KR100903287B1

KR100903287B1 - 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100903287B1
Application number: KR1020070132166A
Authority: KR
Inventors: 박현; 김윤철; 강경화; 김춘매
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2009-06-16

Abstract

본 발명은 톡소포자충 억제 활성을 갖는 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 7-에톡시쿠마린은 콕시디움, 즉 톡소포자충의 증식에 뛰어난 억제 효과를 나타내므로 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis)의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

7-에톡시쿠마린, 콕시디움, 톡소포자충, 톡소플라즈마증

Description

7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising 7-ethoxycoumarin for preventing and treating toxoplasmosis}

본 발명은 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Hoffman, S.L. et al, Plasmodium, human and Anopheles genomics and malaria, Nature, 415(6872), pp 702-9, 2002

[문헌 2] Xu, P. et al, The genome of Cryptosporidium hominis, Nature, 431(7012), pp 1107-12, 2004

[문헌 3] Luft, B.J. et al, Toxoplasmic encephalitis in AIDS, Clin Infect Dis .. 15(2), pp 211-22, 1992

[문헌 4] Biesiada G et al, Toxoplasmosis--epidemiology, clinical manifestation and infection in pregnant women, Przegl Lek ., 63(2), pp 97-9, 2006

[문헌 5] Dannemann BR et al, Assessment of human natural killer and lymphokine-activated killer cell cytotoxicity against Toxoplasma gondii trophozoites and brain cysts, J Immunol . 143(8), pp 2684-91, 1989

[문헌 6] Lucet JC et al, septic shock due to toxoplasmosis in patients infected with the human immunodeficiency virus, Chest .. 104(4), pp 1054-8, 1993

[문헌 7] Guo H et al, Immunity induced by DNA vaccine of plasmid encoding the rhoptry protein 1 gene combined with the genetic adjuvant of pcIFN-gamma against Toxoplasma gondii in mice, Chin Med J ( Engl )., 114(3), pp 317-20, 2001

[문헌 8] Young-ha Lee et al., The korean journal of parasitology , 42(4), pp185-193, 2004

[문헌 9] Bottone EJ, Diagnosis of acute pulmonary toxoplasmosis by visualization of invasive and intracellular tachyzoites in Giemsa-stained smears of bronchoalveolar lavage fluid, J Clin Microbiol .. 29(11), pp 2626-7, 1991

[문헌 10] Hyun Park et al., antimalarial activity of herbal extracts used in traditional medicine in Korea, Biol Pharm Bull ., 26(11),pp1623-1624, 2003

콕시디움(coccidium)에 의해 일어나는 콕시디움증(coccidiosis)은 현재 소, 양, 토끼, 가금에 문제를 일으키는 원충성 질병중 대표적인 질병으로서 특히 가금에 치명적인 손상을 유발한다. 콕시디움증은 치료 및 예방제로서 항생제를 주로 사용하여 왔으나 치료 효율이 비교적 낮고 항생제 내성균이 출현하였으며, 잔류독성 문제도 발생하였다. 최근 1998년도에 말라리아 및 크립토스포리디움에 대한 전체 유전자가 밝혀졌고 그 결과 미생물과는 많은 다른 특이구조가 존재한다는 것이 알려졌다. 따라서 이러한 원충의 성장, 분열 등에 대한 생물학 정보와 게놈 시퀀스(genome sequence)를 이용하여 첨복포자충류에 맞는 약제 개발이 세계 각국에서 시도되고 있다(Hoffman, S.L. et al, Plasmodium, human and Anopheles genomics and malaria, Nature, 415(6872), pp 702-9, 2002; Xu, P. et al, The genome of Cryptosporidium hominis, Nature, 431(7012), pp 1107-12, 2004)

톡소포자충은 콕시디아아강(coccidia亞綱, subclass of coccidia)에 속하는 첨복포자충이다. 세포내에 기생하는 원충류인 톡소플라즈마(Toxoplasma gondii)는 전 세계적으로 분포하는 인체 및 동물 톡소플라즈마증(toxoplasmosis)의 원인 원충으로서 니콜 및 만시앙(Nicolle and Manceanx(1909))에 의하여 발견되었고 허치슨(Hutchison(1969)), 프랭클(Frenkel(1970))에 의하여 생활사가 밝혀졌으며, 우리나라에서는 1965년 돼지에서 분리되었다. 후천성면역결핍증(AIDS) 환자에서 톡소포자충은 톡소포자충성뇌염을 일으키고 생존율을 감소시킨다(Luft, B.J. et al, Toxoplasmic encephalitis in AIDS, Clin Infect Dis .. 15(2), pp 211-22, 1992). 또한 톡소포자충은 임신에 의한 선천성감염의 중요한 원인중의 하나이다(Biesiada G et al, Toxoplasmosis-epidemiology, clinical manifestation and infection in pregnant women, Przegl Lek ., 63(2), pp 97-9, 2006). 이러한 임상적인 중요성이 있음에도 불구하고 지금까지 항톡소포자충제로 사용되어지는 설파제나 피리메타민(pyrimethamine) 등에 내성은 계속 증가하고 있고 브라디조이트(bradyzoite) 단계의 톡소포자충에 대하여는 별로 효과가 없다. 그리하여 내성기전을 이해하고 내성을 일으키지 않는 구조의 신종 항톡소포자충제의 개발이 절실히 요구된다. 또한 이 신약의 구비해야 할 조건은 살충의 효과뿐만 아니라 사람과 동물의 세포에 부작용이 없는 안전한 약물이어야 한다. 항생제는 아무리 효능이 우수하다 하더라도 시간이 지나면 내성이 생기는데, 천연약물을 이용한다면 충분히 이런 문제를 해결할 수 있으리라 예상된다. 그 이유는 천연물은 현재까지 알려지지 않은 새로운 성분이며, 개개의 작용이 다양한 단일성분의 혼합물이므로, 복합물상호간의 약리 작용으로 내성 등의 부작용을 감소할 것이라고 사료된다.

최근 의약품의 연구동향은 여러 가지 부작용이나 독성 및 내성 등이 심각해지고 있으므로 세계적으로 천연물로부터의 의약품 개발에 관한 연구가 활발히 추진되고 있다. 이것들이 질병치료에 효과적으로 이용되기 위해서는 치료용량이 숙주에 대해서는 독성을 주지 않고 감염원에 대해서는 살충효과가 매우 커야 하나 독성이 적으며 내성기생충에 유효한 새로운 항생물질을 연구개발하고, 병용투여와 같은 방법으로 내성기생충의 출현 및 독성을 감소시키기 위한 연구가 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 천연약품자원으로부터 톡소포자충 억제 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 프락시딘구조체가 항톡소포자충 효과가 있음을 확인하였다. 이 프락시딘 구조유도체들을 이용하여 항톡소포자충 실험을 해본 결과, 7-에톡시쿠마린(7-ethoxycoumarin)이 톡소포자충 억제 효과가 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 (A)로 표기되는 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

(A)

본원에서 정의되는 화합물은 시중에서 구입 가능하다.

본 발명의 항톡소포자충 활성을 갖는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

또한, 상기 톡소포자충의 대상 동물은 돼지, 소, 염소 등의 포유류; 잉어, 금붕어 등의 어류; 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제를 예로 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증 의 예방 및 치료용 항원충보조제를 제공한다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 7-에톡시쿠마린은 톡소포자충의 증식에 뛰어난 억제 효과를 나타내므로 톡소플라즈마증 예방 및 치료용 약학조성물및 항원충보조제로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 7- 에톡시쿠마린의 준비

본 발명의 화합물인 7-에톡시쿠마린은 시그마사(한국)에서 구입하여 하기의 실험예의 시료로 사용하였다.

참고예 2. 톡소포자충( Toxoplasma gondii )의 준비

항톡소포자충 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii , ATCC, No.50174)의 영양형(tachyzoite)은 KP100 CD-1 암컷 마우스(female mouse)에 서 얻었다. 1× 10⁶개의 톡소포자충의 영양형을 4주령 KP100 CD-1 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 사망시켰다. 그리고 2%의 FBS(GIBCO, Lot No. 1315128)를 함유한 RPMI 1640 media(GIBCO, Lot No. 1346255) 5㎖을 복강에 주입하고 1분 30초 동안 가볍게 마사지 해주었다. 다시 복수액을 10㎖짜리 주사기로 전부 뽑아내고 500RPM에서 5분간 원심분리 후, 침전물은 버리고 상등액은 새로운 50㎖ 튜브에 옮겨서 500RPM에서 5분간 원심분리 하였다. 이렇게 얻은 상등액은 새로운 50㎖ 튜브에 옮겨서 2400RPM에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리법으로 얻은 비교적 순수한 톡소포자충의 영양형은 10%의 FBS를 함유한 RPMI 1640배지에 재부유시키고 4℃에서 5 내지 6일간 보관할 수 있었다. 이중 일부는 실험관 내(in vitro) 실험에 사용하고 일부는 또 다시 새로운 KP100 CD-1 마우스에 주입하여 유지하였다(Young-ha Lee et al ., The korean journal of parasitology, 42(4), pp185-193, 2004).

참고예 3. Hela 세포 배양

HeLa세포는 한국세포주은행(10002)에서 구매하였고 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 항톡소포자충 활성 유효성 확인

김사 염색(Giemsa stain)은 세포에서 톡소포자충의 감염율을 확인하는 보편 적인 방법이다. 하지만 번거롭고 인력이 많이 필요하기에 항톡소포자충 시약을 대량으로 스크리닝하기에는 적합하지 않다. 신속하고 정확한 고효율스크리닝 시스템을 찾기 위하여 여러 가지 세포생존율 측정방법과 세포에서 톡소포자충의 감염율의 상관성을 비교해보았다. 본 실험에서는 문헌에 기재된 세 가지 방볍인 (1) 트리판 블루 염색(trypan blue stain; Dannemann BR et al, Assessment of human natural killer and lymphokine-activated killer cell cytotoxicity against Toxoplasma gondii trophozoites and brain cysts, J Immunol . 143(8), pp 2684-91, 1989), LDH assay(Lucet JC et al, septic shock due to toxoplasmosis in patients infected with the human immunodeficiency virus, Chest.. 104(4), pp 1054-8, 1993), MTT assay(Guo H et al, Immunity induced by DNA vaccine of plasmid encoding the rhoptry protein 1 gene combined with the genetic adjuvant of pcIFN-gamma against Toxoplasma gondii in mice, Chin Med J (Engl)., 114(3), pp 317-20, 2001) 방법을 사용하여 하기와 같이 실험을 수행하여 김사 염색(Giemsa stain; Bottone EJ, Diagnosis of acute pulmonary toxoplasmosis by visualization of invasive and intracellular tachyzoites in Giemsa-stained smears of bronchoalveolar lavage fluid, J Clin Microbiol.. 29(11), pp 2626-7, 1991)한 결과와 비교하였다.

항톡소포자충 시약인 설파디아제를 사용하여 4가지 부동한 방법으로 실험한 결과 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 김사 염색(Giemsa stain), 트리판 블루 염색(trypan blue stain), LDH assay, MTT assay에서 각각 1.64, 1.94, 2.07, 2.18 mg/ml의 EC50를 얻었다(표 1). 또한 김사 염색(Giema stain)방법으로 얻은 감염억제율은 도 1 내지 도 3에서 나타나는 바와 같이, 서로 다른 세 가지 세포생존율 실험방법에서 얻은 생존억제율과 각각 79.9%, 84.4%, 92.7%의 상관성을 보였음을 확인할 수 있었다 (도 1 내지 도 3 참조).

이로부터 이 세 가지 세포생존율 측정방법은 모두 항톡소포자충 감염율 측정방법으로 사용할 수 있으며 본 연구에서는 MTT assay 방법으로 사용하였다.

실험방법	HeLa 세포에서의 EC₅₀(mg/ml)
김사 염색(Giemsa stain)	1.64
트리판 블루 염색(Trypan blue)	1.94
LDH assay	2.07
MTT assay	2.18

실험예 2. 7-에톡시쿠마린의 항톡소포자충 활성 측정

상기 참고예 3의 HeLa 세포(한국세포주은행, 10002)를 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 96 웰에 2*10⁴/㎖되게 접종하고, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 6시간 후, 2%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교환하고 그로부터 18시간 후, 2%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 교환 및 톡소포자충의 영양형을 HeLa 세포수의 5배가 되게 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 7-에톡시쿠마린과 설파디아제(Sulfadiazine sodium salt, 시그마사)을 처리하고 24시간 뒤, 세포증식분석(cell titer 96AQ_ueous one solution cell proliferation assay(PROMEGA, Lot No.: 22257902))을 실시하였고, 1시간 30분 후, 흡광광도계로 490㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 시그모이달 커브(sigmoidal curve)를 작성한 후, 톡소포자충의 증식을 억제하는 농도(EC₅₀; 50% 세포증식억제농도)를 산출하였고, 하기 수학식 1을 이용하여 약효판정계수 선택성(selectivity)을 구하였다(Hyun Park et al., antimalarial activity of herbal extracts used in traditional medicine in Korea, Biol Pharm Bull., 26(11), pp 1623-1624, 2003).

실험 결과, 본 발명의 7-에톡시쿠마린을 처리한 후, 세포증식분석(cell titer 96AQ_ueous one solution cell proliferation assay)으로 선택성을 조사한 결과, 하기 표 2와 같이, 본 발명의 7-에톡시쿠마린은 HeLa 세포에서 현재 사용 중인 항톡소포자충 약물인 설파디아제보다 5.2배의 선택성을 보였음을 확인할 수 있었다.

	HeLa 세포에서의 EC₅₀ (㎍/㎖)	톡소포자충에서의 EC₅₀(㎍/㎖)	선택성
7-에톡시쿠마린	3050	760	4.01
설파디아제	1670	2180	0.77

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

7-에톡시쿠마린 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

7-에톡시쿠마린 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

7-에톡시쿠마린 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

7-에톡시쿠마린 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

7-에톡시쿠마린 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

도 1은 김사 염색 방법을 이용한 감염 억제율과 트리판 블루 염색을 이용한 세포 생존율과의 상관관계를 나타낸 도이고,

도 2는 김사 염색 방법을 이용한 감염 억제율과 LDH 어세이법을 이용한 세포 생존율과의 상관관계를 나타낸 도이며,

도 3은 김사 염색 방법을 이용한 감염 억제율과 MTT 어세이법을 이용한 세포 생존율과의 상관관계를 나타낸 도이다.

Claims

하기 구조식 (A)로 표기되는 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 약학조성물:

(A)
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 약학조성물.
제 1항의 구조식 (A)로 표기되는 7-에톡시쿠마린을 유효성분으로 함유하는 톡소플라즈마증의 예방 및 치료용 항원충보조제.