JPH08504403A

JPH08504403A - ニームノキから誘導される治療用化合物

Info

Publication number: JPH08504403A
Application number: JP6511477A
Authority: JP
Inventors: ウデインヤ、イロカ・ジェイ
Original assignee: ニーム・ファーマコ
Priority date: 1992-09-11
Filing date: 1993-09-08
Publication date: 1996-05-14
Also published as: BR9307044A; EP0671925A1; EP0671925A4; US5370873A; WO1994017815A1; CA2144320A1; KR950703348A; OA10134A; AU4844093A

Abstract

(57)【要約】この発明は、ニームノキの葉から得られる抽出精製物に関する。この抽出物は、感染性細胞や癌細胞の内皮細胞への付着を抑制するので、マラリアや癌を含む種々の疾患の治療に有用である。該抽出物は無性生殖および有性生殖のマラリア寄生虫およびウイルスも抑制する。この発明は抽出法および抽出精製物含有薬剤にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ニームノキから誘導される治療用非合物発明の背景発明の分野この発明は、大まかに言えばニームノキ（Neem tree）から誘導される化合物に関する。この発明は、マラリア、癌およびＡＩＤＳを含む疾患の治療用薬剤の調製における該化合物の使用にも関する。背景技術ニームノキ［アザジラヒタ・インジカ（Aradirachta Indica)］は、インドやアフリカにおいて、マラリアの諸症状およびその他の種々の病気（皮膚疾患や炎症を含む）の治療に用いられている植物である。通常、ニームの葉、樹皮および／または根から抽出される未精製の粗製水抽出物またはアルコール抽出物がこの種の症状の治療に用いられている。ニームの種子とオイルも皮膚感染症の局所的治療薬または殺虫剤や駆虫剤として使用されている。ニームの樹皮から抗腫瘍性化合物が抽出されることがペチット（Pettit）ら［ジャーナル・オブ・ナチュラル・プロダクツ（Gaurnal of Natural Products ）、第４６巻、第３７９頁〜第３９０頁（１９８３年）参照］およびフジワラ（ Fujiwara）ら［カーボハイドレート・リサーチ（Carbohydrate Reseerch）、第１４１巻、第１６８頁（１９８５年）参照］によって報告されている。これらの抽出物は、癌細胞に対して毒佳効果をもたらす点で有用であるとされている。しかしながら、これらの抽出物は、癌の治療に用いられている多くの他の組成物の場合と同様に、非癌細胞に対しても毒性をもたらす。さらに、シミザ（Shimiza）らによる米国特許第４，５１５，７８５号、同第４，５３６，４９６号および同第４，５３７，７７４号各明細書にはニームの樹皮の抽出物に関する発明が開示されており、該抽出物は、ウニの受精卵において抗有糸分裂活性を示し、また、マウスの肉腫１８０の腹水と固体腫瘍およびマウスのＬ −５１７８Ｙ細胞に対して成長抑制作用を発揮するとされている。ニームノキは、気候が温暖な世界の多くの地域、特にアジアやアフリカに野性する薬用植物であり、ナイジェリアでは一般に「ドゴニアロ（dogonyaro)」と呼ばれている。アフリカとアジアの全域においては、ニームノキの種々の部位、例えば、葉、樹皮および種子等がヒトの種々の軽疾患または慢性疾患の治療薬として使用されている。ニーム薬製品は皮膚疾患、炎症、リューマチ性疾患および熱病の治療に広く使用されているだけでなく、蠕虫や原生動物による感染症の治療において駆虫薬として広く利用されている。インドでは、ニーム油およびこれから単離されるニムビジオール（nimbidiol）、ニムビジン（nimbidin）およびジエチルスルフィドは抗マイコバクテリア剤および抗菌剤として使用されている。ニームの別異の医学的用途を裏付ける証拠は、ニームの抽出物またはニームから単離される化合物が種々の薬理活性を示すことである。例えば、ニームの茎の樹皮からの水抽出物は抗炎症剤として、一般的および特別な補体経路活性、即ち、補体依存性応答、アナフィラキシー、走化性、オプソニン作用およびマクロファージと多形核白血球の刺激を低減させる活性を低下させる。また、該水抽出物はフォルボールミリステートアセテートで誘発される化学ミネセンスを抑制する。ニームの葉の抽出物およびこれから単離されるテトラノルトリテルペノイド、ゲドウニンおよびニムボリドがヒトのマラリア寄生虫である熱帯熱マラリア原虫の生体外での発育を抑制することが、種々の研究によって明らかにされている。ニームからの化合物７−アセチルネオトリキレノンおよび１，２−ジユポキシアザジラジオンがネズミのＰ−３８８リンパ細胞の白血病セルラインをそれぞれ１０ mgおよび８．５mgのＥＤ₅₀で抑制することが報告されている。ニームから単離された種々の化合物に関する研究により、ニームの大部分の医学的生物学的活性は、副次的な役割をする硫化化合物を含むリモノイド、フラボノイドおよびマクロライドの構造的な特徴と関係することが明らかにされた。ニーム医薬は、何百年間にもわたって広範囲に使用されてきたにもかかわらず、ヒトに対する毒性に関する研究はわずかである。マウスにおける実験により、種々のニーム化合物（特に、油状物）を多量に投与すると毒性がもたらされることが報告されている。一方、ニーム化合物であるニムビジンを用いたラットと犬における実験においては、全身的な毒性は認められなかった。ニーム油を被験者に７g経口投与するか、または１g筋肉内注射しても、局部的または全身的な副作用は認められなかった。従って、ニーム油の薬剤としての投与と取扱いにおいてもたらされる毒性は低いと考えられる。興味深いことには、ニームの葉から単離された化合物は、昆虫の食糧に対する非常に強力な忌避剤であるアザジラクチンとその関連化合物である。この結果、ニームノキは生き残ることができたのである。発明の概要この発明は、培養内皮細胞に対する癌細胞とマラリア感染赤血球の付着を抑制するニームの葉からの抽出精製物に関する。この抽出精製物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、黄熱ウイルスおよびサシチョウバエ熱（シチリア）ウイルスのウイルス発育も抑制し、また、ヒトマラリア寄生虫の有性生殖型（生殖母細胞）および無性生殖型（シゾント）の発育を抑制する。本発明は、生のニームの葉からの抽出精製物をソックスレー抽出処理に付した後、受動沈澱処理および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分画処理に付すことを含む該抽出精製物の抽出法にも関する。さらに本発明は、該抽出精製物から調製される薬剤組成物にも関する。図面の簡単な説明本発明の種々の目的、利点および新規な特徴は、添付図と以下の説明から容易に理解されるであろう。図１は、ニームの葉の抽出物ＩＲＡＢの蒸発処理を併用した沈澱フラクションのＨＰＬＣスペクトルを示す。図２は、ニームの葉の抽出物ＩＲＣのＨＰＬＣスペクトルを示す。図３は、熱帯熱マラリア原虫で感染された赤血球に対するＩＲＡＢの抗付着効果をグラフで示す。図４は、マラリア寄生虫の生体外での発育に対するＩＲＡＢの効果を抑制百分率および寄生虫で感染された細胞の数（赤血球１００個あたり）で示す。図５は、生殖母細胞の生体外での成熟に対するＩＲＡＢの効果を抑制百分率および生殖母細胞で惑染された細胞の数（赤血球１０００個あたり）で示す。図６は、生体外における成熟生殖母細胞に対するＩＲＡＢの効果を抑制百分率および生殖母細胞で感染された細胞の数（赤血球１０００個あたり）で示す。図７は、有性生殖型および無性生殖型のマラリア寄生虫の生体外での排除効に関して、ニーム抽出物ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢはクロロキンに比べて優れた結果をもたらすことをグラフで示す。図８は、クロロキン感作寄生虫およびクロロキン耐性寄生虫における抗マラリア効果に関して、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢはクロロキンに比べて優れた結果をもたらすことをグラフで示す。図９は、成熟性生殖母細胞の排除におけるＩＲＤＮＡの有効性をグラフに示す。図１０は、成熟性生殖母細胞の排除におけるＩＲＤＮＢの有効性をグラフで示す。図１１は、成熟生殖母細胞の排除におけるＩＲＤＮＡの有効性をグラフで示す。図１２は、成熟生殖母細胞の排除におけるＩＲＤＮＢの有効性をグラフで示す。図１３は、癌細胞付着アッセイに対する対照をグラフで示す。図１４は、ニームの葉の抽出物ＩＲＡＢを用いた癌細胞付着アッセイの結果をグラフで示す。図１５は、ＩＲＡＢを用いた抗ＨＩＶアッセイの結果を示す。発明の詳細な説明抽出と精製プロセス有用な物質を抽出する方法の出発原料はニームの葉であり、この出発原料は、ナイジェリア南東部のエヌグを含む多数の産地から入手し得る。最良の結果を得るためには、成熟したニームノキから新鮮な緑色葉を採取し、これをオーブン中、約３０〜７０℃、好ましくは４０〜５０℃で数日間乾燥させて縮らせる（即ち、触れると粉々に崩れるように乾燥する）。乾燥した葉はブレンダーを用いて粗い粉末に粉砕する。粗い粉末はそのまま使用に供してもよく、あるいは必要なときまでポリテン袋内に収納して室温で保存してもよい。活性化合物を抽出するために、粗い粉末をソックスレー抽出処理に付す。この場合、粗い粉末約１０〜約２０g、好ましくは、約１５〜約２０gを秤量し、これをセルロース円筒濾紙、好ましくは、ワットマンセルロース円筒濾紙（３３mm× ８０mm）に入れた後、該円筒濾紙をソックスレー装置に装着させ、次いで適当な溶剤を注ぎ、粗い粉末を溶剤に一夜浸漬させる。使用したソックスレー装置は貯留用のガラス製フラスコを具備しており、該フラスコには円筒濾紙のハウジングが接続され、該ハウジングには、冷水道水の循環によって冷却されるコンデンサーが連結される。翌日、溶剤に浸した粉末を、同じ溶剤を用いる標準的なソックスレー抽出処理に付す。抽出温度は約７０〜約９５℃、好ましくは、約７０〜約８０℃である。抽出は約２４時間続行するか、または、溶出液（円筒濾紙からフラスコに流入する溶液）が最初の緑色から無色に変化するまで続行する。この抽出処理によって濃緑色の濁った液状抽出物が得られる。該抽出物は密閉したガラス製広口瓶に入れて約０〜約１０℃の冷蔵庫内または室内において一夜保存する。この抽出処理においては、極性有機溶剤、例えば、アルコール類、アセトン、ピリジンと水の混合溶剤およびこれらの混合物等を含む種々の周知の溶剤が使用できるが、好ましい溶剤はアセトンと蒸留水の５０／５０混合物である。ニームの葉の粗い粉末を約１５〜２０g処理する場合には、浸漬処理には約２５〜約５０mlの溶剤を使用し、抽出処理には約１００mlの溶剤を使用する。液状抽出物から抽出化合物を回収する処理は、標準的なローター蒸発システムを用いておこなう。ローター蒸発システムは、抽出物を保有するガラス製ローターフラスコを含む装置全体がガラス製のシステムであり、該ローターフラスコは、連結カラムを介して水冷コンデンサーに接続される。コンデンサーの底部は溶剤捕集フラスコに連結される。この装置全体はコンデンサーを介して可変真空源へ接続される。このシステムを使用し、真空下で約６０〜約９０℃（好ましくは約８０〜約９０℃）での標準的な手順によって、液状抽出物から溶剤と抽出化合物が回収される。この場合、該手順には、抽出物を保有するローターフラスコを６０〜９０℃の温浴中で連続的に回転させながら、抽出物を減圧下で加熱する操作が含まれる。ローター蒸発処理中、抽出化合物のフラクションは連続的に分離させ、ローターフラスコ側に沈澱させる。連続的な蒸発によって最終的に溶剤が駆逐されると、ローターフラスコの底部には褐色で油状の液状残渣が残留する。この油状液は乾燥用鍋に注ぎ、空気中、約３０〜約６０℃、好ましくは約３０〜約４０℃で一夜乾燥させてペーストにする。回収したこの乾燥残渣は「ＩＲＣ」で示す。ローターフラスコ側の沈澱物を回収するために、適当な溶剤（好ましくはアセトン）約２０〜５０ml、好ましくは約２０〜約３０mlを該フラスコ内に注いで沈澱物を溶解させる。この溶液をガラスビーカーに移し、溶剤を室温で１〜２日間にわたって蒸発させる。回収した溶剤蒸発後の残渣は「ＩＲＡＢ」で示す。抽出生成物ＩＲＡＢを使用し、１mlあたりＩＲＡＢを１００mg含有する貯蔵溶液を調製する。即ち、ＩＲＡＢを適当な溶剤、例えば、水、メタノール、アセトニトリルまたは好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に約３７℃で溶解させることによって貯蔵溶液を調製する。分析のために、この貯蔵溶液を所望の濃度（約１０〜約５０mg／ml）に希釈した後、分析用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分別処理に付す。ＨＰＬＣによる分別処理は、「μボンダパック（Bondapak）Ｃ₁₈」１０μＭを予め充填した分取用カラム（３００mm×内径７．８mm）［ウォーターズ社（Ｗat ers Ａssoc．）製］を用いておこなうのが好ましい。μボンダパックＣ₁₈の固定相は、オクタデシルシリルが結合した相充填材である。カラムに含まれる固体状支持媒体はpＨ２〜８の範囲で使用可能であり、広範囲の温度範囲（＜３００℃ ）において熱的に安定である。また、加水分解に対して優れた安定性を示すので、種々の親水性−疎水性混合溶剤系、例えば、アセトニトリル／酢酸等が該カラムに対して相溶性を示す。移動相は、好ましくはアセトニトリルを混合した０.０２Ｍ氷酢酸であり、２台の高圧ポンプを用いて移動相を送給する。アセトニトリル／０.０２Ｍ氷酢酸（百分比３５：６５）を無勾配様式で使用する。流速は好ましくは約１.５ml／分であり、カラム圧は約７２〜約８０barである。全ての分離は周囲温度でおこない、所定量の試料は連続フローループインゼクター（flow loop injector）を通してカラム内へ導入する。クロマトグラフィーで分離したピークに対応する成分を含有する分別アリコートは、粗製抽出物を多数回注入する間に捕集し、各ピークの検出は、２５４nmに調整した紫外吸収検出器を用いておこなう。ピーク面積はオンラインコンピューターを使用するインテグレーターを用いて測定するのが好ましい。上記の分別条件下においては、クロマトグラフの分離ピークとして現れる化合物ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢは種々の保持時間で溶離する。即ち、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢは保持時間２５〜２８分間および２９〜３１分間においてそれぞれ溶離する。ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢの溶離量も一般的な分別処理において変化する。例えば、ＩＲＡＢ４mgを分別するときには、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢはそれぞれ０.６mgおよび０.９mg得られ、これらの収量は、それぞれＩＲＡＢの分別量の約１５％および約２３％に対応する。精製物上述のように、前記の抽出と精製処理によって得られる生成物はＩＲＡＢ、ＩＲＣ、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢで示す。抽出生成物はＩＲＡＢは、ローターフラスコ側の沈澱物から溶剤を蒸発させた後の残分である。この生成物は暗緑褐色のペースト状の固体であって、特有の強い臭気があり、ＤＭＳＯには容易に溶解するが、水やメタノールに対する溶解度は低い。ＩＲＡＢは室温または冷蔵温度において安定であって、０〜２０℃で９年間貯蔵後でも活性を失わない。この生成物は、オートクレーブ中、１２０℃で約１５〜２５分間保持しても安定である。図１に示すように、ＩＲＡＢの分析用ＨＰＬＣスペクトルには、保持時間（ＲＴ）４.９４〜５６分間において現れるピークの大きさが大きく異なる２６個の分離ピークが含まれる。該スペクトルのデータを次の表１に示す。抽出生成物ＩＲＣは、抽出後にローターフラスコ内に残留する油状液の乾燥残分である。この生成物は褐色の半固体状の油状物であって、特有の臭気があり、ＤＭＳＯに容易に溶解するが、水やメタノールに対する溶解度は低く、二相に分離する。該分離相の上相は完全に溶解した褐色溶液であり、下相は濁って黄ばんだ液滴または懸濁液から成る。この生成物は０〜２０℃において５年間は安定である。図２に示すように、ＩＲＣの分析用ＨＰＬＣスペクトルには、ＲＴ４. ８０〜３２.５４分間において現れるピークの大きさが大きく異なる１４個の分離ピークが含まれる。該スペクトルのデータを以下の表２に示す。抽出精製物ＩＲＤＮＡはＩＲＡＢのＨＰＬＣによる分別生成物の１種である。この生成物は淡褐色を帯びた黄色綿毛状粉末であって、真空乾燥後、通常は空気によって移送される。この生成物はＤＭＳＯに可溶であり、ＤＭＳＯ溶液中では６カ月間にわたって活性を保持する。ＩＲＤＮＡは、オートクレーブ内における１２０℃で１０〜２５分間の処理に対しても安定で、活性を失わない。図１に示すように、ＩＲＤＮＡはＩＲＡＢのスペクトル中において、種々の保持時間を有する鋭くて明確なピークとして現れる。例えば、ＩＲＡＢの３回の別々のＨＰＬＣ分析においては、ＩＲＤＮＡはそれぞれ保持時間２５.６８分間、２７.５２分間および３１.６０分間において現れた。保持時間の変化は、カラムにかけられる試料のサイズ、分別の速さと圧力および周囲温度の変化を含む分別過程に付随する種々の要因によってもたらされる。抽出精製物ＩＲＤＮＢは、ＩＲＡＢのＨＰＬＣ分別によって得られる生成物の１種である。真空乾燥後のこの生成物は、黄色を帯びた褐色の綿毛状粉末であって、ＤＭＳＯに可溶であり、ＤＭＳＯ溶液中では６カ月間にわたって安定である。この生成物は、オートクレーブ内における１２０℃で１０〜２０分間の処理に対しても安定であ、失活しない。図１に示すように、ＩＲＤＮＢはＩＲＡＢのスペクトル中において、種々の保持時間を有する鋭くて明確なピークとして現れる。例えば、ＩＲＡＢの３回の別々のＨＰＬＣ分析においては、ＩＲＤＮＢはそれぞれ保持時間２７.８９分間、２９.９６分間および３４.５８分間において現れる。前述のように、保持時間のわずかな変化は、カラムにかけられる試料のサイズ、分別の速さと圧力および周囲温度の変化を含む分別過程に付随する種々の要因によってもたらされる。ニームの葉からの抽出精製物の重要な治療特性の１つは、細胞に関する抗付着効果である。この特性を利用することによって、移動性または転移性の癌細胞や感染性微生物が身体の正常細胞に付着するのを防止することができる。従って、癌細胞または惑染性細胞の新たな転移増殖は妨げられる。抗付着性化合物は多くの分野において利用可能である。発病、例えば、アテローム性動脈硬化症や関節炎等の発病は、内皮に損傷をもたらす血液成分の付着によってもたらされる。血液成分の付着を妨げる化合物は、このような病気の症状の発生を防止するのに有効である。また、血行性腫瘍の最も重要な初期段階は、循環性悪性細胞の血管内皮への付着とその後の血管からの浸出である。従って、悪性細胞の付着を抑制するか、または該細胞を脱着させる化合物は癌の治療において重要な役割を演ずる。現在では、付着防止については、細菌性疾患、ウイルス病および癌疾患の治療の観点から研究されている。ニームからの抽出物の抗付着効果によって癌細胞または感染性細胞の転移増殖が阻止されるという結果は、該抽出物が癌細胞や感染性細胞を無能化または無力化させることを意味する。従って、このような非転移増殖細胞は自然の防御機構、たとえば免疫系によって体外へ排出させることができる。ニームの葉からの抽出物の抗付着効果の存在を確認するための好ましいアッセイには、培養内皮細胞に対する感染性細胞の付着抑制の定量化が含まれる。感染性細胞はいずれの病原細胞であってもよく、例えば、単球、組織球およびリンパ芽球の白血病細胞等を含む癌細胞並びに熱帯熱マラリア原虫、げっ歯類マラリア原虫または四日熱マラリア原虫で感染された赤血球等を含むマラリア細胞が挙げられる。上記のアッセイ用感染性細胞は、「ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシヨン（Ｔhe Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)」（ロックビル・メリーランド）から入手してもよい。内皮細胞は、培養したヒト内皮細胞、例えば、ヒトのへそ静脈内皮細胞およびヒトの微小血管内皮細胞等のいずれであってもよい。好ましい内皮細胞はヒトの培養したへそ静脈内皮細胞であり、該内皮細胞は、病院の産科や分娩室から排出される廃棄胎盤組織から入手してもよい。感染赤血球は、ＩＲＡＢ、ＩＲＣ、ＩＲＤＮＡまたはＩＲＤＮＢを０.１〜１０μg／ml用いて３７℃で１５〜３０分間処理し、これにより、期待される抗付着効果を発揮させる。次いで、培養内皮細胞に上記の処理感染細胞を接種し（ヘマトクリット値：２％、寄生虫血：２〜１０％）、３７℃で６０〜９０分間培養をおこなう。別の対照内皮細胞培養物に未処理感染細胞を同じ条件下で接種する。未処理感染細胞培養物の場合に比べて、処理感染細胞の内皮細胞に対する付着度は低下し、このことは、試験に供したニームの葉の抽出物の抗付着効果を示すものである。ＩＲＡＢのみが付着に関して測定可能な効果を示したが、これは、ＩＲＡＢのフラクションであるＩＲＤＮＡとＩＲＤＮＢがこれらの抗付着特性を発揮するのに十分な量回収されなかったことによるものであり、これらのフラクションも同様の抗付着特性を発揮する。ニームの葉の抽出物はこのような抗付着効果をもたらすので、付着性または転移性の感染細胞によって特徴づけられる種々の疾患、例えぱ、マラリア、ウイルス性感染症およびヒトの癌（例えば、ヒトの組織球リンパ腫およびリンパ芽球性白血病等）等の治療において有用である。しかしながら、ニームの葉の抽出精製物の抗付着効果は、マラリア細胞や癌細胞、特に、マラリア感染赤血球による大脳血管の付着性閉塞によって特徴づけられる大脳マラリアの治療において最も有効である。マラリア感染症マラリアは、特別な感染サイクルによって特徴づけられる特有な疾患である。この感染サイクルにおいては、寄生虫を発生させる蚊が刺すことによってヒトに感染させる。寄生虫（スポロゾイト）は肝臓細胞内へ侵入し、該細胞内において数千倍に増殖し、メロゾイトに変化する。結局、寄生虫は肝臓細胞を破り、メロゾイトは肝臓内に流入し、急速に赤血球内に入った後、血液の流れによって全身へ移動する。寄生虫は血球の内部において再び増殖を開始し、感染赤血球内で数種の娘細胞を発生させる。寄生虫が成熟すると、後期の寄生虫［トロフォゾイト（栄養体）およびシゾント］を保有する赤血球は毛細血管と細静脈の内皮に付着して滞留する。寄生虫が完全に成熟すると、滞留感染細胞は破れて破壊するので、寄生虫（メロゾイト）は放出される。放出されたメロゾイトは新鮮な赤血球中へ再侵入し、寄生虫の赤血球への侵入と赤血球の破壊のサイクルが統行する。メロゾイトが新鮮な赤血球内へ侵入すると、赤血球の一部は、赤血球の破壊経路を辿らずに、雄または雌の生殖母細胞になる。これらの生殖母細胞は結局は蚊によって吸い取られ、蚊の体内において雄と雌の生殖母細胞は結合してスポロゾイトに変化する。スポロゾイトを保有する蚊は別のヒトを刺すことにより次の感染を開始させ、これによってヒトマラリア寄生虫の生活環が完結する。前述のように、ニームの葉の抽出物は、抗付着特性によってマラリア感染赤血球の滞留を防止するので、マラリア感染症に対して有効である。この効果を図３に示す。図中、最も左側の棒は対照を示し、その右側はＩＲＡＢで前処理した感染赤血球（ＩＥ）を示す。第三はＩＲＡＢで前処理した内皮細胞（ＥＣ）を示す。最も右側の棒はＩＲＡＢで前処理した感染赤血球と内皮細胞を示す。濃度５μ g／mlのＩＲＡＢは、熱帯熱マラリア原虫で感染された赤血球がヒトのへそ静脈内皮細胞に付着するのを完全に抑制する。このアッセイは次の様にしておこなった。感染赤血球とヒトのへそ静脈内皮細胞は３７℃の培養室（酸素５％、二酸化炭素５％および窒素９０％から成る混合ガス雰囲気の培養室）内において別々に培養した。培養を１〜２日間おこなった後、感染赤血球の一部を、濃度５μg／m lのＩＲＡＢを用いて１５〜３０分間処理した。処理後、処理した感染赤血球（ヘマトクリット値：２％、寄生虫血：５％）１mlを赤血球培養物の一部に添加した。未処理感染赤血球を別の内皮細胞培養物（対照）に添加した。細胞は６０〜９０分間にわたって一緒に培養した。培養後、非付着性感染赤血球を除去した。内皮細胞に付着した赤血球の数を光学顕微鏡を用いて測定した。対照の場合に比べて、処理感染細胞による内皮細胞への付着度は低下し、このことは、ニームの抽出物による抗付着効果を示すものである。ＩＲＡＢのみがマラリア感染赤血球に関して測定可能な抗付着効果を示したが、抽出精製物ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢはマラリアサイクルにおいて、抗寄生虫特性と抗生殖母細胞特性を示すことが判明した。生殖母細胞はマラリア感染サイクルの有性段階のものであって、蚊の体内でスポロゾイトに変化した後は、該蚊を介してヒトからヒトへと運ばれる。ＩＲＤＮＡとＩＲＤＮＢはいずれも生殖母細胞の成熟形態への発育を妨げる。発育性（成熟性）生殖母細胞および発育（成熟）生殖母細胞のいずれの場合も、ＩＲＤＮＡとＩＲＤＮＢは細胞の破壊をもたらす。生殖母細胞に対するＩＲＤＮＡとＩＲＤＮＢの抑制効果（殺配偶子活性）は、ヒトマラリアをもたらす熱帯熱マラリア原虫単離菌ＮＦ５４に対して生体外において認められた。一方、抗マラリア効果（殺シゾント活性）は、熱帯熱マラリア原虫のマラリア寄生虫の菌株であって、クロロキンに対して感受性のＩＴＧ２Ｆ６菌株と耐性のＷ２菌株に関して生体外で認められた。ニームの抽出物ＩＲＡＢと精製フラクションＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢの殺配偶子活性と殺シゾント活性をアッセイするために、マラリア感染赤血球を、前述の混合ガスを満たした定温器内のプラスチック製培養プレート上において３７℃で培養した。試験をおこなうために、前記の抽出物または精製フラクションを種々の濃度（１×１０^-4ng／ml〜５μg／ml）で培養物の一部に添加した。該抽出物を含有しない培養物（対照）を培養物の一部に添加した。対照培養物と試験培養物を２４〜７２時間培養した。培養終了後、血液塗抹標本を調製し、寄生虫の発育を顕微鏡によって調べた。対照の場合に比べて、処理培養物中での寄生虫（シゾントまたは生殖母細胞）の数の減少によって殺シゾント効果または殺配偶子効果を示す。図４〜図１２に示すように、ニームの葉の抽出物は有性生殖母細胞および無性マラリア寄生虫に対して抑制効果を示した。特に、図４〜図６は、ＩＲＡＢ（５ μg／ml）が４８〜７２時間以内に培養物から有性および無性のマラリア寄生虫を完全に排除することを示す（ＩＤ₅₀：１μg／ml以下）。図７は、ＩＲＤＮＡ（黒丸表示）およびＩＲＤＮＢ（正方形表示）が有性および無性寄生虫を非常に低濃度（１０^-2ng／ml）で排除することを示す。クロロキン（三角形表示）の効果も図７に示す。図８は、ＩＲＤＮＡ（黒丸表示）とＩＲＤＮＢの抑制効果が薬剤に対して感受性または耐性の寄生虫に対する場合と同様であることおよび該抑制効果が、抗マラリア剤として現在最も広く使用されているクロロキン（三角形表示）の効果よりも優れていることを示す。ニームの葉の抽出物は成熟性の生殖母細胞の排除（図９および図１０参照。三角形は４８時間後のデータを示し、黒丸は７２時間後のデータを示す。）および成熟した生殖母細胞の排除（図１１および図１２参照。三角形は４８時間後のデータを示し、黒丸は７２時間後のデータを示す。）においても有効である。従って、ＩＲＤＮＡとＩＲＤＮＢはマラリア感染症の治療および該感染症の蔓延の予防に有効である。癌感染症癌は、種々の細胞、例えばリンパ系（リンパ腫）、血球（白血病）、乳房、結腸、脳、前立腺、および皮膚（メラノーマ）等の細胞の悪性腫瘍を包含する症状として大まかに定義される。単球白血病、急性リンパ芽球白血病および組織球リンパ腫等の癌性症状の多くは、転移により特徴付けられる。従って、転移中の癌細胞の増殖を防止する該細胞に対する抗付着効果は、これらの疾患の治療に有効である。癌細胞に対するＩＲＡＢによるこのような抗付着効果は生体外で証明された。特に、ヒトの単球、組織球およびリンパ芽球白血病細胞に対するＩＲＡＢの抗付着効果は以下の手順によりアッセイされた。ヒトの単球（Ａ；Ｔ１Ｂ２０２．ＴＨＰ−１）、組織球（Ｃ；組織球リンパ腫：ＣＲＬ１５９３．Ｕ−９３７）およびリンパ芽球白血病細胞（Ｂ；ＣＲＬ１５５２．ＭＯＬＴ−３、Ｄ；ＣＣＬ１１９．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）の癌細胞、および正常なヒトの内皮細胞（ＥＣ−ＦＰ５分離体）を、酸素５％、二酸化炭素５％および窒素９０％からなる混合ガス雰囲気の室内で別々に培養した。１〜２日間培養後、癌細胞の一部を濃度５．０μg ／ｍｌの抽出物ＩＲＡＢで１５〜３０分間処理（培養）した。次いで、濃度１× １０⁶細胞／ｍｌの処理した癌細胞１ｍｌを、内皮細胞培地物の一部に添加した。対照として、未処理の癌細胞を残りの内皮細胞に添加した。次いで、これらの細胞を６０〜９０分間培養した。培養後、非付着性癌細胞を除去した。内皮細胞に付着した癌細胞の数を倍率１０００倍の光学顕微鏡を用いて決定した。対照と比較して、処理した癌細胞による内皮細胞への付着度は減少した。このことは、試験したニーム抽出物の抗付着活性を示すものである。図１３および図１４を比較すると、ＩＲＡＢは試験された４種の癌細胞のうちの３種に対して、著しい抗付着効果（すなわち５０〜８０％）を示すことが理解される。従って、ＩＲＡＢは一部の癌性症状の治療に効果的な化合物である。ウイルス性感染症ウイルス性感染症はしばしば不明瞭な感染症をもたらすが、時折明白な疾患をもたらすため、一般的に特徴付けることは困難である。それにもかかわらず、ウイルス性感染症は流行するので、医療および公衆の衛生上重要な問題をもたらす。通常よく知られているウイルスには、ＨＩＶ、黄熱ウイルス、サシチョウバエ熱（シチリア型）ウイルスおよび肝炎ウイルスが包含される。ウイルスの成長抑制を証明するためのアッセイを、以下の手順にしたがって行う。ウイルス標的細胞系、例えぽＣＥＭ−ＩＷをマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）培養プレート中の最少必須培地（ＭＥＭ）または培地１９９内で単層になるまで増殖させる。抗ウイルスアッセイを行うために、該単層をウイルス粒子（この場合はＨＩＶである）で感染させ、これをニーム抽出物を含有するか、または含有しない培養培地中に懸濁させる。１〜２時間惑染させた後、該細胞を培地で洗浄し、次いで二酸化炭素を５％含有する雰囲気中、３７℃で２４時間培養する。感染した細胞の割合を間接免疫蛍光法により決定した。対照と比較して、抽出物で処理した細胞における感染率は低く、これは抗ウイルス効果を示す。このアッセイでは、ニームの葉の抽出物ＩＲＡＢを、図１５に示すように、１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合、ＨＩＶの成長抑制効果がもたらされることを証明した。図中、三角形は非感染処理培養に関するデータを示し、菱形は感染処理培養に関するデータを示す。抗ウイルス特性を証明するための別のアッセイは、ウイルスの標的細胞系ＶＥＲＯの単層を、ニームの葉の抽出物含有培地中に懸濁した黄熱ウイルスまたはサシチョウバエ熱ウイルスとともに培養する米国陸軍医療研究司令部（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）の抗ウイルススクリーンである。ニーム抽出物を含有しないウイルス懸濁液とともに培養した細胞を対照とした。該細胞を、ウイルス感染が起こるように１〜２時間培養した後、洗浄し、次いで二酸化炭素を５％含有する雰囲気中において３７℃で２４時間培養した。感染した細胞の割合を間接免疫蛍光法により決定した。対照と比較して、ニーム抽出物で処理した細胞の感染率は低く、これは抗ウイルス効果を示す。このアッセイでは、ＩＲＡＢが黄熱ウイルスおよびサシチョウバエ熱（シチリア型）ウイルスに対して、それぞれ１１９μg／ｍｌおよび８０．２μｇ／ｍｌのＩＤ₅₀で表示される活性をもたらすことが証明された。従って、ＩＲＡＢは様々なウイルス感染症の治療においても効果的な化合物である。製剤本発明による化合物は経口、非経口（筋肉、腹腔、静脈（ＩＶ）または皮下への注射）、鼻、腟、直腸、あるいは舌下を通して投与することができ、また、それぞれの投与経路に適した投与形態で配合処方できる。経口投与用固形製剤には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれる。このような固形製剤では、該活性化合物は少なくとも１種の薬学的に許容される不活性キャリアー、例えば、スクロース、ラクトース、またはデンプン等と混合される。一般的な製剤の場合のように、このような製剤には、不活性なキャリアー以外の添加剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤を含有させることもできる。カプセル剤、錠剤、および丸剤には緩衝剤を含有させてもよい。錠剤および丸剤は腸溶性皮膜で被覆してもよい。経口投与用液状製剤には、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。これらの液状製剤は、水等の当該分野で通常用いられる不活性希釈剤を含んでいてもよい。このような不活性希釈剤に加えて、該製剤には湿潤剤、乳化剤および沈澱防止剤等のアジュバント、ならびに甘味料、調味料、香料を含有させることもできる。本発明による非経口投与用製剤は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、もしくは乳濁液を含有する。非水性の溶媒または賦形剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油等の植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステル等が例示される。このような製剤には、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等のアジュバントを含有させてもよい。これらの製剤は、例えぽ、バクテリア保留フィルターを通す濾過処理、滅菌剤の添加、照射処理、または組成物を加熱処理等により滅菌してもよい。これらの製剤は、使用直前に滅菌水または他の注射可能な滅菌液を用いて調製することもできる。直腸または腟投与のための製剤は、好ましくは坐剤であり、活性物質のほかにココアバターまたは坐剤用ワックス等の賦形剤を含有していてもよい。鼻または舌下投与のための製剤は、当該分野で周知の標準的な賦形剤を用いて調製される。本発明による製剤中の活性成分の投与量は特に限定的ではないが、適切な量の活性成分が投与されるようにすることが必要である。投薬量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の治療時間に応じて適宜選択される。一般的には、体重１ｋｇにつき１日当たり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ哺乳類に投与することによって、効果的な抗マラリア活性、抗癌活性、または抗ウイルス活性が得られる。以下の実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を例証するためのものであり、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。実施例１ニームの葉に含まれる化合物の抽出および精製葉の採取および調製成長したニームノキから新鮮な緑色の葉を採取した。これらの葉を易砕状に縮れるまで数日間４０〜５０℃でオーブンを用いて乾燥させた。乾燥した葉をウェアリングブレンダー（ｗａｒｉｎｇｂｌｅｎｄｅｒ）を用いて粉砕して粗い粉末にした後、プラスチック製バッグ内に収納し、使用に供するまで室温で保存した。葉のソックスレー抽出抽出するために、粉砕した葉の重量を計り、ワットマンセルロース円筒濾紙（３３ｍｍ）１つ当たり１５〜２０ｇ充填した。充填後、これらの円筒濾紙をソックスレー装置に挿入し、アセトンおよび蒸留水を５０／５０に調合した混合溶媒２５〜５０ｍｌを該円筒濾紙に注ぎ、粉砕した葉を一夜浸漬した。次の日、浸漬した葉を、上記の混合溶媒１００ｍｌを使用する標準的なソックスレー抽出処理に付した。抽出温度は７０〜８５℃に調整した。抽出処理は２４時間続行するかまたは溶出液（円筒濾紙から貯留用フラスコに流入する溶液）が初期の緑色から無色になるまで続けた。この抽出処理により、濃緑色で濁った液状抽出物が得られた。該抽出物はガラス製瓶に入れて密封した後、冷蔵庫内で０〜８℃で保存した。液状抽出物からの抽出化合物の回収ブッチ（Ｂｕｃｈｉ）型ローター蒸発系を用いることにより、減圧下、８０〜９０℃で液状抽出物から溶媒と抽出化合物を回収した。化合物ＩＲＣおよびＩＲＡＢの蒸発分離ローター蒸発処理中、抽出化合物のフラクションを連統的に分離し、ローター・フラスコ側に沈澱させた。蒸発を続けて溶媒を除去した後、褐色オイル状液体残留物を得た。このオイル状液体を乾燥皿に注ぎ、ペーストになるまで３０〜４０℃の空気中で乾燥させた。乾燥した残留物を回収した。該残留物は「ＩＲＣ」で表示する。ローター・フラスコ側の沈澱物を回収するために、アセトン２０〜３０ｍｌを該フラスコに注ぎ、沈澱物を溶解させた。この溶液をガラスビーカーに注ぎ、１〜２日間、室温でアセトンを蒸発させた。アセトン蒸発後に残った残留物を回収した。該残留物は「ＩＲＡＢ」で表示する。ＩＲＡＢのＨＰＬＣ分別ならびにＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢの単離ＩＲＡＢの重量を計り、３７℃でＤＭＳＯに溶解させた。濃度１００ｍｇ／ｍ１の原液を調製した。分析するため、この原液を希釈した後（１０〜５０ｍｇ／ｍｌ）、以下のパラメーターを用いる分析用ＨＰＬＣにより分別した。予めカラムを充填した３００ｍｍ×７．８ｍｍ（内径）の１０μＭμボンダパックＣ₁₈分取カラム（ウォーターズ社製）を用いるクロマトグラフィーによって、この実施例に係る全ての化合物を単離した。μボンダパックＣ₁₈の固定相は、オクタデシルシリルが結合した充填材である。カラムに含有される固体状支持媒体はｐＨ２〜８で使用可能であり、広い温度範囲（＜３００℃）で熱的に安定である。また、加水分解に対して優れた安定性を有するので、様々な親水性一疎水性混合溶媒系は該カラムと適合する。移動相は、アセトニトリルを混合した０．０２Ｍ氷酢酸からなる。２台の高圧ポンプを用いて、移動相を送給した。混合比３５：６５（百分率）のアセトニトリル−０．０２Ｍ酢酸を無勾配様式で用いた。流速は１．５ｍｌ／分とした。カラム圧力は７２〜８０ｂａｒの範囲にした。全ての分離は周囲温度でおこなった。所定量の試料を、注入した連統７ロール−プインゼクターを通してカラム内に導入した。クロマトグラフィーで分離したピークに対する成分を含む分別したアリコートは、粗製抽出物を多数回注入する間に補集した。２５４ｎｍに調整した紫外吸収検出器を用いてそれぞれのピークの検出をおこなった。オンラインコンピューターを使用するインテグレーターを用いてピーク面積を測定した。前述の分別条件下では、クロマトグラフの分離ピークとして現れる化合物ＩＲＤＮＡとＩＲＤＮＢは種々の保持時間で溶離する。即ち、ＩＲＤＮＡは２５〜２８分間で溶離し、ＩＲＤＮＢは２９〜３１分間で溶離する。ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢの溶離量もまた一般的な分別処理では変化する。例えば、４ｍｇのＩＲＡＢを分別するときには、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢはそれぞれ０．６ｍｇおよび０．９ｍｇ得られ、これらの収量はそれぞれＩＲＡＢの分別量の１５％および２２．５％に相当する。実施例２熱帯熱マラリア原虫感染赤血球に対する抗付着特性の生体外アッセイ感染赤血球およびヒトのへそ静脈内皮細胞を、酸素５％、二酸化炭素５％および窒素９０％からなる混台ガスを満した培養室内で３７℃で別々に培養した。マラリア感染赤血球は、１０％ヒト血清、３％炭酸水素ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を追加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。内皮細胞は、２０％ヒトＡＢ血清、ヘパリン０．０９ｍｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、および内皮細胞ミトゲン２ｍｇ／ｍｌを追加した培地１９９中で培養した。２４時間培養後、実施例１で調製したニームの葉の抽出物をジメチルスルホキシドに溶解し、濃度５μg／ｍｌ、１０μg／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌで感染赤血球に添加した。抽出物の添加から１５〜３０分間経過後、処理した細胞を、１つのウェル当たり感染赤血球を１ｍｌで含む８つのウェルを備えた培養プレート内の内皮細胞培地に添加した。この感染細胞培地のヘマトクリット値は２％で寄生虫血は５％であった。対照として、未処理の感染赤血球を他の内皮細胞培地に添加した。これらの細胞を９０分間一緒に培養した。培養後、付着していない感染赤血球を吸引することにより除去した。内皮細胞に付着した赤血球の数を光学顕微鏡により決定した。対照と比較して、処理した感染赤血球の内皮細胞への付着率は低く、このことは、試験したニーム抽出物の抗付着効果を示すものである。この付着率の低下をグラフにして図４に示す。図４は、濃度５μg／ｍｌのＩＲＡＢが、ヒトのへそ静脈内皮細胞に対する熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の付着を完全に抑制することを示す。実施例３癌細胞に対する抗付着特性の生体外アッセイこのアッセイのために、ヒトのへそ静脈内皮細胞および癌細胞（単球、組織球、およびリンパ芽球白血病細胞）を二酸化炭素を５％含む雰囲気中、３７℃で別々に培養した。これらの癌細胞はメリーランド州ロックビルに住所を有するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手した。内皮細胞は、２０％ヒトＡＢ血清、ヘパリン０．０９ｍｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、および内皮細胞ミトゲン２μｇ／ｍｌを追加した培地１９９中で培養した。全面生長率が７５％に達するまで、該細胞を８つのウェルを有する培養プレート中で培養した。癌細胞は、ウシの胎児血清を５％追加したドルベコ最少必須培地中で培養した。抗付着活性をテストするために、実施例１で調製したニーム抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、５μg／ｍｌの濃度で癌細胞に添加した。１５分間後、処理した癌細胞を抽出物とともに内皮細胞に添加した。対照として、未処理癌細胞を別の内皮細胞に添加した。これらの細胞を９０分間一緒に培養した。培養後、付着していない癌細胞を吸引除去した。付着した細胞をホルマリンで固定し、顕微鏡で観察するためにギームサ染色液で着色した。対照と比較して、処理した癌細胞の内皮細胞への付着率は低く、このことは抽出物の抗付着効果を示すものである。この付着率の低下効果は、図１４（対照実験）と図１５との比較から明らかである。この比較から明らかなように、ＩＲＡＢはテストした４種の癌細胞のうちの次の３種に対して顕著な抗付着効果（５０〜８０％）を示した：（ヒトの単球）Ｔ１Ｂ２０２．ＴＨＰ−１、ヒトの末梢血液急性リンパ芽球白血病ＣＲＬ１５５２．ＭＯＬＴ−３、およびヒトの末梢血液急性リンパ芽球由血病ＣＣＬ１１９．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ。実施例４有性および無性マラリア原虫に対するニーム抽出物の抑制効果についての生体外アッセイ簡単に言えば、二酸化炭素５％、酸素５％、および窒素９０％からなる混合ガス中において、１０％血清、３％炭酸水素ナトリウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を追加した培地ＲＰＭ１−１６４０を用いて感染した細胞を３７℃で培養することからなる確立された方法により、熱帯熱マラリア原虫の無性１ＴＧ２Ｆ６単離菌で感染したヒトの赤血球を培養した。アッセイのために、該培地のヘマトクリット値を２％に調整し、また寄生虫血を５％に調整した。実施例１で調製したニーム抽出物をＤＭＳＯに溶解させ、培養培地を用いて所望の低濃度まで希釈することによって、ＤＭＳＯ濃度を無毒濃度（＜０．０１％）まで低下させた。次いで、ニーム抽出物溶液をマラリア培地に添加した。異なった濃度の抽出物溶液を用いて該培地を処理した（例えば、ＩＲＡＢについては０．０５〜５．０μg／ｍｌ；ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢについては１×１０^-4〜１０ｎｇ／ｍｌ）。対照として、抽出物を含有しない感染赤血球を培養した。対照と処理した細胞をさらに７２時間培養した。培養期間中と培養終了後に血液塗抹標本を作成し、これを用いて光学顕微鏡によりマラリア原虫の成長過程を観察した。対照と比較して、処理した培地中の寄生虫血は低く、これは抽出物ＩＲＡＢ、ＩＲＤＮＡ、およびＩＲＤＮＢの抗マラリア効果を示すものである。有性マラリア原虫に対するニーム抽出物の抑制活性をアッセイする詳細な手順は、アッセイで用いられるマラリア単離菌がＮＦ５４であることと、アッセイ培地の配偶子細胞血を０．１−１．０％の間で変化させることを除いて、マラリア原虫の場合と同様である。また、生殖母細胞を処理するのに用いた抽出物の濃度は、ＩＲＡＢについては０．０５〜５．０μg／ｍｌの間で、また、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢについては１×１０²〜１×１０³ｎｇ／ｍｌの間で変化させた。図４〜図６に示すように、濃度５μg／ｍｌのＩＲＡＢは、４８〜７２時間の培養において、有性および無性マラリア原虫を完全に排除する（ＩＤ₅₀：１μg ／ｍｌ未満）。図７は、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢが１０^-2ｎｇ／ｍｌという非常に低い濃度で有性および無性寄生虫を完全に排除することを示す。図８は、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢのこの抑制効果が、薬物に対して感受性と耐性を示す寄生虫の場合と同様であるだけでなく、現在最もよく用いられている抗マラリア剤であるクロロキンの効果より優れていることを示す。成熟性生殖母細胞（図９および図１０）ならびに成熟生殖母細胞（図１１および図１２）を排除する場合、ニームの葉の抽出物も同様に効果的であった。実施例５抗ウイルス特性の生体外アッセイ抗ウイルスアッセイを以下のようにして行った。抗ＨＩＶの抗ウイルスアッセイのために、ウイルスの標的細胞系ＣＥＭ−ＩＷをマイクロタイター培養プレート内で単層が形成されるまで培養した。培養培地としては、不活性なウシの胎児血清１０％、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ μg／ｍｌ）を追加した培地１９９を用いた。該細胞を、二酸化炭素を５％含む雰囲気中、３７℃で保持した。ウイルス感染のために、該細胞を氷中に移し、氷冷培地で洗浄した。洗浄した細胞を、冷培地中にＭ０１が１．０ｐ．ｆ．ｕ／細胞になる濃度で懸濁させたウイルス粒子で感染させた。１時間後、該細胞を温培地で洗浄し、二酸化炭素を５％含む雰囲気中、３７℃で２４時間培養した。２４時間後、間接免疫蛍光法により感染性を測定した。ニーム抽出物の抗ウイルス効果を測定するために、細胞（ＣＥＭ−ＩＷ）を、ニーム抽出物ＩＲＡＢ含有培地中に懸濁したウイルス粒子とともに１〜２時間培養した。ウイルス粒子との培養後、該細胞を培地で洗浄し、さらに同様にして２４時間培養した。対照として、米処理のウイルス粒予を用いた。対照と比較して、処理した細胞におけるウイルスの感染性が低いことが観察された。このことは、図１５および以下の表３から明らかなように、ニーム抽出物ＩＲＡＢの抗ウイルス活性を示すものである。他のウイルス、即ちサシチョウバエ熱ウイルス、および黄熱ウイルス、に対する抗ウイルスアッセイは、サシチョウバエ熱、および黄熱ウイルス抗ウイルスアッセイでの標的細胞としてＣＥＭ−ＩＷ細胞系の代わりにＶＥＲＯ細胞系を用いる以外は、ＨＩＶ抗ウイルスアッセイにの場合と同様であった。以上、本発明をその特定な態様に関して説明したが、本発明はさらに変更修正が可能である。上記の開示内容は本発明を限定するものではなく、これを例示的に説明するものである。従って、当業者であれば本発明の技術的思想と以下の請求の範囲の記載の範囲内において、前記の開示内容に基づき、本発明を容易に変更修正できるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ニームの葉の抽出精製物、ＩＲＡＢ、ＩＲＤＮＡおよびＩＲＤＮＢからなる群より選択される抽出精製物であって、培養内皮細胞に対する熱帯熱マラリア原虫惑染赤血球の付着を抑制する抽出精製物。２．抽出精製物がＩＲＡＢである請求項１記載の抽出精製物。３．抽出精製物がＩＲＤＮＡである請求項１記載の抽出精製物。４．抽出精製物がＩＲＤＮＢである請求項１記載の抽出精製物。５．有効治療量の請求項１記載の抽出精製物および生理学的に許容されるキャリアーを含有する薬剤。６．有効治療量の請求項２記載の抽出精製物および生理学的に許容されるキャリアーを含有する薬剤。７．有効治療量の請求項３記載の抽出精製物および生理学的に許容されるキャリアーを含有する薬剤。８．有効治療量の請求項４記載の抽出精製物および生理学的に許容されるキャリアーを含有する薬剤。９．以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ニームの葉からの治療上有用な化合物の抽出方法：（ａ）ニームの葉を乾燥させ、（ｂ）許容可能な溶媒に乾燥させたニームの葉を浸漬し、（ｃ）抽出相から溶媒相を分離し、次いで、（ｄ）抽出相に含まれる溶媒を蒸発させる。１０．蒸発溶媒相および沈澱相を高圧液体クロマトグラフィー処理に付す工程をさらに含む請求項９記載の方法。１１．請求項１記載の抽出精製物をマラリアに惑染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、マラリア感染症の治療方法。１２．請求項２記載の抽出精製物をマラリアに感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、マラリア感染症の治療方法。１３．請求項３記載の抽出精製物をマラリアに惑染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、マラリア感染症の治療方法。１４．請求項４記載の抽出精製物をマラリアに感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、マラリア感染症の治療方法。１５．請求項１記載の抽出精製物を転移性癌に感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、転移性癌症状の治療方法。１６．請求項２記載の抽出精製物を転移性癌に感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、転移性癌症状の治療方法。１７．請求項３記載の抽出精製物を転移性癌に感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、転移性癌症状の治療方法。１８．請求項４記載の抽出精製物を転移性癌に感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、転移性癌症状の治療方法。１９．請求項１記載の抽出精製物をウイルスに感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、ウイルス性感染症の治療方法。２０．請求項２記載の抽出精製物をウイルスに感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、ウイルス性感染症の治療方法。２１．請求項３記載の抽出精製物をウイルスに感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、ウイルス性感染症の治療方法。２２．請求項４記載の抽出精製物をウイルスに感染した哺乳類に治療上有効量投薬することを含む、ウイルス性惑染症の治療方法。