KR100818361B1

KR100818361B1 - 물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리된 프락시딘을포함하는 톡소플라즈마증 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100818361B1
Application number: KR1020060117294A
Authority: KR
Inventors: 김윤철; 박현; 강경화
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2006-11-25
Filing date: 2006-11-25
Publication date: 2008-04-01

Abstract

본 발명은 톡소포자충 억제 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla)의 줄기 껍질인 진피 (Fraxini Cortex)의 추출물 또는 이로부터 분리된 프락시딘은 콕시디움, 즉 톡소포자충에 대한 억제 활성을 나타내므로 톡소플라즈마증(toxoplasmosis) 치료용 약학조성물로 이용될 수 있다.

물푸레나무, 진피, 프락시딘, 콕시디움, 톡소포자충, 톡소플라즈마증, 약학조성물

Description

물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리된 프락시딘을 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 조성물{A composition containing the extract of Fraxinus rhynchophylla or fraxidin isolated therefrom to treat toxoplasmosis}

도 1은 항톡소포자충 활성의 생체내(in vivo) 실험 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 항톡소포자충 활성을 갖는 물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리된 프락시딘을 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

콕시디움(coccidium)에 의해 일어나는 콕시디움증(coccidiosis)은 현재 소, 양, 토끼, 가금에 문제를 일으키는 원충성 질병중 대표적인 질병으로서 특히 가금에 치명적인 손상을 유발한다. 콕시디움증은 치료 및 예방제로서 항생제를 주로 사용하여 왔으나 치료 효율이 비교적 낮고 항생제 내성균이 출현하였으며, 잔류독성 문제도 발생하였다. 최근 1998년도에 말라리아 및 크립토스포리디움에 대한 전체 유전자가 밝혀졌고 그 결과 미생물과는 많은 다른 특이구조가 존재한다는 것이 알 려졌다. 따라서 이러한 원충의 성장, 분열 등에 대한 생물학 정보와 게놈 시퀀스(genome sequence)를 이용하여 첨복포자충류에 맞는 약제 개발이 세계 각국에서 시도되고 있다(Nature 및 GeneBank, 2002, 2004).

톡소포자충은 콕시디아아강(coccidia亞綱, subclass of coccidia)에 속하는 첨복포자충이다. 세포내에 기생하는 원충류인 톡소플라즈마(Toxoplasma gondii)는 전 세계적으로 분포하는 인체 및 동물 톡소플라즈마증(toxoplasmosis)의 원인 원충으로서 니콜 및 만시앙(Nicolle and Manceanx(1909))에 의하여 발견되었고 허치슨(Hutchison(1969)), 프랭클(Frenkel(1970))에 의하여 생활사가 밝혀졌으며, 우리나라에서는 1965년 돼지에서 분리되었다. 후천성면역면역결핍증(AISD) 환자에서 톡소포자충은 톡소포자충성뇌염을 일으키고 생존율을 감소시킨다(Dedicoat M et al, 2006). 또한 톡소포자충은 임신에 의한 선천성감염의 중요한 원인중의 하나이다(Biesiada G et al, 2006). 이러한 임상적인 중요성이 있음에도 불구하고 지금까지 항톡소포자충제로 사용되어 지는 설파제나 피리메타민(pyrimethamine) 등에 내성은 계속 증가하고 있고 브라디조이트(bradyzoite) 단계의 톡소포자충에 대하여는 별로 효과가 없다. 그리하여 내성기전을 이해하고 내성을 일으키지 않는 구조의 신종 항톡소포자충제의 개발이 절실히 요구된다. 또한 이 신약의 구비해야 할 조건은 살충의 효과뿐만 아니라 사람과 동물의 세포에 부작용이 없는 안전한 약물이어야 한다. 항생제는 아무리 효능이 우수하다 하더라도 시간이 지나면 내성이 생기는데, 천연약물을 이용한다면 충분히 이런 문제를 해결할 수 있으리라 예상된다. 그 이유는 천연물은 현재까지 알려지지 않은 새로운 성분이며, 개개의 작용이 다양한 단일 성분의 혼합물이므로, 복합물상호간의 약리 작용으로 내성 등의 부작용을 감소할 것이라고 사료된다.

최근 의약품의 연구동향은 여러 가지 부작용이나 독성 및 내성 등이 심각해지고 있으므로 세계적으로 천연물로부터의 의약품 개발에 관한 연구가 활발히 추진되고 있다. 이것들이 질병치료에 효과적으로 이용되기 위해서는 치료용량이 숙주에 대해서는 독성을 주지 않고 감염원에 대해서는 살충효과가 매우 커야 하나 독성이 적으며 내성기생충에 유효한 새로운 항생물질을 연구개발하고, 병용투여와 같은 방법으로 내성기생충의 출현 및 독성을 감소시키기 위한 연구가 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 천연약품자원으로부터 톡소포자충 억제 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 본 발명의 물푸레나무 추출물 및 이로부터 분리된 화합물인 프락시딘이 톡소포자충 억제 효과가 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생체에 독성 및 내성이 적고 인수 공통 전염병 균주인 톡소포자충 억제 활성을 갖는 물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물인 프락시딘을 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla)로부터 분리된 하기 구조식 (1)의 프락시딘(fraxidin ; 6,7-dimethoxy-8-hydroxy coumarin) 을 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla) 추출물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료를 위한 항원충보조제를 제공한다.

또한 본 발명은 물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla)로부터 분리된 프락시딘(fraxidin ; 6,7-dimethoxy-8-hydroxy coumarin)을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료를 위한 항원충보조제를 제공한다.

상기 물푸레나무 추출물 및 이로부터 분리된 화합물인 프락시딘은 물푸레나무의 줄기 껍질인 진피(秦皮, Fraxini Cortex)로부터 추출 및 분리됨을 특징으로 한다.

또한, 상기 추출물은 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물로써, 조추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 에탄올로 추출한 것을 포함하고, 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 헥산 및 디클로로메탄에 가용된 추출물을 의미한다.

상기 톡소포자충의 대상 동물은 돼지, 소, 염소 등의 포유류; 잉어, 금붕어 등의 어류; 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물 및 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 물푸레나무 추출물은, 건조된 물푸레나무 바람직하게는 물푸레나무의 줄기 껍질을 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 15배의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올로, 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 100℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후 감압 농축하여 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄 및 부탄올로 각각 추출하는 제 2단계; 제 2단계에서 수득한 디클로로메탄 용매 추출물을 디클로로메탄: 메탄올 (16 : 1(v/v))을 용출용매로 크로마토그래피를 수행하여 4개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계의 분획물 중 첫 번째 분획을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 분리하여 프락시딘을 수득하는 제 4단계의 제조 공정을 통해 본 발명의 물푸레나무 추출물 및 이로부터 분리된 프락시딘을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 물푸레나무 추출물 또는 이로부터 분리되어진 프락시딘을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물 제공한다.

본 발명의 항톡소포자충 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에 이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/kg으로 투여하 는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 물푸레나무 추출물의 제조

1-1. 물푸레나무 조추출물의 제조

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 물푸레나무 줄기 껍질인 진피를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 진피 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 물푸레나무 줄기 껍질 분말(1 kg) 질량의 3배에 해당하는 100% 에탄올 용액을 가하여 100℃에서 3시간동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 동결건조하여 물푸레나무 조추출물 109 g을 수득하였다.

1-2. 물푸레나무 극성용매 및 비극성용매 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1-1에서 수득한 물푸레나무 조추출물(109 g)을 증류수(1 ℓ)에 현탁하고 분액깔대기에 넣은 후, 여기에 헥산(800 ㎖), 디클로로메탄(800 ㎖) 및 부탄올(800 ㎖)을 각각 순차적으로 가한 다음 진탕하여 각각의 가용부를 감압농축기로 농축하여 물푸레나무의 헥산가용 추출물(20 g), 디클로로메탄 가용추출물(10 g), 부탄올 가용추출물(44 g) 및 물 가용추출물(30 g)을 수득하였다.

실시예 2. 물푸레나무로부터 프락시딘의 분리

상기 실시예 1-2에서 수득한 물푸레나무 디클로로메탄 가용추출물(10 g)을 실리카겔 컬럼에 걸고 디클로로메탄 : 메탄올(16 : 1(v/v))을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 박층 크로마토그래피에서 동일한 양상을 나타내는 것들을 합하고 농축하여 4개의 분획(A~D)으로 나누었으며, 첫 번째 분획물인 A(2.0 g)를 디클로로메탄 : 메탄올(20 : 1(v/v))을 용출용매로 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 1(259 mg)를 수득하였으며, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 프락시딘(fraxidin ; 6,7-dimethoxy-8-hydroxy coumarin)임을 확인하였다(쓰카모토 et al., Chem . Pharm . Bull., 33, pp.4069-4073, 1985).

무색 분말(Colorless powder); (-)-ESI-MS m/z 221 [M-H]-

1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) : 7.93 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-4), 6.83 (1H, s, H-5), 6.36 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3), 3.81 (3H, s, 6-OCH3), 3.77 (3H, s, 7-OCH3)

13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) : 160.6 (C-2), 115.1 (C-3), 145.2 (C-4), 100.8 (C- 5), 149.6 (C-6), 140.6 (C-7), 138.8 (C-8), 139.0 (C-9), 114.9 (C-10), 56.5 (6-OCH3), 60.4 (7-OCH3).

참고예 1. 톡소포자충의 준비

항톡소포자충 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii , ATCC, No.50174)의 영양형(tachyzoite)은 KP100 CD-1 암컷 마우스(female mouse)에서 얻는다. 1× 106개의 톡소포자충의 영양형을 4주령 KP100 CD-1 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 사망시킨다. 그리고 2%의 FBS(GIBCO, Lot No. 1315128)를 함유한 RPMI 1640 media(GIBCO, Lot No. 1346255) 5㎖을 복강에 주입하고 1분 30초 동안 가볍게 마사지 해준다. 다시 복수액을 10㎖짜리 주사기로 전부 뽑아내고 500RPM에서 5분간 원심분리 후, 침전물은 버리고 상등액은 새로운 50㎖ tube에 옮겨서 500RPM에서 5분간 원심분리 한다. 이렇게 얻은 상등액은 새로운 50㎖ tube에 옮겨서 2400RPM에서 10분간 원심분리 한다. 원심분리법으로 얻은 비교적 순수한 톡소포자충의 영양형은 10%의 FBS를 함유한 RPMI 1640배지에 재부유시키고 4℃에서 5 내지 6일간 보관할 수 있었다. 이중 일부는 생체 내(in vivo) 및 실험관 내(in vitro) 실험에 사용하고 일부는 또 다시 새로운 KP100 CD-1 마우스에 주입하여 유지하였다(Young-ha Lee et al., The korean journal of parasitology, 42 (4),pp185-193, 2004).

참고예 2. MDBK 세포 배양

MDBK 세포는 ATCC(CCL-22™)에서 구매하였고 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 항톡소포자충 활성 시험

1-1. 물푸레나무 조추출물의 항톡소포자충 활성 측정

상기 참고예 2의 MDBK 세포(ATCC, CCL-22™)을 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 96 웰에 8*103/㎖되게 접종하고, 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양한다. 6시간 후, 2%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교환하고 그로부터 18시간 후, 2%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교환 및 톡소포자충의 영양형을 MDBK 세포수의 5배되게 처리한다. 또한 동시에 실시예 1-1에서 수득한 물푸레나무 조추출물을 농도별로 처리하고, 이때 대조군으로서 스피라마이신(spiramycin, SIGMA, China)을 사용한다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 물푸레나무조추출물(상기실시 예1)과 프락시딘(상기실시 예2), 스피라마이신(spiramycin, SIGMA, China)을 처리하고 24시간 뒤, 세포증식분석(cell titer 96® AQueous one solution cell proliferation assay(PROMEGA, Lot No.: 22257902))을 실시하고 1시간 30분 후, 흡광광도계로 490㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 시그모이달 커브(sigmoidal curve)를 작성한 후, 톡소포자충의 증식을 억제하는 농도(EC50; 50% 세포증식억제농도)를 산출하였고, 하기 수학식 1을 이용하여 약효판정계수 선택성(selectivity)을 구하였다(Hyun Park et al., Biological & pharmaceutical bulletin, 26(11), pp1623-1624, 2003).

선택성(selectivity)

= MDBK 세포에 대한 각 시료의 EC₅₀값/ T.gondii에 대한 각 시료의 EC₅₀값

상기 실험 결과, 물푸레나무 조추출물을 처리한 후, 세포증식분석(cell titer 96® AQueous one solution cell proliferation assay)으로 선택성을 조사한 결과, 하기 표 1과 같이, 본 발명의 물푸레나무 조추출물은 MDBK 세포에서 현재 사용 중인 항톡소포자충 약물인 스피라마이신(spiramycin) 보다 4.65배의 선택성을 보였다.

1-2. 프락시딘의 항톡소포자충 활성 측정

상기 실시예 2에서 수득한 프락시딘을 톡소포자충으로 감염시킨 세포를 실험관 내에서 처리한 후, 상기 실험예 1-1의 실험방법과 동일한 방법으로 프락시딘의 항톡소포자충 활성을 측정하였다.

상기 실험 결과, 세포증식분석(cell titer 96® AQueous one solution cell proliferation assay)으로 항톡소포자충 활성을 조사한 결과, 하기 표 2와 같이, 본 발명의 프락시딘은 MDBK 세포에서 현재 사용 중인 항톡소포자충 약물인 스피라마이신(spiramycin) 보다 8.64배의 선택성을 보였다.

실험예 2. 항톡소포자충 활성의 생체 내( in vivo ) 실험

참고예 1에서 수득한 톡소포자충의 영양형 1× 105개를 4주령 KP100 CD-1 암컷 마우스 복강에 주입한다. 주입 2시간 후부터 실시예 2에서 수득한 프락시딘을 존대로 경구 투입한다. 150㎎/㎏/day로 연속 4일간 하루에 한 번씩 경구 투입하고, 4일째 마우스를 경추탈골 사망시키고, 참고예 1의 방법대로 복강 내의 비교적 순수한 톡소포자충의 영양형을 얻어 계량하였다.

상기 실험 결과, 본 발명의 프락시딘은 생체 내에서 99.48%의 억제율을 보였다(도 1 참조).

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 물푸레나무 추출물 및 이로부터 분리된 프락시딘은 톡소포자충에 대하여 뛰어난 억제 효과를 나타내어 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물로 이용될 수 있다.

Claims

물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물.
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제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물푸레나무의 줄기 껍질인 진피(秦皮, Fraxini Cortex)로부터 추출됨을 특징으로 하는 톡소플라즈마증 치료용 약학조성물.
물푸레나무(Fraxinus rhynchophylla) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 톡소포자충의 예방 및 치료를 위한 항원충보조제.