KR100801556B1

KR100801556B1 - 항산화 활성을 갖는 ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＮＬＲＩ 312

Info

Publication number: KR100801556B1
Application number: KR1020050028021A
Authority: KR
Inventors: 정석근; 김현수; 함준상; 채현석; 안종남; 이종문
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-04-04
Filing date: 2005-04-04
Publication date: 2008-02-11
Also published as: KR20060105974A

Abstract

본 발명은 모유를 수유하는 유아의 분변에서 분리한 새로운 유산균인 L. gasseri NLRI 312에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인체에 사용 시 안전하고 항산화 활성을 가지며 활성산소에 의한 지질과산화 억제 효과 및 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 효과를 가지는 유산균인 L. gasseri NLRI 312에 관한 것이다.

항산화활성, Lactobacillus gasseri, 세포보호효과, 지질과산화 억제

Description

항산화 활성을 갖는 ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＮＬＲＩ 312{Antioxidant Lactobacillus gasseri NLRI 312}

도 1은 본 발명에 의한 Lactobacillus gasseri NLRI 312의 전자현미경 사진이다.

도 2는 본 발명에 의한 L. gasseri NLRI 312의 세포지질과산화 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 본 발명에 의한 L. gasseri NLRI 312의 세포보호 효과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 본 발명에 의한 L. gasseri NLRI 312의 세포보호 효과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 모유를 수유하는 유아의 분변에서 분리한 새로운 유산균인 L. gasseri NLRI 312에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인체에 사용 시 안전하고 항 산화 활성을 가지며 활성산소에 의한 지질과산화 억제 효과 및 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 효과를 가지는 유산균인 L. gasseri NLRI 312에 관한 것이다.

활성산소는 미토콘드리아 대사, 중성백혈구(neutrophil) 대사와 같은 다양한 경로를 통하여 세포에서 생성되며(Thannickal and Fanburg, 2000), 화학물질 및 발암물질과 같은 외인성 요인에 의해서도 생성되므로(Primiano 등, 1997) 호기성 생물은 계속해서 활성산소에 노출되게 된다. 생리적으로 발생한 낮은 농도의 활성산소는 세포의 다양한 분자적 메커니즘으로 조절되나(Finkel, 2000), 과도하게 생성된 활성산소는 세포벽의 지질을 공격하여 지질과산화를 개시하고 산화적 손상을 초래하여 세포가 사멸함으로써 노화를 비롯한 각종 질병의 원인이 되고 있다(Davies, 1995).

생체는 많은 양의 불포화 지방산을 함유하고 있으며, 불포화지방산은 세포막의 필수적인 구조를 형성하고, 생물이 환경에 적응할 수 있도록 유연성을 갖게 한다. 그러나 불포화 지방산은 활성산소에 의해 쉽게 손상되어 노화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

항산화물질은 지방이나 지방을 함유하고 있는 식품의 자동산화를 방지하고 세포의 노화를 억제하는 기능을 가진 물질로서 그 이용 범위가 매우 넓다. 항산화제는 그 기능에 따라 유리라디칼 저해제(free radical inhibitor), 금속제거제(metal scavenger), 과산화물 분해제(peroxide decomposer), 상승제(synergist) 및 산소결합 억제제(superoxide dismutase)로 구분된다. 지금까지 보고된 항산화물질 의 낮은 활성과 각종 부작용으로 인하여 인체에 해롭지 않은 천연의 항산화제를 찾고자 하는 연구가 다방면에서 활발하게 이루어지고 있다.

따라서, 항산화 유산균은 다양한 항산화 메커니즘을 통해 산화적 손상으로부터 세포의 생존성을 증가시키고 DNA 손상을 억제할 수 있을 것으로 예측된다. 유산균 중에서도 특히 인체 유래 유산균은 그 안전성이 보장되며(Fuller, 1989; Tannock, 1997) 내산성 및 경구섭취 시 장점막 부착능이 높아 프로바이오틱(probiotic) 유산균으로서 유용하다고 보고되어 있다(Collins 등, 1998). 따라서, 인체 유래의 항산화 유산균의 개발은 활성산소에 기인하는 질병의 예방과 이들 균주를 사용한 유제품의 개발에 유용할 것이다.

이에 본 발명자들은 인체에 사용 시 안전하고 항산화 활성을 가지며 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 세포보호 효과를 갖는 새로운 유산균을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 지질과산화 억제효과를 가지고, Jurkat 세포 주에서 세포지질과산화 억제와 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 세포보호효과를 나타내는 Lactobacillus gasseri NLRI 312 균주를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 모유를 수유하는 건강한 유아의 분변에서 분리한 항산화 활성을 가지는 Lactobacillus gasseri NLRI 312 및 이를 함유하는 항산화 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 모유를 수유하는 건강한 유아의 분변에서 분리한 항산화 활성을 가지는 Lactobacillus gasseri NLRI 312 및 이를 함유하는 항산화 조성물을 제공한다. 또한 본 발명에서는 Lactobacillus gasseri NLRI 312의 항산화 활성을 측정하고, 세포 배양주(cell culture line)에서 항산화 효과를 측정하였다.

본 발명에서 사용한 Lactobacillus gasseri NLRI 312는 모유를 수유하는 건강한 유아의 분변에서 분리한 것으로서, 인체에 사용 시 안전하며 발효유나, 동결건조 등의 형태로서 사용이 가능하다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1] 균주 분리 및 동정

항산화 활성이 높은 균주를 분리하기 위하여 모유를 수유하는 유아의 분변을 0.85% 멸균 생리식염수로 십진 희석한 후 MRS 플레이트에 도말하고 혐기적(BBL Gaspak)으로 37℃에서 48시간 배양 후 그람 양성, 카탈라제 음성 균을 선발한 다음 항산화 효과를 측정 후 항산화 효과가 높은 단일 균주를 재선발하여 Lactobacillus spp. NLRI 312로 명명하였고, 상기 균주를 생명공학연구원 한국유전자원센터에 의뢰하여 이 균주의 16s rDNA 염기서열로 동정한 결과, 서열번호 1의 DNA를 가지는 Lactobacillus gasseri NLRI 312로 판명되었다(도 1). 아울러, 상기 균주를 2005년 3월 4일자로 농촌진흥청 농업생명공학연구원 부설 한국농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC 91155P를 부여받았다.

[시험예 1] 항산화 효과 측정

세포 용균액(cell lysate) 제조

상기 실시예 1에서 분리한 유산균을 MRS 배양액(broth)에 넣고 37℃에서 배양한 후 원심분리(4,000×g, 10분)하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 20mM 인산나트륨 완충액(SPB, pH 7.4)으로 2회 세척 후 다시 SPB에 현탁하여 초음파 처리로 파쇄하고 원심분리(7,000×g, 10분)한 다음 상등액을 0.45㎛ 필터(Milipore)로 여과하였으며, 단백질 함량은 Bradford 법 (Bio-Rad Laboratories)으로 측정하고 약 1㎎/㎖로 조정하여 사용하였다.

항산화 효과 측정

유산균의 항산화 효과는 Lin과 Chang(2000, Digestive Disease and Science 45(8):1617-1622)의 방법으로 다음과 같이 측정하였다. 리놀레산(Linoleic acid; Sigma, 99%) 0.1㎖과 트윈 20(tween 20) 0.2㎖ 및 증류수 19.7㎖을 혼합하여 리놀레산 에멀젼을 만들었다. 0.02M 인산 완충액(pH 7.0) 0.5㎖, 리놀레산 에멀젼 1㎖, 0.01% FeSO₄ 0.2㎖, 0.56mM H₂O₂ 0.2㎖ 및 세포 용균액 0.4㎖를 혼합하여 37℃ 수욕 조(water bath)에서 6시간동안 배양하였다. 배양액 2㎖을 취하여 4% TCA 용액 0.2㎖, 0.8% TBA 용액 2㎖ 및 0.4% BHT 0.2㎖를 혼합한 다음 100℃에서 30분간 가열 후 빠르게 냉각하였다. 부탄올 2㎖을 가하여 추출하고 상층액을 532㎚에서 측정하여 하기 수학식 1을 통해 항산화 효과를 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

항산화 효과(%) =〔1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도〕× 100

L. gasseri NLRI 312의 항산화 효과

균주	항산화 효과 (%)
Lctobacillus gasseri NLRI 312	65.3±2.8

상기 표 1에 보여지는 바와 같이, L. gasseri NLRI 312는 65.3%의 항산화 효과를 나타내었다.

[시험예 2] 항산화 유산균의 세포주에서 항산화 효과 및 세포보호 효과

세포주 및 배양방법

Jurkat T 세포(ATCC TIB-152)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum), 2mmol/ℓ L-글루타민, 1×10⁵ IU/ℓ 페니실린(penicillin) 및 100㎎/ℓ 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

세포에서 항산화 효과

세포(3.5×10⁵cell/㎖)에 L. gasseri NLRI 312 용균액(lysate) 500㎍ 단백질을 첨가하고 30분간 배양한 후 0.5mM H₂O₂를 처리하여 세포에 산화적 스트레스를 가하고 2시간 배양한 다음 세포를 멸균 PBS(Biowhittaker)로 2회 세척한 후 초음파 분쇄기를 사용하여 세포 파쇄(ultrasonication, 40% power, 5초간)하고 원심분리(250×g, 5분)하여 상등액을 얻었다. 세포의 항산화 효과는 Lipid peroxidation assay kit(Calbiochem^®)를 사용하여 MDA(malondialdehyde) 함량을 측정하여 지질과산화 억제 정도로 나타내었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 기준(Standard)으로서 1,1,3,3-테트라메톡시 프로판(1,1,3,3-Tetramethoxy propane)을 사용하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이 Jurkat 세포에 0.5mM H₂O₂ 처리시 유산균 무처리구의 MDA 함량은 4.06μM인 반면 L. gasseri 용균액(lysate) 처리구는 3.53μM로서 지질과산화억제효과를 나타내어 Jurkat 세포에서 항산화 효과를 나타내었다.

세포보호 효과

세포(3.5×10⁵cell/㎖)에 유산균 용균액을 첨가한 다음 30분 후에 활성산소를 처리하고 2시간 후에 세포사멸억제효과를 MTT 분석으로서 세포계측 키트-8(Cell counting kit-8; Dojindo Laboratories)를 사용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에서 보여지는 바와 같이, H₂O₂ 0.5mM 처리시 유산균 무처리구는 39.95% 생존성을 나타내었고, 500㎍ 단백질 L. gasseri 용균액 처리시 69.05% 생존성을 나타내었다. 또한 H₂O₂ 5mM 처리시 유산균 무처리구는 29.75% 생존성을 나타내었고, L. gasseri 용균액(500㎍ protein) 처리구는 43.6%의 생존성을 나타내어 L. gasseri NLRI 312가 활성산소에 대하여 세포보호 효과를 나타냄을 알 수 있다. 또한 2.5mM H₂O₂와 1mM FeSO₄를 처리한 경우에도 유산균 무처리구의 생존성은 31.55% 이었으나, L. gasseri 용균액(500㎍ protein) 처리구는 53.48%, 1㎎ 단백질 처리구는 79.43%의 높은 생존성을 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 모유를 수유하는 유아의 분변에서 분리한 새로운 유산균인 L. gasseri NLRI 312는 65.3%의 항산화 효과를 나타내었으며, Jurkat 세포에서 항산화 효과를 측정한 결과 지질과산화억제효과를 나타내었고, 0.5mM H₂O₂처리시 L. gasseri 처리구는 69.05% 생존성을 나타내어 무처리구 39.95% 보다 높은 생존성을 나타내었다. 또한 2.5mM H₂O₂와 1mM FeSO₄를 처리한 경우에도 유산균 무처리구의 생존성은 31.55%이었으나, L. gasseri 용균액 처리구의 생존성은 53.48%로서 L. gasseri NLRI 312가 활성산소에 대항하여 세포보호효과를 나타내었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

모유를 수유하는 건강한 유아의 분변에서 분리되고 기탁번호 KACC 91155P를 부여받은 Lactobacillus gasseri NLRI 312.
제 1항에 의한 Lactobacillus gasseri NLRI 312를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 조성물은 지질과산화 억제를 위한 것임을 특징으로 하는 항산화용 조성물.