 138.6 (C-4), 100.8 (glc-1), 76.4 (glc-2), 74.9 (glc-3), 70.1 (glc-4), 74.3 (glc-5), 66.7 (glc-6), 101.0 (rha-1), 70.2 (rha-2), 70.5 (rha-3), 71.7 (rha-4), 68.3 (rha-5), 17.6 (rha-6), 165.3 (C = O), 120.4 (galloyl-1), 108.7 (galloyl-2, 6), 145.3 (galloyl-3, 5), 137.9 (galloyl-4).
<실시예 2> DPPH 라디칼 소거 활성(DPPH radical scavenging activity)의 측정Example 2 Measurement of DPPH radical scavenging activity
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물을 포함하는 추출물들의 항산화 활성을 측정하기 위하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. 이때, 합성 항산화제인 BHA(tert-butyl-4-hydroxyanisole) 및 α-토코페롤(α-tocopherol)을 양성 대조군으로 사용하였다.The present inventors measured the DPPH radical scavenging activity in the same manner as in Example 1 to determine the antioxidant activity of the extracts containing the compounds represented by
그 결과, 페놀릭산(phenolic acids) 및 플라보노이드(flavonoid) 화합물들이 농도-의존적으로 강한 라디칼 소거활성을 나타내었으며, 스틸벤(stilbene) 화합물도 비교적 강한 라디칼 소거활성을 나타내었다. 특히, 갈릭산(gallic acid)을 비롯한 갈로일 에스터(galloyl ester)들이 강한 활성을 나타내었는데, 구체적으로는 화학식 6(gallic acid), 화학식 7(methyl gallate), 화학식 8(ethyl gallate), 화학식 17((-)-epicatechin-3-O-gallate), 화학식 18((-)-epigallocatechin-3-O-gallate) 및 화학식 13(myricetin-3-O-(2-O-galloyl)-a-L-rhamnopyranoside)의 IC50 값은 각각 5.1 ±0.4, 5.3 ± 0.3, 7.0 ± 1.1, 6.8 ± 0.5, 6.7 ± 0.4 및 8.6 ± 0.7 g/㎖로 상기 화합물들 간에 현저한 활성의 차이는 없었지만, 이들 화합물 모두는 양성 대조군으로 사용했던 α-토코페롤(IC50 25.4 ± 0.9 g/㎖) 및 BHA(IC50 15.3 ± 0.6 g/㎖) 보다 현저하게 강한 라디칼 소거활성을 나타내었다(표 3).As a result, phenolic acids and flavonoid compounds showed strong radical scavenging activity in a concentration-dependent manner, and stilbene compounds also showed relatively strong radical scavenging activity. In particular, galloyl esters, including gallic acid, showed strong activity. Specifically, gallic acid,
벤젠 링(Benzene ring)의 ortho-위치에 전자 공여 그룹(electron donating group)이 치환되어 있으면 페녹시(phenoxy) 라디칼을 쉽게 안정화 시킬 수 있으므로 라디칼 소거 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다(Cuvelier, M.E., Richard, H., Berset, C., Biosci. Biotechnol. Biochem. 56: 324-325 (1992); Kikuzaki, H., et al., J. Agric. Food Chem. 50: 2161-2168 (2002)). 갈로일(Galloyl)그룹의 경우 3개의 하이드록실 그룹이 인접한 위치에 치환되어 있어 효과적으로 페녹시 라디칼을 안정화 시킬 수 있으므로 강력한 라디칼 소거활성을 나타내는 것으로 사 료된다. 표 3에서 보는 바와 같이 갈로일 에스터 이외에도 화학식 16((+)-catechin), 화학식 9(myricetin), 화학식 10(afzelin), 화학식 11(quercitrin), 화학식 12(myricitrin) 등의 플라보노이드계 화합물도 강한 라디칼 소거활성을 나타내었는데, 이는 플라보노이드 구조 중에 생성된 페녹시 라디칼을 효과적으로 안정화 시킬 수 있는 페놀릭 치환기가 있기 때문으로 생각할 수 있다. 즉, 전자-공여 능력이 큰 치환기를 가진 화합물 일수록 라디칼 소거활성이 증가하는 결과를 보여주었는데, 이것은 페카리넨(Pekkarinen) 등의 보고와도 일치하였다(Pekkarinen, S.S., et al., J. Agric. Food Chem. 47: 3036-3043 (1999)).The substitution of an electron donating group at the ortho -position of the benzene ring is known to increase the radical scavenging activity because it can easily stabilize the phenoxy radical (Cuvelier, ME, Richard). , H., Berset, C., Biosci. Biotechnol.Biochem. 56: 324-325 (1992); Kikuzaki, H., et al., J. Agric.Food Chem. 50: 2161-2168 (2002)). In the case of the galloyl group, three hydroxyl groups are substituted at adjacent positions, which can effectively stabilize the phenoxy radicals, and thus exhibit strong radical scavenging activity. As shown in Table 3, in addition to galloyl esters, flavonoid compounds such as Formula 16 ((+)-catechin), Formula 9 (myricetin), Formula 10 (afzelin), Formula 11 (quercitrin) and Formula 12 (myricitrin) are also strong. Radical scavenging activity was shown, which is thought to be due to the presence of phenolic substituents that can effectively stabilize the phenoxy radicals generated in the flavonoid structure. In other words, the compound having a substituent having a large electron-donating ability was shown to increase the radical scavenging activity, which is consistent with the report of Pekarinen et al. (Pekkarinen, SS, et al., J. Agric. Food Chem. 47: 3036-3043 (1999)).
<실시예 3> 지질 과산화 억제 활성(Lipid peroxidation inhibitory activity) 측정Example 3 Measurement of Lipid Peroxidation Inhibitor Activity
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 지질 과산화 억제 활성을 측정하였다. 지질의 산화는 지질 하이드로퍼옥사이드(lipid hydroperoxides), 컨쥬게이트된 지방산(conjugated fatty acids, HODEs), 에폭시 지방산(epoxy fatty acids), 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA), 4-하이드록시노네날(4-hydroxynonenal, 4-HNE) 등의 산화물을 생성시켜 세포를 구성하는 생체막을 직접 손상시키거나 다른 세포 구성성분과 2차적인 반응을 일으켜 여러 가지 퇴행성질환 및 노화과정의 중요한 원인으로 알려져 있다(Esterbauer, H. et al., Free Radic. Biol. Med., 1991, 11:81-128; Esterbauer,H., Cheeseman, K.H., Methods Enzymol., 1990, 186:407-421; Jira, W., et al., Chem. Phys. Lipids, 1996, 84:165-173; Jira, W. et al., Biosci, 1998, 53:1061-1071). 일반적으로, 미토코드리아나 마이크로좀 등 세포내 전자전달계에서 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼은 체내 효소반응을 통하여 H2O2로 전환되며 이는 다시 카탈라제나 글루타치온 퍼옥시다제와 같은 효소에 의해 독성이 없는 물로 변환된다. 하지만, 여러 가지 요인에 의해 체내 활성산소가 많이 생성되면 H2O2는 펜톤(Fenton) 반응(Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO· + HO-)이나 메탈-카탈리즈된 하버-웨이스 반응(metal-catalysed Haber-Weiss reaction)(O2- + H2O2 → O2 + HO · + HO-)을 통해 반응성이 큰 하이드록실 라디칼(HO·)을 발생시켜 지질과산화물을 생성시키고 이것은 다시 체내 금속이온과 반응하여 지질 라디칼(L·)이나 지질 퍼옥시 라디칼(LOO·)을 유도하여 지질과산화 연쇄반응을 일으키는 것으로 잘 알려져 있다(Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., Free radicals in biology and medinene, 3rd Edition, Oxford University Press, Oxford, 1999; Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., Biochem. J., 1999, 219:1-14; Harman, D., Free radical theory of aging. Alan R Liss, New York, 1986, 3-49; Stadtman, E.R., Levine, R.L., Ann. NY Acad. Sci., 2000, 899:191-208). 그러므로, 전자 공여 능력이 있는 화합물은 결과적으로 지질의 과산화를 억제할 수 있는 것으로 받아들여진다.The present inventors measured the lipid peroxidation inhibitory activity in order to measure the antioxidant activity of the compound represented by
지질 과산화 억제 활성을 측정하는 것은 Fe2+/아스코르브산 반응계에 의하여 최종 생성된 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical)이 지질을 산화시켜 생성되는 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)를 티오바비투릭산(thiobarbituric acid, 이하 'TBA'라 칭함)과 반응시켜 분광학적 방법으로 정량하는 것이다. 구체적으로, 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물 시료 각각 10 ㎕과 10 mg 단백질/㎖ 농도의 쥐의 뇌 균질화물(Rat brain homogenate) 50 ㎕ 및 50 mM 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH 7.4) 740 ㎕를 섞은 후 0.1 mM FeSO4·7H2O와 1 mM 아스코르브산(ascorbic acid) 혼합액 200 ㎕를 넣어 37℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액에 20% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, 이하 'TCA'라 칭함)(Sigma) 250 ㎕를 가하여 반응을 정지시킨 후 1% TBA(Sigma) 250 ㎕를 가하고 100℃에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응액을 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 지질과산화 억제 활성은 하기 수학식 2에 따라 산출하였으며, 지질과산화 반응을 50% 억제시키는 농도를 IC50으로 하였다. 비교군으로는 α-토코페롤 및 BHA를 사용하였으며 대조군으로는 시료 및 용액을 아무것도 첨가하지 않은 것을 사용하였다.To measure the lipid peroxidation inhibitory activity, malondialdehyde (MDA) formed by oxidizing lipids of hydroxyl radicals produced by Fe 2+ / ascorbic acid reaction system was used to determine thiobarbituric acid. And hereinafter referred to as 'TBA') to quantify by spectroscopic method. Specifically, 10 μl of the compound samples represented by
Acontrol:시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도A control : Absorbance of control group without sample
Asample:시료를 첨가한 반응군의 흡광도A sample : Absorbance of reaction group with sample added
Ablank: 시료, TCA 및 TBA 용액을 첨가하지 않은 흡광도A blank : Absorbance without adding sample, TCA and TBA solution
그 결과, 플라보노이드계, 스틸벤계 및 페놀릭산계 화합물들이 농도-의존적으로 강한 지질과산화 억제활성을 나타내었다. 특히, 스틸벤계의 화학식 5(piceatannol)은 IC50 값이 0.09 ± 0.01 g/㎖로서 강력한 지질과산화 억제제로 알려져 있는 BHA(IC50 0.11 ± 0.02 g/㎖)와 비슷한 정도의 강한 활성을 나타내었다. 또한, 활성을 검색한 대부분의 플라보노이드계 화합물들이 강한 지질과산화 억제활 성을 나타내었는데, 구체적으로는 화학식 9(myricetin), 화학식 17((-)-epicatechin-3-O-gallate), 화학식 18((-)-epigallocatechin-3-O-gallate), 화학식 11(quercitrin), 화학식 12(myricitrin) 및 화학식 13(myricetin-3-O-(2-O-galloyl)-a-L-rhamnopyranoside)의 IC50 값이 각각 0.95 ± 0.06, 2.9 ± 0.06, 1.0 ± 0.08, 6.21 ± 0.40, 5.27 ± 0.32 및 4.73 ± 0.41 g/㎖로 나타나 양성 대조군으로 사용했던 α-토코페롤 보다 현저하게 강한 지질과산화 억제활성을 나타내었다(표 4). 지질과산화 억제 활성의 경우도 상기 실시예 2에서 실시한 DPPH 라디칼 소거활성 결과와 같이, 벤젠링에 전자-공여 그룹이 많이 치환되어 있을수록 페녹시 라디칼을 쉽게 안정화시키기 때문에 활성이 증가한다고 사료되었다. 특히, 플라보노이드계 화합물의 구조는 효과적으로 페녹시 라디칼을 안정화 시킬 수 있을 뿐만 아니라 금속이온을 킬레이트화 시킬 수 있으므로 강력한 지질과산화 억제활성을 나타내는 것으로 사료되었다.As a result, flavonoid-based, stilbene-based and phenolic acid-based compounds showed a concentration-dependent strong lipid peroxidation inhibitory activity. In particular, the stilbene formula (piceatannol) showed a strong activity similar to that of BHA (IC 50 0.11 ± 0.02 g / ml), which is known as a potent lipid peroxidation inhibitor with an IC 50 value of 0.09 ± 0.01 g / ml. In addition, most of the flavonoid compounds that detected the activity showed strong lipid peroxidation inhibitory activity, specifically, the formula (myricetin), formula 17 ((-)-epicatechin-3-O-gallate), formula 18 ( IC 50 values of (-)-epigallocatechin-3-O-gallate, Formula 11 (quercitrin), Formula 12 (myricitrin) and Formula 13 (myricetin-3-O- (2-O-galloyl) -aL-rhamnopyranoside) These were 0.95 ± 0.06, 2.9 ± 0.06, 1.0 ± 0.08, 6.21 ± 0.40, 5.27 ± 0.32 and 4.73 ± 0.41 g / ml, respectively, which showed significantly stronger lipid peroxidation inhibitory activity than α-tocopherol used as a positive control ( Table 4 ). In the case of lipid peroxidation inhibitory activity, as in the DPPH radical scavenging activity of Example 2, the more the electron-donating group is substituted in the benzene ring, the more the phenoxy radicals are stabilized, so the activity increases. In particular, the structure of the flavonoid-based compound can be effectively stabilized phenoxy radicals and chelate the metal ions, it is considered to exhibit a strong lipid peroxidation inhibitory activity.
<실시예 4> 하이드록실 라디칼 소거 활성(Hydroxyl radical scavenging activity) 및 나이트릭 옥사이드(nitric oxide) 소거활성 측정<Example 4> Measurement of hydroxyl radical scavenging activity and nitric oxide scavenging activity
하이드록실 라디칼(HO·)은 체내 금속이온 또는 슈퍼옥사이드 라디칼과 반응하여 생성되는데, 반응성이 매우 커서 직접적으로 체내 단백질, 지질 및 DNA의 산화적 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 나이트릭 옥사이드(Nitric oxide, NO·) 또한 슈퍼옥사이드 라디칼과 반응하여 반응성이 강한 퍼록시 나이트라이트(ONOO-)를 생성함으로써 하이드록실 라디칼과 비슷한 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Yan, L.J., Sohal, R.S., Free Radic. Biol. Med., 2000, 29:1143-1150). 이에, 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 화학식 1 내지 화 학식 20으로 표시되는 화합물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 할리웰의 방법(Halliwell, B. et al., Anal Biochem., 1987, 165, 215-219)에 따라 하이드록실 라디칼 제거 활성을 측정하였다. 구체적으로, 화합물을 DMSO에 녹인 시료 10 ㎕, 포스페이트 버퍼(20 mM, pH 7.4), 데옥시리보스(deoxyribose) 5.6 mM, FeCl3 0.1 mM, H2O2 1 mM 및 아스코르브산 0.1 mM을 혼합하여 1 ㎖이 되게 하여 37℃에서 60분간 반응시켰다. 상기 반응액에 20% TCA 250 ㎕ 및 1% TBA 용액(50 mM NaOH에 녹임) 250 ㎕를 첨가하여 95℃에서 5분동안 열반응시켰다. 상기 반응 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하이드록실 라디칼 소거 활성은 하기 수학식 3에 따라 계산하였다. 양성 대조군으로는 BHA 및 α-토코페롤을 사용하였다.Hydroxyl radicals (HO.) Are produced by reaction with metal ions or superoxide radicals in the body, and are known to be highly reactive and directly cause oxidative damage to proteins, lipids and DNA in the body. Nitric oxide (NO ·) is also known to exhibit a similar action to hydroxyl radicals by reacting with superoxide radicals to produce highly reactive peroxy nitrite (ONOO − ) (Yan, LJ, Sohal, RS). , Free Radic. Biol. Med ., 2000, 29: 1143-1150). Thus, the inventors of the present invention to measure the antioxidant activity of the compound represented by
Acontrol: 대조구 웰의 흡광도A control : absorbance of control wells
Asample: 시료를 첨가한 반응구 웰의 흡광도A sample : Absorbance of reaction wells with sample added
Ablank: 시료, TCA 및 TBA 용액을 첨가하지 않은 웰의 흡광도A blank : Absorbance of wells without addition of sample, TCA and TBA solution
하이드록실 라디칼 소거활성을 검색한 결과, 플라보노이드계, 스틸벤계 및 페놀릭산계 화합물들은 대조군과 비교하여 12.7 내지 54.0% 정도의 소거활성을 나타내었다. 특히, 화학식 17((-)-epicatechin-3-O-gallate), 화학식 18((-)-epigallocatechin-3-O-gallate), 화학식 7(methyl gallate), 화학식 8(ethyl gallate) 및 화학식 13(myricetin-3-O-(2-O-galloyl)-a-L-rhamnopyranoside) 등 갈로일 그룹이 치환된 화합물들이 강한 하이드록실 라디칼 소거활성을 나타내었다(표 5).As a result of searching for hydroxyl radical scavenging activity, the flavonoid-based, stilbene-based and phenolic acid-based compounds showed scavenging activity of about 12.7 to 54.0% compared to the control group. In particular, Formula 17 ((-)-epicatechin-3- O- gallate), Formula 18 ((-)-epigallocatechin-3- O -gallate), Formula 7 (methyl gallate), Formula 8 (ethyl gallate), and
또한, 나이트릭 옥사이드 소거활성을 검색한 결과, 화학식 18((-)-epigallocatechin-3-O-gallate), 화학식 17((-)-epicatechin-3-O-gallate), 화학식 16((+)-catechin), 화학식 9(myricetin) 등이 비교적 강한 활성을 나타내었다(표 5).In addition, as a result of searching for nitric oxide scavenging activity, Chemical Formula 18 ((-)-epigallocatechin-3- O -gallate), Chemical Formula 17 ((-)-epicatechin-3- O -gallate), Chemical Formula 16 ((+) -catechin), formula 9 (myricetin) and the like showed a relatively strong activity ( Table 5 ).
<실시예 5> 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성(Superoxide radical scavenging activity) 측정Example 5 Measurement of Superoxide Radical Scavenging Activity
슈퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical, O2-) 자체는 반응성이 비교적 약하지만, 쉽게 H2O2로 변환되어 결국, 반응성이 강한 하이드록실 라디칼을 생성하거나, 나이트릭 옥사이드(nitric oxide, NO·)와 반응하여 반응성이 강한 퍼록시 나이트라이트(peroxy nitrite, ONOO-)를 생성하여 SH-그룹의 산화, 단백질 티로신의 질산화(nitration), 지질과산화, DNA 손상 등을 일으키는 원인이 된다. 이에, 상기 실시예 1에서 분리한 화학식 1 내지 화학식 20으로 표시되는 화합물의 항산화 활성을 확인하기 위하여 다른 유해 활성산소류의 전구물질로 작용하는 슈퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical, O2
-)의 소거 활성을 측정하였다. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거 활성은 슈퍼옥사이드를 디스뮤테이션(dismutation) 시킴으로써 슈퍼옥사이드를 소거하는 효소인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 활성을 측정하여 검색할 수 있으며, 본 발명에서는 크산틴/크산틴 산화 효소(xanthine/xanthine oxidase)의 효소반응에 의한 슈퍼옥사이드 발생계 및 니트로 블루 테트라졸리움(nitro blue tetrazolium, 이하 'NBT'라 칭함)가 환원되어 포르마잔(formazan)이 생성되는 반응(NBT + 2O2
- → NBTH2 + 2O2)에 대한 시료의 억제 정도를 측정하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 4 mM 크산틴(xanthine, Sigma) 50 ㎕, 250 mM NBT(Sigma) 50 ㎕, 50 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.8, 1mM EDTA) 50 ㎕ 및 시료 10 ㎕를 넣은 후 크산틴 산화효소(Sigma) 40 ㎕를 넣어 반응시켰다. 상기 반응 후 시간별로 각 반응액을 수거하여 ELISA 측정기로 550㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성은 하기 수학식 4에 나타난 바와 같이 대조구에 대한 NBT의 환원 감소 정도로써 산출하였으며, 슈퍼옥사이드 라디칼을 50% 소거시키는 시료의 농도를 IC50으로 하였다. 양성대조군으로는 α-토코페롤 및 카페익산(caffeic acid)을 사용하여 항산화 효과를 비교하였다.Superoxide radicals (O 2- ) themselves are relatively weak, but are easily converted to H 2 O 2 , resulting in highly reactive hydroxyl radicals, or nitric oxides (NO ·) reaction by a strong reactive peroxidase nitrite - is caused by creating a cause such as the oxidation of SH- groups, protein tyrosine nitride (nitration), lipid peroxidation, DNA damage (peroxy nitrite, ONOO). Thus, in order to confirm the antioxidant activity of the compounds represented by
Acontrol: 시료를 첨가하지 않은 대조구 웰의 흡광도A control : Absorbance of control well without sample
Asample: 시료를 첨가한 반응구 웰의 흡광도A sample : Absorbance of reaction wells with sample added
Ablank: 시료 및 NBT 용액을 첨가하지 않은 웰의 흡광도A blank : absorbance of sample and wells without NBT solution
그 결과, 플라보노이드계, 스틸벤계 및 페놀릭산계 화합물들이 농도-의존적으로 강한 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 나타내었다. 특히, 플라반-3-올(flavan-3-ol)의 화학식 17((-)-epicatechin-3-O-gallate), 화학식 18((-)-epigallocatechin-3-O-gallate) 및 화학식 15(myricetin-3-O-(2-O-galloyl)-a-L-rhamnopyranoside)의 IC50 값은 각각 11.9 ± 2.1, 24.0 ± 3.5 및 13.2 ± 2.5 g/㎖로서 강력한 슈퍼옥사이드 라디칼 소거제로 알려져 있는 카페익산(caffeic acid)(IC50 11.0 ± 1.8 g/㎖)과 비슷한 정도의 강한 활성을 나타내었다. 또한, 플라보노이드계 및 페놀릭산계 화합물들이 강한 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 나타내었는데, 화학식 9(myricetin), 화학식 16((+)-catechin), 화학식 7(methyl gallate) 및 화학식 8(ethyl gallate)의 IC50 값은 각각 12.1 ± 1.1, 16.5 ± 2.0, 16.5 ± 1.4 및 15.8 ± 1.6 g/㎖ 정도로서 강한 활성을 나타내 었다. 하지만, 찰콘계 화합물의 경우는 비교적 활성이 약하게 나타났다. 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성의 경우도, 슈퍼옥사이드와 반응하여 생성된 페녹시 라디칼을 쉽게 안정화 시킬 수 있는 구조를 가진 화합물들이 좋은 활성을 나타내었다. 특히, 갈로일 그룹이 치환된 화합물이 강한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(표 6).As a result, flavonoid-based, stilbene-based and phenolic acid-based compounds showed a concentration-dependently strong superoxide radical scavenging activity. In particular, the formula 17 ((-)-epicatechin-3-O-gallate), formula 18 ((-)-epigallocatechin-3-O-gallate), and
<실시예 6> <Example 6> tt -부틸하이드로퍼옥사이드로 유도되는 산화적 손상에 대한 세포보호 활성Cytoprotective Activity Against Oxidative Damage Induced by -Butylhydroperoxide
t-부틸하이드로퍼옥사이드는 세포에 들어가서 자유 라디칼 중간체(intermediate)로 대사되어 지질과산화를 유발시켜 결국 세포 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은 세포와 조직에서 일어나는 산화적 스트레스와 유사하므로, 실질적인 의미에서 산화적 스트레스에 의한 노화 억제를 평가할 수 있는 유용한 방법이다. 신생아 표피 세포인 HEK-N/F 세포에 t-부틸하이드로퍼옥사이드 1.5 mM을 3시간 동안 처리한 결과, 세포의 생존율이 11.2 ± 1.2%정도로 현저히 감소된 반면, 분리된 화합물을 50.0 g/㎖의 농도로 함께 처리하였을 때에는 현저한 세포보호 활성을 나타내었다. 특히, 화학식 5(piceatannol)를 병용처리 했을 때 세포 생존율이 84.7 ± 6.9%로서 가장 강한 활성을 나타내었으며, 화학식 9(myricetin), 화학식 11(quercetin) 등의 플라본 3-올 화합물도 각각 61.0 ± 4.5%와 48.1 ± 5.7%의 세포 생존율을 나타내었다. 또한, 화학식 6(gallic acid), 화학식 7(methyl gallate), 화학식 8(ethyl gallate) 등도 각각 41.5 ± 3.1%, 43.0 ± 5.6%, 43.1 ± 4.1% 정도의 세포보호 활성을 나타내었다. 상기 결과를 통해 본 발명의 박태기나무 추출물에서 수득한 화합물은 세포의 산화적 스트레스를 효과적으로 억제하여 과산화에 의한 세포 사멸을 억제하는 것으로써 산화적 스트레스에 의한 노화를 억제 시킬 수 있음을 확인하였다. t -Butylhydroperoxide is known to enter cells and metabolize into free radical intermediates, causing lipid peroxidation and eventually cell damage. Since this phenomenon is similar to the oxidative stress occurring in cells and tissues, it is a useful method to evaluate the inhibition of aging by oxidative stress in a practical sense. Treatment of neonatal epidermal cells, HEK-N / F cells, with 1.5 mM of t -butylhydroperoxide for 3 hours resulted in a significant decrease in cell viability of 11.2 ± 1.2%, whereas 50.0 g / ml When treated together at a concentration, it showed significant cytoprotective activity. In particular, the combination of Formula 5 (piceatannol) and the combination showed the strongest cell survival rate of 84.7 ± 6.9%, and the flavone 3-ol compounds of Formula 9 (myricetin), Formula 11 (quercetin), respectively 61.0 ± 4.5 Cell viability of 4% and 48.1 ± 5.7% was shown. In addition, Formula 6 (gallic acid), Formula 7 (methyl gallate), Formula 8 (ethyl gallate) and the like also showed a cytoprotective activity of about 41.5 ± 3.1%, 43.0 ± 5.6%, 43.1 ± 4.1%, respectively. Through the above results, it was confirmed that the compound obtained in the extract of Paktaegi of the present invention can effectively inhibit the oxidative stress of the cell and thereby inhibit aging caused by the oxidative stress by inhibiting cell death by peroxidation.
<실시예 7> UV 조사로 유도되는 산화적 스트레스에 대한 보호 활성Example 7 Protective Activity Against Oxidative Stress Induced by UV Irradiation
<7-1> UV 조사에 대한 세포보호 효과(<7-1> Cytoprotective effect on UV irradiation ( in vitroin vitro ))
UV 조사는 세포내 활성산소를 현저히 증가시켜 DNA 손상, DNA-단백질 연결 등을 유발한다. HEK-N/F 세포에 35 mJ/cm2의 UVB를 조사하면 핵의 DNA 사슬이 끊어지는데, 이것을 DNA 가닥 인터킬레이팅(intercalating) 형광염료인 에티듐 호모다이머(Et2)와 결합시킨 후 형광의 세기를 측정함으로써 정량하였다. 구체적으로, HEK-N/F 세포를 무혈청 KGM 배지(Clonetics)에 넣고 배양시킨 후 24-웰 플레이트에 0.5 내지 4 ×104 세포수/2 cm2가 되도록 접종 시켰다. 세포를 18시간 동안 배양시킨 후 2시간 동안 시료를 처리하였다. PBS로 세척한 후 UV 검출기(Spectronics UV transilluminator EBF-260, the maximal wavelength, 312 nm; a half-peak intensity range, 297-328 nm)을 이용하여 세포에 UV를 조사하였다. UV 조사된 세포를 1-7시간 배양시키고 5 M 에티듐 호모다이머(Et2, Millipore)를 투여했다. 30분 후 밀리포어 마이크로플레이트 프루오로미터 사이토플루오로 2350(Millipore microplate fluorometer Cytofluor 2350, excitation: 485 nm, emission: 645 nm)을 이용하여 형광을 측정하였다.UV irradiation significantly increases free radicals in cells, causing DNA damage, DNA-protein linkages, and the like. Irradiation of 35 mJ / cm 2 UVB to HEK-N / F cells breaks the DNA chain of the nucleus, which binds to the ethidium homodimer (Et2), a DNA strand intercalating fluorescent dye. Quantification by measuring the intensity. Specifically, HEK-N / F cells were inoculated in serum-free KGM medium (Clonetics) and incubated in a 24-well plate so as to be 0.5 to 4 × 10 4 cells / 2 cm 2 . Cells were incubated for 18 hours and then sampled for 2 hours. After washing with PBS, the cells were irradiated with UV using a UV detector (Spectronics UV transilluminator EBF-260, the maximal wavelength, 312 nm; a half-peak intensity range, 297-328 nm). UV irradiated cells were incubated for 1-7 hours and administered with 5 M ethidium homodimer (Et2, Millipore). After 30 minutes, fluorescence was measured using a Millipore microplate fluorometer Cytofluor 2350 (excitation: 485 nm, emission: 645 nm).
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 박태기나무 추출물, 화학식 9(myricetin) 및 화학식 5(piceatannol)을 처리하였을 때에는 대조군의 형광보다 각각 54.7% 및 66.7% 정도 낮은 형광을 나타내었다. 즉, 박태기나무 추출물 및 이들로부터 분리한 활성성분은 UV에 의한 산화적 스트레스를 억제하여 DNA 손상을 현저히 감소시켰다.As a result, as shown in Figures 6a and 6b , when treated with the extract of Paktaegi, Formula 9 (myricetin) and Formula 5 (piceatannol) showed a fluorescence of 54.7% and 66.7% lower than the fluorescence of the control, respectively. In other words, the extract of Park Tae-gi and the active ingredients separated from them significantly inhibited the oxidative stress caused by UV and significantly reduced DNA damage.
<7-2> UV 조사에 대한 피부조직 보호 효과(<7-2> Skin tissue protection effect against UV irradiation ( in vitroin vitro ))
5-6주령 된 암컷 무모쥐(hairless mouse, SKH-hr-1)를 온도 24 ±2℃, 상대습도 50 ±10%, 12시간 낮/밤의 사이클로 14일 정도 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험하기 30-60분 전에 시료를 무모쥐의 5개의 지점에 피하주사한 후 쥐의 등에 UVB를 조사시켰다. 다음으로 20 ×15 ×5 cm 케이지에 한 그룹 당 5마리의 쥐를 넣고 15 cm의 거리에서 UV 램프(HP-15M, 280-400 nm, max. 312 nm; Atto Co., Japan)로 제곱미터 당 15 kJ이 되도록 UVB를 조사하였다. UVB를 24시간 동안 조사한 후 등쪽의 피부를 잘라 과산화 측정시까지 -70℃에서 보관하였다.5-6 week old female hairless mice (hairless mouse, SKH-hr-1) were used in the experiment after adapting the temperature 24 ± 2 ℃,
UVB 조사는 피부 조직에서 현저한 지질과산화를 유발시키므로, 과산화된 지질의 함량을 측정함으로써 피부의 손상 정도를 측정할 수 있다. 이에 지질과산화를 측정하였다. 구체적으로 SKH-1 무모쥐의 등 표면에 UVB를 조사하고 48시간 후에 등의 피부조직을 잘라 티오바비튜릭산(thiobarbituric acid, TBA)법으로 지질과산화를 측정하였다. 무모 쥐의 등쪽 피부를 10배의 50 mM K-P 완충액에 넣은 후, 균질화(homogenation)시켰다.Since UVB irradiation causes significant lipid peroxidation in skin tissue, the extent of damage to the skin can be measured by measuring the content of peroxidized lipids. Lipid peroxidation was measured. Specifically, UVB was irradiated on the back surface of SKH-1 hairless rat, and after 48 hours, the skin tissue of the back was cut and lipid peroxidation was measured by thiobarbituric acid (TBA) method. Dorsal skin of hairless rats was placed in 10-fold 50 mM K-P buffer and then homogenized.
다음으로 하이드로젠 퍼옥사이드를 관찰하였다. 냉동시킨 등의 피부 절편을 1 ㎎/㎖ 글루코스와 1 ㎎/㎖ 디아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAB)을 함유한는 0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 넣고 37℃에서 5 내지 6시간 동안 배양하였다. 증류수로 세척한 후 2% 메틸 그린(methyl green)으로 60분간 염색하였다. 현미경으로 갈색의 DAB-퍼옥시다제와 파란색으로 염색되는 핵을 관찰하였다.Next, hydrogen peroxide was observed. Frozen sections of skin were placed in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mg / ml glucose and 1 mg / ml diaminobenzidine (DAB) and incubated at 37 ° C. for 5-6 hours. . After washing with distilled water and stained with 2% methyl green (methyl green) for 60 minutes. Microscopically observed brown DAB-peroxidase and nuclei stained blue.
UV 조사는 피부조직에서 활성산소종의 생성을 유도하여 DNA 손상, 단백질의 산화, 지질과산화 등을 유발 시켜 결국, 염증이나 암, 피부노화 같은 피부의 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 도 7에서 나타난 바와 같이 90 mJ/cm2으로 UVB를를 조사하였을 때에는 현저한 피부 손상이 관찰되었다. 하지만, 박태기나무 추출물 및 화학식 5(piceatannol)을 50 ㎎/㎏의 농도로 전처리 하였을 때에는 SKH-1 무모쥐의 피부손상이 현저히 억제되었다. 상기 실시예의 결과에서 알 수 있듯이 박태기나무 추출물 및 그의 활성 성분인 화학식 5(piceatannol)는 강력한 라디칼 소 거활성, 지질과산화 억제활성 및 산화적 스트레스에 대한 피부세포의 보호활성을 나타내었으므로, UVB 조사로 유도되는 피부 손상에 대한 보호 효과는 이러한 항산화 활성에서 기인할 것으로 사료되었다. 디아미노벤지딘(Diaminobenzidine, DAB)은 조직의 퍼옥시다제와 반응하여 진한 갈색의 DAB-퍼옥시다제를 생성하므로 이를 이용해 UVB 조사에 의해 생성되는 H2O2를 관찰하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이 90 mJ/cm2로 UVB를 조사하였을 때에는 진한 갈색의 DAB-퍼옥시다제가 많이 관찰되었지만, 박태기나무 추출물 및 화학식 5(piceatannol)을 50 mg/kg의 농도로 전처리 하였을 때에는 SKH-1 무모쥐의 피부 조직에서 H2O2 생성이 현저히 억제되었다. UV irradiation is known to induce the generation of reactive oxygen species in the skin tissues, causing DNA damage, protein oxidation, lipid peroxidation, and eventually cause skin damage such as inflammation, cancer, and skin aging. As shown in FIG. 7 , when irradiated with UVB at 90 mJ / cm 2 , significant skin damage was observed. However, the skin damage of SKH-1 hairless rats was significantly inhibited when the extract of Park Tae Ki and Formula 5 (piceatannol) were pretreated at a concentration of 50 mg / kg. As can be seen from the results of the above example, the extract of Park Tae-gi and its active ingredient, formula (piceatannol), showed strong radical scavenging activity, lipid peroxidation inhibitory activity and protective activity of skin cells against oxidative stress, and thus, UVB irradiation The protective effect against skin damage induced by H. pylori was thought to be due to this antioxidant activity. Diaminobenzidine (DAB) reacted with tissue peroxidase to produce dark brown DAB-peroxidase, and thus observed the H 2 O 2 produced by UVB irradiation. As shown in FIG. 7 , dark brown DAB-peroxidase was observed when UVB was irradiated at 90 mJ / cm 2 , but when the extract of P. chinensis and Formula 5 (piceatannol) was pretreated at a concentration of 50 mg / kg H 2 O 2 production was markedly inhibited in skin tissues of SKH-1 hairless mice.
지질과산화를 측정한 결과, UVB를 조사한 군의 평균 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances) 함량은 약 0.68 nmol/mg 단백질로서 UVB를 조사하지 않은 대조군(0.32 ± 0.05 nmol/mg 단백질)에 비해 2배 정도 지질과산화가 일어났다 (표 8). 박태기나무 추출물 및 화학식 5(piceatannol)를 처리한 군은 농도-의존적으로 피부의 지질과산화가 감소되었다. 특히, 화학식 5는 같은 농도에서 양성 대조군으로 사용했던 MAP(magnesium-L-ascorbyl-2-phosphate)보다도 높은 활성을 나타내었다.As a result of measuring lipid peroxidation, the average thibarbituric acid reactive substances (TBARS) content of the UVB-irradiated group was about 0.68 nmol / mg protein, which was twice as much as the control group (0.32 ± 0.05 nmol / mg protein) without UVB irradiation. Peroxidation occurred ( Table 8 ). The group treated with the extract of Park Tae-Ki and Formula 5 (piceatannol) reduced the lipid peroxidation of the skin in a concentration-dependent manner. In particular,
<실시예 8> 세포 수명에 대한 연장 효과Example 8 Prolonged Effect on Cell Lifespan
HEK-N/F 세포들은 피부의 또 다른 주성분인 섬유아세포를 유리딘 브로마이드(uridine bromide)로 처리한 후 인간 신생아 포피로부터 얻어 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양시켰다. HEK-N/F 세포는 1:4의 희석 비율로 연속적으로 배양시켰다. 시료를 처리하기 전에 약 3의 PDL(population doubling level)에 이르기까지 성장시키고, 이후 배양하는 동안 각각의 시료를 3 g/ml의 농도로 투여하였다. 배지 교환은 동일한 농도의 시료를 함유하는 배양액을 첨가하여 3일마다 수행하였다. 세포 배양후 본 발명의 박태기나무 추출물, 화학식 5(piceatannol) 및 화학식 9(myricetin)를 처리하여 세포 분열을 관찰하였다.HEK-N / F cells were treated with uridine bromide, another major component of skin, and then cultured in DMEM medium containing 10% FBS obtained from human neonatal foreskin. HEK-N / F cells were cultured continuously at a dilution ratio of 1: 4. The samples were grown to a population doubling level (PDL) of about 3 before treatment, and then each sample was administered at a concentration of 3 g / ml during incubation. Medium exchange was performed every 3 days with the addition of a culture solution containing the same concentration of sample. After cell culture, cell division was observed by treating the extract of Park Tae-Ki, Formula 5 (piceatannol) and Formula 9 (myricetin) of the present invention.
그 결과, 박태기나무 추출물 및 활성성분은 피부 세포의 수명을 연장시키는 것으로 나타났다. 아무 것도 처리하지 않은 대조군은 평균 수명이 약 35일인데 반하여 박태기나무 추출물을 3 ㎍/㎖씩 처리하여 배양했을 때에는 평균 수명이 42일 정도로 대조군에 비해 약 1.2배 정도 수명이 연장되었다. 활성 성분인 화학식 9(Myricetin)와 화학식 5(piceatannol)을 처리하여 배양했을 때에는 평균 수명이 각각 56일과 76일로 대조군에 비해 각각 1.6배 및 2.1배 정도 세포의 수명이 연장되었다(도 8). 따라서, 본 발명의 박태기 나무 추출물 및 이로부터 분리한 활성 성분은 세포 수명 연장효과를 가짐을 알 수 있었다.As a result, it was found that the extract and active ingredient of taegi tree extends the life of skin cells. The control group which was not treated with anything had an average lifespan of about 35 days, whereas the life expectancy was extended by 1.2 times as compared to the control group when the average lifespan was 42 days when incubated with 3 ㎍ / ml of the extract. When the cells were cultured with the active ingredients of Formula 9 (Myricetin) and Formula 5 (piceatannol), the average lifespan was 56 days and 76 days, respectively, and the lifespan of the cells was extended by 1.6 and 2.1 times, respectively ( Fig. 8 ). Therefore, it was found that the extract of Park Tae-Ki of the present invention and the active ingredient isolated therefrom have the effect of prolonging cell life.
<실시예 9> 텔로미어 길이와 세포수명에 대한 연장 효과Example 9 Extension Effect on Telomere Length and Cell Lifetime
상기 실시예 8에서 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리한 활성성분은 세포수명 연장효과를 가짐을 확인하였다. 이에, 세포수명 연장효과와 텔로미어 길이 사이의 관계를 알아보고자 하였다. 구체적으로, 게노믹 DNA는 핵산 추출 킷트(IsoQuick Nucleic Acid Extraction kit, ORCA Research Inc.)를 이용하여 각각의 연령의 세포들로부터 추출하였고, Tris-EDTA(10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용해하여 4℃에서 보존하였다. 1.5 ㎖ 튜브에 10 ×H 완충액(TaKaRa) 2 ㎕, 상기에서 추출한 게노믹 DNA 용액 2 ㎕를 넣고 3차 증류수를 넣어 전체를 19 ㎕가 되도록 한 후 제한 효소 Hinf I(6 U/l, TaKaRa) 1 ㎕를 첨가하였다. 상기 혼합액을 37℃에서 3 내지 4시간 동안 반응시킨 후 전기영동을 시켰다. 전기영동시 아가로즈(type I, Sigma) 겔은 브릿지 부분이 1%, 베드부분이 0.8%가 되도록 갤 농도를 조절하여 겔판을 제작하였고(마리솔 KS-8405, 20×14 cm), 1×보이어 완충액(50 mM Tris-HCl, 20 mM 소듐 아세테이트, 2 mM EDTA, 18 mM NaCl, pH 8.0)를 사용하였다. 마커로는 1 Kb DNA 래더(GIBCO)를 사용하여 0.5 ㎍을 로딩하였고 모든 샘플은 로딩 버퍼 3 ㎕씩을 넣고 35 V/cm로 20시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 에티듐 브로마이드(2 ㎍/㎖)로 15분간 염색하고 UV에 놓고 확인하였다. 이어서 겔을 0.25 N HCl에 넣어 15분간 진탕한 후 증류수로 2회 세척하였다. 이 겔을 변성액(0.2 N NaOH, 0.6 M NaCl)에 담그고 실온에서 25분간 진탕한 뒤 증류수로 3회 세척하였다. 6 ×SSC를 채운 블라팅(blotting) 장치에 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane Optitran BA-S 85, Schleicher & Schuel), 3 mm 노지, 페이퍼 타월, 유리판, 추(2 ㎏)의 순서대로 얹고 하루 밤 동안 블라팅시켰다. 블라팅이 완료된 후에 막 필터를 3 ×SSC에 담그고 가볍게 수분을 제거한 후 UV에서 웰의 위치를 기입하였다. 노지에 꽂아 80℃에서 하루 밤 베이킹(baking)하고 65℃에서 변성된 연어 정자(denatured salmon sperm) DNA(Wako)로 전혼성화(prehybridization) 시킨 후 50℃에서 혼성 완충액(1×Denhan solution, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 50 g/ml denatured salmon sperm DNA)과 5'-말단 [32P]-표지된 (TTAGGG)4로 혼성화시켰다. 혼성화된 막을 세정액(4×SSC/0.1% SDS)에 담그고 55℃에서 15분 진탕한 후 건조시켜 랩으로 덮고 X-ray 필름(Scientific Imaging Film, Kodak)과 함께 증감지를 붙인 카세트에 세트하여 -80℃에서 하루 밤 동안 동위원소 현상(autoradiography)을 실시하였다. 현상한 필름과 막의 위치를 합해 매직으로 웰의 위치를 표시하였다. TRFs의 밀도 피크를 레이저 덴시토미터(laser densitometer UltroScan XL, Pharmacia)로 검출하여 그 이동도를 산출하였다.In Example 8, it was confirmed that the extract of Park Tae Ki of the present invention and the active ingredient separated therefrom have an effect of prolonging cell life. The aim of this study was to investigate the relationship between cell life extension effect and telomere length. Specifically, genomic DNA was extracted from cells of each age using an IsoQuick Nucleic Acid Extraction kit (ORCA Research Inc.), and Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). ) And stored at 4 ° C. 2 μl of 10 × H buffer (TaKaRa) and 2 μl of the genomic DNA solution extracted above were added to a 1.5 ml tube, followed by tertiary distilled water to make 19 μl of the total restriction enzyme, Hinf I (6 U / l, TaKaRa). 1 μl was added. The mixture was reacted at 37 ° C. for 3 to 4 hours, followed by electrophoresis. In electrophoresis, agarose (type I, Sigma) gel was prepared by adjusting the concentration of the gel so that the bridge part was 1% and the bed part was 0.8% (Marisol KS-8405, 20 × 14 cm), 1 × Boy Buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM sodium acetate, 2 mM EDTA, 18 mM NaCl, pH 8.0) was used. As a marker, 0.5 μg was loaded using 1 Kb DNA ladder (GIBCO), and all samples were subjected to electrophoresis for 20 hours at 35 V / cm in 3 μl of loading buffer. After electrophoresis was completed, stained with ethidium bromide (2 ㎍ / ㎖) for 15 minutes, placed in UV and confirmed. The gel was then shaken for 15 minutes in 0.25 N HCl and washed twice with distilled water. The gel was immersed in a denatured solution (0.2 N NaOH, 0.6 M NaCl), shaken for 25 minutes at room temperature, and washed three times with distilled water. 6 x SSC-filled blotting device in order of nitrocellulose membrane Optitran BA-S 85, Schleicher & Schuel, 3 mm noji, paper towel, glass plate, weight (2 kg) Blotting while. After blotting was complete the membrane filter was immersed in 3 x SSC, lightly dehydrated and the wells positioned in UV. Baked at 80 ° C. overnight at 80 ° C., prehybridized with denatured salmon sperm DNA (Wako) at 65 ° C., and then mixed buffer (1 × Denhan solution, 1 M at 50 ° C.). NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.1% SDS, 50 g / ml denatured salmon sperm DNA) and 5'-terminal [ 32 P] -labeled (TTAGGG) 4 . The hybridized membrane was immersed in a cleaning solution (4 × SSC / 0.1% SDS), shaken at 55 ° C. for 15 minutes, dried, covered with a wrap, and placed in a sensitized cassette together with an X-ray film (Scientific Imaging Film, Kodak). Autoradiography was performed overnight at < RTI ID = 0.0 > The position of the well was marked by magic by combining the developed film and the position of the film. The density peaks of TRFs were detected with a laser densitometer UltroScan XL, Pharmacia to calculate their mobility.
그 결과, 세포분열을 함에 따라 텔로미어의 길이가 점진적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 도 9에서 보여진 바와 같이, 대조군은 14.8회 분열한 후 텔로미어의 길이가 약 8.0 kbp정도로 감소해 더 이상 분열하지 못했다. 반면, 박태기나무 추출물이나 활성 성분을 처리한 군은 대조군에 비해 훨씬 더 많은 분열을 한 후에 텔로미어의 길이가 임계치(본 발명에서는 약 8.0 kbp)에 도달하였다. 세포분열은 텔로머릭 DNA가 임계치(인간 피부 케라티노사이트는 7.9-8.4 kb인 것으로 추정) 이상으로 유지되는 한 계속될 수 있었다. 이러한 관점에서 텔로미어가 단축되는 속도를 지연시켜 임계치에 도달하는 속도를 늦춤으로써 세포분열 능력이 종료되는 주기를 연장시킬 수 있는 것으로 나타났다. 즉, 대조군의 최대 PDL은 14.1인데 반해 박태기나무 추출물을 투여했을 때에는 최대 PDL이 17.2, 화학식 9(myricetin)은 23.1, 화학식 5(piceatannol)는 29.9로써 최대 PDL이 현저히 증가하였다.As a result, it was observed that the length of telomeres gradually decreased with cell division. As shown in FIG . 9 , the control group splits 14.8 times, and the telomeres decrease to about 8.0 kbp in length, and no longer divide. On the other hand, in the group treated with the extract or active ingredient, the length of telomeres reached a critical value (about 8.0 kbp in the present invention) after much more cleavage than the control group. Cell division could continue as long as telomeric DNA remained above the threshold (presumably human skin keratinocytes were estimated to be 7.9-8.4 kb). In this regard, it has been shown that by delaying the rate at which telomeres are shortened, the rate at which the cell division capacity is terminated can be extended by slowing the rate of reaching the threshold. In other words, the maximum PDL of the control group was 14.1, whereas the maximum PDL was significantly increased when the extract was administered to 17.2, formula 9 (myricetin) 23.1, formula 5 (piceatannol) 29.9.
또한, 세포분열 횟수와 상기 측정한 텔로미어 길이의 관계로부터 텔로미어 단축 속도를 계산한 결과, 박태기나무 추출물, 화학식 9(myricetin) 및 화학식 5(piceatannol)를 투여한 군의 텔로미어 단축 속도는 대조군에 비해 각각 1.2, 1.6 및 2.1배 씩 늦춰진 것을 확인하였다(도 10). 따라서, 박태기나무 추출물 및 활성성분의 피부세포 수명 연장 효과는 텔로미어 단축 속도를 늦춤으로써 나타나는 결과로 사료되었다.In addition, as a result of calculating the telomere shortening rate from the relationship between the number of cell division and the measured telomere length, the telomere shortening rate of the group administered the extract of Park Tae-gi, extracts (myricetin) and formula (piceatannol) were respectively compared to the control group. It was confirmed that the delayed by 1.2, 1.6 and 2.1 times ( Fig. 10 ). Therefore, the effect of prolonging the skin cell lifespan of the extract of Park Tae Ki and the active ingredient was considered to be the result of slowing down the telomeres shortening rate.
<제조예 1> 박태기나무 추출물을 함유하는 기능성 식품의 제조Preparation Example 1 Preparation of Functional Food Containing Extract of Park Tae Ki
본 발명자들은 상기 박태기나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품을 하기와 같이 제조하였다.The present inventors prepared the food containing the extract of Paktaegi as an active ingredient as follows.
<1-1> 음료의 제조<1-1> Beverage Production
꿀 522 ㎎522 mg of honey
치옥토산아미드 5 ㎎
니코틴산아미드 10 ㎎
염산리보플라빈나트륨 3 ㎎
염산피리독신 2 ㎎
이노시톨 30 ㎎
오르트산 50 ㎎Orthoic acid 50 mg
박태기나무 추출물 0.48 ∼ 1.28 ㎎Park Tae-gi Extract 0.48-1.28 mg
물 200 ㎖200 ml of water
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.With the above composition and content, drinks were prepared using conventional methods.
<1-2> 츄잉껌의 제조<1-2> Preparation of Chewing Gum
껌베이스 20 %
설탕 76.36 ∼ 76.76 %Sugar 76.36-76.76%
박태기나무 추출물 0.24 ∼ 0.64 %Park Tae-gi Extract 0.24 ~ 0.64%
후르츠향 1 %1% fruit flavor
물 2 %
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.Chewing gum was prepared using conventional methods using the above composition and content.
<1-3> 캔디의 제조<1-3> Preparation of Candy
설탕 50 ∼ 60 %50 to 60% sugar
물엿 39.26 ∼ 49.66 %Starch syrup 39.26-49.66%
박태기나무 추출물 0.24 ∼ 0.64 %Park Tae-gi Extract 0.24 ~ 0.64%
오렌지향 0.1 %Orange flavor 0.1%
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.Candy was prepared using conventional methods with the above composition and content.
<1-4> 비스켓의 제조<1-4> Preparation of Biscuits
박력1급 88 ㎏
중력1급 76.4 ㎏Gravity First Class 76.4 ㎏
정백당 16.5 ㎏16.5 kg per white
식염 2.5 ㎏2.5 kg of salt
포도당 2.7 ㎏2.7 kg of glucose
팜쇼트닝 40.5 ㎏Palm shortening 40.5 kg
암모 5.3 ㎏5.3 kg of ammo
중조 0.6 ㎏Medium kg 0.6 kg
중아황산나트륨 0.55 ㎏0.55 kg sodium bisulfite
쌀가루 5.0 ㎏Rice flour 5.0 kg
비타민 B1 0.003 ㎏Vitamin B1 0.003 kg
비타민 B2 0.003 ㎏0.003 kg of vitamin B2
밀크향 0.16 ㎏Milk Flavor 0.16 ㎏
물 71.1 ㎏71.1 kg of water
전지분유 4 ㎏
대용분유 1 ㎏Substitute
제일인산칼슘 0.1 ㎏0.1 kg of calcium phosphate
살포염 1 ㎏Spray
분무유 25 ㎏25 kg of spray oil
박태기나무 추출물 0.2 ∼ 0.5 ㎏0.2 ~ 0.5 kg
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 비스켓을 제조하였다.Biscuits were prepared using conventional methods with the above composition and content.
<1-5> 아이스크림의 제조<1-5> Preparation of Ice Cream
유지방 10.0 %Milkfat 10.0%
무지유고형분 10.8 %Non-fat solids 10.8%
설탕 12.0 %Sugar 12.0%
물엿 3.0 %Starch syrup 3.0%
유화안정제(스팬,span) 0.5 %Emulsifying stabilizer (span) 0.5%
향료(스트로베리) 0.15 %Spices (Strawberries) 0.15%
물 63.31 ∼ 62.91 %Water 63.31-62.91%
박태기나무 추출물 0.24 ∼ 0.64 %Park Tae-gi Extract 0.24 ~ 0.64%
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.Ice cream was prepared using conventional methods using the above composition and content.
<1-6> 쵸코렛의 제조<1-6> Preparation of Chocolate
설탕 34.36 ∼ 34.76 %Sugar 34.36-34.76%
코코아 버터 34 %Cocoa Butter 34%
코코아 매스 15 %
코코아 파우다 15 %
레시틴 0.5 %Lecithin 0.5%
바닐라향 0.5 %0.5% vanilla
박태기나무 추출물 0.24 ∼ 0.64 %Park Tae-gi Extract 0.24 ~ 0.64%
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 초코렛을 제조하였다.With the above composition and content, chocolate was prepared using conventional methods.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 박태기나무 추출물 및 이로부터 분리 된 화학식 1 내지 화학식 21로 표시되는 화합물은 합성 항산화제와는 달리 인체에 무해하고 다른 천연 항산화제에 비하여 활성이 우수할 뿐만 아니라 세포노화와 관련 있는 텔로미어 길이의 단축을 억제함으로써 피부세포의 수명을 연장시킬 수 있으므로, 노화 또는 활성 산소에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 기능성 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the extract of Park Tae-gi and the compounds represented by
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